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Patent Searching and Data


Title:
SOLID PHASE-BOUND NUCLEOSIDES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2011/061115
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to solid phase-bound nucleosides, in which the nucleoside is covalently bound to a solid phase by a 3'-O-disulfide bridge, and to a method for the production and use thereof.

Inventors:
MÜLLER, Sabine (Wolgaster Str. 130b, Greifswald, 17489, DE)
MATTHÄUS, Janczyk (Im Schlagenkamp 11, Herne, 44623, DE)
Application Number:
EP2010/067320
Publication Date:
May 26, 2011
Filing Date:
November 11, 2010
Export Citation:
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Assignee:
ERNST-MORITZ-ARNDT-UNIVERSITÄT GREIFSWALD (Domstrasse 11, Greifswald, 17487, DE)
MÜLLER, Sabine (Wolgaster Str. 130b, Greifswald, 17489, DE)
MATTHÄUS, Janczyk (Im Schlagenkamp 11, Herne, 44623, DE)
International Classes:
C07H19/073; C07H19/173; C07H21/00; C07H21/04
Domestic Patent References:
WO2001025247A1
Foreign References:
US20040175726A1
Other References:
SEMENYUK ET AL: "A base-stable dithiomethyl linker for solid-phase synthesis of oligonucleotides", TETRAHEDRON LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, Bd. 48, Nr. 3, 14. Dezember 2006 (2006-12-14), Seiten 469-472, XP005730761, ISSN: 0040-4039, DOI: DOI:10.1016/J.TETLET.2006.11.045
Matthäus Janczyk: "Synthese funktionalisierter Trinukleotide und ihre Anwendung bei der RandomisierungSynthese funktionalisierter Trinukleotide und ihre Anwendung bei der Randomisierung", , 17. Dezember 2009 (2009-12-17), XP002617745, Gefunden im Internet: URL:http://ub-ed.ub.uni-greifswald.de/opus/volltexte/2009/726/ [gefunden am 2011-01-20]
None
Attorney, Agent or Firm:
WABLAT LANGE KARTHAUS (Potsdamer Chaussee 48, Berlin, 14129, DE)
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Claims:
Patentansprüche

1. Festphasengebundenes Nukleosid der allgemeinen Formel 1, wobei der Rest R für Wasserstoff, eine Schutzgruppe PG oder weitere, über Phosphatgruppen gebundene Nukleo- side steht, wobei die freien OH-Gruppen der Phosphate selbst Schutzgruppen PG' aufweisen, und wobei das

Nukleosid eine Base B aus der Gruppe der Purin- und Py- rimidin-Basen aufweist, wobei im Falle freier NH2- Gruppen diese acyliert vorliegen und wobei im Falle mehrerer Nukleoside die Basen B gleich oder unterschiedlich sind, dadurch gekennzeichnet, dass das

Nukleosid über eine 3' -O-Disulfid-Brücke kovalent an eine Festphase gebunden ist

Formel 1 wobei n gleich 0 oder 1 ist und X bei n = 1 eine - (CRV),,- (NH)p-C (=Y) -Gruppe ist, worin

Rl und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff oder verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen mit jeweils 1 bis 10 C-Atomen sind und worin m eine Zahl zwischen 1 und 10 ist, wobei die Summe aller C-Atome nicht größer 10 ist und

worin p gleich 0 oder 1 ist und Y Sauerstoff oder

Schwefel ist.

Festphasengebundenes Nukleosid nach Anspruch 1 gemäß der allgemeinen Formel 2, dadurch gekennzeichnet, das es zwei weitere Nukleoside aufweist, welche jeweils ü ber 3 5 ' -Phosphatgruppen gebunden sind, wobei die Phosphatgruppen und die abschließende 5'-OH-Gruppe Schutzgruppen PC n

Formel 2

3. Festphasengebundenes Nukleosid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass n=l und X eine -(CHR1^- (NH) p-C (=Y) -Gruppe ist, worin R1 Wasserstoff oder eine verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe mit jeweils 1 bis 10 C-Atomen ist und worin m eine Zahl zwischen 1 und 10 ist, wobei die Summe aller C-Atome nicht größer 10 ist und worin p gleich 0 oder 1 ist und Y Sauerstoff oder Schwefel ist.

4. Festphasengebundenes Nukleosid nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass n=l und X eine - (CHCH3) -C (=0) -Gruppe ist.

5. Festphasengebundenes Nukleosid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppen PC der Phosphatgruppen ausgewählt sind aus Methylgrup¬ pen und substituierten oder unsubstituierten Ethylgrup- pen, vorzugsweise ß-Cyanoethylgruppen (CE) und die Schutzgruppen PG der 5'-OH-Gruppe Dimethoxytrityl- Gruppen (DMT) sind.

6. Festphasengebundenes Nukleosid nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Festpha¬ se ausgewählt ist aus Flüssigphasenpolymeren, gelati¬ neartigen Polymeren, makroporösen Polymeren, nichtporösen Polymeren und gepfropften Polymeren, vorzugsweise Polystyrol oder poröses Glas (CPG) , besonders bevorzugt CPG, wobei kovalent gebundene funktionelle Gruppen, vorzugsweise Thiolgruppen oder Aminogruppen, an der Festphase vorhanden sind.

7. Festphasengebundenes Nukleosid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei n=0 die Fest¬ phase Polystyrol mit an der Festphase gebundenen Thi¬ olgruppen und bei n=l die Festphase CPG mit an der Festphase gebundenen Aminogruppen ist. Verfahren zur Herstellung eines festphasengebundenen

Nukleosids gemäß Formel 1, wobei der Rest R für Wasserstoff, eine Schutzgruppe PG oder weitere, über Phosphatgruppen gebundene Nukleoside steht, wobei die freien OH-Gruppen der Phosphate selbst Schutzgruppen PG' aufweisen und wobei das Nukleosid eine Base B aus der Gruppe der Purin- und Pyrimidin-Basen aufweist, wobei im Falle freier NH2~Gruppen diese acyliert vorliegen und wobei im Falle mehrerer Nukleoside die Basen B gleich oder unterschiedlich sind, und wobei das Nukleosid über eine 3 ' -O-Disulfid-Brücke kovalent an eine Festphase gebunden ist

Formel 1

wobei n gleich 0 oder 1 ist und X bei n = 1 eine

- (CRV),,- (NH)p-C (=Y) -Gruppe ist, worin

Rl und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff oder verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen mit jeweils 1 bis 10 C-Atomen sind und m eine Zahl von 1 bis 10 ist, wobei die Summe aller C-Atome nicht größer 10 ist und worin p gleich 0 oder 1 ist und Y Sauerstoff oder ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Umsetzen eines Nukleosids der allgemeinen Formel 3, welches eine mit einer Schutzgruppe PG geschützte 5'- OH-Gruppe und eine freie 3'-OH-Gruppe aufweist, wobei der Rest B die oben genannte Bedeutung hat,

Formel 3

mit Dimethylsulfoxid (DMSO) zum 3 ' -O-Methylthio- methylderivat der allgemeinen Formel 4

Formel 4

und anschließende Umsetzung des 3 ' -O-Methylthio- methylderivats mit einem Festphasenmaterial, welches kovalent gebundene Thiol- oder Aminogruppen aufweist, woraus ein festphasengebundenes Nukleosid gemäß Formel 1 mit R = PG resultiert.

9. Verfahren zur Herstellung eines festphasengebundenen Nukleosids nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet dass bei Festphasen mit kovalent gebundenen Aminogrup¬ pen das 3 ' -O-Methylthiomethylderivat der allgemeinen Formel 4 an der Methylthiomethylgruppe zuerst mit ei¬ nem bifunktionalen Reportermolekül umgesetzt wird, welches eine Thiolgruppe und eine mit Aminogruppen um¬ setzbare elektrophile Gruppe, vorzugsweise eine Carbo- xyl-, eine Isothiocyanat- oder Isocyanat-Gruppe auf¬ weist, wobei zwischen der Thiolgruppe und der mit Ami¬ nogruppen umsetzbaren Gruppe eine (CR1R2) m-Gruppe vor- handen ist, worin

R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff oder verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen mit jeweils 1 bis 10 C-Atomen sind und m eine Zahl von 1 bis 10 ist, wobei die Summe aller C-Atome nicht größer 10 ist, und anschließende Umsetzung mit dem Festphasenmaterial, welches kovalent gebundene Aminogruppen aufweist, wo¬ bei bei einer Carboxylgruppe am Reportermolekül diese zuerst aktiviert wird, woraus ein festphasengebundenes Nukleosid gemäß Formel 1 mit R=PG und n=l resultiert.

10. Verfahren zur Herstellung eines festphasengebundenen Nukleosids nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die (CR1R2) m-Gruppe eine (CHR1) m-Gruppe ist, worin R1 Wasserstoff oder eine verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe mit jeweils 1 bis 10 C-Atomen ist und worin m eine Zahl zwischen 1 und 10 ist, wobei die Summe aller C-Atome nicht größer 10 ist und worin p gleich 0 oder 1 ist und Y Sauerstoff oder Schwefel ist .

11. Verfahren zur Herstellung eines festphasengebundenen Nukleosids nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet dass das Reportermolekül 2-Mercapto- propansäure ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines festphasengebundenen Nukleosids nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass in weiteren Schritten aus einem Nukleosid gemäß Formel 1 mit R = PG diese Schutzgruppe PG abgespalten wird, das festphasengebundene Nukleosid anschließend mit einem Nukleosid- -3 ' -O-Phosphoramidit der allgemeinen Formel 5, wobei die Phosphatgruppe und die abschließende 5'-OH-Gruppe Schutzgruppen PC und PG aufweisen, umgesetzt wird,

PG'

Formel 5 worin B die oben genannte Bedeutung hat,

anschließend die 5' -OH- Schutzgruppe abgespalten wird und danach eine erneute Umsetzung mit einem weiteren Nukleosid-5' -O-Dimethoxytrityl-3 ' -O-Phosphoramidits der allgemeinen Formel 5, worin PG, PG' und B die oben ge¬ nannte Bedeutung haben, erfolgt.

13. Verfahren zur Herstellung eines festphasengebundenen Nukleosids nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppen PG' der Phos¬ phatgruppen ausgewählt sind aus Methylgruppen und sub¬ stituierten oder unsubstituierten Ethylgruppen, vorzugsweise ß-Cyanoethylgruppen (CE) und die Schutzgrup¬ pen PG der 5'-OH-Gruppe Dimethoxytrityl-Gruppen (DMT) sind .

14. Verwendung eines festphasengebundenes Nukleosid gemäß der allgemeinen Formel 2 zur Herstellung eines Tri- nukleotid-5 ' -O-PG-3 ' -O-Phosphoramidits der allgemeinen Formel 6, worin PG, PG' und B die oben genannte Bedeu¬ tung haben,

Formel 6 wobei eine Abspaltung von der Festphase, bei welcher alle Schutzgruppen am Trinukleotid erhalten bleiben, und eine anschließende Phosphitylierung der freien 3'- OH-Gruppe erfolgt.

15. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei zur Abspaltung von der Festphase ein nicht basisches weiches Nukleophil, gelöst in einem organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls unter Zusatz von Wasser bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 genutzt wird.

16. Verwendung gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei zur Abspaltung von der Festphase Dithiothreitol (DTT) , ge¬ löst in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid (DMF) genutzt wird.

Description:
Festphasengebundene Nukleoside

Alle bisherigen Verfahren zur Synthese von Trinukleotid- synthons verlaufen in Lösung nach dem Posphortriester- verfahren oder dem Phosphoramiditverfahren . Die Lösungschemie hat den Vorteil, dass der Maßstab der Synthese prinzi ¬ piell beliebig wählbar ist, also auch größere Mengen an Trinukleotiden in einem Ansatz hergestellt werden können. Allerdings ist das mehrstufige Verfahren aufwendig, da nach jedem Syntheseschritt eine Isolation und Reinigung des Pro ¬ duktes notwendig ist. Insbesondere bei der Herstellung meh ¬ rerer Trinukleotide ist die Zeit ein entscheidender Faktor, da eine solche Synthese teilweise mehrere Wochen dauern kann .

Durch Festphasenchemie lassen sich diese sehr zeitauf- wändigen Schritte umgehen, da lediglich ein Herunterwaschen der Nebenprodukte, Reagenzien und unumgesetzten Ausgangs ¬ stoffe vom Träger erforderlich ist, während das gewünschte Produkt auf der Festphase verbleibt. Zudem sind die Bau ¬ steine für die Festphasensynthese von Trinukleotiden, die - 3 λ -O-Phosphoramidite der N-Acyl-5 λ -O-DMT geschützten Nukleoside, kommerziell erhältlich, und erlauben so eine schnel ¬ le Synthese der Trinukleotide in wenigen Stunden. Dies ist ein entscheidender Vorteil gegenüber der Lösungschemie, die durch oben genannte Reinigungsschritte zumindest mehrere Tage benötigt.

Bei der Darstellung von RNA- bzw- DNA-Strängen an der Festphase werden heutzutage festphasengebundene Nukleoside ver- wendet, die mittels eines O-Succinat-Linkers an das Fest ¬ phasenmaterial gebunden sind.

Die Festphasensynthese von geschützten Trinukleotiden scheiterte bisher daran, dass eine Abspaltung der Trinukle- otide von den handelsüblichen Trägermaterialien mit einem Verlust der Schutzgruppen einherging. Das Startnukleosid ist üblicherweise durch eine Esterbindung zum Linkermolekül an die Festphase gebunden. Eine solche Bindung wird übli ¬ cherweise durch Reaktion mit geeigneten Nukleophilen, beispielsweise wässrigem oder methanolischem Ammoniak, gespalten .

Nukleophile greifen aber ebenfalls die Acylschutzgruppen an den Nukleobasen sowie die üblichen Phosphatschutzgruppen an, und führen zu deren Abspaltung, d.h. nahezu alle

Schutzgruppen gehen auf diesem Weg verloren. Nach Entfernen von fast allen Schutzgruppen hat ein daraus resultierendes Trinukleotid als ungeschütztes Polyanion aus synthetischer Sicht keinerlei Bedeutung mehr. Kopplungsreaktionen sind auf Grund zahlreicher reaktiver Gruppen (Hydroxylgruppen, Aminogruppen) nicht mehr gezielt durchführbar. Darüber hinaus erfordert die hohe Polarität des Moleküls polare, mög ¬ lichst protische Lösungsmittel, welche mit den üblichen be- dingungen der Festphasensynthese nicht kompatibel sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es somit, festpha- sengebundene Nukleoside bzw. ein Verfahren zur Festphasensynthese von Nukleosiden bereitzustellen, welche (s) die o- ben genannten Nachteile überwinden/überwindet. Insbesondere war von Interesse, die Freisetzung des Tri- nukleotids von der Festphase unter Bedingungen zu errei ¬ chen, die alle übrigen Schutzgruppen intakt lassen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch festphasengebundene Nukleo ¬ side gemäß Anspruch 1 bzw. durch ein Herstellungsverfahren für festphasengebundene Nukleoside gemäß Anspruch 8. Weite ¬ re bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen .

In anderen Worten wird die Aufgabe durch festphasengebunde ¬ ne Nukleoside der allgemeinen Formel 1 gelöst, wobei der Rest R für Wasserstoff, eine Schutzgruppe PG oder weitere, über Phosphatgruppen gebundene Nukleoside steht, wobei die freien OH-Gruppen der Phosphate selbst Schutzgruppen PG' aufweisen und wobei das Nukleosid eine Base B aus der Grup ¬ pe der Purin- und Pyrimidin-Basen aufweist, wobei im Falle freier NH 2 ~Gruppen diese acyliert vorliegen und wobei im Falle mehrerer Nukleoside die Basen B gleich oder unterschiedlich sind, wobei kennzeichnend ist, dass das Nukleo ¬ sid über eine 3'-0- Disulfid-Brücke kovalent an eine Fest ¬ phase gebunden ist

Formel 1 wobei n gleich 0 oder 1 ist und X bei n = 1 eine - (CR R ) m - (NH) p -C (=Y) -Gruppe ist, worin Rl und R 2 unabhängig vonein ¬ ander Wasserstoff oder verzweigte oder unverzweigte Al- kylgruppen mit jeweils 1 bis 10 C-Atomen sind und worin m eine Zahl zwischen 1 und 10 ist, wobei die Summe aller C- Atome nicht größer 10 ist und worin p gleich 0 oder 1 ist und Y Sauerstoff oder Schwefel ist.

Der Begriff „Phosphat" bezeichnet hier generell einen Phos- phorsäure-di- oder -tri-ester. Mit „Phosphit" werden gene ¬ rell Phosphorigsäureester bezeichnet.

Bevorzugt ist ein festphasengebundenes Nukleosid gemäß der allgemeinen Formel 2, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es zwei weitere Nukleoside aufweist (d.h. dass der Rest R aus Formel 1 zwei weitere Nukleoside bedeutet) , wel ¬ che jeweils über 3 5 ' -Phosphatgruppen gebunden sind, wobei die Phosphatgruppen und die abschließende 5'-OH-Gruppe Schutzgruppen PC und PG aufweisen

Formel 2

In einer bevorzugten Ausführungsform ist n=l und X eine - (CHR 1 ) m - (NH) p-C (=Y) -Gruppe, worin R 1 Wasserstoff oder eine verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe mit jeweils 1 bis 10 C-Atomen ist und worin m eine Zahl zwischen 1 und 10 ist, wobei die Summe aller C-Atome nicht größer 10 ist und worin p gleich 0 oder 1 ist und Y Sauerstoff oder Schwefel ist. Höchst bevorzugt ist n=l und X eine - (CHCH3) -C (=0) - Gruppe .

Die Schutzgruppen PC der Phosphatgruppen sind vorzugsweise ausgewählt aus Methylgruppen und substituierten oder unsub- stituierten Ethylgruppen, vorzugsweise ß-Cyanoethylgruppen (CE) . Die Schutzgruppen PG der 5'-OH-Gruppe sind vorzugs ¬ weise Dimethoxytrityl-Gruppen (DMT) . Bei Methylgruppen oder unsubstituierten Ethylgruppen ist später in der Synthese noch ein weiterer Abspaltungsschritt mit einem weichen Nukleophil, vorzugsweise einem Thiolat, erforderlich.

Als Festphasenmaterial werden Flüssigphasenpolymere, gela ¬ tineartige Polymere, makroporöse Polymere, nicht-poröse Po ¬ lymere und gepfropfte Polymere, vorzugsweise Polystyrol o- der poröses Glas (CPG) , besonders bevorzugt CPG, verwendet, wobei kovalent gebundene funktionelle Gruppen, vorzugsweise Thiolgruppen oder Aminogruppen, an der Festphase vorhanden sind. Verwendbar sind auch ( Papier- ) Filterscheiben, Membranen oder gesinterte Blöcke.

Flüssigphasenpolymere sind Polymere mit hohem Molekularge ¬ wicht, welche in den für die Synthese erforderlichen Lö ¬ sungsmittel komplett gelöst werden können. Nach Beendigung der Kopplungsreaktion können sie durch Zugabe von Lösungsmitteln, in welchen sie unlöslich sind, wieder ausgefällt werden. Flüssigphasenpolymere sind insbesondere PEG- Polymere mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 5000 bis 2000, Celluloseacetate und Poly (N-acryloylmorpholine) . Gelatineartige Polymere sind insbesondere Polystyrol- divinylbenzol-Polymere mit geringem Quervernetzungsgrad (1- 5%) und Polyacrylamid-Träger . Gepfropfte Polymere weisen lange Polymerketten auf, welche auf einen festen Träger aufgepfopft vorliegen. Insbesondere sind hier Polystyrol- Tetrafluorethylen- (PS-PTFE) oder Polyethylenglycol- Polystyrol- (PEG-PS) gepfropfte Copolymere zu nennen. Nicht ¬ poröse Trägermaterialien sind beispielsweise Silica-Perlen, welche keine Poren aufweisen.

Makroporöse Festphasenmaterialien umfassen Kieselgele und poröse Gläser (CPG) , sowie Polymere wie Polystyrol oder Po- lymethacrylat oder deren Copolymere mit anderen Monomeren wie beispielsweise Polymethacrylat-Vinylalkohol-Copolymere . Dabei werden variable Vernetzungsgrade genutzt, d.h. es können Polymere mit hohen, aber auch mit niedrigen Vernetzungsgraden eingesetzt werden.

Bevorzugt werden makroporöse Polymere als Festphasenmateri ¬ al genutzt. Die Festphase ist dabei vorzugsweise ausgewählt aus Polystyrol oder porösem Glas (CPG) , vorzugsweise CPG, wobei kovalent gebundene funktionelle Gruppen, vorzugsweise Thiolgruppen oder Aminogruppen, an der Festphase vorhanden sind .

Bei festphasengebundenen Nukleosiden gemäß Formel 1 oder 2, in welchen n=0 ist, wird als Festphase in einer bevorzugten Ausführungsform Polystyrol mit an der Festphase gebundenen Thiolgruppen als Trägermaterial verwendet.

Das Verfahren zur Herstellung eines festphasengebundenen Nukleosids gemäß Formel 1, wobei der Rest R für Wasser ¬ stoff, eine Schutzgruppe PG oder weitere, über Phosphat ¬ gruppen gebundene Nukleoside steht, wobei die freien OH- Gruppen der Phosphate selbst Schutzgruppen PG' aufweisen und wobei das Nukleosid eine Base B aus der Gruppe der Pu ¬ rin- und Pyrimidin-Basen aufweist, wobei im Falle freier NH 2 ~Gruppen diese acyliert vorliegen und wobei im Falle mehrerer Nukleoside die Basen B gleich oder unterschiedlich sind, und wobei das Nukleosid über eine 3 ' -O-Disulfid- Brücke kovalent an eine Festphase gebunden ist

Formel 1

wobei n gleich 0 oder 1 ist und X bei n = 1 eine

- (CR 1 ! 2 ) m - (NH)p-C (=Y) -Gruppe ist, worin Rl und R 2 unab ¬ hängig voneinander Wasserstoff oder verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen mit jeweils 1 bis 10 C-Atomen sind und m eine Zahl von 1 bis 10 ist, wobei die Summe aller C-Atome nicht größer 10 ist und worin p gleich 0 oder 1 ist und Y Sauerstoff oder Schwefel ist, umfasst die folgenden Schritte:

• Umsetzen eines Nukleosids der allgemeinen Formel

3, welches eine mit einer Schutzgruppe PG ge ¬ schützte 5'-OH-Gruppe und eine freie 3'-OH-Gruppe aufweist, wobei der Rest B die oben genannte Be ¬ deutung hat,

Formel 3

mit Dimethylsulfoxid (DMSO) zum 3 ' -O-Methylthio- methylderivat der allgemeinen Formel 4

Formel 4

und

• anschließende Umsetzung des 3 ' -O-Methylthio- methylderivats mit einem Festphasenmaterial, wel ches kovalent gebundene Thiol- oder Aminogruppen aufweist, woraus ein festphasengebundenes Nukleo sid gemäß Formel 1 mit R = PG resultiert.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet dass bei Festphasen mit kovalent gebundenen Aminogruppen das 3 ' -O-Methylthiomethylderivat der allgemeinen Formel 4 an der Methylthiomethylgruppe zuerst mit einem bifunktiona len Reportermolekül umgesetzt wird, welches eine Thiolgrup pe und eine mit Aminogruppen umsetzbare elektrophile Grup ¬ pe, vorzugsweise eine Carboxyl-, eine Isothiocyanat- oder Isocyanat-Gruppe aufweist, wobei zwischen der Thiolgruppe und der mit Aminogruppen umsetzbaren Gruppe eine (CR 1 R 2 ) m - Gruppe vorhanden ist, worin R 1 und R 2 unabhängig voneinander Wasserstoff oder verzweigte oder unverzweigte Alkyl- gruppen mit jeweils 1 bis 10 C-Atomen sind und m eine Zahl von 1 bis 10 ist, wobei die Summe aller C-Atome nicht grö ¬ ßer 10 ist, und anschließende Umsetzung mit dem Festphasen material, welches kovalent gebundene Aminogruppen aufweist wobei bei einer Carboxylgruppe am Reportermolekül diese zu erst aktiviert wird, woraus ein festphasengebundenes Nukle osid gemäß Formel 1 mit R=PG und n=l resultiert. Die (CR R ) m -Gruppe ist vorzugsweise eine (CHR )m-Gruppe, worin R 1 Wasserstoff oder eine verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe mit jeweils 1 bis 10 C-Atomen ist und worin m eine Zahl zwischen 1 und 10 ist, wobei die Summe aller C- Atome nicht größer 10 ist und worin p gleich 0 oder 1 ist und Y Sauerstoff oder Schwefel ist. Vorzugsweise ist das Reportermolekül 2-Mercaptopropansäure .

In weiteren Schritten des Herstellungsverfahrens wird aus einem Nukleosid gemäß Formel 1 mit R = PG diese Schutzgrup ¬ pe PG abgespalten, das festphasengebundene Nukleosid an ¬ schließend mit einem Nukleosid-3 ' -O-Phosphoramidit der all ¬ gemeinen Formel 5, wobei die Phosphatgruppe und die ab ¬ schließende 5'-OH-Gruppe Schutzgruppen PG' und PG aufwei ¬ sen,

PG'

Formel 5 worin B die oben genannte Bedeutung hat, umgesetzt. An ¬ schließend wird die 5 ' -OH-Schutzgruppe abgespalten und da ¬ nach erfolgt eine erneute Umsetzung mit einem weiteren Nukleosid-3 ' -O-Phosphoramidit der allgemeinen Formel 5, worin PG, PG' und B die oben genannte Bedeutung haben.

Die Schutzgruppen PG' der Phosphatgruppen sind vorzugsweise ausgewählt aus Methylgruppen und substituierten oder unsub- stituierten Ethylgruppen, vorzugsweise ß-Cyanoethylgruppen (CE) . Die Schutzgruppe PG der 5'-OH-Gruppe ist vorzugsweise eine Dimethoxytrityl-Gruppe (DMT) . Die Besonderheiten für Methyl- und unsubstituierte Ethylaruppen wurden oben bereits erläutert.

Schema 1 gibt einen Überblick über das Syntheseverfahren für festphasengebundene Nukleoside gemäß Formel 1 oder 2, in welchen n=0 ist. Dabei wird als Festphase bevorzugt Polystyrol mit an der Festphase gebundenen Thiolgruppen als Trägermaterial verwendet. Die jeweiligen Reste/Schutzgruppen in Schema 1 haben die bereits genannte Bedeutung, wobei hier für die Schutzgruppe PG exemplarisch eine DMT- Gruppe dargestellt ist. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird die Festphase durch einen Kreis symbolisiert.

Schema 1 Zunächst wird durch Umsetzung des N-Acyl-5 λ -O-DMT geschüt- zen Nukleosids mit Acetanhydrid, DMSO und Essigsäure ein 3 λ -O-Methylthiomethyl funktionalisiertes Nukleosid herge ¬ stellt. Dieses wird in einer Folgereaktion durch Bildung einer Disulfidbrücke kovalent an eine thiolmodifizierte Festphase, beispielsweise Mercaptoethylpolystyren, gebunden. Anschließend wird das Trinukleotid an der Festphase durch Kopplung zweier N-Acyl-5 λ - (DMT) -3 λ -O-Nukleosid- phosphoramidite nach dem Standardphosphoramiditverfahren synthetisiert. Die Abspaltung des geschützten Trinukleotids von der Festphase erfolgt durch Behandlung mit Dithiothrei- tol (DTT) in einer Mischung aus DMF und Wasser (1:1) bei 45°C über 10 Stunden. Dabei wird zunächst die Disulfidbrü- cke gespalten und eine 3 λ -O-Methylenthiolgruppe am Nukleo ¬ sid erzeugt. Dieses gemischte Halbacetal unterliegt einer raschen Folgereaktion unter Freisetzung von Methanthial und Generierung der freien 3 λ -OH-Gruppe .

Bei festphasengebundenen Nukleosiden gemäß Formel 1 oder 2, bei welchen n=l ist, ist die Festphase vorzugsweise CPG mit an der Festphase gebundenen Aminogruppen . Verschiedene chemisch modifizierte CPG-Träger mit verschiedenen funktionellen Gruppen sind kommerziell erhältlich, welche alle für diese Synthese einsetzbar sind. Die Oberfläche sowie die maximale Beladung hängen von der Porengröße ab, so dass größere Poren eine höhere Beladungskapazität bedeuten.

Höchst bevorzugt wird ein CPG-Träger eingesetzt, welcher ein langkettiges Alkylamin trägt („long chain alkyl amin", LCAA; LCAA-CPG) .

Alternativ wird also in einem zweiten Verfahren das 3 λ -0- methylthiomethyl funktionalisierte Nukleosid über ein Re- portermolekül mit der Festphase verknüpft, wobei vorzugs ¬ weise wie oben beschrieben 2-Mercaptopropansäure verwendet wird. Einsetzbar ist aber auch jedes andere bifunktionelle Molekül, welches einerseits mit einer Thiolgruppe und an ¬ dererseits mit einer elektrophilen Gruppierung, die sich mit Aminen umsetzen lässt, vorzugsweise Carbonsäurederiva ¬ te, Isocyanate oder Isothiocyanate, ausgerüstet ist.

Schema 2 gibt einen Überblick über das Verfahren für fest- phasengebundenen Nukleoside gemäß Formel 1 oder 2, bei wel ¬ chen n=l ist und 2-Mercaptopropansäure als Reportermolekül eingesetzt wird. Die jeweiligen Reste/Schutzgruppen haben die bereits genannte Bedeutung, wobei hier für die Schutz ¬ gruppe PG exemplarisch eine DMT-Gruppe dargestellt ist. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird die Festphase durch ei ¬ nen Kreis symbolisiert.

Schema 2

Die Umsetzung des 3 -O-methylthiomethyl funktionalisierten Nukleosids mit 2-Mercaptopropansäure nach Aktivierung mit Sulfurylchlorid und Kaliumthiotosylat führt zur Ausbildung einer Disulfidbrücke und somit zur kovalenten Verknüpfung des Nukleosids mit dem Reportermolekül. Die Carboxylgruppe der Mercaptopropansäure wird anschließend nach Aktivierung, vorzugsweise mit TSTU, mit Amino-funktionalisiertem CPG um ¬ gesetzt, und so das Nukleosid mit der Festphase verknüpft. Andere Aktivatoren neben TSTU sind HBTU, HATU und TBTU. Die Synthese des Trinukleotids erfolgte nach dem Phosphorami- ditverfahren 'wie oben beschrieben, und auch die Freisetzung der geschützten Trinukleotide geschah unter identischen Be- dingungen, vorzugsweise durch Behandlung mit DTT in einer DMF-Wasser-Mischung im Verhältnis 1:1. Als Zwischenprodukt wird dabei ein 3 ' -O-Thiomethylderivat gebildet, welches an ¬ schließend unter Freisetzung von Methanthial die freie 3'- OH-Gruppe liefert.

Durch HPLC und MALDI-MS-Analyse wurde eindeutig die Identi ¬ tät der synthetisierten Trinukleotide und der Erhalt aller Schutzgruppen belegt (siehe Fig. 1) . Neben den Acyl- schutzgruppen an den Nukleobasen und den 5 λ -O-DMT-Gruppen erwiesen sich sowohl Methylgruppen als auch ß-Cyanoethyl- gruppen an den Phosphaten unter diesen Bedingungen als stabil.

Das zweite Verfahren unter Verwendung von CPG als Festphase erwies sich vorteilhaft gegenüber der Verwendung von Mer- captoethylpolystyren, da das verwendete aminofunktionali- sierte CPG besser an die Bedingungen der Oligonukleotid- synthese angepasst ist, beispielsweise nicht quillt und ei ¬ nen größeren Abstand zwischen Polymerphase und Nukleosid gewährleistet .

Festphasengebundene Nukleoside gemäß der allgemeinen Formel 2 werden zur Herstellung eines Trinukleotid-5 ' -O-PG-3 ' -0- Phosphoramidits der allgemeinen Formel 6, worin PG, PG' und B die oben genannte Bedeutung haben, verwendet,

Formel 6 wobei eine Abspaltung von der Festphase, bei welcher alle Schutzgruppen am Trinukleotid erhalten bleiben, und eine anschließende Phosphitylierung der freien 3'-OH-Gruppe erfolgt .

Zur Abspaltung von der Festphase wird dabei ein nicht basi ¬ sches weiches Nukleophil, gelöst in einem organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls unter Zusatz von Wasser bei ei ¬ nem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 genutzt. Vorzugsweise wird zur Abspaltung von der Festphase Dithiothreitol (DTT) , gelöst in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethyl- formamid (DMF) genutzt.

Die Phosphitylierung der freien 3'-OH-Gruppe der Trinukleo- tide erfolgt vorzugsweise durch Reaktion mit 2-Cyanoethyl- N, N, N λ , N x -tetraisopropylphosphoramidit, wodurch ein 3 λ -0- Phosphoramidit erhalten wird. Beschreibung der Figur

Fig.l Die Abbildung zeigt drei verschiedene Trinukleo- tide, welche an einer CPG-Festphase synthetisiert wurden. Die entsprechenden MALDI-Massenspektren zeigen, dass die Synthese erfolgreich verlief. Die Abspaltung von der Festphase führte in allen Fällen zur Freisetzung des jeweiligen Trinukleo- tids unter Erhalt aller erforderlichen Schutzgruppen, wobei als Zwischenprodukt eine 3'-0- Thiomethylgruppe gebildet wird. Gezeigt sind die zu unterschiedlichen Zeitpunkten aufgenommenen Massenspektren. Nach drei Stunden ist ein beginnender Verlust der Thiomethylgruppe zu erkennen. Nach 8-10 Stunden kann ein fast vollständiger Verlust der Thiomethylgruppe unter Generierung einer freien 3'-OH-Gruppe nachgewiesen werden (Spektren II, IV und VI) .

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen erläu- tert .

Beispiele

Beispiel 1 : IV-Acylierung von 2 " -Desoxyadenosin / 2 ' - Desoxycytidin / 2 " -Desoxyguanosin

1

Ansatz :

1. 500 ml Pyridin

2. 50 mmol 2 ' -Desoxynukleosid (13.45 g dA-Hydrat; 13.35 g dG; 13.15 g dC-Hydrochlorid)

3. 5 Äq. Trimethylchlorsilan (32.5 ml)

4. 5 Äq. Acylierungsmittel (42.5 ml Isobuttersäureanhydrid bzw. 30 ml Benzoylchlorid)

In einem 1000 ml Einhalskolben wurden 50 mmol 2'- Desoxyadenosin / 2 ' -Desoxycytidin / 2 ' -Desoxyguanosin zwei Mal mit je 100 ml trockenem Pyridin coevaporiert und schließlich in 500 ml trockenem Pyridin suspendiert. Unter Kühlung wurden 5 Äquivalente Trimethylchlorsilan (32,5 ml) innerhalb 10 Minuten zur Lösung hinzugetropft, die Lösung daraufhin 15 Minuten lang weitergerührt. 5 Äquivalente Iso ¬ buttersäureanhydrid (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin; 42,5 ml) bzw. Benzoylchlorid (Desoxycytidin; 30 ml) innerhalb von 10 Minuten zur weiterhin gekühlten Lösung getropft, das Eisbad daraufhin entfernt. Nach 20 Minuten wurde die Lösung wiederum in einem Eisbad gekühlt und die Reaktion durch die Zugabe von 200 ml kaltem Wasser beendet, nach weiteren 15 Minuten wurden 100 ml einer 30% Ammoniaklösung hinzugege- ben. Nach 30 Minuten Rühren wurden alle Lösungsmittel entfernt, der Rückstand in möglichst wenig Wasser (ca. 50 ml) vollständig gelöst. Die wässrige Phase wurde daraufhin mit 100 ml Diethylether gewaschen und in einen Erlenmeyerkolben überführt. Die Kristallisation begann z.T. bereits nach einigen Sekunden und konnte ggf. durch Kühlung bzw. durch Entfernen eines Teils des Wassers beschleunigt bzw. ermög ¬ licht werden. Der Erlenmeyerkolben wurde über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt, das auskristallisierte Produkt am nächsten Tag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und in einem Exsikkator bei vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Als Produkt wurden färb- und geruchlose Kristalle von wat ¬ teartiger Konsistenz erhalten. Die Mutterlauge wurde für eine etwaige Nachfällung aufbewahrt, die Kristallisation unter o.g. Bedingungen wiederholt.

Bei nicht erfolgter Kristallisation wurde das Produkt bis zur Trockene eingeengt und mittels Säulenchromatographie (CH 2 CI 2 : Methanol 80:20) von den organischen Salzen ge ¬ trennt. Nach Entfernen des Dichlormethan/Methanol-Gemisches wurde ein farbloser Feststoff erhalten.

R f -Wert (CH 2 Cl 2 :MeOH 8:2): 0,5

Ausbeuten :

• dA (N-acyl) : 94 %

• dC (N-acyl) : 90 %

• dG (N-acyl) : 96 % Beispiel 2 : 5 " -O-Tritylierung

2

Ansatz :

1. 100 ml Pyridin (trocken)

2. 7 mmol W-Acyl-Nukleosid 1

3. 2 ml Triethylamin (trocken)

4. 0.05 Äq. DMAP (0.043 g)

5. 1.3 Äq. DMTC1 (3.1 g)

7 mmol des W-acylierten Desoxynukleosids 1 bzw. Thymidins wurden in einem 250 ml Einhalskolben jeweils zwei Mal mit je 30 ml trockenem Pyridin coevaporiert und schließlich in 100 ml trockenem Pyridin und 1.5 ml trockenem Triethylamin suspendiert. 0.05 Äquivalente DMAP (43 mg) und daraufhin 1.3 Äquivalente Dimethoxytritylchlorid (3.1 g) wurden zur Suspension hinzugegeben. Die Bildung des tritylierten Produkts wurde mittels Dünnschichtchromatographie überprüft. Bei nicht vollständiger Umsetzung wurde weiteres DMTC1 zu ¬ gegeben. Die Reaktion wurde nach Zugabe von 100 ml Wasser beendet. Das Produkt wurde so oft mit jeweils 100 ml Diethylether extrahiert bis kein Produkt mehr in der wäss- rigen Phase vorhanden war (ca. 10 x) . Nachdem die Lösungs ¬ mittel unter vermindertem Druck vollständig am Rotations ¬ verdampfer entfernt wurden, konnte das Produkt säulenchro- matographisch gereinigt werden (CH 2 Cl 2 :MeOH = 99:1 ^ 95:5). R f -Wert (CH 2 Cl 2 :MeOH 9:1) : 0.5

Ausbeuten :

• 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl) : 92 %

• 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl) : 91 %

• 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl) : 86 %

• 5 ' -O-Trityl-T : 97 %

Die tritylierten Nukleoside wurden mittels MALDI als Natriumsignale nachgewiesen.

• 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl) : 646.3 m/z (Natriumpeak)

• 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl) : 656.1 m/z (Natriumpeak)

• 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl) : 663.0 m/z (Natriumpeak)

• 5 ' -O-Trityl-T : 566 m/z (Natriumpeak)

Beispiel 3: Synthese eines 3"-0-MTM funktionalisierten Nukleosids

3

Ansatz :

1. 50 ml DMSO

2. 50 ml Acetanhydrid

3. 40 ml Essigsäure

4. 10 mmol Nukleosid 2

In einem mit 10 mmol eines 5 ' -O-DMT-geschützten Desoxy- nukleosids 2 gefüllten 250 ml Einhalskolben wurden nachein- ander 50 ml DMSO, 50 ml Acetanhydrid und 40 ml Essigsäure zugegeben. Die Lösung wurde solange gerührt bis sich das Edukt vollständig umgesetzt hat (5-24h) . Nach vollständiger Umsetzung wurde die Lösung in 200 ml gesättigte Natrium- hydrogencarbonatlösung gegossen, das Produkt durch Zugabe von weiteren 200 ml Dichlormethan extrahiert. Sofern noch Produkt in der wässrigen Phase vorhanden war, wurde die Extraktion mit weiteren 100 ml Dichlormethan wiederholt.

Die Lösungsmittel wurden bei vermindertem Druck destillativ entfernt, das Produkt danach säulenchromatographisch gereinigt .

R f -Wert (CH 2 Cl 2 :MeOH 95:5) : 0.7

Ausbeuten :

• 3 ' -0-MTM-dA (N-acyl) : 71 %

• 3 ' -0-MTM-dC (N-acyl) : 80 %

• 3 ' -0-MTM-dG (N-acyl) : 66 %

• 3'-0-MTM-T: 75 %

Folgende Nukleoside wurden mittels MALDI nachgewiesen:

dA: errechnet: 684 g/mol; gemessen: 685 m/z

(kein Natriumpeak)

dC : errechnet: 694 g/mol; gemessen: 717 m/z

dG: errechnet: 700 g/mol; gemessen: 701 m/z

(kein Natriumpeak)

T: errechnet: 604 g/mol; gemessen: 627 m/z Beispiel 4 : Synthese eines über eine Disulfidbrücke an eine Festphase gebundenen Nukleosids

3'- O-Disulfidsäure

4

3'-0-MTM funktionalisiertes Nukleosid 3 wurde mit 2- Mercaptopropansäure umgesetzt, um das gewünschte Produkt zu erhalten .

Rf-Wert (CH 2 Cl 2 :MeOH 95:5): 0.2

Ausbeuten :

• dA: 62 %

• dC 55 %

• T: 60 %

Folgende Nukleoside wurden mittels MALDI als Natriumsignale nachgewiesen :

dA: errechnet: 794 g/mol; gemessen: 774 m/ z

dC : errechnet: 783 g/mol; gemessen: 786 m/ z

T: errechnet: 694 g/mol; gemessen: 694 m/ z Kopplung mit einem Amino-CPG- räger

5

In einem 2 ml Eppendorfgefäß wurden 0,1 mmol der 3'-0- Disulfidsäure 4 in 1,5 ml einer 1:1 Mischung aus DMF und Wasser gelöst, es wurden 50 μΐ Triethylamin und 0,2 mmol TSTU zugegeben, woraufhin sich die Lösung braun färbte. Schließlich wurde 1 g des CPG-Trägers (105 ymol/g; 1 Äq.) zugegeben, das Eppendorfgefäß wurde über Nacht bei Raumtem ¬ peratur geschüttelt. Am nächsten Tag wurde das Eppendorfge ¬ fäß anzentrifugiert , der Überstand daraufhin vorsichtig ab ¬ genommen und verworfen. Der Träger wurde daraufhin in 1 ml einer 1:1 Mischung aus Wasser und Ethanol aufgenommen, kurz geschüttelt, wiederum anzentrifugiert , der Überstand ver ¬ worfen. Der Vorgang wurde fünf Mal wiederholt, der CPG- Träger daraufhin im geöffneten Eppendorfgefäß an der Luft getrocknet . Beispiel 5 : Synthese eines Trinukleotids an der Festphase

Die Präparation des Trinukleotids an der Festphase (CPG) erfolgte nach dem Standard-Phosphoramiditverfahren im 1 μιηοΐ Maßstab unter Nutzung eines DNA-Syntheseautomaten (Ge- neAssembler, Pharmacia). Kommerziell erhältliche N-Acyl-5 '- DMT geschützte 3 ' -O-Phosphoramidite der vier Nucleoside A, C, G und T wurden an die Festphase (CPG mit Startnukleosid gebunden über eine Disulfidbrücke) entsprechend der ge ¬ wünschten Sequenz gekoppelt. Die Synthesen erfolgten im "Trityl off"-Modus. Durchschnittliche Kopplungsausbeuten lagen bei 99,4 % . Beispiel 6 : Abspaltung des Trinukleotids von der Festphase

Ansatz :

1. 100 mg CPG-Träger (500 Ä; 105 ymol/g; ca. 1 ymol ge ¬ bundenes Trinukleotid)

2. 15 mg DTT (154 g/mol; 100 Äquivalente)

3. 1 ml trockenes DMF

Der nach der Festphasensynthese erhaltene CPG-Träger wurde fünf Mal mit 1 ml einer 1:1 Mischung aus Wasser und Aceto- nitril gewaschen. Nach Entfernen der Lösungsmittel wurde der Träger in 1 ml DMF in einem Eppendorfgefäss aufgeschlemmt, es wurde ein 100-facher Überschuss DTT zugegeben. Das Eppendorfgefäss wurde mit Parafilm verschlossen und bei 40°C inkubiert. In Abständen von 1 h wurde der Überstand auf Vollständigkeit der Abspaltreaktion untersucht (DC, MALDI). Auszüge der MALDI-Massenspektren zur Abspaltung sind in Fig. 1 wiedergegeben. Nach vollständiger Abspaltung der 3 ' -O-Thiomethylgruppe (Verbindungen 8) wurde das Lö- sungsmittel entfernt, das Produkt in 100 μΐ Aceto- nitril/Wasser (1:1) aufgenommen, filtriert und mittels prä- parativer RP-HPLC gereinigt.

Lösungsmittel System:

Puffer A: 5 % Acetonitril in Wasser

Puffer B. 70 % Acetonitril in Wasser

Beispiel 7 : Synthese des Trinukleotid-3 ' -O-Phosphoramidits

ßN-Acyl

9

Ansatz :

1. 5 ml Dichlormethan (trocken)

2. 0.5 mmol Trinukleotid 1_

3. 0.55 mmol 2-Cyanoethyl-W,A/ ' ,A/ ' ' ,ΛΓ -tetraisopropylphos- phoramidit

4. 0.6 mmol BMT (0.12 g) In einem 10 ml Einhalskolben wurden 0.5 mmol des gereinigten Trinukleotids 7 in 5 ml trockenem Dichlormethan gelöst, es wurden 0.55 mmol 2-Cyanoethyl-N / .N / .N ',N' - tetraisopropylphosphoramidit und 0,6 mmol BMT zugegeben. Die Reaktionslösung wurde ca. zwei Stunden gerührt bis das Edukt vollständig verschwunden war. Nach vollständiger Reaktion wurde das Lösungsmittel entfernt, das Phosphoramidit zwei Mal mit trockenem Dichlormethan coevaporiert und über Nacht am Olpumpenvakuum getrocknet. Eine wässrige Aufarbei ¬ tung und Reinigung fand nicht statt. Das Phosphoramidit wurde sofort für die Festphasensynthese verwendet.

Rf-Wert (CH 2 Cl 2 :MeOH 9:1): 0.7

Ausbeute: 50-70 %