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Title:
SINGLE-LABELLING AGENTS BASED ON VINYL SULPHONE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2009/106664
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to labelling agents containing a compound with a labelled molecule and a vinyl sulphone group. The invention also relates to the compounds, the method for obtaining same and the uses thereof in the marking of biomolecules and, more specifically, proteins.

Inventors:
SANTOYO GONZÁLEZ, Francisco (Cuesta del Hospicio, s/n, Granada, E-18071, ES)
HERNÁNDEZ MATEO, Fernando (Cuesta del Hospicio, s/n, Granada, E-18071, ES)
LÓPEZ JARAMILLO, Francisco Javier (Cuesta del Hospicio, s/n, Granada, E-18071, ES)
ORTEGA MUÑOZ, Mariano (Cuesta del Hospicio, s/n, Granada, E-18071, ES)
Application Number:
ES2009/070034
Publication Date:
September 03, 2009
Filing Date:
February 19, 2009
Export Citation:
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Assignee:
UNIVERSIDAD DE GRANADA (Cuesta del Hospicio, s/n, Granada, E-18071, ES)
SANTOYO GONZÁLEZ, Francisco (Cuesta del Hospicio, s/n, Granada, E-18071, ES)
HERNÁNDEZ MATEO, Fernando (Cuesta del Hospicio, s/n, Granada, E-18071, ES)
LÓPEZ JARAMILLO, Francisco Javier (Cuesta del Hospicio, s/n, Granada, E-18071, ES)
MORALES SANFRUTOS, Julia (Cuesta del Hospicio, s/n, Granada, E-18071, ES)
ORTEGA MUÑOZ, Mariano (Cuesta del Hospicio, s/n, Granada, E-18071, ES)
International Classes:
C07C317/18; C07C317/28; C07D311/80; C07D495/04; C09B62/503; G01N33/531; G01N33/533; G01N33/58; G01N33/68
Domestic Patent References:
WO2003084982A2
Foreign References:
EP0187076B1
Other References:
SHIMOBOJI, T. ET AL.: 'Mechanistic Investigation of Smart Polymer-Protein Conjugates' BIOCONJUGATE CHEMISTRY vol. 12, no. 2, 2001, pages 314 - 319
HAGENSTEIN, M. ET AL.: 'Chemical tools for activity-based proteomics' JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY vol. 124, 2006, pages 56 - 73
Attorney, Agent or Firm:
PONS ARIÑO, Ángel (Glorieta de Rubén Darío 4, Madrid, E-28010, ES)
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Claims:

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de fórmula general (I):

O

donde:

Y es oxígeno (O) ó el grupo -N(R 1 JCH 2 CH 2 SO 2 ; donde R 1 es un radical, sustituido o no sustituido, que se selecciona de entre un grupo alquilo (C 1 -C 10 ) o un grupo (CH 2 ) m C≡CH; donde m toma valores de 1 a 10;

R es un radical, sustituido o no sustituido, que se selecciona del grupo que comprende: -R 2 OCH 2 CH 2 , CH 2 CH 2 OR 2 OCH 2 CH 2 ó -(CH 2 CH 2 O) n CH 2 CH 2 ; donde

R 2 es un radical, sustituido o no sustituido, que se selecciona de entre un grupo alquilo (C 1 -C 10 ) ó un grupo dialquilarilo; donde n toma valores de 2 a 20; y

W é P representa una molécula etiqueta.

2. Compuesto según Ia reivindicación 1 , donde Ia molécula etiqueta es biotina o un fluoróforo.

3. Compuesto según Ia reivindicación 2, donde el fluoróforo es dansilo o rodamina.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R es -(CH 2 CH 2 O) n CH 2 CH 2 .

5. Compuesto según Ia reivindicación 4, donde n toma valores de 1 a 3.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde Y es

oxígeno (O).

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde Y es el grupo -N(R 1 )CH 2 CH 2 SO 2 y R 1 está definido en Ia reivindicación 1.

8. Compuesto según Ia reivindicación 7, donde R 1 es un alquilo (C 2 -C 6 ).

9. Compuesto según Ia reivindicación 8, donde R 1 es sec-butilo.

10. Compuesto según Ia reivindicación 7, donde R 1 es grupo (CH 2 ) m C≡CH y m toma los valores de 1 a 3.

11. Compuesto según Ia reivindicación 10, donde m es 1.

12. Compuesto según Ia reivindicación 1 , de fórmula: o ϊ

HN NH

o 13. Compuesto según Ia reivindicación 1 , de fórmula:

14. Compuesto según Ia reivindicación 1 , de fórmula:

15. Compuesto según Ia reivindicación 1 , de fórmula:

16. Compuesto según Ia reivindicación 1 , de fórmula:

17. Compuesto según Ia reivindicación 1 , de fórmula:

18. Compuesto según Ia reivindicación 1 , de fórmula:

19. Método de obtención de un compuesto de fórmula general (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende Ia reacción de: a. el compuesto de fórmula general (II):

(H) donde: R está definido en Ia reivindicación 1 ; y

X es OH ó el grupo -SO 2 CH 2 CH 2 NH(R 1 ); donde R 1 está definido en Ia reivindicación 1.

b. con una molécula etiqueta o cualquiera de sus derivados.

20. Método según Ia reivindicación 19, donde los derivados de las moléculas etiqueta son cloruros de ácido o cloruros de sulfonilo.

21. Método según Ia reivindicación 19, donde Ia vinilsulfona funcionalizada del paso (a) se selecciona de entre los compuestos de fórmula:

O

22. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, como agente de etiquetado.

23. Agente de etiquetado que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

24. Uso del agente de etiquetado según Ia reivindicación 23, para el mareaje de biomoléculas.

25. Uso del agente de etiquetado según Ia reivindicación 24, donde las biomoléculas son proteínas.

Description:

AGENTES DE ETIQUETADO SIMPLE BASADOS EN VINILSULFONA

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) que comprende una molécula etiqueta y grupos vinilsulfona, cuya función es llevar a cabo Ia unión covalente con las moléculas susceptibles de etiquetado, también se refiere a sus procedimientos de obtención y a sus usos. Más particularmente, se refiere al uso de estos compuestos para el etiquetado de biomoléculas y a sus aplicaciones biotecnológicas.

O)

ESTADO DE LA TéCNICA ANTERIOR

El etiquetado de biomoléculas es una herramienta básica en el campo de Ia genómica y Ia proteómica para Ia detección, purificación y estudio de interacciones entre biomoléculas.

De entre Ia gama de etiquetados de biomoléculas que son plausibles, destacan por su especial importancia los etiquetados con fluoróforos y con biotina debido a sus aplicaciones biotecnológicas y su impacto comercial.

El etiquetado fluorescente es un elemento clave para Ia detección y análisis de biomoléculas (Patton, W.F. Electrophoresis (2000), vol. 21 , pp. 1123-

1144) y es el motor de una industria de miles de millones de euros. Las ventajas del etiquetado fluorescente, frente a métodos convencionales como son el azul Coomassie (Wang, X., et al. Biotechnol. Lett. (2007), vol.

29, pp. 1599-1063), Ia plata (Rabilloud, T. Electrophoresis (1990), vol. 11 pp. 785-794), el oro coloidal (Rohringer, R.; Holden, D.W., Anal. Biochem.

(1985), vol. 144, pp. 118-127) o Ia radioactividad (Waggoner, A., Curr.

Opin. Chem. Biol. (2006), vol.10, pp. 62-66), son las siguientes:

-Detección rápida y de sensibilidad elevada: cada etiqueta fluorescente puede originar del orden de 10 7 -10 8 fotones por segundo. -Versatilidad: Distintos etiquetados originan distintos "colores", siendo posible realizar un etiquetado "policromático" como el empleado, por ejemplo, en Ia secuenciación de ADN (Smith, L., et al., N ature (1986), vol. 321 , pp. 674-679).

-Inercia: Tamaño y propiedades del fluoróforo raramente interfieren con Ia biomolécula marcada.

-Localización de Ia señal en el punto de etiquetado, a diferencia del etiquetado enzimático.

Sin embargo, su potencial va más allá de Ia detección pasiva dado que técnicas como Ia polarización de fluorescencia y FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer, también denominado Forster Resonance Energy Transfer) permiten evaluar cambios conformacionales, interacciones entre proteínas o entre proteína y ligando. La medida de Ia polarización proporciona información sobre orientaciones y movilidad que permite estudiar las interacciones receptor-ligando (Jameson, D. M., Seifried, S. E., Methods (1999), vol. 19, pp. 222-233), y FRET es una interacción entre fluoróforos en Ia cual Ia excitación pasa de un fluoróforo excitado (donante) a otro que se excita (aceptor) sin Ia emisión de un fotón. Esta interacción se produce cuando Ia longitud de onda de emisión del donante es muy próxima a Ia de excitación del aceptor y es muy dependiente de Ia distancia entre donante y aceptor, por Io que se ha empleado como regla (Remedios, C. G., Moens, P. D., J. Struct. Biol. (1995), vol. 115, pp. 175-185) para analizar cambios conformacionales e interacción entre biomoléculas.

Actualmente existe una gran cantidad y variedad de fluoróforos. Entre los empleados para el etiquetado de biomoléculas se encuentran el dansilo, Ia fluoresceína y Ia rodamina B, cuyas características fundamentales y algunas de sus aplicaciones se resumen en Ia tabla adjunta:

Por otro lado, el etiquetado con biotina también tiene gran importancia biotecnológica (Wilchek, M.; Bayer, E. A., Anal. Biochem. (1988), vol. 171 , pp. 1-32). La biotina es una molécula que actúa como coenzima de determinadas carboxilasas relacionadas con el metabolismo del dióxido de carbono. Sin embargo, su interés biotecnológico radica en Ia alta especificidad y afinidad que Ia avidina, estreptavidina y otras proteínas relacionadas presentan por esta biomolécula (constante de disociación del orden de 10 ~15 M "1 ), haciendo que Ia interacción tenga Ia fortaleza de un enlace covalente sin serlo. Así, Ia biotinilización transforma moléculas difícilmente detectables en sondas que pueden ser detectadas o capturadas con avidina/estreptavidina marcadas o inmovilizadas. Este principio es común para localizar antígenos en tejidos, células y para

detectar biomoléculas en inmunoensayos y en pruebas de hibridación de ADN. Sin embargo, para determinadas aplicaciones, como por ejemplo Ia purificación mediante cromatografía de afinidad, se necesita que Ia interacción biotina-avidina sea reversible, para Io cual se puede modificar tanto Ia avidina (por nitrosación de las tirosinas del centro activo (Morag, E., et al., Biochem. J., (1996), vol. 316: pp. 193-199) como usar derivados de biotina (destiobiotina e iminobiotina). Existen biotinas marcadas fluorescentemente para cuantificar los sitios activos de Ia avidina (Gruber, H. J, et al., Biochim. Biophvs. Acta (1998), vol. 1381 , pp. 203-212) y biotina etiquetada con DNP (DNP-X-biocytin-X; US5180828A) (dinitrofenol), etiquetado versátil que además de actuar como cromóforo es reconocido por anticuerpos anti-DNP, permitiendo Ia correlación entre fluorescencia y estudios de microscopía electrónica. Existe también en el mercado peroxidasa de rábano picante (HRP) etiquetada con biotina.

Un aspecto fundamental de cara al uso de cualquier etiquetado es Ia unión a Ia biomolécula y Ia estabilidad de dicha unión. Desde un punto de vista químico existen cuatro grupos presentes en las biomoléculas susceptibles de actuar como dianas para el anclaje de los reactivos de etiquetado convenientemente derivatizados a través de Ia formación de un enlace covalente, como son las aminas, tioles, alcoholes y ácidos carboxílicos, que a continuación se detallan:

Aminas: Son Ia diana más común de los reactivos de modificación covalente y Ia principal en proteínas. En Ia mayoría de estas biomoléculas el extremo amino esta libre y además prácticamente todas tienen lisina, residuo en cuya cadena lateral hay un grupo ε-amino fácilmente modificable dado que se localiza mayoritariamente en Ia superficie de las proteínas. Estos grupos reaccionan con reactivos acilantes y Ia reactividad es dependiente del reactivo acilante, del tipo de amina, basicidad y pH de reacción. Las aminas alifáticas, como Ia de Ia cadena lateral de Ia lisina, son moderadamente básicas y reaccionan con Ia mayoría de los reactivos acilantes a pH superior a 8.

Tres son las derivatizaciones de los reactivos de etiquetado que reaccionan con las aminas de las biomoléculas:

- Succinimidil esteres. Reaccionan con aminas para originar amidas. Es Ia derivatización más frecuente dada Ia estabilidad del enlace amida que se genera. Reaccionan bien con aminas alifáticas y presentan baja reactividad con aminas aromáticas, alcoholes, fenoles (tirosina) e imidazol. En presencia de tioles (cisteína) pueden formar tiosteres pero en proteínas el grupo acilo puede ser transferido a una amina vecina. Uno de los principales inconvenientes de los succinimidil esteres es su solubilidad, que en algunos casos puede ser muy baja. Por ello, en el mercado existen derivados de ácidos carboxílicos que pueden convertirse en sulfosuccinimidil esteres (Staros, J.V., et al., Anal. Biochem. (1986), vol. 156, pp. 220-222) o STP esteres (Gee, K.R., et al., Tetrahedron Lett. (1999), vol. 40, pp. 1471-1474), que son más polares, y por ello más solubles en agua, aunque también menos reactivos con aminas poco expuestas. - Isotiocianatos. Reaccionan con aminas para formar tioureas, las cuales son razonablemente estables en Ia mayoría de los casos.

- Cloruros de ácido sulfónico. Reaccionan con aminas y producen sulfonamidas. Son muy reactivos e inestables en medios acuosos, especialmente al pH alcalino necesario para que reaccionen con las aminas alifáticas, por Io que se trabaja a baja temperatura. Una vez conjugados el enlace es extremadamente estable y resistente. También reaccionan con fenoles (tirosina), alcoholes alifáticos (polisacáridos), tioles (cisteína), e imidazoles (histidina), aunque los conjugados con tioles e imidazoles son inestables y los conjugados con alcoholes alifáticos pueden sufrir desplazamientos nucleofílicos.

- Otras funcionalizaciones pueden ser: aldehidos y agentes arilantes. Aldehidos que reaccionan con las aminas para formar bases de Schiff. Se han preparado derivados del o-ftalaldehído (OPA), naftalendicarboxaldehído (NDA) y 3-acrilquinilencarbaxaldehído (OTTO- TAG) y se han empleado para cuantificación de aminas en solución (Liu, J., Hsieh, et al., Anal. Chem. (1991 ), vol. 163, pp. 408-412). Y agentes arilantes como el cloruro o fluoruro de 4-nitro-2,1 ,3-benzoxadiazol (NBD) (Watanable, Y., Imai, K., J. Chromatoqr. (1982), vol. 239, pp. 723-732).

Tioles: Son dianas más selectivas que el grupo amino, pues son poco frecuentes en biomoléculas y para ser reactivos tienen que estar libres (no

formar puente disulfuro). El grupo sulfhídrico puede ser introducido en Ia macromolécula a marcar vía modificación química, reducción de puentes disulfuro o vía inteína (Tan, L. P., Yao, S.Q., Protein and Pept. Lett. (2005), vol. 12, pp. 769-751 ) (en el caso de proteínas), o mediante mutagénesis dirigida para introducir cisteína.

Los grupos tioles reaccionan a pH fisiológico (pH 6.5-8) con reactivos alquilantes (como son las yodoacetamidas y las maleimidas) o arilantes (como el 7-cloro ó 7-fluor-4-nitro-2,1 ,3-benzoxadiazol (NBD)), para originar tioéteres estables. Reaccionan también con muchos de los reactivos acilantes de aminas, incluyendo isotiocianatos y succinimidil esteres. También los disulfuros simétricos como Ia didansyl-L-cisteína o el ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB) (DaIy, TJ. , et al., Biochemistry (1986), vol. 25, pp. 5468-5474) reaccionan con los tioles para dar uniones de tipo disulfuro no simétrico.

Alcoholes: La función hidroxilo está presente en las cadenas laterales de Ia tirosina, serina y treonina, en esteróles y carbohidratos, pero su reactividad en soluciones acuosas es extremadamente baja, especialmente en proteínas por Ia presencia de nucleófilos más activos como las aminas y los tioles. Una función que reacciona específicamente con dioles vecinales es el ácido borónico y forma complejos cíclicos (Gallop, P. M., et al., Science (1982), vol. 217, pp. 166-169). Sin embargo, un procedimiento estándar para incrementar Ia reactividad, especialmente en el caso de carbohidratos, es Ia oxidación con peryodato para originar Ia función aldehido. Las principales funcionalizaciones de los reactivos de etiquetado que reaccionan con Ia función aldehido de las biomoléculas son: amina, hidrazidas, semicarbazida, carbohidrazida y O-alquilhidroxilaminas.

Grupo ácido carboxilo: Son abundantes en macromoléculas pero poco reactivos, por Io que es habitual derivatizarlos de forma tal que se introducen aminas que reaccionan con las funcionalizaciones anteriormente descritas.

Actualmente es posible adquirir comercialmente toda una gama de productos de etiquetado con fluorescencia y con biotina convenientemente derivatizados. La estrategia más frecuente para funcionalizar los reactivos

de etiquetado es Ia derivatización como succinimidil esteres para reaccionar con las funciones aminas de Ia biomolécula.

Por otro lado, y desde una perspectiva química las sulfonas α,β- insaturadas (vinil sulfonas) son reconocidas como intermediarios sintéticos de gran utilidad debido fundamentalmente a su capacidad para participar en reacciones de adición 1 ,4 (aceptores de Michael). Adicionalmente, las vinilsulfonas son fáciles de preparar, a través de una amplia variedad de procesos sintéticos, y de manipular (Simphinks, N. S., Tetrahedron (1990), vol. 282, pp. 6951-6984). Estas características han encontrado recientemente utilidad en el diseño de fármacos y en química médica cuando se demostró su capacidad para inhibir de forma potente y reversible una variedad de procesos enzimáticos, fundamentalmente aquellos en los que están implicados cistein proteasas a las que se unen a través de reacciones de adición con el grupo tiol presente en el residuo de cisteína del sitio activo de estas enzimas (Meadows, D. C, et al., Med. Res. ReV 1 (2006), vol. 26(6), pp. 793-814).

Sin embargo, desde un punto de vista biotecnológico su potencial va más allá. La reactividad de las vinilsulfonas con biomoléculas se ha aprovechado para Ia introducción de polietilenglicol vía reacción con tioles (Morpurgo, M., et al., Bioconiuq. Chem. (1996) vol. 7, pp. 363-368), para Ia formación de hidrogeles mediante entrecruzamiento de péptidos con polietilenglicol funcionalizado con vinilsulfona (Rizzi, S. C, et al., Biomacromolecules (2006), vol. 7, pp. 3019-3029) y para Ia introducción de moléculas de glucosa derivatizada con vinilsulfona vía reacción con las aminas de las proteínas (López-Jaramillo, et al., Acta Cryst. (2005) vol. F61 , pp. 435-438).

Como marcadores, se han descrito diferentes compuestos coloreados que contienen grupos vinilsulfona. En este sentido, Ia patente US4473693 describe colorantes, para el mareaje intracelular, basados en amarillo Lucifer y que contienen un grupo vinilsulfona. En Ia patente EP0187076 se describen compuestos fluorescentes que contienen un grupo vinilsulfona, estos compuestos son útiles para estudios inmunológicos.

EXPLICACIóN DE LA INVENCIóN

En Ia presente invención se proporciona un nuevo compuesto de fórmula general (I) que comprende una molécula etiqueta, además de un grupo vinilsulfona, y que permite llevar a cabo el etiquetado de biomoléculas de una forma altamente eficaz y sencilla. Estos compuestos constituyen una alternativa a las derivatizaciones empleadas actualmente en proteómica y genómica para introducir un reactivo de etiquetado en biomoléculas.

Por Io tanto, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a los compuestos de fórmula general (I) (a partir de ahora compuestos de Ia invención):

^ sof^

O) donde:

Y es un radical seleccionado de entre un átomo de oxígeno (O) o del grupo, sustituido o no sustituido, -N(R 1 )CH2CH2SO2, donde: R 1 es un radical, sustituido o no sustituido, que se selecciona de entre el grupo que comprende un alquilo (C1-C10) o el grupo (CH 2 ) m C≡CH; donde m es un valor de entre 1 y 10, preferiblemente m es un valor de 1 a 5, más preferiblemente m es 1 , 2 ó 3, aún más preferiblemente m es 1. Cuando R 1 es un grupo alquilo, preferiblemente es un alquilo (C2-C6), más preferiblemente es un alquilo C 4 y aún más preferiblemente es un grupo sec-butilo.

R es un radical, sustituido o no sustituido, que se selecciona del grupo que comprende las siguientes fórmulas: -R 2 OCH 2 CH 2 , -CH 2 CH 2 OR 2 OCH 2 CH 2 , ó -(CH 2 CH 2 O) n CH 2 CH 2 , donde R 2 es un radial alquilo (C1-C10), sustituido o no sustituido, ó un radical dialquilarilo ((Ci-Cio)Ar(Ci-Cio)), sustituido o no sustituido; y n es un valor de entre 2 y 20; preferiblemente R es un grupo de fórmula -(CH 2 CH 2 O) n CH 2 CH 2 , n puede ser un valor de 2 a 10, más preferiblemente n es 2, 3, 4, 5 ó 6; aún más preferiblemente n puede ser 2 ó 4; y

^^ representa una molécula etiqueta.

El término "alquilo" se refiere en Ia presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo, sec-butilo, n- pentilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 2 a 6 átomos de carbono.

Por "dialquilarilo" se entiende en Ia presente invención a un grupo arilo que está sustituido con dos grupos alquilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, más preferiblemente tiene de 1 a 5 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden ser iguales o diferentes, preferiblemente son iguales y por "arilo" se entiende en Ia presente invención a una cadena carbocíclica aromática, que tienen de 6 a 12 átomos de carbonos, pueden ser de anillo único ó múltiple, separados y/o condensados. Los grupos arilo típicos contiene de 1 a 3 anillos separados o condensados y desde 6 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono de anillo, tales como radicales fenilo, naftilo, indenilo, fenantrilo o antracilo.

El término "molécula etiqueta" se refiere en esta descripción cualquier sustancia biorreconocible, colorante, fluoróforo o cualquier otro grupo detectable por técnicas espectrofotométricas, fluorométricas, de microscopía óptica, fluorescencia o confocal, anticuerpos y /o RMN, y que permite fácilmente Ia detección de otra molécula que por sí sola es difícil de detectar y/o cuantificar. Preferentemente, esta molécula etiqueta es biotina o un fluoróforo seleccionado de entre marcadores fluorescentes conteniendo al menos un grupo ácido carboxílico ó un grupo ácido sulfónico, a partir de ahora representados según las figuras:

Más preferiblemente el fluoróforo puede ser dansilo, rodamina o cualquiera de sus derivados.

Los derivados de las moléculas etiqueta pueden ser halogenuros de ácido ó de sulfonilo, y más preferiblemente cloruros de ácido o de sulfonilo.

Un segundo aspecto de Ia presente invención se refiere al método de obtención de los compuestos de Ia invención, es decir, de los compuestos de fórmula general (I), y que comprende:

reaccionar las vinilsulfonas funcionalizadas de fórmula general (II), que presentan, además de un grupo vinilsulfona, uno o dos grupos funcionales adicionales para Ia unión con las moléculas de etiquetado:

x' R ^sop^

(H) donde: R está definido anteriormente; y

X es -OH ó el grupo -SO 2 CH 2 CH 2 NH(R 1 ); donde R 1 está definido anteriormente.

con una molécula etiqueta que contiene un grupo ácido carboxílico o ácido sulfónico que permite a través de ellos mismos o de uno de sus derivados activados Ia formación: -de un enlace amida o sulfonamida con las vinilsulfonas de fórmula general (II) cuando X representa el grupo -SO 2 CH 2 CH 2 NH(R 1 ); o

-de un enlace éster o sulfonato cuando X representa un grupo -OH; según el siguiente esquema:

O") O)

En una realización preferida de Ia presente invención, se utilizan cloruros de ácido o cloruros de sulfonilo derivados de las moléculas etiqueta y Ia obtención de los compuestos de Ia invención se lleva a cabo por reacción de estos derivados con las vinilsulfonas de fórmula general (II) a través de: a) reacciones de esterificación con cloruros de ácido de las etiquetas

cuando X es -OH; b) reacciones de amidación con cloruros de ácido o cloruros de sulfonilo de las etiquetas cuando X es -SO 2 CH 2 CH 2 NH(R 1 ). De esta forma se pueden obtener compuestos de etiquetado biotinilantes y compuestos de etiquetado fluorescentes conteniendo dansilo ó rodamina como fluoróforos.

Una realización preferida del método de Ia presente invención comprende vinilsulfonas funcionalizadas de fórmula general (II) donde X es -OH, -SO 2 CH 2 CH 2 NHCH(CH 3 )CH 2 CH 3 ó -SO 2 CH 2 CH 2 NHCH 2 C≡CH; R es (CH 2 CH 2 O) n CH 2 CH 2 y n puede tomar los valores de entre 2 y 4. Es decir, las vinilsulfona de fórmula general (II) preferidas son las siguientes:

En otra realización preferida estos compuestos de fórmula general (II) se obtienen por reacción de divinilsulfona (DVS) con dioles (fórmula (III)): a) en una proporción 1 :1 para dar Ia ω-hidroxi vinilsulfona, cuando X es -OH (corresponde al compuesto de fórmula general (IV)); ó b) en una proporción >2:1 para dar bis-vinilsulfonas, correspondientes al compuesto de fórmula general (V), que son transformadas posteriormente por reacción de uno de los grupos vinil sulfona con aminas primarias a través de una reacción de adición tipo Michael dando las correspondientes amino vinilsulfona, es decir, los compuestos de fórmula general (II) cuando X es -SO 2 CH 2 CH 2 NH(R 1 ), que corresponde, en el siguiente esquema, al compuesto de fórmula general (Vl).

donde:R 1 y n están definidos anteriormente. x toma valores de 0 a 19 y, n está relacionado con x de Ia siguiente forma: n es x+1 en Ia fórmula general (IV) y n es x+2 en Ia fórmula general (Vl).

En una realización aún más preferida, estos dioles son tetraetilenglicol (cuando x es 3) y etilenglicol (cuando x es 0).

De esta forma, se pueden proporcionar compuestos difuncionales (compuestos 4 y 8) y tri-funcionales (compuesto 9) con grupos que presentan una reactividad ortogonal entre sí, circunstancia que permite modular su reactividad. Así, según el método de Ia presente invención las vinilsulfonas de fórmula general (II) permiten llevar a cabo Ia incorporación de cualquier molécula etiqueta que contenga grupos funcionales con una reactividad complementaria a los grupos presentes en las mismas y que dejen inalterado un grupo vinilsulfona el cual es usado para Ia posterior ligación a las biomoléculas. En particular y dado que las vinisulfonas de fórmulas (II) de Ia realización preferida de Ia presente invención son portadoras de las funciones hidroxilo y amino se pueden utilizar, pero sin limitarse a, derivados de moléculas etiqueta conteniendo a) Ia función cloruro de ácido o b) cloruro de sulfonilo.

De esta forma, los derivados de estas moléculas etiqueta preferidas pueden ser los siguientes:

El compuesto de Ia invención proporciona una técnica de etiquetado que se basa en Ia ligación quimioselectiva de Ia función vinilsulfona con grupos complementarios presentes de forma natural en cualquier biomolécula (grupos amino o grupos tioles) y con los que reacciona a través de reacciones de adición tipo Michael. Además, el compuesto es compatible con Ia naturaleza biológica de las biomoléculas y Ia técnica no requiere ninguna estrategia de activación.

El uso de Ia función vinilsulfona como derivatización de los reactivos de etiquetado para llevar a cabo Ia unión covalente biomolécula-compuesto de Ia invención presenta las siguientes ventajas:

a) Estabilidad de los agentes de etiquetado conteniendo tal función. b) Formación de una unión covalente estable. c) La reacción es rápida y con altos rendimientos no generándose ningún tipo de subproducto. d) No se requieren grandes excesos de reactivos. e) Las reacciones se llevan a cabo en ausencia de catalizadores por simple mezcla de los reactivos. f) Las reacciones pueden llevarse a cabo en agua sin el uso de co- solventes. g) Las reacciones pueden llevarse a cabo bajo condiciones fisiológicas: medio acuoso, rango de pH estrecho, temperaturas suaves. h) Procesos de purificación y aislamiento sencillos. i) Existe una tolerancia hacia los otros grupos funcionales presentes en las biomoléculas distintos de los grupos amino y tioles con los que reaccionan las vinil-sulfonas.

Por tanto, otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula general (I) como agentes de etiquetado para el mareaje o etiquetado de moléculas, y más preferiblemente de biomoléculas. En Ia presente invención se entiende por "agente de etiquetado" aquellos compuestos capaces de unirse a una molécula y que además permitan Ia visualización, detección y/o cuantificación mediante espectroscopia (absorción, fluorescencia, RMN y otros), reacción enzimática (peroxidasa, fosfatasa alcalina y otros) o espectrometría (masas y otros) de Ia molécula objeto del mareaje.

En una realización preferida de Ia presente invención, las biomoléculas son proteínas.

En una realización aún mas preferida de Ia presente invención, las proteínas son seleccionadas del grupo que comprende albúmina sérica bovina (BSA), lisozima, GFP ("Green fluorescent protein"), Concanavalina A, Avidina ó extracto crudo de guisante.

En una realización preferida de Ia presente invención el etiquetado de proteínas se realiza en una solución sin aminas libres como por ejemplo, pero sin limitarse a, fosfato o HEPES, de fuerza iónica moderada (50 - 200 mM) y pH básico (7,5 -8,7) y Ia reacción con un exceso de los reactivo de etiquetado de fórmula general (I) durante un tiempo suficiente

(habitualmente durante toda Ia noche a temperatura ambiente) eliminándose el exceso de reactivo mediante diálisis (Esquema 1 ).

Esquema 1.- Reacción de etiquetado entre los compuestos de fórmula general (I) y las biomoléculas:

donde:

Y y R están definidos anteriormente;

R 3 es NH ó S; y

representa Ia biomolécula

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

FIG 1. Muestra el mareaje de avidina con el compuesto 18, originando fluorescencia (gel de Ia izquierda (A)) y compatible con Ia posterior tinción con Coomassie (gel de Ia derecha (B)). Las muestras son, de izquierda a derecha: calle 1 : estequiometría 1 :4 / 3 horas calle 2: estequiometría 1 :4 / 8 horas calle 3: estequiometría 1 :4 /24 horas calle 1 : estequiometría 1 :8 / 3 horas calle 2: estequiometría 1 :8 / 8 horas calle 3: estequiometría 1 :8 /24 horas

FIG 2. Muestra el mareaje de concanavalina A con el compuesto 17, originando fluorescencia (gel de Ia izquierda (A)) y compatible con

Coomassie (gel de Ia derecha (B)). Las muestras son, de izquierda a derecha: calle 1 : estequiometría 1 :5 / 3 horas calle 2: estequiometría 1 :5 / 8 horas calle 3: estequiometría 1 :5 /24 horas calle 1 : estequiometría 1 :10 / 3 horas calle 2: estequiometría 1 :10 / 8 horas calle 3: estequiometría 1 :10 /24 horas

FIG 3. Muestra el etiquetado previo a electroforesis de BSA y lisozima con el compuesto 17, originando fluorescencia (gel de Ia izquierda (A)) que permite detectar "de viso"" del orden de 125 ng y es compatible con una posterior tinción de plata tras Ia electroforesis (gel de Ia derecha (B)). Las muestras son, de izquierda a derecha: calle 1 : BSA-rodamina calle 2: lisozima-rodamina calle 3: BSA sin etiquetar (control) calle 4: lisozima sin etiquetar (control)

FIG 4. Muestra el etiquetado previo a electroforesis de un extracto crudo de guisante con el compuesto 17, permite su análisis sin necesidad de una posterior tinción con Coomassie o plata.

FIG 5. Muestra Ia detección de BSA marcada con biotina (estequiometrías BSA:biotina entre paréntesis) con diferentes estequiometrías de avidina fluorescente. De izquierda a derecha:

calle 1 : Avidina-Dansilo: BSA-biotina (1 :10) estequiometría 1 :1 calle 2: Avidina-Dansilo: BSA-biotina (1 :10) estequiometría 4:1 calle 3: Avidina-Dansilo: BSA-biotina (1 :5) estequiometría 1 :1 calle 4: Avidina-Dansilo: BSA-biotina (1 :5) estequiometría 4:1 calle 5: Control de Avidina-Dansilo sin BSA-biotina

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto Ia especificidad y efectividad de los compuestos de Ia invención.

EJEMPLO 1.- Síntesis de vinilsulfonas de fórmula (II): compuestos 4, 8 y 9.

Las vinilsulfonas de fórmula general (II) se obtuvieron a partir de divinilsulfona (DVS) y dioles, (a) en una proporción 1 :1 ,2 para dar Ia ω- hidroxi vinilsulfona (compuesto 4) ó (b) en una proporción 3:1 para dar bis- vinilsulfonas (compuestos 5) que son transformadas posteriormente por

reacción con aminas primarias de uno de los grupos vinil sulfona a través de una reacción de adición tipo Michael dando las correspondientes amino vinilsulfona (compuesto 8 y 9).

Compuesto 4: A una disolución de tetraetilenglicol 2 (1.760 g, 9.07 mmol) en CH 2 CI 2 (20 ml_) se Ie adicionó DVS 1 (1.1 ml_, 11 mmol) y DBU (690 mg, 4.5 mmol). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (16 h). El disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH 10:1 ) obteniéndose 4 como un líquido (1.07 g, 38%).

Compuesto 5: A una disolución de etilenglicol 3 (330 mg, 5.3 mmol) en THF (100 ml_) se Ie adicionaron DVS 1 (1.6 ml_, 16 mmol) y t-BuOK (119 mg, 1.1 mmol). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (30 min). El disolvente se eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt-hexano 2:1 a 3:1 ) obteniéndose 5 como un sirope (800 mg, 51 %).

Compuesto 8: A una disolución de 5 (1.0 g, 3.3 mmol) en CI 2 CH 2 - isopropanol 2:1 se Ie adicionó sec-butilamina 6 (164 mg, 2.2 mmol). La mezcla de reacción se deja a temperatura ambiente (6 h). El disolvente se eliminó por evaporación a vacío obteniéndose un crudo que se purificó por

cromatografía en columna (AcOEt a AcOEt-MeOH 10:1 ) obteniéndose 8 como un sirope (472 mg, 57%).

Compuesto 9: A una disolución de 5 (414 mg, 1.4 mmol) en CI 2 CH 2 - isopropanol 2:1 se Ie adicionó propargilamina 7 (51 mg, 0.93 mmol). La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente (1 día). El disolvente se eliminó por evaporación a vacío obteniéndose un crudo que se purificó por cromatografía en columna (AcOEt a AcOEt-MeOH 10:1 ) obteniéndose 9 como un sirope (170 mg, 52%).

EJEMPLO 2- Síntesis de agentes de etiquetado simple basados en vinil sulfona conteniendo biotina: compuestos 12-14

14

Compuesto 12: Una disolución de biotina 10 (247 mg, 1 mmol) en CI 2 SO (5 ml_) se mantuvo a temperatura ambiente (1 h). El exceso de CI 2 SO se eliminó por evaporación a vacío coevaporándose sucesivamente con tolueno anhidro. El crudo obtenido fue el cloro derivado 11 que se disolvió en CH 2 CI 2 anhidro (15 ml_), se enfrió en un baño de agua-hielo y se Ie

adicionaron 4 (343 mg, 1.1 mmol) y EtβN (0.145 ml_). Se dejó que Ia mezcla de reacción alcanzara Ia temperatura ambiente procediéndose entonces a Ia eliminación del disolvente por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (CH 2 CI 2 -MeOH 20:1 ) obteniéndose 12 como un sirope (234 mg, 42%).

Compuesto 13: Una disolución de biotina 10 (120 mg, 1 mmol) en CI 2 SO (5 ml_) se mantuvo a temperatura ambiente (1 h). El exceso de CI 2 SO se eliminó por evaporación a vacío coevaporándose sucesivamente con tolueno anhidro. El crudo obtenido fue el cloro derivado 11 que se disolvió en THF anhidro (15 ml_), se Ie adicionaron 8 (145 mg, 1.2 mmol) y EtβN (0.085 ml_) disueltos en THF anhidro (5 ml_). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 10 min procediéndose entonces a Ia eliminación del disolvente por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH 10:1 a 5:1 ) obteniéndose 13 como un sirope (140 mg, 63%).

Compuesto 14: Una disolución de biotina 10 (200 mg, 0.82 mmol) en CI 2 SO (5 ml_) se mantuvo a temperatura ambiente (1 h). El exceso de CI 2 SO se eliminó por evaporación a vacío coevaporándose sucesivamente con tolueno anhidro. El crudo obtenido fue el cloro derivado 11 que se disolvieron en THF anhidro (15 ml_), se enfrió en un baño de agua-hielo y se Ie adicionaron 9 (353 mg, 1 mmol) y EtβN (0.230 ml_, 1.6 mmol) disueltos en THF anhidro (5 ml_). Se dejó que Ia mezcla de reacción alcanzara Ia temperatura ambiente procediéndose entonces a Ia eliminación del disolvente por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt-MeOH 5:1 ) obteniéndose 14 como un sirope (438 mg, 92%).

EJEMPLO 3.- Síntesis de agentes de etiquetado simple basados en vinil sulfona conteniendo fluoróforos: compuestos 17, 18, 19 y 20.

Compuesto 17: Una disolución de rodamina B (100 mg, 0.2 mmol) en CI2SO (5 ml_) se mantuvo a temperatura ambiente (1 día). El exceso de CI2SO se eliminó por evaporación a vacío coevaporándose sucesivamente con tolueno anhidro. El crudo obtenido fue el cloro derivado 15 que se disolvió en THF anhidro (15 ml_), se Ie adicionó 8 (64 mg, 0.17 mmol) y EtsN (0.050 ml_) disueltos en THF anhidro (5 ml_). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 10 min procediéndose entonces a Ia eliminación del disolvente por evaporación a vacío. El crudo

obtenido se purificó por cromatografía en columna (CH 2 CI 2 -MeOH 30:1 a 10:1 ) obteniéndose 17 como un sirope (64 mg, 44%).

Compuesto 18: A una disolución de cloruro de dansilo 16 (130 mg, 0.48 mmol) en acetonitrilo anhidro (15 ml_) se Ie adicionaron 8 (150 mg, 0.40 mmol) y Et 3 N (0.115 ml_). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente (2 días) procediéndose entonces a Ia eliminación del disolvente por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1 :1 a 3:1 ) obteniéndose 18 como un sirope (182 mg, 74%).

Compuesto 19: Una disolución de rodamina B (195 mg, 0.41 mmol) en POCI 3 (5 ml_) y 1 ,2-dicloroetano (5 ml_) se mantuvo a reflujo (16 h). El exceso de POCI 3 y el disolvente se eliminaron por evaporación a vacío coevaporándose sucesivamente con tolueno anhidro. El crudo obtenido contenía el cloruro de rodamina 15 que fue usado directamente por disolución en THF anhidro (15 ml_). Se enfrió en un baño de agua-hielo y se Ie adicionaron 9 (174 mg, 0.49 mmol) y Et 3 N (0.174 ml_, 1.22 mmol) disueltos en THF anhidro (5 ml_). Se dejó que Ia mezcla de reacción alcanzara Ia temperatura ambiente procediéndose entonces a Ia eliminación del disolvente por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (CI 2 CH 2 -MeOH 20:1 ) obteniéndose 19 como un sólido (272 mg, 86%).

Compuesto 20: A una disolución de cloruro de dansilo 16 (275 mg, 1.0 mmol) en acetonitrilo anhidro (15 ml_) se Ie adicionaron 9 (180 mg, 0.50 mmol) y Et 3 N (0.150 ml_). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente (3 días) procediéndose entonces a Ia eliminación del disolvente por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1 :1 a 3:1 ) obteniéndose 20 como un sirope (252 mg, 84%).

EJEMPLO 4. Etiquetado simple de proteínas con agentes de etiquetado biotinados.

Ejemplo 4.1. Etiquetado de Ia albúmina sérica bovina (BSA) con el compuesto 13.

La albúmina sérica bovina (BSA) comercial (SIGMA A4503) (0.15 mM en agua) se incubó con compuesto 13 (25.1 mM en 1 :1 DMSO:agua) con una estequiometría 1 :5 y 1 :10 durante 3 horas, transcurridas las cuales se eliminó mediante diálisis el exceso de producto 13. Para evaluar si Ia BSA marcada con biotina es reconocida por avidina, se incubó con avidina fluorescente (ejemplo 5.1 ) según las estequiometrías avidina:BSA 4:1 y 1 :1 durante 30 minutos y se analizó mediante SDS-PAGE con desnaturalización suave (2 minutos a 100 0 C). La fluorescencia se visulizó con un transiluminador comercial (λ=365 nm) y Ia proteína se detectó mediante Coomassie (FIG 5). El resultado demuestra que Ia avidina fluorescente del ejemplo 5.1 reconoce a Ia BSA marcada con biotina y forma complejos estables de elevado peso molecular que no entran en el gel separador (14% acrilamida).

Ejemplo 4.2. Etiquetado de Green Fluorescent Protein (GFP) con el compuesto 12.

La proteína GFP se obtuvo a partir de una cepa de E. coli que fue transformada con el plásmido pGFPCR que codifica para Ia variante UV de Ia GFP. Una vez usadas las bacterias, Ia proteína es purificó utilizando una columna IMAC. La proteína purificada (2 mg/ml) se dializó frente a PBS y se incubó con un exceso de 20 veces de reactivo biotinilante 12 (considerando que Ia proteína GFP tiene un peso molecular de 27000). La incubación se mantuvo a 4 0 C durante 12 h y el exceso de reactivo se bloqueó por adición de etanolamina. Esta muestra es dializada posteriormente frente a tampón PBS. La muestra así obtenida se utilizó directamente en una cromatografía de afinidad sobre una columna de biotina-silica (según Ia solicitud de patente española: P200701850) saturada de avidina utilizando un sistema de microfiltro con sólo 100 mg de Ia silica funcionalizada. La elución se realizó con HCI 0.2 N y el eluato, tras ser liofilizado se ha analizado mediante espectrometría MALDI-TOF que muestra valores de peso molecular 14295.1 (monómero de avidina) y 28565 (una molécula de GFP modificada con 4 biotinas).

EJEMPLO 5. Etiquetado simple de proteínas con agentes de etiquetado fluoróforos.

Ejemplo 5.1. Etiquetado de avidina con el compuesto 18.

La avidina comercial (SIGMA A9275) (0.35 mM en agua) se incubó con el compuesto 18 (24.8 mM en 1 :1 DMSO:agua) con una estequiometría 1 :4 y 1 :8 durante 3, 8 y 24 horas en HEPES 50 mM pH 8 y se analizó el resultado en SDS-PAGE. La fluorescencia se visualizó con un transiluminador comercial (λ=365 nm) y Ia proteína se detectó mediante Coomassie (FIG. 1 ). El tiempo óptimo de mareaje fue del orden de 8 horas, aunque con 3 horas de reacción ya se puede detectar Ia fluorescencia. El mareaje es compatible con Ia detección mediante Coomassie y no altera Ia capacidad de Ia avidina marcada para interaccionar con biotina.

Ejemplo 5.2. Etiquetado de Concanavalina A con el compuesto 17.

La concanavalina A comercial (SIGMA L7647) (0.39 mM en agua) se incubó con compuesto 17 (18 mM en 1 :1 DMSO:agua) con una estequiometría 1 :5 y 1 :10 durante 3, 8 y 24 horas en HEPES 50 mM pH 8 y se analizó el resultado en SDS-PAGE (FIG. 2). La fluorescencia se visualizó con un transiluminador comercial (λ=365 nm) y Ia proteína se detectó mediante Coomassie. La fluorescencia fue tan intensa que no se apreciaban diferencias en función del tiempo. Elevadas estequiometrías y tiempos de reacción promovían Ia precipitación de Ia muestra. El mareaje fue compatible con Ia detección mediante Coomassie.

Ejemplo 5.3. Etiquetado previo a electroforesis de BSA y lisozima con rodamina como alternativa a las tinciones con Coomassie o plata de geles de electroforesis.

Se evaluó Ia viabilidad del mareaje fluorescente previo a Ia electroforesis mediante Ia reacción durante 10 minutos a 100 0 C de 33 microgramos de las proteínas modelo albúmina sérica bovina comercial (SIGMA A4503) y lisozima de huevo con 3 microgramos del compuesto 17 en tampón HEPES

120 mM pH 8.8. A continuación se añadieron 100 microlitos de tampón de carga (Tris-HCI 65.8 mM pH 6.8, glicerol 26% (v/v), SDS 2.1 % (v/v), azul de bromofenol 0.01 % (w/v)). Se analizó el resultado en SDS-PAGE (FIG. 3). La fluorescencia se visualizó con un transiluminador comercial (λ=365 nm) y Ia proteína se detectó mediante tinción de plata. El mareaje fue compatible con Ia posterior detección mediante tinción de plata y no alteraba el patrón de migración de ninguna de las dos proteínas. El límite de detección "de visu" es del orden de 125 ng para ambas proteínas.

Ejemplo 5.4. Etiquetado de un extracto crudo de guisante con rodamina como alternativa a las tinciones con Coomassie o plata de geles de electroforesis.

Se marcaron 52 microgramos de un extracto de guisante con 3, 6 y 9 microgramos del compuesto 17 mediante incubación durante 10 minutos a

100 0 C en HEPES 331 mM pH 8.8. A continuación se añadieron 30 microlitros de tampón de carga y se realizó una electroforesis (SDS-PGE)

(FIG 4). El resultado fue el típico de un extracto crudo, confirmando Ia universalidad del mareaje, Ia viabilidad como sistema de mareaje fluorescente previo a Ia electroforesis y Ia compatibilidad con Ia posterior tinción de Coomassie y/o plata.