L'invention est relative à des compositions comprenant du minoxidil, utiles notamment pour lutter contre la chute des cheveux. En particulier, l'invention concerne de nouvelles compositions se présentant sous la forme d'une suspension aqueuse de nanoparticules lipidiques solides renfermant du minoxidil, leur procédé de préparation, ainsi que leur utilisation pour lutter contre la chute des cheveux et/ou favoriser leur repousse.

Le minoxidil ou 6-(l-pipéridinyl)-2,4-diamine-3-oxide pyrimidine (CAS : 38304-91-5) de formule :

est notamment utilisé, sous la forme de composition pour application topique sur le cuir chevelu, dans le but d'arrêter la chute des cheveux et de permettre leur repousse. Plusieurs compositions topiques du minoxidil ont déjà fait l'objet d'une commercialisation.

Le minoxidil est connu pour sa solubilité très faible en milieu aqueux. Dans certaines des compositions jusqu'à ce jour développées, le minoxidil est associé à un solvant ou mélange de solvants peu polaires, tel que le propylène glycol, afin d'améliorer sa solvatation et donc sa pénétration vers le bulbe pileux.

Cependant, ces solvants confèrent un caractère gras et non esthétique au cheveu, rendant de telles compositions difficiles à utiliser, car leur usage sur le cuir chevelu est très désagréable. De plus, le propylène glycol est connu pour un effet sensibilisant sur les muqueuses. Il a donc été envisagé de mettre en œuvre des solutions hydro-alcoolique permettant de limiter l'utilisation de propylèneglycol. Néanmoins, l'utilisation de solutions hydroalcoolique contenant de l'éthanol est bien souvent responsable d'intolérances cutanées, se manifestant notamment sous différentes formes tels que irritations ou acné et augmente, ainsi, le nombre d'échecs au traitement.

Récemment, ont été proposées des solutions dans lesquelles le minoxidil est encapsulé sous forme moléculaire dans des liposomes ou des niosomes, c'est-à-dire des vésicules de surfactant non chargé (Journal of drug targeting, 23007, vol.15, issue, 2, p 101-108). Néanmoins, de telles techniques ne permettent pas d'atteindre des taux d'encapsulation en minoxidil satisfaisant et, de plus, la faible stabilité des compositions obtenues est problématique.

La publication de A. C. Silva et al. dans Pharmazie, 2009, 64, 3, 177- 182 décrit, quant à elle, une suspension aqueuse de véhicules lipidiques nanostructurés (nommés NLC) et un hydrogel obtenu à partir d'une telle suspension comprenant un mélange d'acide stéarique et d'acide oléique, du poloxamer 188, 0,3% en masse de minoxidil et du carbopol 940 ou du perfluorocarbone (PFC). Ce type de formulation, du fait de la présence d'acide stéarique et d'acide oléique sont irritantes lorsqu'elles sont appliquées de manière cutanée. De plus, ces NLC sont formées, à température ambiante, d'une matrice lipidique composée de lipides solides et liquides en proportion variable. De telles formulations ne permettent pas d'encapsuler des taux de minoxidil, notamment de l'ordre de 3 à 4%.

La présente invention s'intéresse à la mise au point de compositions de minoxidil dans lesquelles le minoxidil va être dispersé au sein de nanoparticules lipidiques solides appelées classiquement SLN. Les nanoparticules appartiennent à une famille de vecteurs colloïdaux utilisables, par exempte, pour l'administration de principes actifs, telles que des molécules thérapeutiques chez l'homme ou l'animal. De tels vecteurs colloïdaux préservent ces principes actifs et peuvent permettre leur libération contrôlée et/ou prolongée au niveau de leur site d'action. La demande de brevet WO 99/39700 (D2) décrit des compositions pharmaceutiques sous la forme de nanoparticules solides comprenant un matériau composite qui consiste en au moins une substance lipidique et au moins une substance amphiphile et un principe actif pharmaceutique hydrosoluble, hyposoluble ou peu soluble. Le minoxidil est cité parmi un grand nombre de principes actifs, mais aucun des exemples ne porte sur des formulations à base de minoxidil. De plus, les exemples donnés dans ce document avec d'autres principes actifs contiennent de l'acide stéarique et donc poseraient les mêmes types de problème que ceux mentionnés précédemment pour la publication de A. C. Silva et al.

Aussi, un des objectifs de l'invention est de proposer des compositions à base de nanoparticules lipidiques solides contenant du minoxidil, qui soient stables et faciles à préparer, et ce à moindre coût. Un autre objectif de l'invention est de fournir des compositions à base de minoxidil qui soient adaptées à une application topique. Aussi, l'invention se propose de fournir des compositions conduisant à une pénétration satisfaisante dans la peau du minoxidil, notamment par rapport aux compositions commerciales existantes à base d'éthanol. L'invention vise également des compositions qui pourront permettre de moduler la libération du minoxidil.

Un autre objectif de l'invention est de fournir des compositions qui soient bien tolérées pour une application topique et qui notamment ne nécessitent pas la présence d'alcool tel que d'éthanol ou du moins contienne au plus 2% en masse d'éthanol.

Dans ce contexte, la présente invention concerne une suspension de nanoparticules lipidiques solides dans une phase aqueuse dans laquelle : les nanoparticules lipidiques solides encapsulent du minoxidil dans une matrice lipidique, et comprennent, en outre, au moins un composé amphiphile Al choisi parmi les phospholipides, et en particulier parmi les phosphatidylcholines et les lécithines, du propylène glycol, un ou plusieurs surfactants et éventuellement de l'éthanol, la phase aqueuse contient de l'eau, du propylène glycol et éventuellement de l'éthanol.

Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet des nanoparticules lipidiques solides encapsulant du minoxidil dans une matrice lipidique, et comprenant, en outre, au moins un composé amphiphile Al choisi parmi les phospholipides, et en particulier parmi les phosphatidylcholines et les lécithines, du propylène glycol, un ou plusieurs surfactants et éventuellement de l'éthanol. L'invention a également pour objet des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques comprenant de telles suspensions ou de telles nanoparticules lipidiques solides.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'une suspension selon l'invention comprenant les étapes suivantes : - obtention d'un mélange du composé amphiphile Al choisi parmi les phospholipides, et en particulier parmi les phosphatidylcholines et les lécithines, avec le propylène glycol, le ou les surfactants, le minoxidil et la matrice lipidique maintenue à une température supérieure à sa température de fusion, et, éventuellement l'éthanol, émulsification du mélange obtenu dans de l'eau, solidification des nanoparticules lipidiques obtenues, par refroidissement.

L'invention concerne également un procédé de préparation de nanoparticules solides selon l'invention comprenant, en plus des étapes ci- dessus, une étape de lyophilisation.

Certaines définitions de termes utilisés dans le cadre de la description de l'invention sont données ci-après.

Par nanoparticules lipidiques « solides », on entend des nanoparticules qui se trouvent à l'état solide, au moins à une température proche de la température ambiante, notamment à une température comprise dans la gamme allant de 10 à 30 ⁰ C. De telles nanoparticules sont entièrement solides dans cette gamme de température : elles ne comportent pas de lipides liquides comme les NLC. Le HLB (de l'anglais « hydrophilic lipophilic balance ») du surfactant ou du mélange de surfactants sera déterminé par la méthode de Griffin. (Griffin WC: Classification of Surface-Active Agents by ¹ HLB,' Journal of the Society of Cosmβtic Chemists 1 (1949): 311. Griffin WC: Calculation of HLB Values of Non-Ionic Surfactants, Journal of the Society ofCosmetic Chemists 5 (1954): 259).

Le diamètre des nanoparticules lipidiques solides, qui correspond au diamètre moyen pondérée par l'intensité lumineuse diffusée des nanoparticules, sera déterminé, directement sur les suspensions après dilution dans l'eau, par spectroscopie de corrélation de photons, par exemple à l'aide d'un appareil Zêtamaster® de Malvern. Par nanoparticules, on entend des particules de forme sensiblement sphérique, de diamètre inférieur ou égal à 500 nm. En particulier, les nanoparticules lipidiques solides selon l'invention présentent un diamètre compris dans la gamme allant de 100 à 500 nm, de préférence dans la gamme allant de 150 à 300 nm.

L'indice de polydispersité est la largeur de la distribution, c'est-à-dire l'équivalent de la variance sur une distribution log-normale, calculé directement par l'appareil Zêtamaster®. Ce paramètre indique la largeur de distribution d'une suspension de nanoparticules. Si la valeur est comprise entre 0,000 et 0,003 l'échantillon est dit monodisperse ; de 0,03 à 0,08 l'échantillon est dit presque monodisperse ; de 0,08 à 0,50 l'échantillon est dit polydisperse ; et supérieur à 0,5 l'échantillon est dit très polydisperse. Les supensions selon l'invention présente, de préférence, un indice de polydispersité de 0,00 à 0,50.

La suspension selon l'invention comprend différents constituants : une phase dispersée qui correspond aux nanoparticules lipidiques solides dans lesquelles se trouve le minoxidil, solubilisé dans les lipides grâce au composé amphiphile Al, au propylène glycol, au(x) surfactant(s) et à l'éthanol éventuellement présent, une phase aqueuse comprenant de l'eau, du propylène glycol, et éventuellement de l'éthanol. Une telle suspension présente avantageusement un pH proche de la neutralité et proche du pH de la peau, c'est-à-dire entre 5 et 7. Les pourcentages donnés dans le reste de la description sont des pourcentages en masse. Lorsque les pourcentages sont relatifs à la suspension, les pourcentages sont donnés par rapport à la masse totale de la suspension aqueuse. Par contre, lorsque les pourcentages sont relatifs aux nanoparticules lipidiques solides, les pourcentages sont donnés par rapport à la masse totale des nanoparticules lipidiques solides seules.

Selon une caractéristique essentielle de l'invention, les nanoparticules lipidiques solides comprennent un composé amphiphile Al qui va permettre de solubiliser le minoxidil dans la matrice lipidique. Ce composé amphiphile Al est choisi parmi les phospholipides, et en particulier parmi les phosphatidylcholines et les lécithines. Les lécithines correspondent à des phospholipides extraits du vivant, telle que la lécithine de soja, comprenant une part importante de phosphatidylcholines. Selon un mode de réalisation particulier, le composé amphiphile Al comprend de la lécithine de soja ou est constitué exclusivement de lécithine de soja. La lécithine de soja utilisée est, de préférence, constituée majoritairement de phosphatidylcholines (c'est-à-dire que les phosphatidylcholines représentent plus de 50 % en masse de la lécithine de soja utilisée). On pourra par exemple utiliser de la lécithine de soja, notamment commercialisée sous la marque Phospholipon®. La suspension aqueuse pourra, par exemple, comprendre de 1 à 10%, de préférence de 1,5 à 5% en masse de composé amphiphile Al. De même, les nanoparticules lipidiques solides pourront, par exemple, comprendre de 1 à 20%, de préférence de 5 à 15% en masse de composé amphiphile Al. La matrice lipidique sera choisie pour être compatible avec une administration chez l'homme ou l'animal et sera, notamment, choisie parmi les lipides non toxiques. Selon un mode de réalisation de l'invention, la matrice lipidique comprend au moins un lipide Ll choisi parmi les mono-, di- et triglycérides. Selon un autre mode de réalisation pouvant être combiné au précédent, la matrice lipidique ne comprend pas d'acide stéarique. La matrice lipidique pourra être constituée exclusivement de mono-, di- et triglycérides. Par exemple, le lipide Ll pourra être un mélange de triglycérides en Cn-Cis- Le Suppocire® est un exemple de triglycéride en Ci ₂ -Ci ₈ - La suspension pourra, par exemple, comprendre de 5 à 30 %, de préférence de 5 à 15 % en masse de lipide Ll. De même, les nanoparticules lipidiques solides pourront, par exemple, comprendre de 35 à 80%, de préférence de 35 à 55% en masse de lipide Ll.

La suspension selon l'invention comprend du propylène glycol partagé entre les nanoparticules lipidiques solides et la phase aqueuse. En fait, au cours du procédé de fabrication, qui sera détaillé dans la suite de la description, le propylène glycol se trouve dans le mélange lipidique qui est sous forme liquide. A la fin du procédé, lorsque il y a solidification des nanoparticules, il est partagé entre la phase aqueuse et les nanoparticules lipidiques solides, suivant son coefficient de partage îogP=-l,34. Selon une caractéristique avantageuse, la suspension comprend de 1 à 10 %, de préférence de 1 à 5 % en masse de propylène glycol. De même, les nanoparticules lipidiques solides pourront, par exemple, comprendre de 0,1 à 2%, de préférence de 0,1 à 0,75% en masse de propylène glycol.

Par rapport à des compositions de type lotions qui utiliseraient des associations alcool/polyalcool, tel que éthanol/polyéthylène glycol, les suspensions ou nanoparticules selon l'invention, lorsqu'elles ne sont pas utilisées sous la forme d'une suspension aqueuse, de par la présence de l'ensemble des constituants sélectionnés, permettent, dans des modes de réalisation préférés, d'utiliser une quantité beaucoup plus faible de propylène glycol, ce qui permet notamment d'avoir une composition beaucoup plus agréable à utiliser dans le cas d'une application directe sur les cheveux. La phase aqueuse dans laquelle les nanoparticules lipidiques sont dispersées, lorsqu'elles se trouvent sous la forme d'une suspension aqueuse, comprend de l'eau, en plus du propylène glycol partagé entre la phase aqueuse et les nanoparticules. La composition comprend, par exemple, de 50 à 90 %, de préférence de 65 à 75 % en masse d'eau. De façon avantageuse, la phase aqueuse de la suspension est constituée, essentiellement d'eau et de propylène glycol. A titre d'exemple, une suspension selon l'invention pourra contenir une quantité faible d'éthanol correspondant à 0,1 à 2% en masse de la composition et, de préférence, de 0,1 à 0,5%. L'éthanol se trouve partagé entre la phase aqueuse et les nanoparticules lipidiques solides. Aussi, les nanoparticules lipidiques solides pourront, par exemple, comprendre de 0,1 à 1,5%, de préférence de 0,1 à 0,75% en masse d'éthanol.

Les nanoparticules lipidiques solides selon l'invention contiennent, en outre, un ou plusieurs surfactants qui permettent d'émulsionner la partie lipidique dans l'eau, lors de leur préparation sous la forme d'une suspension et assurent également la stabilité de la suspension obtenue, une fois que la matrice lipidique s'est solidifiée. A titre d'exemple, le(s) surfactant(s) est(sont) choisi(s) parmi les esters d'acides gras et de sorbitan et les esters d'acides gras et de sorbitan polyoxyéthyléné. A titre d'exemple de tels surfactants, on peut citer le Montanox®, le Montane®, Tween® et Span®. De façon avantageuse, le(s) surfactant(s) présente(nt) un HLB compris dans la gamme allant de 7,0 à 11,0, de préférence de 8,5 à 9,5. De telles valeurs de HLB permettent d'améliorer la stabilité de la suspension aqueuse. Une suspension selon l'invention comprendra, par exemple, de 1 à 15 %, de préférence de 8 à 12 % en masse de surfactant(s). De même, les nanoparticules lipidiques solides pourront, par exemple, comprendre de 5 à 45%, de préférence de 10 à 30% en masse de surfactant(s).

Enfin, une suspension selon l'invention contient, par exemple, de 0,1 à 10 % et de préférence de 3 à 7 % en masse de minoxidil, ce qui rend compatible son utilisation dans des compositions pharmaceutiques selon l'invention. Les nanoparticules lipidiques solides comprennent donc de 1 à 30 %, de préférence de 15 à 29 % en masse de minoxidil. Les nanoparticules lipidiques solides pourront également contenir un ou plusieurs conservateurs classiquement utilisés pour ce genre d'applications.

Par ailleurs, il a été constaté qu'à basse température (< 13 ⁰ C) les suspensions selon l'invention avaient tendance à prendre en masse. Aussi, les suspensions selon l'invention contiennent de façon avantageuse un agent cryoprotecteur et, en particulier du NaCI, qui n'a pas d'effet irritant. Notamment, les suspensions selon l'invention contiennent de 0,1 à 5% et de préférence de 0,5 à 2% en masse de NaCI.

La préparation des suspensions selon l'invention s'effectue par mélange des différents constituants. En particulier, on pourra opérer de la façon suivante : obtention d'un mélange du composé amphiphile A1 , du propylène glycol, du ou des surfactants, du minoxidil, de la matrice lipidique maintenue à une température supérieure à sa température de fusion, et éventuellement de l'éthanol, - émulsification du mélange obtenu dans de l'eau, solidification des nanoparticules lipidiques obtenues, par refroidissement.

L'introduction du composé amphiphile A1 , du propylène glycol, du ou des surfactants, du minoxidil et éventuellement de l'éthanol dans la matrice lipidique peut être effectuée simultanément. Il est également possible que leur introduction soit faite de manière séquencée. Par exemple, on pourra tout d'abord additionnée, le composé amphiphile A1, le propylène glycol, le ou les surfactants, et l'éthanol, lorsqu'il est présent, simultanément, à la matrice lipidique en fusion, puis additionner le minoxidil tout en maintenant la matrice lipidique à une température supérieure à sa température de fusion (par exemple supérieure de 5 à 10 ⁰ C pour éviter toute dégradation) et en effectuant une homogénéisation du mélange, au moyen d'une technique appropriée, par exemple au moyen d'un agitateur mécanique à hélice ou à pales. L'eau pourra alors être additionnée au mélange obtenu, maintenu à une température supérieure à la température de fusion de la matrice lipidique. De façon avantageuse, l'eau additionnée sera également à une température supérieure à la température de fusion de la matrice lipidique, afin d'éviter la solidification de celle-ci dès l'addition de l'eau. Au lieu d'additionner l'eau sur le mélange contenant les autres constituants, il est également possible de procéder de manière inverse.

Lorsque la suspension contient du NaCI, celui-ci est, par exemple, additionné en dernier. Selon un mode de réalisation de l'invention, le mélange avec l'eau est réalisé sous agitation, au moyen d'une technique appropriée, par exemple au moyen d'un agitateur mécanique à hélice ou à pales. Ensuite, la distribution resserrée en taille des nanoparticules lipidiques solides de la suspension est obtenue soit directement sur l'émulsion et donc à chaud, soit après solidification, sur les nanoparticules. En effet, une étape d'homogénéisation est réalisée, soit sous agitation à haute vitesse et à chaud, par exemple avec un agitateur à turbine tel qu'un ultra-Turrax®, soit avec un homogénéisateur haute pression tel qu'un Emulsiflex, à chaud, ou à température ambiante. Les nanoparticules lipidiques solides selon l'invention sont ainsi obtenues en suspension aqueuse qui se présente sous la forme d'un mélange homogène. Les nanoparticules lipidiques solides se présentent sous la forme d'une matrice solide relativement homogène, dans laquelle le minoxidil est distribué : on dit que le minoxidil est encapsulé dans les nanoparticules lipidiques solides, bien que ces dernières ne se présentent pas sous la forme d'une capsule à structure cœur/membrane. La concentration en minoxidil, notamment, pourra être adaptée, en fonction de l'application visée et, notamment, du mode d'administration choisi. En fonction de la viscosité de la suspension, les nanoparticules lipidiques solides auront plus ou moins tendance à sédimenter. La composition selon l'invention confère au minoxidil, une protection lors de son stockage, ainsi que lors son transport vers son site d'action. Ces nanoparticules lipidiques solides sont donc tout à fait appropriées pour être utilisées comme système colloïdal de vectorisation du minoxidil. Les compositions selon l'invention, pourront notamment être administrées par voie entérale, parentérale, ou de préférence topique.

Il est également possible de lyophiliser, la suspension aqueuse de nanoparticules obtenues, par toute technique connue. Une telle composition lyophilisée pourra être directement utilisée ou redispersée dans une phase aqueuse pour conduire à la composition désirée, en fonction du mode d'administration envisagé. Il est, par exemple, possible d'utiliser les nanoparticules lipidiques solides sous la forme d'une poudre formulée en aérosol avec un gaz vecteur approprié, jouant le rôle de phase dispersante. Les compositions selon l'invention permettent d'obtenir une meilleure pénétration dans la peau du minoxidil, notamment par rapport aux compositions commerciales existantes à base d'une grande quantité d'éthanol. Cette propriété est particulièrement avantageuse car elle permet au minoxidil de gagner plus facilement son site d'action.

De plus, du fait de la combinaison des différents composants utilisés, il est possible d'utiliser des quantités réduites de propylène glycol et d'éthanol, lorsqu'il est présent, ce qui rend leur utilisation sur les muqueuses et le cuir chevelu, mieux tolérée. En effet, une réduction de la quantité de propyiène glycol, par rapport aux formulations existantes permet de diminuer le pouvoir sensibilisant des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques contenant de telles suspensions ou nanoparticules lipidiques solides.

Les compositions selon l'invention pourront également permettre de moduler la libération du minoxidil. Aussi, les suspensions et nanoparticules lipidiques solides selon l'invention pourront être utilisées pour lutter contre la chute des cheveux et/ou favoriser leur repousse, sous la forme de composition cosmétique ou pharmaceutique. Notamment, elles pourront se trouver, sous une forme adaptée à une application topique, par exemple sous la forme de crème, gel, solution, aérosol ou toute autre forme adaptée à une application topique. De telles compositions selon l'invention pourront être utilisées pour le traitement de l'alopécie, notamment en favorisant la pousse des cheveux.

L'exemple ci-après permet d'illustrer l'invention, mais n'a aucun caractère limitatif. EXEMPLE 1 a) La composition qualitative et quantitative de la suspension aqueuse de nanoparticules lipidiques solides (nommées SLN de l'anglais « solid lipid nanoparticles ») chargées en minoxidil est donnée ci-dessous : Suppocire® 5 g Phospholipon® 1,5 g

Minoxidil (cas #38304-91-5) 2,5 g

Propylène Glycol (cas #57-55-6) 0,85g Montanox® 20 (cas #9005-64-5) 2 g

Montane® 80 (cas #1338-43-8) 3 g

Eau purifiée (cas #7732-18-5) 35,1 g

Ethanol (cas # 64-17-5) 0,05g Dans une première étape, le Suppocire® est fondu à 40 ⁰ C dans un bêcher. La Phospholipon ®, le propylène glycol, le Montanox® 20 l'éthanol et le Montane® 80 sont mélangés avec le Suppocire® fondu, sous agitation (25rpm), pendant 20 min, à 40 ⁰ C. Le minoxidil est ajouté dans ce bêcher. Ce mélange est laissé sous agitation (25 rpm), pendant 12 heures, à 4O ⁰ C. L'eau purifiée est chauffée à 40 ⁰ C puis ajouté au mélange sous agitation (60 rpm). L'agitation est maintenue jusqu'à ce que la température du mélange soit descendue à 2O ⁰ C. Enfin, le mélange est passé à l'homogénéiseur haute pression (5 passages à 100000 kPa).

La taille des SLN, déterminés à l'aide d'un Zetamaster® S, est de 200 nm. La concentration de minoxidil dans la suspension a été déterminée par chromatographie liquide haute performance et est de 4,67% en masse. Le pH de cette suspension est de 6,5. b) Selon une autre variante de réalisation, après ajout de l'eau purifiée, le mélange, à 40 ⁰ C, est passé à l'homogénéiseur haute pression (5 passages à 100000 kPa). En sortie d'homogénéiseur, le mélange est conservé sous agitation (60 rpm) dans un bêcher. L'agitation est maintenue jusqu'à ce que la température du mélange soit descendue à 2O ⁰ C. La taille des SLN obtenue et le rendement en minoxidil sont identiques. c) Selon une autre variante de réalisation, dans une première étape, le Suppocire® est fondu à 40 ⁰ C dans un bêcher. La Phospholipon®, le propylène glycol, le Montanox® 20 et le Montane® 80 sont mélangés avec le Suppocire® fondu, sous agitation (30 rpm), pendant 20 min, à 40 ⁰ C. Le minoxidil est ajouté dans ce bêcher. Ce mélange est laissé sous agitation (30 rpm), pendant 12 heures, à 40 ⁰ C. L'eau purifiée est chauffée à 40 ⁰ C puis ajouté au mélange sous agitation avec une turbine (10000 rpm). L'agitation est maintenue jusqu'à ce que la température du mélange soit descendue à 20 ⁰ C. La taille des SLN obtenue est alors de 300 nm, par contre, le rendement en minoxidil reste inchangé.

EXEMPLE 2 a) La composition qualitative et quantitative de la suspension aqueuse de nanoparticules lipidiques solides (nommées SLN de l'anglais « solid lipid nanoparticles ») chargées en minoxidil est donnée ci-dessous : Suppocire® 5 g

Phospholipon® 1,5 g Minoxidil (cas #38304-91-5) 2,5 g

Propylène Glycol (cas #57-55-6) 0,85g

Montanox® 20 (cas #9005-64-5) 2 g

Montane® 80 (cas #1338-43-8) 3 g

Eau purifiée (cas #7732-18-5) 34.65 g NaCI (cas #7647-14-5) 0,45g

Ethanot (cas # 64-17-5) 0,05g

Dans une première étape, le Suppocire® est fondu à 40 ⁰ C dans un bêcher. La Phospholipon ®, le propylène glycol, le Montanox® 20, l'éthanol et le Montane® 80 sont mélangés avec le Suppocire® fondu, sous agitation (25rpm), pendant 20 min, à 4O ⁰ C. Le minoxidil est ajouté dans ce bêcher. Ce mélange est laissé sous agitation (25 rpm), pendant 12 heures, à 4O ⁰ C. Le NaCI est dissous dans l'eau purifiée. Le mélange est chauffé à 4O ⁰ C, puis ajouté au mélange de lipides sous agitation (60 rpm). L'agitation est maintenue pendant lheure, à 40 ⁰ C. Enfin, le mélange est passé à l'homogénéiseur haute pression (5 passages à 100000 kPa). b) Selon une autre variante, après agitation (25 rpm), pendant 12 heures, à 4O ⁰ C du mélange contenant le Suppocire®, la Phospholipon ®, le propylène glycol, le Montanox® 20, l'éthanol, le Montane® 80 et le minoxidil, l'eau purifiée est chauffée à 40 ⁰ C puis ajouté au mélange sous agitation (60 rpm). L'agitation est maintenue pendant lheure, à 4O ⁰ C. Enfin, le mélange est passé à l'homogénéiseur haute pression (5 passages à 100000 kPa). Le NaCI est ajouté dans la suspension de SLN sous agitation magnétique (50rpm). L'agitation est maintenant pendant 30 min.

La stabilité des formulations avec et sans NaCI a été étudiée selon un test de rhéologie en boucle (avec une géométrie à cylindres coaxiaux) : départ à 25°C, descente jusqu'à 1O ⁰ C, puis remontée jusqu'à 25°C taux de cisaillement constant 10s ^"1

Les résultats sont présentés sur la Figure unique.

Résultats de tolérance = résultats des tests de corrosivité :

Le principe de l'étude est d'évaluer le potentiel corrosif des formulations par une méthode ex-vivo. La corrosivité est déterminée sur de la peau d'oreille de porc. Pour valider la méthode, un témoin négatif et un témoin positif sont réalisés dans les mêmes conditions.

La surface cutanée est traitée par la formulation à tester pendant 15 minutes. A l'issue du traitement la formulation est éliminée de la surface cutanée. Une solution de Sulforhodamine B (colorant hydrophile marquant les protéines cutanées) est alors appliquée à la surface cutanée pendant 15 minutes. Après 15 minutes, la solution de Sulforhodamine B est éliminée, à l'aide d'une seringue puis d'un écouvilion. Enfin la surface cutanée est rincée avec 1 ml de solution de NaCI à 0,9 %. L'absorbance de la solution de NaCI contenant des traces de Sulforhodamine B, (Le., Sulforhodamine B initialement adsorbée sur les protéines épidermiques) est déterminée par spectrophotomètre à 565,5 nm.

• En l'absence d'un effet corrosif, les protéines épidermiques sont intactes ; l'adsorption puis la désorption de la Sulforhodamine B est maximale. La Sulforhodamine B, initialement adsorbée sur les protéines cutanées, est désorbée dans la solution de rinçage. L'absorbance de la solution de rinçage est donc maximale.

• En présence d'un effet corrosif, les protéines épidermiques sont dénaturées. La Sulforhodamine B peut donc pénétrer dans la peau. Lors du rinçage, peu de Sulforhodamine B se désorbe dans la solution de rinçage. L'absorbance de la solution de rinçage est donc minimale.

Mode opératoire pour la détermination du facteur de corrosivité

^Prélever un échantillon de peau sur une oreille de porc non rasée, à l'aide d'un scalpel en évitant de la léser. >Découper des échantillons de peau de la dimension du compartiment donneur, puis les placer dans la cellule de Franz de façon à ce que le derme se trouve du côté du compartiment receveur.

>Remplir à l'aide d'une seringue le compartiment receveur avec du sérum physiologique en faisant attention qu'il n'y ait pas de bulle d'air au contact avec le derme.

> Placer le compartiment donneur de la cellule sur l'épiderme et le fixer avec une pince de Môhr.

>Placer les cellules au bain marie à 37°C.

> Déposer 200μL de chaque formulation sur la surface cutanée de chaque échantillon de peau. > Laisser en contact 5 minutes. > Eliminer les formulations à l'aide d'une seringue de 1OmL.

> Rincer 2 fois avec 1 ml de NaCI 0,9% (aspiration/ refoulement, plusieurs fois à la surface de la peau).

> Déposer 0,5 ml de Sulforhodamine B sur la surface cutanée de chaque échantillon. ^Laisser en contact 15 minutes.

>Eliminer la solution de sulforhodamine de la surface cutanée à l'aide d'une seringue (éliminer les traces restantes avec un écouvillon). > Déposer 1 ml de NaCl sur la surface de chaque échantillon de peau. >Puis réaliser 5 aspirations refoulement de la solution NaCI. ^Récupérer la solution de NaCI puis la transférer dans une micro cuve pour mesurer l'absorbance par spectrophotomètre UV. > Mesurer l'absorbance des solutions à 565,5nm, après avoir réglé le zéro sur la solution de NaCI initiale. Le facteur de corrosivité est déterminé grâce à la formule suivante :

_J Abs Echantillon - A bs NaCl 0,9%

Facteur de corrosivité = — — -, - „

Abs NaCI 0,9%

Si le facteur de corrosivité est supérieur à zéro alors l'échantillon est non corrosif.

Si le facteur de corrosivité est inférieur à zéro alors l'échantillon est corrosif.

Le TABLEAU 1 présente les facteurs de corrosivité de différentes formulations dont la formulation de l'exemple la). TABLEAU 1

Les SLN blanches sont préparées comme dans l'exemple la), mais sans minoxidil.

Si le facteur de corrosivité est supérieur à zéro alors l'échantillon est non corrosif. Si le facteur de corrosivité est inférieur à zéro alors l'échantillon est corrosif.

Le TABLEAU 2 représente les résultats d'une étude statistique sur le facteur de corrosivité (Si t probabilité > 0,05, alors les facteurs sont statistiquement identiques. Si t probabilité <0,05, alors les facteurs sont statistiquement différents.) TABLEAU 2

La suspension de SLN blanches et la suspension de SLN chargées ne sont pas corrosives. La solution commerciale Alopexy 5 % est légèrement corrosive mais nettement moins que l'acide nitrique (témoin positif).

A titre de comparaison des NLC ont été préparées conformément au protocole décrit par A. C. Silva et al. supra. Bien que le protocole ait été rigoureusement suivi, les NLC chargées à 0,3% en minoxidil obtenues ne présentent pas le diamètre annoncé dans la publication. Tout d'abord, il faut noter que si les échantillons ne sont pas passés aux ultrasons, il est très difficile voire impossible de mesurer le diamètre des NLC. Après 5 minutes dans le bain à ultrasons, le diamètre des NLC non chargées et des NLC chargées (0,3% de minoxidil) est de 450 nm ± 100 nm.

A cause de problème de matériel, la mesure du facteur de corrosivité des NLC chargées à 0,3% a été adaptée au matériel disponible. Le même test a été effectué mais les résultats ont été interprétés avec un chroma mètre.

Les paramètres de couleur sont enregistrés dans un système L*, a*, b* où une couleur est exprimée vectoriellement dans un système de 3 coordonnées tridimensionnelles : un axe rouge-vert (a*), un axe bleu-jaune (b*) et un axe de brillance (L*). La variation totale de la couleur est exprimée selon l'équation suivante :

AE = _^ J Aa ^*2 +Ab ^*1 + AL ^*2 Les résultats sont présentés dans le TABLEAU 3 ci-après. TABLEAU 3

Plus la valeur de E est grande, plus l'échantillon testé est corrosif.

De la même manière, le facteur de corrosivité de la formulation de l'exemple 2a) a été testée et les résultats sont présentés dans le TABLEAU 4 ci-après.

TABLEAU 4