技术领域 本发明属于分子生物学技术领域， 具体涉及一类由 5个氨基酸组成的小肽， 尤其涉 及一类由 5个氨基酸为核心序列的具有抗血小板聚集、 抗血栓形成作用的小肽衍生物及 其应用。

背景技术 血栓形成是多种心脑血管疾病共同的病理过程 ， 包括心脑血管性血栓性栓塞、 肺栓 塞和深静脉血栓形成等， 是指在一定条件下， 血液有形成分在血管 （多数为小血管） 形 成栓子， 造成血管部分或完全堵塞、 相应部位血供障碍的病理过程而形成的一系列 综合 征。 随着社会的发展和人口老龄化的进程， 血栓性疾病的发病率逐年增加。 据世界卫生 组织统计， 全球每年有 1500万人死于血栓性疾病。据统计， 我国每年的发病人数有 1000 万， 病死人数有 100万， 致残率也很高。 血栓性疾病已经占据全球疾病总死亡率的第一 位。 提高血栓性疾病的防治水平， 减少其发病率， 降低致残率、 死亡率， 降低由此而产 生的社会问题， 已成为当务之急。

血栓形成主要有动脉血栓形成和静脉血栓形成 两种。大部分心肌梗死及 80%的中风是 由于动脉血栓形成引起， 而心血管疾病引起死亡的病因中， 静脉血栓栓塞位列第三位。 一般说来， 以血小板为靶点的药物用于治疗动脉血栓， 而以凝血因子为靶点的药物对治 疗静脉血栓有显著优势。 抗血小板药物， 维生素 K拮抗剂， 肝素及低分子量肝素是用于 防治血栓形成最常用的药物。 但是， 这些药物的安全性、 有效性使其临床应用受到很大 的限制。 例如， 抗血小板药物阿司匹林 (aspirin)、 氯吡格雷（clopidogrel)、 噻氯匹定 (Prasugrel)等， GPI Ibl l la抑制剂阿昔单抗（abciximab)、伊替巴肽 ( eptif ibatide )等 在抑制血小板聚集和血栓素 A2合成的同时， 具有胃肠道刺激和出血倾向等不良反应。 而 肝素的抗凝效应具有很大的个体差异， 必需密切监控出凝血时间。 此外， 不良反应血小 板减少症虽然少见却可严重威胁病人生命， 进一步限制了肝素和低分子量肝素在临床的 使用。 维生素 K拮抗剂具有更多的局限性， 诸如与其他药物的相互作用以及反应性的个 体差异。 因此， 研究开发新的高效低毒的抗血栓药物具有十分 重要的临床意义。

血小板参与血液凝固的过程并在血栓形成的启 动和扩大中起着十分重要的作用。 当 血管内皮损伤， 内皮下大分子物质如胶原和凝血酶暴露， 血小板可粘附其上， 进一步引 发血小板聚集和血小板颗粒内容物的释放。 多种血小板激活剂， 如 ADP, 凝血酶和 5-羟 色胺等加强血小板反应性。血小板活化后， 血小板 P选择素和 GPI Ib/I I Ia活性位点的暴 露， 促进血小板和白细胞募集， 而使血栓进一步扩大。 随机设计的大型临床实验已证明 血小板是心脑血管疾病的治疗靶点， 通过抑制血小板反应性可显著改善急性冠脉综 合征 和经皮血管再通术病人的愈后。 但是， 由于现有的抗血小板药物存在着出血并发症、 血 小板减少症和药物抵抗等不良反应， 新型抗血小板药物仍然是目前的研究重点。

通过前期大量的活性筛选， 首次发现了由 5个氨基酸组成的核心小肽序列具有抗血 小板聚集、 抗体内血栓形成作用。

发明内容 解决的技术问题： 本发明提供一种小肽， 可抑制血栓形成和血小板聚集。 可用于制 备抗血栓和血小板聚集的药物。

技术方案：一种抗血栓和血小板聚集的小肽， 序列为： X-Arg-Y-X-Lys(X-精氨酸 -Y-X- 赖氨酸）， 其中， X为非极性氨基酸， 所述非极性氨基酸包括丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 脯氨酸或苯丙氨酸； Y代表极性氨基酸， 所述极性氨基酸为甘氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸、 半胱氨酸、 酪氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 天冬氨酸或谷氨酸。

上述结构组成核心序列的任意位置用有机物或 无机物进行修饰所产生的系列衍生 物。

上述结构组成核心序列的上游和 /或下游添加任意 广 5 个氨基酸序列所产生的衍生 物。

用上述结构的小肽及其衍生物单独或组合使用 作为其它药物的辅料或添加剂。

一种抗血栓和血小板聚集的小肽， 优选序列为： lie Arg Thr Pro Lys。

上述蛋白质在制备抗血栓形成和血小板聚集药 物中的应用。

有益效果： 通过体外血小板聚集试验、 体内血栓形成试验表明， 该小肽能以浓度依 赖的方式抑制血小板聚集； 同时， 可明显抑制大鼠体内动静脉旁路血栓的形成。 该小肽 及其衍生物可以用于抗血小板聚集、 抗血栓形成治疗。 综上， 该小肽可用于制备抗血栓 和血小板聚集的药物。

附图说明 图 1. HPLC法分析纯度；

图 2. LC/MS确定分子量；

图 3. 对血小板聚集的抑制作用。

具体实施方式

实施例 1

小肽的固相合成

以 FM0C (9-芴甲氧羰基） 为保护基团进行固相合成， 用 95 % (v/v) 三氟乙酸、 2. 5 % (v/v)水和 2. 5 % (v/v)三异丙甲硅烷（ TIA) 将其从树脂上裂解。 用乙醚沉淀 3次后， 通 过反相高效液相色谱（RP-HPLC)纯化多肽， 以含 0. 05 % (v/v)三氟乙酸的 0 %〜 60 % (v/v) 乙腈为流动相， 3 mL/ min 的流速进行梯度洗脱。 洗脱后样品进行冷冻干燥， 以高效液 相色谱法（HPLC)鉴定纯度为 95% (图 1 )，用液-质联用分析仪（LC-MS)确定分子量为 613. 76 (图 2)， 与理论分子量一致。

实施例 2

体外抗血小板聚集实验

人肘静脉穿刺抽血， 用 ACD液 (9:1) (v/v) 抗凝， 150 g离心 8 min， 吸取富血小板血 浆， 再以 650 g离心 10 min; 弃去上清液， 加入含 lg/L的牛血清白蛋白的羟乙基哌嗪乙磺 酸 (HEPES)缓冲液吹散沉淀， 调整血小板数至（200〜300) X 109 I L, 每次测试取 300 μ L, 加入不同浓度的小肽 10 L ((Γ2.0 mmol/L), 最后加入诱导剂二磷酸腺苷 （美国 Sigma-Aldrich公司） 15 μ L至终浓度 5 μ mol/L; 在 LBY-NJ4血小板凝集仪 （北京普利生） 上连续测定 60s， 180s, 300s, 及最大血小板聚集率 （RPA); 实验重复 3次； 同时计算血 小板聚集抑制率{抑制率 =[1_(RPA未加药 -RPA加药后）/RPA未加药] X 100%}。 结果显示， 随小肽 （IRTPK) 浓度的增加， 60s、 180s, 300s及最大血小板聚集率 （Max) 逐渐减小， 呈浓度依赖特性； IC50约为 1 mmol/L (图 3)。

在小肽 N端或 C端修饰 H2N-(CH2)7【即 H2N- (CH2) 7_ IRTPK和 IRTPK- (CH2) 7_應】 (由 上海科肽公司合成）， 用上述相同方法考察修饰产物对血小板聚集的 影响， 结果显示， 修 饰物对 60s、 180s, 300s及最大血小板聚集率 （Max) 的影响与核心序列一致。

在小肽 C端修饰氨基 （gpiRTPK-H2N) (由上海科肽公司合成）， 用上述相同方法考察 修饰产物对血小板聚集的影响，结果显示，对 60s、 180s, 300s及最大血小板聚集率（Max) 的影响与核心序列一致。

在小肽 N端或 C端修饰磷酸基团 （gPp-IRTPK和 IRTPK-p) (由上海科肽公司合成）， 用 上述相同方法考察修饰产物对血小板聚集的影 响， 结果显示， 对 60s、 180s、 300s及最大 血小板聚集率 （Max) 的影响与核心序列一致。

在小肽 N端和 C端修饰氨基酸序列 ISKPI (即 ISKPIIRTPK和 IRTPKISKPI) (由上海科肽 公司合成），用上述相同方法考察修饰产物对 血小板聚集的影响，结果显示，对 60s、 180s, 300s及最大血小板聚集率 （Max) 的影响与核心序列一致。

实施例 3

小肽单独使用或与阿司匹林合用对大鼠动静脉 旁路血栓形成的影响

(1) 实验动物： 雄性 SD大鼠 15只， 体重 250 - 280 g, 购自浙江省实验动物中心， 动物许可证号为 SCXK (浙） 2008-0033。

(2) 实验过程： 将大鼠随机分为 8组， 每组 3只， 分别为空白对照组 （给予等体积 的生理盐水）， 阳性药对照阿司匹林组 (Sigma, 10mg/kg), 低、 中、 高剂量小肽 (IRTPK) 组（0.65， 1.3， 2.6mg/kg)及低、中、高剂量与阿司匹林合用（10m _g /k _g 阿司匹林 +0.65， 1. 3， 2. 6 mg/kg小肽） 组。 给药容积为 0. 5 mL/100 g， 除阿司匹林组灌胃给药外， 其余 组均股静脉注射给药。手术前，在三段聚乙烯 管的中段放入一根长 5 cm的 1号手术丝线， 丝线两端各多出 0. 5 cm固定于两端聚乙烯管外， 将生理盐水溶液充满聚乙烯管， 作为插 管。 大鼠给予阿司匹林 l h后， 其他组给药 5 min后， 用 20% ( v/v) 乌拉坦按 lg/kg麻 醉， 颈部正中切口， 分离右侧颈总动脉及左颈外静脉， 将聚乙烯管一端插入右侧颈总动 脉， 另一端插入左颈外静脉， 打开动脉夹， 血液从右颈总动脉经聚乙烯管返回左颈外静 脉。 开放血流 15 min后停止， 迅速取出丝线， 用滤纸吸取血栓表面的血液， 精确称重， 总重量减去丝线重量， 即为血栓湿重。 以 t检验同生理盐水组进行比较， 同时计算出血 栓抑制率。

血栓抑制率 （％ ) = 血栓湿重 （生理盐水组）一血栓湿重 （试验组）

χ100

血栓湿重 （生理盐水组）

结果发现， 除了低剂量组， 阳性药阿司匹林、 高、 中剂量小肽组及阿司匹林与小 肽合用组能使血栓湿重显著下降， 与生理盐水组比较， 差异显著 （ P 〈0. 05) (表 1 ); 且剂量与血栓形成抑制率呈明显正相关 （r= 0. 997 ; P〈0. 05)。 表 1 对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响 （n=3)

*与生理盐水组比较， P〈0. 05