以下、本発明の好ましい実施の形態を詳� ��に説明する。

 [固体支持体]
 本発明の一実施形態に係る固体支持体は、� ��コール酸含有糖脂質との結合能を有するポ� ��ペプチドが、担体表面に固定化されてなる� ��該固体支持体(以下、「細胞結合用固体支持 体」とも称する)によると、細菌細胞の細胞� �に存在するミコール酸含有糖脂質と固体支� �体の担体表面に固定化されたポリペプチド� �が結合し、細菌細胞が結合した固体支持体� �得ることができる。この細菌細胞が結合し� �固体支持体を試料中から回収することによ� �て、細胞を単離することができる。そして� �細胞を単離した後に、固体支持体に結合し� �細菌細胞を溶菌処理して核酸を遊離させ、� �体支持体に結合した細菌の細胞壁を取り除� �ことによって、核酸を抽出することができ� �。

 また、本発明の他の実施形態に係る固体� ��持体は、核酸との結合能を有するポリペプ� ��ドが、担体表面に固定化されてなる。該固� ��支持体(以下、「核酸結合用固体支持体」と も称する)によると、核酸と固体支持体の担� �表面に固定化されたポリペプチドとが結合� �、核酸が結合した固体支持体を得られる。� �の核酸が結合した固体支持体を試料中から� �収することによって、高純度の核酸を得る� �とができる。

 (ポリペプチド)
 上記細胞結合用固体支持体におけるポリペ� ��チドは、ミコール酸含有糖脂質との結合能� ��有する。本明細書において、「ポリペプチ� ��」とは、アミノ酸がペプチド結合により重� ��したポリマー分子であって、高次構造を有� ��るタンパク質及び修飾タンパク質も含む。� ��た、本明細書において、「結合」とは、イ� ��ン結合、および水素結合などの他、双極子� ��相互作用、ファンデルワールス力、および� ��水性相互作用などの分子間相互作用による� ��着・吸着なども含む。該ポリペプチドは、� ��コール酸含有糖脂質との結合能を有するも� ��であれば、特に制限なく用いることができ� ��。ミコール酸含有糖脂質はマイコバクテリ� ��ム属(Mycobacterium属:抗酸菌属)やその近縁菌で あるノカルディア属(Nocardia属)、ロドコッカ� �属(Rhodococcus属)などの細胞壁に含まれる糖脂� ��であり、一般に種々の分子量を持つ類似体� ��混合物の状態で存在する。マイコバクテリ� ��ム(抗酸菌)属には、ヒト型結核菌(Mycobacterium  tuberculosis)、ライ菌(Mycobacterium leprae)などの� ��原性を有する細胞内寄生菌が含まれており� ��増殖が極めて緩慢なため、細胞内寄生を可� ��にし、また薬剤に対する抵抗性が獲得され� ��。ミコール酸含有糖脂質としては、例えば� ��アビミコール酸I、ホミノミコール酸I、ミ� �ール酸IIa、ミコール酸IIb、ミコール酸IIIa、� ��コール酸IIIb、コリノミコール酸、トレハロ ース-6-モノミコレート、トレハロース-6,6’-� ��ミコレート、およびメロミコール酸などが� ��られている。このうち、トレハロース6,6’- ジミコレートは、トレハロースの6,6’位にミ コール酸が2分子、エステル結合した抗酸菌� �特異的な糖脂質であり、マイコバクテリウ� �の細胞壁を特徴づける主要糖脂質である。

 上記核酸結合用固体支持体におけるポリ� ��プチドは、トレハロース6,6’-ジミコレート などのミコール酸含有糖脂質と結合していな い場合は、核酸との結合能を有する。すなわ ち、該ポリペプチドは、水素結合、イオン結 合、疎水性相互作用といった非共有的相互作 用を介して、高いアフィニティで核酸と結合 する。本明細書において、「核酸」とは、DNA 、RNA、および修飾核酸塩基を含むポリヌクレ オチドを意味し、一本鎖または二本鎖を問わ ず、それらのポリペプチドの組み合わせ(部� �的なdsまたはss)であってもよく、さらにペプ チド核酸(PNA)なども含まれる。核酸結合能を� ��するポリペプチドは、核酸を可逆的に結合� ��解離することができる既知のものであれば� ��に限定されず、DNA結合タンパク質、RNA結合� ��ンパク質などの公知の核酸結合タンパク質� ��適宜採用することができる。使用される核� ��結合タンパク質としては、例えば、ヒスト� ��系タンパク質(またはヒストン様のタンパク 質)、転写因子、遺伝子修復タンパク質(ポリ( ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)、Kuタンパク� �など)、リボソームタンパク質などが総称的� ��挙げられる。DNAに結合して転写の開始、伸� ��、終結などの転写調節に関わる転写因子の� ��類は、50種類以上を超えている。DNA結合タ� �パク質として具体的には公知のλファージ転 写因子croタンパク質、ATF2、c-Fos、DP-1、c-Myb、 c/EBP、CREB、FosB、E2F-1、c-Myc、Egr-1、c-Jun、E2F-2� ��Infl 1、Infl 2、Onc 1、Onc 2、Onc 3、Max、HIF-1 α、c-Rel、JunD、Rb、USF1、HIF-1β、NFκB p50、Sp-1� ��p107、USF2、Oct I、NFκB p65、 STAT1、Sp-1、p53� �Oct IIなどが挙げられる。なお、ここでいう� ��DNA結合タンパク質」とは、生理的意義が知� ��れた狭義の「DNA結合タンパク質」に限定さ� ��るものではなく、細胞の核物質中でDNA分子� ��の特定部位に特異的に結合し、あるいはDNA� ��特異的に直接相互作用することでDNAの機能� ��影響を及ぼすタンパク質を意味する。これ� ��は、遺伝子発現を起動する転写因子、特化� ��れた機能を付与するステロイドホルモン受� ��体、およびゲノムの完全性を維持するDNA修� ��タンパク質として、正常細胞の活性におい� ��中心的役割を果たしている。また、RNA結合� ��ンパク質としては、DRBP(dsRNA binding proteins)� ��どがあり、例えば、DRBP76、PACT、RAXなどが挙 げられる。本発明において上記「核酸結合タ ンパク質」は、どのように調製されたもので もよい。例えばそのタンパク質をコードする 遺伝子を用いて、公知の遺伝子工学的手法に より試験管内で発現させた遺伝子組換え体で あってもよい。あるいは該タンパク質を含む 分画を生体や細胞から抽出してもよい。また タンパク質、ペプチドライブラリーから得ら れるサンプルを使用してもよい。核酸結合能 を有するポリペプチドは、上記「核酸結合タ ンパク質」を化学修飾、部分切断(プロテア� �ゼ部分消化、ブロムシアン開裂、ジスルフ� �ドリル基還元など)などによって得られ、核� ��結合能を保持しているポリペプチドも含む� ��

 本発明の細胞結合用固体支持体または核� ��結合用固体支持体に用いるポリペプチドは� ��ミコール酸含有糖脂質および核酸の両方と� ��結合能を有することが好ましい。かような� ��リペプチドを用いることによって、遺伝子� ��査における病原性細菌細胞の単離および該� ��菌中の核酸の抽出・精製を1種の固体支持体 で行うことが可能となる。該ポリペプチドと しては、ミコール酸含有糖脂質および核酸の 両方と結合することができるポリペプチドで あれば、特に制限なく用いることができる。 かようなポリペプチドとしては、例えば、マ イコバクテリウム属に属するBCG東京株から分 離されたMDP1(Mycobacterium DNA-Binding Protein 1)が� ��げられる。

 MDP1は、抗酸菌に特異的なヒストン様タン パク質であり、核酸コンフォーメーションを 認識してDNA、RNA両方に結合することができる 。またMDP1は、遺伝子の発現制御に関与して� �酸菌の遅発育性の原因となるとの報告があ� �(特開2000-219699号公報)。結核菌などの細胞壁� ��は、MDP1が存在することが知られ、これはグ リコサミノグリカンと強力に相互作用する。 さらに本発明者らの研究から、結核菌細胞壁 成分のミコール酸含有糖脂質と遊離状態のMDP 1とが強い相互作用をすること、ならびに細� �壁においてもミコール酸含有糖脂質とMDP1と� ��実際に結合している可能性が示された。MDP1 は、BCG東京株から得ることができるが、該株 に限定されず、BCG東京株以外のBCG株、結核菌 などのマイコバクテリウム属の菌から分離精 製することによっても得られる。

 MDP1は、205個のアミノ酸を有するポリペプ チドであるが、MDP1の1個または複数個、好ま� ��くは1個~数個のアミノ酸が特定の位置また� �ランダムに置換、付加もしくは欠失したポ� �ペプチドであってもよい(本明細書では、こ� ��らも「MDP1」として言及する)。「1個~数個」 の範囲は特には限定されないが、例えば、1~2 0個、好ましくは1~10個、さらに好ましくは1~5� ��、特に好ましくは1~3個程度を意味する。こ� ��でアミノ酸残基の修飾である「置換」、「� ��加」、「欠失」は、通常の意味であり、MDP1 の機能を保持する修飾が許容される。アミノ 酸の置換、欠失および/または付加といった� �異を導入するには、例えば部位特異的突然� �異/PCR法などの周知の技術(S.N.Hoら、Gene 77、5 1(1989);西郷薫と佐野弓子共訳、Current protocols� ��ンパクト版、分子生物学実験プロトコールI 、1997年6月、丸善)を用いることによって可能 である。

 上記MDP1として、6×ヒスチジン融合タンパ ク質、GST融合タンパク質といった組換えタン パク質の態様が好適に用いられる。このよう な組換えタンパク質を作製する場合には、ま ず該タンパク質をコードするDNAを入手するこ とが必要である。MDP1をコードするDNAの入手� �その塩基配列などについては特開2000-219699号 公報に記載されている。このDNAを適当な発現 系に導入することにより、組換えタンパク質 として発現させ、これを抽出しアフィニティ クロマトグラフィーによって分離することが できる。例えば、MDP1をコードするDNAを適当� �ベクター、例えば、pQE30、pGEXなどに組み込� �、これを大腸菌、BCGなどの細菌、酵母など� �細胞に導入して形質転換体として培養する� �とによって所望のポリペプチドが産生され� �(特開2000-219699号公報)。

 MDP1は、グアニン(G)あるいはシトシン(C)の認 識を通じた核酸結合活性をもっている。その 結果、核酸は、その配列中に含まれるGある� �はCを介して本発明の固定化支持体表面のMDP1 結合することとなる。肝要なことは、MDP1がG� ��C塩基を認識することで、GCリッチな核酸を� ��異的に捕捉することに優れることである
 (担体)
 本発明において担体は、上記ポリペプチド� ��固定化するための基材の役割を果たす。以� ��、担体の好ましい形態を説明するが、以下� ��形態は、上述の細胞結合用および核酸結合� ��のいずれの固体支持体においても特に制限� ��く採用することができる。担体は、細菌細� ��の単離および核酸の抽出・精製工程におい� ��固液分離による分離を行うことから、水不� ��性の材料からなることが好ましい。ここで� ��う水不溶性とは、具体的に水、他のいかな� ��水溶液にも溶解しないことを意味する。担� ��は、固定、分離などの用途に現在広く使用� ��れ、提案されている公知の担体(支持体)ま� �はマトリックスのいずれであってもよい。

 担体に用いられる材料としては、例えば� ��無機化合物、金属、金属酸化物、有機化合� ��またはこれらを組み合わせた複合材料を含� ��。担体は、抗酸性細菌細胞を結合させ得る� ��のであれば、材質、形状、サイズは特に限� ��されない。好ましいものは、細胞の結合ま� ��は核酸の結合のために高い表面積を与える� ��料である。

 担体に用いられる具体的な材料としては� ��特に限定されるものではないが、一般にポ� ��スチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレ� ��ト、ポリメチルメタクリレート、ポリエチ� ��ン、ポリアミド、ラテックスといった有機� ��リマーなどの高分子材料、ガラス、シリカ� ��二酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化ジルコニ� ��ム、酸化アルミニウム、酸化ナトリウム、� ��化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化亜� ��などの無機物またはステンレス、ジルコニ� ��などの金属が挙げられる。これらのうち、� ��ラス、シリカ、ラテックス、または高分子� ��料が好ましく、なかでも有機ポリマー、特� ��ポリスチレンが好ましい。これらの材料は� ��般に多孔性を有するなど不規則な表面を持� ��、また、粒子、繊維、ウェブ、または焼結� ��などの様々な形態に加工することが可能で� ��る。

 担体は、全体が同一の材料から構成され� ��いる場合の他に、必要に応じて複数の素材� ��ら構成されるハイブリッド体であってもよ� ��。例えば、分析の自動化に対応するために� ��コア部分は酸化鉄、または酸化クロムのよ� ��な磁気応答性材料で作られ、その表面を有� ��ポリマーで被覆された粒子が挙げられる。� ��ような磁気応答性材料を含む担体を、本明� ��書においては、「磁性担体」とも称する。� ��た、磁性担体を担体として用いた固体支持� ��を、以下、「磁性固体支持体」とも称する� ��

 細胞を結合させた磁性担体を含む固体支� ��体を、試料液から磁石の磁力によって容易� ��(固液)分離・固体支持体の回収をすること� �できる点で、その磁性担体が常磁性体、強� �磁性体および強磁性体などの磁性体が含有� �れてなるものであることが好ましく、常磁� �体および強常磁性体の両方またはいずれか� �方が含有されてなることがより好ましい。� �に、残留磁化がないかまたは少ない点で、� �常磁性体を用いることが好ましい。

 かかる磁性体の具体例としては、四三酸化� ��(Fe ₃ O ₄ )、γ-重三二酸化鉄(γ-Fe ₂ O ₃ )、各種フェライト、鉄、マンガン、コバル� �、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル� �マンガンを含む各種合金を挙げることがで� �、これらのうち、四三酸化鉄が特に好まし� �。また、コバルト、ニッケルはヒスチジン� �グと親和性を有するという点において好ま� �い。

 本発明において用いられる磁性担体は、� ��れた磁気分離性(すなわち磁気によって短時 間で分離する性能)を有し、かつ、ゆるい上� �振盪の操作によって再分散し得るものであ� �ことが好ましい。

 磁性担体における磁性体の含有割合は、� ��磁性体の含有割合が30質量%以上であること� ��ら、70質量%以下とされるが、好ましくは20~7 0質量%、より好ましくは30~70質量%である。磁� ��体の含有割合が20質量%未満であると、充分� ��磁気応答性が発現されず、所要の磁力によ� ��て短時間で固体支持体を分離することが困� ��となることがある。一方、この割合が70質� �%を超えると、担体表面に露出する磁性体の� ��が多くなるため、該磁性体の構成成分、例� ��ば鉄イオンの溶出などが生じ、使用時に他� ��材料に悪影響を及ぼすことがあり、また、� ��体が脆くなって実用的な強度が得られない� ��とがある。

 従来からも、磁性担体を含む固体支持体� ��用いた細胞分離法(特表2003-520048号公報)が開 発されているが、これらの固体支持体は、細 菌の細胞壁のタンパク質と非特異的に結合す る糖をリガンドとして用いていたために、細 菌細胞の中には、該固体支持体に付着しない 細菌もあった。たとえ、付着する場合であっ ても、非特異的な結合であっては、目的とす る細菌細胞だけを効率よくその表面上に集積 することは非常に困難であった。本発明では ミコール酸含有糖脂質を細胞壁に有する病原 性抗酸菌(特に結核菌)を確実に単離するため� ��担体(好ましくは磁気担体)の表面にミコー� �酸含有糖脂質と結合能を有する基として、MD P1を支持体表面に結合(好ましくは共有結合)� �せている。その固定化量は、支持体材料、� �定化方法、必要とする核酸回収量などに基� �いて適宜設定される。

 また、固体支持体として磁性支持体を用� ��る核酸精製法も、これまでに多数、開発さ� ��ている。例えば、有毒な溶媒を使用しない� ��離方法として、カオトロピック試薬を利用� ��てタンパク質、脂質などの夾雑物を水相に� ��溶化し、核酸をシリカビーズに吸着させて� ��相で回収した後、その核酸を再び水相に溶� ��するBoom法(Boomら、J.Clin.Microbiol.第28巻、第495 ~503頁(1990))がある。この方法では、過塩素酸� ��どのカオトロピックイオンが必要とされる� ��したがって抽出された核酸は、短く断片化� ��れているものが多い。本発明の好ましい実� ��形態では、そのような過酷な試薬を用いな� ��生理的条件下で、磁気ビーズなどの磁気粒� ��を用いた磁性固体支持体への核酸の結合を� ��進するため、核酸に対して親和性を有する� ��として、MDP1を担体表面に固定化(好ましく� �共有結合)させ、固定化されたMDP1を介して結 合させている。そのMDP1の固定化量は、担体� �料、固定化方法、必要とする核酸回収量な� �に基づいて適宜設定される。好ましい態様� �して、特にヒスチジンタグを付した組換えMD P1(rMDP1)の調製を、遺伝子工学技術に基づいて 行うことができ、磁気ビーズ表面上への固定 化は、ヒスチジンタグを介して磁気ビーズ上 の活性化基への共有結合の形成による。

 本発明の固体支持体に用いられる担体の� ��状としては、特に限定されるものではない� ��、粒状、棒状、板状、シート、ゲル、膜、� ��維、毛細管、ストリップ、フィルターなど� ��挙げられ、好ましくは粒状である。粒状担� ��、例えばビーズは、結合能力が大きいため� ��一般に好ましく、特にポリマーのビーズが� ��ましい。

 本発明の固体支持体に用いられる担体は� ��子状であることが好ましく、粒子状の形態� ��しては、例えば球形、楕円体形、錐体、立� ��形、直方体形などが考えられる。このうち� ��形粒子の担体は製造がしやすく、各種精製� ��程において、固体支持体の回転撹拌がしや� ��いことからも好ましい。細胞を結合させる� ��体支持体としての担体のサイズは、平均粒� ��径として0.5~10μm、好ましくは2~6μmであるこ� ��が好ましい。平均粒子径が0.5μm未満である� ��合、該担体が上述のように磁性体を含有し� ��なるものは、充分な磁気応答性を発現せず� ��該担体を含む固体支持体を分離するために� ��当に長い時間を要し、また、分離するため� ��相当に大きい磁力が必要となる。一方、平� ��粒子径が10μmを超える場合には、該担体が� �性媒体中で沈降しやすいものとなるため、� �胞を捕捉する際に水性媒体中を撹拌する操� �が必要となる。また、担体の質量当たりの� �面積が小さくなるため、充分な量の細胞を� �捉することが困難となることがある。なお� �本明細書中において、「粒子径」とは、粒� �の輪郭線上の任意の2点間の距離のうち、最� ��の距離Lを意味する。また、「平均粒子径」 の値としては、走査型電子顕微鏡(SEM)や透過� ��電子顕微鏡(TEM)等の観察手段を用い、数~数� ��視野中に観察される粒子の粒子径の平均値� ��して算出される値を採用するものとする。

 本発明の固体支持体は、上記ポリペプチ� ��を上記担体の表面に固定化することによっ� ��製造できる。固定化の方法は、従来公知の� ��術を適用することによる。固体支持体の好� ��しい形態のうち、ポリペプチドとしてMDP1を 用い、担体として磁気ビーズを用いる場合に おいては、例えば、磁気ビーズのトシル基に 、ヒスチジンタグを介してペプチドを共有結 合させることにより固定化させる。磁気ビー ズのコバルトあるいはニッケルと、ヒスチジ ンタグとを配位結合させて固定化することも できる。または磁気ビーズのトシル基あるい はエポキシ基にポリペプチドのアミノ基を共 有結合させることで固定化してもよい。水溶 性カルボジイミドなどの脱水縮合剤の存在下 、該ポリペプチド分子のアミノ基を支持体表 面に露出するカルボキシル基(アンカーされ� �無水マレイン酸など)に反応させてアミド結� ��を形成することにより該ポリペプチドを固� ��化することができる。ポリスチレンにアン� ��ーされた活性マレイミド基とタンパク質の� ��ルフヒドリル基とのチオエーテル結合形成� ��もよい。あるいはポリスチレン系のラテッ� ��ス粒子に該ポリペプチドを物理的に吸着さ� ��る方法でもよい。なお、担体上に固定化す� ��ポリペプチド量やポリペプチドの種類を当� ��者が選択することによって、固体支持体に� ��合させる細胞または核酸の量や特異性を適� ��変更することができる。

 [細胞の単離方法]
 本発明の細胞の単離方法は、上記細胞結合� ��固体支持体と、ミコール酸含有糖脂質を細� ��壁に有する細菌細胞を含む試料とを接触さ� ��る段階を含むことを特徴とする。本発明の� ��胞の単離方法によると、ミコール酸含有糖� ��質を細胞壁に有する細胞を単離することが� ��きる。細胞は、ミコール酸含有糖脂質を細� ��壁に有する細胞であれば特に制限はないが� ��例えば、病原性抗酸菌細胞であることが好� ��しい。「病原性抗酸菌」(以下、単に「抗酸 菌」とも称する)は、抗酸菌(Mycobacterium sp.)に 属するグラム陽性菌で病原性を有する細菌で ある。特にマイコバクテリウム(Mycobacterium属) に属する微生物細胞の単離に好適である。結 核菌群およびMycobacterium leprae(らい菌)以外の� ��養可能な抗酸菌は、非定型抗酸菌(atypical My cobacteria)と呼ばれることもある。

 抗酸菌のうち、本発明では特に結核菌群( M.tuberculosis complex)、すなわち結核菌(Mycobacteri um tuberculosis、ヒト型結核菌)、ウシ型結核菌( M.bovis、ウシ型菌、ウシ菌)、マイコバクテリ� ��ム・アフリカンス(M.africans)、ネズミ型結核� ��(M.microti)の4菌種を対象とする。いずれも遅� ��育菌群であり、またその遺伝子も極めて類� ��しているため、遺伝学上は区別できない。� ��れら以外にもエム・アビウム(M.avium)、エム� ��イントラセルラレエ(M.intracellularae)、エム・ ケロネエ(M.chelonae)、エム・マリヌム(M.marinum)� ��パラ結核菌(M.paratuberculosis)は、疫学的およ� �臨床的観点から重要である。

 本発明の細胞の単離方法は、試料液中に� ��まれる病原性細菌、例えば、病原性抗酸菌� ��胞を、上記の固体支持体、好ましくは磁気� ��ーズなどの磁性担体を含む磁性固体支持体� ��結合させ、該細胞を試料液、不純物から分� ��して病原性抗酸菌細胞を単離するものであ� ��。

 試料は、上記細菌細胞を含有する生体由� ��の試料であれば、特に制限はないが、生物� ��来の検体、培養液もしくは細胞含有溶液が� ��当する。生物由来の検体としては、例えば� ��血、血漿、血清、バフィーコート、尿、糞� ��、唾液、喀痰、脳脊髄液、精液、組織(例え ば、癌組織、リンパ節等)、細胞培養液(例え� ��、細菌培養物等)もしくは細胞含有溶液など 生体由来のほとんどの試料が該当する。試料 の形態は、好ましくは流体の試料であり、通 常は溶液もしくは懸濁液などの液体である。

 本方法におけるその具体的な操作手順は� ��上記固体支持体として磁性固体支持体を使� ��する次の態様が例示されるが、これに限定� ��れるものではない。細胞含有試料と磁性担� ��(好ましくは磁性ビーズ)を含む磁性固体支� �体とを混ぜて撹拌し、試料液中の病原性抗� �菌細胞を、その磁性担体表面に固定化され� �ポリペプチド(好ましくはMDP1)に結合させる� �その際、磁性固体支持体への該細胞の結合� �促進するために、適当な結合バッファーを� �用してもよい。上記磁性固体支持体を試料� �から固液分離すれば、試料中に含まれる不� �物、不要物などが分離除去され、病原性抗� �菌細胞が表面に固定化されたポリペプチド� �結合した磁性固体支持体が得られる。

 次いで、該磁性固体支持体を洗浄バッフ� ��ーとともに撹拌し、洗浄する操作、引き続� ��て再び固液分離操作をすることにより、磁� ��固体支持体に付着する不純物をさらに除去� ��ることが好ましい。このように本発明の方� ��において固液分離の過程が含まれる。その� ��の固液分離の方法については特に制限はな� ��が、例えば、遠心分離操作や、磁気作用を� ��用した方法が挙げられ、磁気作用により行� ��れることが好ましい。より好ましくは、そ� ��磁性固体支持体を含む容器に外部磁石によ� ��磁気を作用させることにより、完全閉鎖系� ��固液分離が実施される。該方法によれば、� ��作は遠心分離操作よりも簡便で、コンタミ� ��ーションの虞もない。

 固体支持体が磁気ビーズを用いた磁性固� ��支持体である場合、磁性固体支持体を試料� ��と混合する前、混合した後、磁性固体支持� ��の洗浄時のうち、少なくともいずれかの段� ��において懸濁させることが好ましい。この� ��うに懸濁させる意義は、次の通りである。� ��合する前においては、磁性固体支持体は、� ��存中に担体である磁気ビーズ同士の磁力作� ��で凝集してしまう。そこで懸濁によって磁� ��固体支持体を分散させると、試料液と混合� ��る際に磁性固体支持体と細胞との接触表面� ��、接触回数が増大する。試料と混合した後� ��も懸濁状態を保つと、懸濁によって試料液� ��で磁性固体支持体が分散し、磁性固体支持� ��と細胞との接触表面積、接触回数が増える� ��また洗浄時にあっては、懸濁によって洗浄� ��ッファー中で磁性固体支持体が分散し、洗� ��バッファーの洗浄有効物質と磁性固体支持� ��中の磁気ビーズ(その表面に細胞が付着して いる)との接触表面積、接触回数が増える。� �れらの効果によって、それぞれの段階で試� �液から細胞、核酸を分離し、回収できる量� �純度の向上が期待される。

 [核酸の抽出方法]
 本発明の核酸の抽出方法は、上記細胞結合� ��固体支持体と、ミコール酸含有糖脂質を細� ��壁に有する細菌細胞を含む試料とを接触さ� ��て細胞を単離する段階および単離した細胞� ��の核酸を抽出する段階とを含むことを特徴� ��する。

 本方法における、上記固体支持体と、ミ� ��ール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細菌細� ��を含む試料とを接触させて細胞を単離する� ��階は、上述の細胞の単離方法で用いた方法� ��同様の方法を用いることができるので、こ� ��では説明を省略する。その後の、単離した� ��胞内の核酸を抽出する段階は、細菌細胞を� ��体支持体に結合させた状態で、超音波処理� ��加熱、または化学試薬処理などによりその� ��胞壁および細胞膜や核膜などの生体膜を破� ��(溶菌)して核酸を細胞外に放出させ、細胞� �が結合した固体支持体を取り除き、残りの� �液を核酸溶液として分離回収するものであ� �。この方法ではろ過、減圧処置といった操� �を含まず、簡便かつ迅速に核酸を単離する� �とができる。さらに、磁性支持体を用いた� �合は遠心分離操作を行わずに固液分離が可� �である。

 前記の細胞壁および生体膜の破壊は、公� ��の様々な物理的方法または化学的方法を用� ��ることができる。物理的方法には、超音波� ��射法、凍結・溶融法、加熱法などがあり、� ��学的方法として化学試薬を用いる処理、例� ��ば酵素消化法、カオトロープ試薬、界面活� ��剤または溶菌剤などによる変性法などが知� ��れている。特開平06-319527号公報の表1および 2には、マイコバクテリウムなどの細胞を溶� �するための様々のプロトコールがまとめら� �ている。

 本発明の方法では、溶菌処理として超音� ��照射法、凍結・溶融法、加熱法などの物理� ��方法、または化学試薬処理あるいはこれら� ��組み合わせにより細胞膜破壊が行われるこ� ��が好ましい。特に、物理的な方法は操作が� ��便であり、化学試薬処理のように細胞膜破� ��に使用した薬剤(カオトロープ試薬、界面活 性剤、または溶菌剤など)を後で除く必要が� �いため、望ましい。後工程で行われる反応� �処理に悪影響を及ぼすそのような薬剤を使� �しなければ、単離された核酸は、そのままDN A増幅反応、ハイブリダイゼーション、制限� �素反応、検出反応または電気泳動分析など� �適用することができる。したがってサンプ� �量が微量であっても、本発明の方法によれ� �、細胞から核酸を高収率で単離することが� �きる。

 上記の超音波処理または加熱処理、超音� ��および加熱の併用処理は、溶菌に有効な処� ��条件であり、少なくとも核酸が、超音波ま� ��は熱により変性しない範囲で行う。超音波� ��理の場合、溶菌に有効である超音波の照射� ��件、照射時間を適宜設定する。照射量は、� ��用する超音波分散機の定格出力、照射する� ��濁液の量、照射する時間から計算すること� ��できる。例えば、超音波強度は、製剤の容� ��、撹拌条件などによって選択されるが、周� ��数10~100kHz、好ましくは15~45kHzの超音波を、� �なくとも5分間、好ましくは5~30分間程度照射 することが好ましい。加熱処理の場合、その 温度範囲、すなわち70~120℃、好ましくは80~120 ℃、さらに好ましくは80~100℃で、20秒~10分間� ��好ましくは20秒~300秒間の加熱による。加熱� ��件(温度、時間)は細胞または菌の種類(大き� ��、細胞膜の組成と厚さなど)によって異なる ため、上記の範囲で適宜選択する。加熱は、 あらゆる適切な加熱手段により行われるが、 ドライ・ヒートブロック、湯浴、マイクロウ ェーブ・オーブン、各種ヒーターなどが例示 される。しかし、これらに限定されるもので はない。前記病原性抗酸菌細胞を溶解して核 酸を遊離させるためのより好ましい処理は、 加熱および超音波照射の処理による態様であ る。超音波照射と加熱を組み合わせた併用処 理では、上記のそれぞれの処理条件よりもさ らに温和な条件で溶菌が達成できる。

 [核酸の精製方法]
 本発明の核酸の単離方法は、上記核酸結合� ��固体支持体と、核酸を含む試料とを接触さ� ��る段階を含むことを特徴とする。

 本発明の単離方法の対象とする核酸は、DNA� ��たはRNAであり、DNAとしてゲノムDNA、cDNAなど 、またRNAとしてmRNA、t RNA、r RNAなどが含ま� �る。さらには一本鎖または二本鎖を問わな� �。単離されるDNA量は、0.0005ng~2mg、好適な範� �として0.001ng~1mg(200~2×10 ¹¹  copies)である。

 精製の対象とする核酸を含む試料として� ��、細胞溶解により抽出された核酸を含む溶� ��、電気泳動後の泳動ゲル中から抽出された� ��酸を含む溶液、酵素反応後の核酸含有溶液� ��どが該当する。ここで細胞溶解により抽出� ��れた核酸を含む溶液とは、生物由来の検体� ��培養液もしくは細胞含有溶液から抽出され� ��核酸を含む溶液であって、細胞膜破壊処理� ��より遊離してきた核酸が存在している。生� ��由来の検体は特に限定されず、広く生物起� ��の材料、生体からの試料など、細胞(細菌細 胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞など)を� �む被験物が挙げられる。培養液は、微生物� �細胞、組織などを培養した培養液である。� �た、酵素反応後の核酸含有溶液における酵� �反応とは、酵素反応として特に限定されな� �が核酸が基質などとして関与する酵素反応� �あり、その結果生じる反応溶液には核酸ま� �はその断片が含有されている。例えば制限� �素、逆転写酵素、DNAポリメラーゼなどを使� �する酵素反応である。

 本発明において、上記核酸はGCリッチな� �酸であることが好ましい。ここで「GCリッチ な核酸」とは、GCに富む核酸、換言するとGC� �量が高い核酸をいい、特にGCリッチ(rich)な配 列を多く含む核酸が該当する。GC含量は核酸� ��塩基組成を表す場合、GとCが全体の中で占� �る割合(%)をいう。DNAのGC含量は生物ごとに異 なり、高等動物では42%を中心とした狭い範囲 の値をとる。核酸塩基としてGとCが多く含ま� ��る遺伝子には細胞の生存に必要な基本的な� ��伝子が多いとされる。GCリッチな配列は、� �象とする核酸の塩基配列において、部分的� �G(グアニン)とC(シトシン)の含量が高い配列� �いう。具体的にはGC含量が60%以上、好ましく は70%以上、特に好ましくは80%以上である。例 えば遺伝子のプロモーター領域に多い「CpG島 」が示される。しかしながら、必ずしも「CpG 島」のようにグアニン(G)とシトシン(C)が隣り 合っている配列でなくともよい。

 本発明の核酸の単離方法に従えば、「核� ��結合タンパク質」として予め「核酸結合能� ��持つタンパク質」を選定しておくことによ� ��、核酸結合タンパク質が認識する特異的な� ��基配列を含む核酸またはその断片を「該タ� ��パク質に結合する核酸」として探索するこ� ��ができる。この場合、結合する核酸は、非� ��異的な相互作用に基づいて結合することも� ��るが、特異的なタンパク質結合部位(protein-b inding site)を有する核酸であってもよい。

 本発明の核酸の単離方法の好ましい態様� ��、生物由来の検体、培養液もしくは細胞含� ��溶液に含まれる細胞の細胞膜破壊により細� ��溶解して抽出された核酸、電気泳動後の泳� ��ゲル(例えばアガロースゲル、ポリアクリル アミドゲルなど)から抽出された核酸、また� �酵素反応後の核酸含有溶液中の核酸を前記� �体支持体と接触させることにより、その表� �上のMDP1に結合させ、該核酸を回収して精製� ��ることを特徴とする方法である。さらに好� ��しい態様では、磁性固体支持体表面のMDP1に 結合した核酸を、磁石、磁気選別機などの手 段によって固液分離することにより、細胞膜 、その他の細胞内成分、アガロースゲル成分 もしくはポリアクリルアミドゲル成分、また はタンパク質などの夾雑物、さらに化学試薬 を含んでいる溶解バッファーから分離し、所 望する核酸を分離して精製することができる 。この方法による核酸の精製では、核酸を捕 捉した固体支持体を洗浄する操作、捕捉され た核酸を固体支持体から溶離する操作におい て、遠心分離、ろ過、デカンテーションなど の代替として、磁気作用を利用した固液分離 をする。遠心分離、ろ過、減圧処置といった 操作を含まないために、簡便かつ迅速に核酸 を単離・精製することができる。

 本発明の好ましい態様としては、上記の� ��胞の単離、核酸の抽出、核酸の精製方法を� ��み合わせて病原性細菌細胞を含む試料から� ��酸を精製する方法すなわち、ミコール酸含� ��糖脂質との結合能を有するポリペプチドが� ��体表面に固定化されてなる固体支持体と、� ��コール酸含有糖脂質を細胞壁に有する細菌� ��胞を含む試料とを接触させて細胞を単離す� ��段階、単離した細菌細胞の核酸を抽出する� ��階、および核酸との結合能を有するポリペ� ��チドが担体表面に固定化されてなる固体支� ��体と、核酸を含む試料とを接触させる段階� ��含む、核酸の単離方法が挙げられる。本方� ��によると、固体支持体に結合したまま核酸� ��抽出および抽出された核酸の精製を連続的� ��進めることができる。細胞の単離、核酸の� ��出、核酸の精製の各段階の好ましい操作方� ��は上述の通りであるので、ここでは説明を� ��略する。

 本方法の好ましい態様としては、固体支� ��体のMDP1に病原性抗酸菌細胞を結合させた後 、物理的方法または化学的方法などにより結 合している該細胞を溶解して核酸を遊離させ 、固体支持体のMDP1に結合させて分離する核� �の精製方法が挙げられる。核酸の精製に用� �る固体支持体は、細胞の単離に用いたもの� �再度核酸の精製に用いてもよいし、別の固� �支持体を用いてもよい。すなわち、試料に� �まれる細胞を固体支持体に一旦結合させ、� �いで細胞溶解によって遊離する核酸を同一� �または別の固体支持体上に回収する態様で� �ってもよい。

 上記病原性抗酸菌を結合した磁性固体支� ��体を溶解バッファーに懸濁させ、必要であ� ��ばさらに加熱、超音波などの変性処理によ� ��て細胞膜を破壊する。該細胞から遊離し、� ��性固体支持体表面のMDP1に結合した核酸を、 上記手段によって固液分離することにより細 胞膜、その他の細胞内成分、さらに化学試薬 を含んでいる溶解バッファーから分離し、所 望する核酸を単離することができる。しかし ながら、細胞の単離、核酸の抽出、核酸の精 製の各段階の具体的な方法については、上記 の形態に制限されることなく、上述したいか なる方法をも適宜採用することができる。こ の方法では遠心分離、ろ過、減圧処置といっ た操作を含まないために、簡便かつ迅速に核 酸を単離・精製することができる。

 本方法により、細胞から核酸を抽出した� ��に、電気泳動などにより目的の核酸を抽出� ��る工程を含む場合には、電気泳動に用いた� ��ガロースゲルの溶解は、公知の化学試薬と� ��熱処理によって行うことができる。本発明� ��方法では、Promega社のPCR purification kitを用� �て、60℃で加熱処理することが好ましい。な お、核酸の抽出後に遊離した核酸を固体支持 体上のMDP1が効果的に捕捉する条件を設定す� �必要がある。この段階に先立ち、例えば固� �支持体を含む懸濁液全体を透析することに� �り、細胞膜破壊に使用した上記溶解バッフ� �ー、アガロースゲル溶解液あるいは酵素反� �溶液を除去してもよい。固体支持体上のMDP1� ��結合して残留している核酸を洗浄して不要� ��を除き、次いで固体支持体から分離するこ� ��によって精製された核酸は、そのままDNA増� ��反応、ハイブリダイゼーション、制限酵素� ��応、検出反応または電気泳動分析などに適� ��することができる。したがって試料量が微� ��であっても、本発明の方法によれば、細胞� ��ら高収量でしかも純度が高い核酸を単離す� ��ことができる。具体的には、前記の細胞膜� ��壊処理は、溶菌に有効な処理条件であり、� ��たアガロースの溶解処理は、アガロース溶� ��に有効な処理であり、少なくとも遊離する� ��酸が変性しない範囲である。固体支持体か� ��核酸を溶出するには、低イオン強度の溶媒� ��緩衝液を固体支持体に作用させ、必要なら� ��温する。核酸溶出のための温度は、好まし� ��は50~90℃、より好ましくは70~80℃である。こ のような溶出液としては、水、トリス塩酸緩 衝液、リン酸緩衝液などが例示される。溶出 された核酸は、上記固液分離操作などにより 固体支持体を除去して回収される。

 上記の核酸精製方法により得られた核酸� ��、PCR、SDA、LCR、LAMP、TMA、TAS、3SR、NASBAなど� ��DNA増幅法に用いたり、例えば塩基配列決定� ��ハイブリダイゼーション法、サザンブロッ� ��分析などの解析に用いたりすることもでき� ��。

 本発明の核酸の単離方法は、上述の具体� ��な記載に限定されるものでなく、任意の核� ��結合タンパク質と任意の核酸との結合に基� ��く単離精製をする際にも利用可能であるこ� ��はいうまでもない。

 [キット]
 本発明に係るキットは、ミコール酸含有糖� ��質および/または核酸との結合能を有するポ リペプチドが、担体表面に固定化されてなる 固体支持体を含む。該キットは、本発明の細 胞の単離方法、核酸の抽出方法、または核酸 の単離方法あるいはこれらを組み合わせた核 酸の単離方法に使用されうる。このため、該 キットは、本発明の固体支持体の他にも、本 発明の方法を実施するために必要とされる器 材一式、具体的には、各種試薬、固体支持体 (好ましくは磁気担体を含む固体支持体)、細� ��単離および核酸抽出・精製に必要な器具を� ��みうる。これらの試薬の中には、試料を溶� ��(または希釈)するための溶解(または希釈)液 、洗浄液、各種の緩衝液なども含まれる。本 発明の方法を実施するための磁気ビーズ、結 合バッファー、細胞洗浄バッファー(細胞洗� �液)、溶解バッファー(再懸濁液)、核酸洗浄� �ッファー(核酸洗浄液)、核酸溶出バッファー (溶出液)がそれぞれ容器に予め封入されてい� ��態様のキットが好ましい。必要な器材一式� ��中には、さらに細胞を固体支持体に付着も� ��くは結合させ、その細胞膜を破壊して内部� ��含まれる核酸を抽出する専用の器具を、キ� ��ト要素として含めてもよい。これらの器具� ��用いて上記の本発明の核酸抽出・精製方法� ��実施することができる。

 後述する本発明の方法を実施するために� ��上記以外の用具または機器を必要とするこ� ��もあるが、これらは適宜、本発明のキット� ��構成要素として含められる。固液分離には� ��気選別機を使用するが、遠心分離機を利用� ��てもよく、その場合小型遠心機などを使用� ��る。

 本発明の細胞の単離方法または核酸の抽� ��方法では、少なくとも2種の緩衝液が使用さ れる。結合バッファーは、塩として塩化ナト リウム、酢酸カリウム、またEDTA、界面活性� �などを含んでもよいリン酸系、酢酸系、ト� �ス系、またはHEPES系の緩衝液が挙げられ、例 えばPBS、TBS、HBSが示される。洗浄バッファー は、上記結合バッファーを4~5倍に希釈したも のを用いてもよいが、異なる種類のバッファ ーを別途に用意してもよい。溶解バッファー としては、水または緩衝液、または塩を含有 する緩衝液が例示され、特にTE緩衝液が好適� ��ある。上記のように、本キットには、従来� ��術において核酸抽出に用いられてきたクロ� ��ホルム、フェノールなどの有機溶媒、カオ� ��ロープ試薬、溶菌剤などを含まないことが� ��ましいが、必要によってはこれらの試薬を� ��宜採用することも可能である。

 また、上記細胞の単離、核酸の抽出、核� ��の精製方法を組み合わせて病原性細菌細胞� ��含む試料から核酸を精製する方法では、少� ��くとも4種の緩衝液が使用される。結合バッ ファーは、塩として塩化ナトリウム、酢酸カ リウム、またEDTA、界面活性剤などを含んで� �よいリン酸系、酢酸系、トリス系またはHEPES 系の緩衝液が挙げられ、例えばPBS、TBS、HBSが 示される。細胞洗浄バッファーは、上記結合 バッファーを4~5倍に希釈したものを用いても よいが、異なる種類のバッファーを別途に用 意してもよい。溶解バッファーとしては、SDS などを含むPBS、TBS、HBSなどが例示され、特に 核酸がMDP1と結合するのに最適なものが良い� �核酸洗浄バッファーは、上記溶解バッファ� �を4~5倍に希釈したものを用いてもよいが、� �なる種類のバッファーを別途に用意しても� �い。核酸溶出バッファーとしては、水また� �緩衝液、または塩を含有する緩衝液が例示� �れ、特にTE緩衝液が好適である。上記のよう に、本キットには、従来技術において核酸抽 出に用いられてきたクロロホルム、フェノー ルなどの有機溶媒などは含まないことが好ま しいが、必要によってはこれらの試薬を適宜 採用することも可能である。

 必要な器具一式と試薬類を一つのセット� ��して、本発明の核酸抽出・精製方法専用の� ��ットを構成する。いずれの用具も通常は1回 分析用の消耗品として構成されることが好ま しい。バッファーなどを含む容器は予め滅菌 処理され、雑菌の汚染を防止することが好ま しい。

 本発明の方法を実施する際には、上記の� ��耗品とともに撹拌のためのミキサー、撹拌� ��、加熱するためのヒーターもしくは超音波� ��生器、磁気処理による固液分離に使用する� ��石、磁気選別機なども使用される。具体的� ��は、撹拌は試験管ミキサーによる振動、ま� ��は容器を回転する転倒混和が好ましく、磁� ��は棒磁石であってもよい。磁石の種類は電� ��石、永久磁石のどちらでもよいが、簡便性� ��操作性から永久磁石、特に磁力の強さから� ��オジム磁石が好ましい。

 これらは、通常、検査室に備えられてい� ��機器であり、それらの機器を本キットとと� ��に使用して本発明方法を実施することがで� ��る。さらに必要であれば、そうした機器の� ��部をキットの構成物として含めてもよい。

 上記固体支持体、キットの全体または一� ��についても、構造、構成、配置、形状形態� ��寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣� ��に合致する限り、種々のものにすることが� ��きる。

 予め特定の「核酸結合タンパク質」を選� ��して、「該タンパク質を結合する核酸」を� ��索する場合、「核酸」は、前記「核酸結合� ��ンパク質」を特異的もしくは非特異的に結� ��することが予測される任意の核酸であり得� ��。本発明のこのような局面において、上記� ��キットおよび核酸単離方法を利用して、目� ��とする核酸または特異的な遺伝子の効率的� ��探索にも供することができる。また、DNA-タ ンパク質相互作用を標的とする化合物、タン パク質および試薬のスクリーニングのために も利用することができる。この場合、特定の DNA-タンパク質相互作用に対して影響を及ぼ� �作用は、DNAの結合量の測定で評価すること� �できる。

 本方法の一例として、GCリッチな塩基配� �を有するDNAもしくは遺伝子の探索に利用す� �態様がある。GCリッチな配列を有する遺伝子 の遺伝子産物は、サイトカイン、成長因子、 キナーゼ、転写因子など重要な生理的意義を 持つものが多い。また、上記の「CpG島」メチ ル化現象は、遺伝子の転写活性調節と発現制 御に関与し、また疾患と治療に関わるSNP(一� �基多型)解析にも関係してくる。さらに「ト� ��プレットリピート病」という遺伝子レベル� ��規定される疾病に関係する既知のトリプレ� ��トにGとCが占める割合が高い。このようにGC リッチな塩基配列、リピート配列を有するDNA もしくは遺伝子(「GCリッチ遺伝子」)の調査� �研究は、ゲノム機能と調節、疾患、再生医� �、発生、老化などの分野で極めて重要な位� �を占めている。それにもかかわらず、GCリッ チな塩基配列を有する核酸、遺伝子の研究は 、強固な2次構造や配列多様性の低下による� �いホモロジーが原因となり、増幅効率の低� �、プライマーにおける制約、塩基配列解析� �おける障害、低い翻訳効率、SNP検出効率の� �下などの障害に直面する。本発明の精製方� �およびキットは、G、C塩基を認識するMDP1な� �を利用するために、GCリッチ核酸のスクリー ニングおよびその単離が容易であり、また特 異的な遺伝子の探索と同定にも有用である。