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Title:
SOLUBLE BALLS FOR PREPARING SOLUTIONS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2017/162801
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to the preparing of solutions, in particular for performing analysis methods, in particular by spectrometry, especially for the production of standard solutions that are useful, for example, in the calibration of spectrometry apparatus or for performing diagnostic methods. The invention enables the performing of an easy preparation method for such standard solutions. In particular, the present invention relates to the preparation of a solution of at least one product to be dissolved, comprising the dissolving of one or more soluble balls in the solvent of the solution, to the surface of which said product or products are grafted.

Inventors:
FORTIN, Tanguy (22 rue Germain, LYON, 69006, FR)
BARDET, Chloé (8 rue Rabelais, LYON, 69003, FR)
BIARC, Jordane (7 rue Celu, LYON, 69004, FR)
Application Number:
EP2017/056949
Publication Date:
September 28, 2017
Filing Date:
March 23, 2017
Export Citation:
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Assignee:
ANAQUANT (5 Rue de la Doua, VILLEURBANNE, 69100, FR)
International Classes:
G01N1/28; C07K17/10; G01N30/72; G01N33/68; H01J49/00
Domestic Patent References:
WO2013043388A12013-03-28
WO2003008547A22003-01-30
WO2010035504A12010-04-01
WO2014066284A12014-05-01
WO2013043388A12013-03-28
WO1998007411A11998-02-26
Foreign References:
US5591473A1997-01-07
US20080090295A12008-04-17
EP1456227A22004-09-15
US5591473A1997-01-07
FR2574659A11986-06-20
Attorney, Agent or Firm:
TETAZ, Franck (9 rue Paul Chevrel, SAINT DIDIER AU MONT D'OR, 69370, FR)
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Claims:
REVENDICATIONS

1 . Procédé de préparation d'une solution d'au moins un produit à dissoudre, caractérisé en ce qu'il comprend la dissolution d'une ou plusieurs billes solubles dans le solvant de la solution à la surface desquelles sont greffés le ou lesdits produits.

2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les billes sont calibrées avec un diamètre homogène.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le diamètre des billes va de 1 à 4 mm.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le solvant contient de l'eau et la bille constituée de un ou plusieurs composés hydrosolubles choisis parmi les sucres, les polyosides, les acides hydroxycarboxyliques, et leurs mélanges.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le composé hydrosoluble est choisi parmi le saccharose, le lactose, les alginates et l'acide lactique.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la quantité de produit greffé sur chaque bille est prédéterminée, de 1 picogramme à 100 microgrammes par bille.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le produit est choisi parmi les peptides, les protéines ou petites molécules, éventuellement marquées isotopiquement, deutérées ou pouvant contenir des modifications comme les phosphorylations, les oxydations ou les carbamidométhylation.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la solution préparée est appropriée pour son utilisation dans une méthode d'analyse par spectrométrie.

9. Ensemble de billes solubles supportant un produit à analyser greffé à leur surface, telles que décrites dans l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les billes ont chacune une quantité prédéterminée de produit greffé à leur surface sensiblement égale.

10. Ensemble de billes selon la revendication 9, caractérisé en ce que les billes sont conditionnées dans un même emballage permettant une libération contrôlée du nombre de billes.

1 1 . Gamme de produits à analyser caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux ensembles de billes selon la revendication 9 ou 10, chaque ensemble ayant une quantité prédéterminée de produit adsorbé différente des autres ensembles.

12. Gamme selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce que les quantités prédéterminées de chaque ensemble sont séparées d'un facteur prédéterminé.

13. Procédé de préparation billes solubles supportant un produit à analyser greffé à leur surface, telles que décrites dans l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend une première étape d'imprégnation des billes de polymères par une solution contenant la ou les produits à dissoudre pour permettre le greffage desdits produits à la surface des billes, puis une étape de séchage des billes greffées obtenues.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'imprégnation et/ou le séchage sont réalisés sous atmosphère contrôlée.

15. Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que le cycle d'imprégnation et de séchage est répété plusieurs fois.

Description:
BILLES SOLUBLES POUR LA PRÉPARATION DE SOLUTIONS

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne la préparation de solutions, notamment pour la mise en œuvre de méthodes d'analyse, en particulier par spectrométrie, notamment pour la réalisation de solutions standard utiles par exemple à la calibration d'appareils de spectrométrie ou pour la mise en œuvre de méthodes de diagnostique. Elle permet la mise en œuvre d'un procédé aisé de préparation de telles solutions standard. ETAT DE LA TECHNIQUE

L'utilisation d'appareils de spectrométrie nécessite une calibration de ces derniers, tant pour s'assurer de son bon fonctionnement, de la qualité des résultats, que pour mettre en œuvre des méthodes de spectrométrie quantitative.

On connaît par exemple des méthodes d'analyse quantitatives de protéines par spectrométrie de masse au moyen de gammes de produits marqués nécessitant la réalisation de solutions standard (EP 1 456 227, WO 2010/035504, WO 2014/066284). La réalisation de telles solutions standard est souvent chronophage et nécessite une attention toute particulière pour s'assurer une bonne reproductibilité des résultats dans le temps et une bonne stabilité.

De même, la préparation de solutions de réactifs pour des réactions chimiques ou enzymatiques en quantité prédéterminées pourrait être simplifiée si on disposait de moyens simples de préparation de solutions standard qui préservent l'activité de ces réactifs, molécules chimiques ou enzymes.

La demande WO 2013/043388 décrit la préparation par lyophilisation de particules constituées essentiellement de protéines à dissoudre avec du sel, un tampon et un agent de charge. Cette technique de lyophilisation ne permet pas de réaliser des particules calibrées susceptibles d'être employées pour la préparation de solutions standard.

Le brevet US 5,591 ,473 décrit la préparation d'un complexe protéine-polysaccharide, bien connu de l'homme du métier, mais ne décrit pas la préparation de tels complexes pour la préparation billes calibrées.

La présente invention permet de résoudre ce problème technique avec des billes solubles supportant au moins un produit à solubiliser greffé à leur surface.

EXPOSE DE L'INVENTION

L'invention concerne un procédé de préparation d'une solution d'au moins un produit à dissoudre, en particulier à dissoudre en quantité prédéterminée, notamment pour son analyse par spectrométrie, caractérisé en ce qu'il comprend la dissolution d'une ou plusieurs billes solubles dans le solvant de la solution à la surface desquelles sont greffés le ou les dits produits à dissoudre, en particulier pour leur analyse.

Elle concerne aussi un ensemble de billes solubles supportant au moins un produit à dissoudre greffé à leur surface, caractérisé en ce que les billes ont chacune une quantité prédéterminée de produit greffé à leur surface sensiblement égale, en particulier un ensemble dont les billes sont conditionnées dans un même emballage permettant une libération contrôlée du nombre de billes, et par ce moyen un contrôle de la quantité de produit à dissoudre.

L'invention concerne également une gamme de produits à dissoudre caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux ensembles de billes selon l'invention, chaque ensemble ayant une quantité prédéterminée de produit greffé différente des autres ensembles.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un procédé de préparation d'une solution d'au moins un produit, caractérisé en ce qu'il comprend la dissolution d'une ou plusieurs billes solubles dans le solvant de la solution à la surface desquelles est greffé le ou lesdits produit.

Par bille, que l'on peut également appeler grain, on entend selon l'invention tout support solide particulaire de forme patatoïde susceptible de s'écouler au travers d'un tamis. Toutefois, l'objectif étant de réaliser des solutions standard, l'homme du métier choisira de préférence des billes de forme homogène, notamment ovoïdes, de préférence essentiellement rondes.

Les billes sont avantageusement calibrées avec un diamètre homogène, de préférence de 1 à 4 mm. La mesure du diamètre des billes est bien connue de l'homme du métier. S'agissant de préférence de billes produites industriellement, le diamètre moyen d'un ensemble de bille produites dans un même lot est généralement homogène, avec une marge d'erreur de moins de 5%, de préférence de moins de 3%. Le diamètre des billes peut contrôlé par l'utilisation de tamis tolérant une marge d'erreur de 5%, voire de 3%, de la taille attendue.

L'homme du métier connaît bien les constituants des billes et saura les choisir en fonction du solvant employé dans les solutions et de l'usage de la solution obtenue, notamment de spectrométrie, et pour un produit à analyser, de la nature du produit et de la méthode de spectrométrie. En effet, les constituants des billes ne doivent pas interférer avec les produits greffés après dissolution, et notamment avec les appareils de spectrométrie et les résultats obtenus.

Par « greffé », on entend selon l'invention toute interaction entre le support et le produit qui permet de lier le produit à son support lors de son stockage (produit sec) et facilite la libération du produit après dissolution du support. Cette liaison peut être une liaison physicochimique forte ou faible, en particulier une adsorption du produit à la surface du support. Il est important que la liaison produit/support soit rompue de sorte que le produit soit substantiellement intégralement libéré dans la solution. L'homme du métier saura déterminer cette libération intégrale en comparant la concentration attendue en produit dans la solution à la concentration mesurée.

Le solvant des solutions est généralement de l'eau ou une solution hydroacloolique, de préférence de l'eau.

La bille est avantageusement constituée de un ou plusieurs composés hydrosolubles choisis parmi les sucres, les polyosides, les acides hydroxycarboxyliques, et leurs mélanges, en particulier choisis parmi le saccharose, le lactose, les alginates, l'acide lactique et leurs mélanges.

On citera en particulier les billes employées comme support pour des préparations homéopathiques, bien connues de l'homme du métier, notamment décrites dans WO 98/0741 1 .

De manière avantageuse, la quantité de produit greffé sur chaque bille est prédéterminée de sorte que chaque bille d'un ensemble de billes comprend substantiellement la même quantité de produit, permettant ainsi à l'homme du métier de connaître la quantité de produit dans la solution par simple multiplication du nombre de billes dissoutes dans la solution.

La quantité de produit va de 1 picogramme à 100 microgrammes par bille.

Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour préparer des solutions de produits à analyser, plus particulièrement par spectroscopie.

Bien entendu, le procédé selon l'invention est adapté pour la préparation aisée de solutions de produits de concentrations prédéterminées, quelque soit la finalité de ces solutions.

Par produit à dissoudre, on entend tout produit dont la dissolution permet de réaliser des solutions de concentrations prédéterminées, comme des molécules chimiques, des peptides ou des protéines, notamment des enzymes.

Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un procédé de préparation d'une solution d'au moins un produit pour son analyse par spectrométrie, caractérisé en ce qu'il comprend la dissolution d'une ou plusieurs billes solubles dans le solvant de la solution à la surface desquelles sont greffés le ou les dits produits à analyser

Selon un autre mode particulier de réalisation, l'invention concerne un procédé de préparation d'une solution d'au moins une enzyme active, caractérisé en ce qu'il comprend la dissolution d'une ou plusieurs billes solubles dans le solvant de la solution à la surface desquelles sont greffés la ou les enzymes dont l'activité à été préservée.

L'homme du métier connaît les différents produits susceptibles d'être employés pour préparer des solutions de concentrations prédéterminées, en particulier pour des analyses par spectrométrie, notamment comme produits de calibration, ou pour préparer des solutions d'enzymes. On citera notamment les peptides, protéines ou petites molécules. Les molécules greffées peuvent être marquées isotopiquement, deutérées ou contenir des modifications comme les phosphorylations, les oxydations, les carbamidométhylation ou tout autre modification post traductionnelle connues dans le cas des peptides ou des protéines. Les molécules greffées peuvent être synthétisées chimiquement puis adsorbé sur le support polymérique purifiées ou non. Les molécules peuvent également être purifiées directement à partir d'échantillon biologique avant d'être greffées sur les supports polymériques ou être ajouté greffée lors de la production par couche successive des supports polymériques.

La bille selon l'invention peut comprendre plusieurs produits greffés, chacun dans des proportions prédéterminées, indépendantes les unes des autres. Une même bielle peut avoir greffé à sa surface 2, 3, 5, 10, 20 voir 30 produits différents ou plus. Une bille greffée avec plus de 70 produits différents a été préparée selon la présente invention.

Parmi les produits susceptibles d'être greffés, seuls ou combinés, on peut citer des peptides ou des petites molécules organiques, notamment des produits ayant une activité thérapeutique, comme des antibiotiques, en particulier les produits ci-après

Séquence Séquence Séquence Séquence Séquence peptide/ Nom peptide/ Nom peptide/ Nom peptide/ Nom peptide/ Nom molécule molécule molécule molécule molécule

EGVLYVGSK Bitertanol TFDPYYAVALVK Isoprocarb VQIINK

VQIVY [Pho] KP

EGWAAAEK Boscalid FTDPVNIISVYK Isoproturon VDLSK

EGWHGVTTVAE LGDPLGADVAQV AVFVDLEPTVID K Bromucanozole TGALR Ivermectin EVR

EQVTNVGGAW YQPPTWPG TGVTAVAQK Bupirimate GIDPEAVLADLR Kresoxim- VGIN

methyl GDLAK

YDPLWFSHGLGA VAPEEHPVLLTEA

QGVAEAAGK Buprofezin FR Linuron PLNPK

TVEGAGNIAAA TGFVK Butafenacil QDPNEILIFWSK Lufenuron GYSFTTTAER

AEEAGIGDTPN

EQDPVTNVGGAW QEDQAAGHV [ Butocarboxim TGVTAVAQK Mandipropamid DVNAAIAAIK

Pho ] QAR

AEEAGIGDTPN

Butoxycarboxi

QEDQAAGHVTQ IDPGSSDGSSSR Mefenacet El IDPVLDR

AR m

AEEAGIGDTPS LEDEAAGHV [ Carbaryl EGDPWAAAEK Mepanipyrim DSYVGDEAQSK

Pho ] QAR

AEEAGIGDTPS LEDEAAGHVTQ Carbendazim EADPNYIGSDK Mepronil AVFPSIVGRPR

AR

C [CAM] GSLGN

IHHKPGGGQVE Carbetamide SQDPTVLQNTGGR Mesotrione GIAPLQLGK

VK

LHTFGDENEDDSE

DRTGNDEK Carbofuran SGDPGVCLNCR Metaflumizone LAR ES [Pho] PLQT

PTEDGSEEPGS Carboxin ATDPFNPAQDK Metalaxyl SGGVCLNCR ETSDAK

ES [Pho] PPQP

Carfentrazone- PADDGAEEPGS ANDPIGATLNR Metconazole SPIAPCIK ETSDAK ethyl

ESPLQTPTEDG SEEPGSETSDA Chlorantranilipr LYYDPSQDNDR Methabenzthiaz SSLVIQWR K oie uron

ESPPQPPADDG

Methamidopho

AEEPGSETSDA Chlorfluazuron SDPIAPCIK gentamicine K s

FDPVHAALVWGPE

GAAPPGQK Chlorotoluron SLADPAWTGK Methiocarb K

GAASPAQK Chloroxuron TLDPFSR Methomyl SYDPYWIGIR

HLSNVSSTGSI

LHDPTFGDENEDD DMVDSPQLATL Clethodim SELAR Methoprotryne Flusilazole ADEVSASLAK

HVLGGGSVQIV YKPVDLSK Clofentezine ASDPYLDCIK Methoxyfenozid

Flutolanil e

HVPGGGSVQIV IGDPSLDNITHVP YKPVDLSK Clothianidin GGGNK Metobromuron Flutriafol

IATPRGAAPPG ADPAATWDVDEV

Cyazofamid

QK R Metribuzin Forchlorfenuron

IATPRGAASPA Formetanate

Cycluron VDPSVYPLDR Mevinphos QK HCL

IGS [Pho] LDN

I HVPGGGNK Cymoxanil EGDPYYGYTGAFR Mexacarbate Fuberidazole

IGS [Pho] EN

LK Cyproconazole DSDPAYGFFK Monocrotophos Furalaxyl

IGSLDNITHVP GGGNK Cyprodinil VEDPSWILR Monolinuron Furathiocarb

IGSTENLK Cyromazine SSDPLVIQWR Moxidectin Halofenozide

LDLSNVQS [Ph

CIPDFVNAAFGK

o] K Desmedipham Myclobutanil Hexaconazole

LDLSNVQSK Diclobutrazol Tacrolimus Neburon Hexaflumuron

LQTAPVPMPDL K Dicrotophos Sirolimus Nitenpyram Hexythiazox

QEFDTMEDHAG DYTLLQDQEGD Diethofencarb Everolimus Novaluron Hydramethylnon MDHGLK

QEFEVM [Oxi ] TCTTPAQGNSMFP

EDHAGTYGLGD Difenoconazole SCCCTKPTDGNCT Nuarimol Imidacloprid R CIPIPSSWAFAK

QEFEVMEDHAG TCTTPAQGNSMFP TYGLGDR Diflubenzuron SCCCTKPTD Omethoate Indoxacarb

S [Pho] PWSG GNCTCIPIPSSWA

Dimethoate Ipconazole DTS [Pho] PR FAK Oxadixyl

S [Pho] PWSG KTCTTPAQGNSMF

Dimethomorph

DTSPR PSCCCT Oxamyl Iprovalicarb

S [Pho] P [P

KPTDGNCTCIPIP

ho] AEDVTAPL Dimoxystrobin SSWAFA Paclobutrazol Isocarbophos VDEGAPGK

S [Pho] PT [P

TCTTPAQGNSMFP

ho] AEDVTAPL Diniconazole SCCCTK Penconazole GIAPLQLGK VDER

S [Pho] TPTAE

PTDGNCTCIPIPS IAKPNVSASTQAS DVTAPLVDEGA Dinotefuran SWAFAK Pencycuron R

PGK S [Pho] PTAE

Dioxacarb LGPLV*EQGR Phenmedipham TLDFHDSNVK DVTAPLVDER

SGYSSPGS [Ph

LGATQSNEITIPV

o] PG [Pho] P Diuron Picoxystrobin VLPEDGPR

TFESR GSR

SGYSSPGS [Ph NGVPQEESLEDSD Piperonyl

Doramectin YLGADYIK o] PGTPGSR VDADFK butoxide

SGYSSPGSPGT 3-

Emamectin- LGASVPGSQTVW

Pirimicarb Hydroxycarbofur [Pho] PGSR benzoate K

an

SGYSSPGSPGT

Epoxiconazole NGISQVLEK Prochloraz Abamectin PGSR

SPWSGDTS [P

Eprinomectin NGFSIQVR Promecarb Acephate ho] PR

SPWSGDTSPR Etaconazole DGVTLQK Prometon Acetamiprid

STP [Pho] AE

Acibenzolar-S- DVTAPLVDEGA Ethiofencarb S G I P DNAFQ S FGR Propamocarb

methyl PGK

STP [Pho] AE LGLIFDTSNLQSG

Ethiprole Propargite Alanycarb DVTAPLVDER VPSR

STPTAEDVTAP

Ethirimol LGPQTLSR Propham Aldicarb LVDEGAPGK

STPTAEDVTAP

Ethofumesate EGQLTPLIK Propiconazole Aldicarb sulfone LVDER

T [Pho] PPGS [

Etoxazole EGFDDLPLAEQR Propoxur Aldicarb sulfoxide Pho] GEPPK

T [Pho] PPGSG TGQSSLVPALTDF Prothioconazol

Famoxadone Ametryn EPPK VR e

T [ Pho ] PPSS [ GGFPEFVNELHNN

Fenamidone Pymetrozine Aminocarb Pho] GEPPK GQK

T [Pho] PPSSG

Fenarimol EGAQLPVIENK Pyracarbolid Amitraz EPPK

T [Pho] PS [Ph

Fenazaquin AGI PNNQVLGK Pyraclostrobin Azoxystrobin o] LPTPPTR

TDHGAEIVY [P

Fenbuconazole ALVQIVGK Pyridaben Tebufenpyrad ho] K

TDHGAEIVYK Fenhexamid GHSGLQPGR Pyrimethanil Tebuthiuron

TPPGS [Pho] G ASTPGAAAQIQEV

Fenobucarb Pyriproxyfen Teflubenzuron EPPK GK

TPPGSGEPPK Fenoxycarb WNPTQGK Quinoxyfen Temephos

TPPSS [Pho] G

Fenpropimorph IPLENLQIIGR Rotenone Terbumeton EPPK

TPPSSGEPPK Fenpyroximate NLAVQAQGK Secbumeton Terbutryn

TPS [Pho] LPT

Fenuron VLDALQAIGK Siduron Tetraconazole PPTR

VTEPISAESGEQV

TPSLPTPPTR Fipronil Simetryn Thiabendazole

EGR

VAWRT [ Pho ] ISPNTSQQNFVTQ

Flonicamid Spinetoram Thiacloprid PPK GR

FQAFANGSLLIPD

VAWRT PPK Fluazinam Spinosad Thiamethoxam

FGGK

VQIVYKPVDLS

Flubendimide EPISVSSEQVLGK Spirodiclofen Thidiazuron K

HLSNVSS [Pho

] TGSIDMVDSP AVFQANQENLPIL

Fludioxonil Spiromesifen Thiobencarb QLATLADEVSA GK SLAK HVPGGGSVQIV

Y [Pho] KPVDL Flufenacet VQPVSEILQLGK Spirotetramat Thiofanox

SK

HVSGGGSVQIV YKPVDLSK Flufenoxuron ALDVIQAGGK Thiophanate-

Spiroxamine

methyl

SGYSS [Pho] P

Fluometuron I IHESGAQILGR Sulfentrazone Triadimefon

GSPGTPGSR

[Pho] PSLPT

PPTR Fluoxastrobin EQLSSVSSFER Tebuconazole Triadimenol

TPSLP [Pho] Fluquinconazol GDVAFVK

PPTR Tebufenozide Trichlorfon e

Parmi les produits susceptibles d'être greffés, seuls ou combinés, on peut citer des protéines, en particulier des enzymes comme la trypsine, la chymotripsine, la papaïne, la pepsine ou toutes autres peptidases. Toute protéine dont l'homme du métier souhaite préparer des solutions de quantité prédéterminée sans dénaturation entre dans le champ de la présente invention.

La préparation de telles billes et les méthodes pour leur imprégnation par des réactifs sont bien connues de l'homme du métier, en particulier en adaptant les méthodes usuelles de préparations de billes pour médicaments homéopathiques (FR 2 574 659, WO 98/0741 1 ).

Les billes sont déposées dans un contenant en verre de taille proportionnelle au diamètre des billes. Avantageusement, le volume du contenant doit être 5 fois supérieur au volume totale représenté par les billes, soit, par exemple, 50 billes de 3mm dans un contenant de 4 cm de diamètre.

La solution mère des produits, molécules, à greffer est composée à plus de 70% de solvant organique comme le méthanol ou l'acétonitrile. Les billes sont mises en contact avec la solution mère avec une proportion de 1 g de bille pour 100 μΙ de solution mère pouvant contenir de l'acide afin de favoriser l'adsorption des molécules sur les billes de polymères.

Le procédé de greffage est réalisé de préférence sous agitation permanente afin de garantir une adsorption homogène des molécules sur l'ensemble des billes d'un lot de production. Le procédé de fabrication peut être décomposé en deux étapes, une première étape consistant en l'imprégnation des billes de polymères par une solution contenant la ou les molécules à greffer, puis une seconde étape de séchage des billes de polymères.

L'imprégnation est réalisée de préférence sous agitation dans un contenant en verre, en particulier à une pression allant de 300mbar à 800mbar, de préférence environ 600 mbar et à une température allant de 20°C à 60°C, de préférence environ 40°C, pour une durée comprise entre 10 et 40 minutes, de préférence environ 20 minutes.

Le séchage des billes après imprégnation est réalisé de préférence sous une atmosphère contrôlée à une pression allant de 300mbar à 800mbar, de préférence environ 600 mbar, à une température allant de 20°C à 60°C, de préférence environ 40 °C, avantageusement par un flux de gaz, pouvant être de l'air comprimé, de l'azote ou tout autre gaz inerte, par exemple entrant par l'intermédiaire d'un tube dont l'extrémité est à l'entrée du flacon en verre contenant les billes, pour une durée comprise avantageusement entre 10 et 40 minutes, de préférence environ 10 minutes.

Ce cycle d'imprégnation et séchage peut être répété plusieurs fois, avantageusement à au moins trois reprises pour garantir une homogénéité du greffage des molécules sur les billes de polymère.

Lorsqu'il y a plusieurs produits greffés, on pourra les greffer soit ensembles, à partir d'un solution mère qui les comprend tous, ou encore les greffer en plusieurs groupes successifs, chacun comprenant un ou plusieurs produits.

L'invention concerne aussi un ensemble de billes solubles supportant un produit à analyser greffé à leur surface, telles que décrites précédemment et dans les exemples, caractérisé en ce que les billes ont chacune une quantité prédéterminée de produit adsorbé à leur surface sensiblement égale.

De manière avantageuse, cet ensemble de billes est conditionné dans un emballage qui permet une libération contrôlée du nombre de billes. De tels emballages sont bien connus de l'homme du métier, notamment utilisés pour la libération de billes de compositions homéopathiques, de produits alimentaires tel que les tablettes d'aspartame ou des bonbons.

L'invention concerne aussi une gamme de produits à analyser caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux ensembles de billes selon l'invention, chaque ensemble ayant une quantité prédéterminée de produits greffés différente des autres ensembles.

La différence de quantités de produits greffés entre les différents ensembles dépendra de l'usage de ces ensembles. On pourra choisir des quantités prédéterminées de chaque ensemble séparées par exemple par un facteur 2, ou un facteur 10, ou encore selon une règle logarithmique.

Une telle gamme de produits peut être employée pour la réalisation de gammes d'étalonnage externe utilisées pour la quantification de composés ou la mesure de composé dans des échantillons ayant des niveaux de concentration différents du composé à analyser.

Les billes greffées peuvent avoir différents usages, elles peuvent être utilisées pour la quantification absolue de composés.

Les billes greffées peuvent également être utilisées pour libérer un standard permettant la quantification relative d'échantillon entre eux, les billes seront donc utilisées pour normaliser les résultats issus de l'analyse des échantillons.

Elles peuvent également être utilisées pour libérer des composés utilisés pour le contrôle qualité d'instrument de mesure comme les spectromètres.

Les billes greffées peuvent être utilisées pour libérer des composés utiles à la détection de mécanisme biologique comme des réactions immunitaires, des compétitions entre un anticorps et un antigène ou évaluer la toxicité des composés sur des modèles biologiques, notamment pour des analyses dans le domaine du diagnostique.

De manière avantageuse, les billes pourront être mis dès les premières étapes de la préparation d'échantillon, à une étape intermédiaire de la préparation d'échantillon ou encore à la fin de la préparation d'échantillon avant analyse de l'échantillon final.

EXEMPLES

Exemple 1 - Préparations de billes greffées avec des peptides

Une solution mère de peptide est réalisée par la reprise de 20C^g de peptide GDVAFVK marqué aux isotope lourd 13C et 15N sur la lysine (K) par 1 ml d'une solution de méthanol 0,5% d'acide formique. 10ΟμΙ de cette solution mère sont prélevé et mis dans 900μΙ de méthanol pour obtenir une solution à 20μg ml. 50 billes de saccharose d'un diamètre de 3mm sont déposées dans un ballon en verre d'un volume de 25ml. 100μΙ de la solution à 20μg ml sont déposé dans le ballon contenant les billes de saccharose.

Le ballon en verre contenant les billes et la solution peptidique est mis en rotation et sous vide pour atteindre une pression de 600mbar pendant 20 minutes. A l'issue de cette période d'imprégnation, de l'air comprimée est injectée dans le ballon à un débit de 12L/min pendant 10 minutes sous un vide constant de 600mbar. A l'issu de ce premier cycle d'imprégnation/séchage, il est répété deux fois pour obtenir trois cycles complets.

Une bille greffée avec le peptide GDVAFVK est reprise dans 500μΙ d'une solution 95%

H20, 5% ACN et 0,5% acide formique puis solubilisé pendant 2 minutes.

Un volume de 40μΙ de l'échantillon obtenu est injecté et analysé selon les conditions suivantes :

Chaîne chromatographique 1290 de la société Agilent (Les Ulys, France)

- Colonne Phenomenex Aeris peptide C18, 2,1 mm de diamètre interne, 100mm de long, taille de particule de 3,6mm

- Solvant A : H20 + 0,1 % acide formique

- Solvant B : ACN + 0,1 % acide formique

Gradient de chromatographie liquide suivant :

min Flow (ul/min) Soient A Solvent B

0 300 95 5

1 300 95 5

8 300 50 50

8.1 300 5 95

12 300 5 95

12.1 300 95 5

15 300 95 5 L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans un détecteur à barrette de diode 1290 de la société Agilent. L'absorption en UV est mesurée à une longueur d'onde de 205 nm.

L'éluat en sortie de colonne chromatographique peut également être directement injecté dans la source d'ionisation du spectromètre de masse de type QTRAP® 5500 de la société Sciex (Foster City, Etats Unis d'Amérique). Les paramètres machine utilisés sont les suivants :

Type de balayage: MRM

Polarité: Positive

Source d'ionisation: Turbo V (Sciex)

Précurseur: 372,2

Ion fragment: 472,3

Ion fragment: 401 ,3

Ion fragment: 571 ,4

Réglage Q1 : Filtrage avec résolution unitaire Réglage Q3: Filtrage avec résolution unitaire Tension de cône: 5500 V

Température de source: 500,00 °C

Gaz de nébulisation: 50,00 psi

Gaz chauffant: 40,00 psi

Gaz rideau: 50,00 psi

Ce protocole peut également s 'appliquer à d'autres type de molécules comme des pesticides, des antibiotiques ou tout autre petite molécule.

Exemple 2 - Préparation de billes greffées avec 7 peptides (figure 1)

Les 7 peptides suivant ont été greffés aux billes de saccharose

GIAPLQLG [K (13C6; 15N2)]

EQLSSVSSFE [R ( 13C6; 15N4)]

TLDFHDSNV [K (13C6; 15N2)]

VLPEDGP [R (13C6; 15N4)]

GDVAFV [ K ( 13C6 ; 15N2)]

YLGADYI [K (13C6; 15N2)]

IAKPNVSASTQAS [R ( (13C6) ; 15N4) ]

Un aliquot de 200μg du premier peptide est dissous dans 1 ml de méthanol. La solution est ajoutée au 200μg du second peptide puis cette dernière est ajoutée au 200μg du troisième peptide et ainsi de suite jusqu'au septième et dernier peptide afin d'obtenir un mélange de 7 peptides avec chacun une concentration de 200μg ml. 1 ,8 ml de méthanol est ajouté à la solution mère à 200μ9/ιηΙ pour obtenir une solution à 70^g/ml. 10ΟμΙ de cette solution sont ajouté à 250μΙ de méthanol pour obtenir une solution à 20μ9/ιηΙ pour chacun des peptides.

Le protocole de greffage décrit dans l'exemple 1 est réalisé pour obtenir des billes greffées avec les 7 peptides.

Une bille greffée avec les 7 peptides est reprise dans 500μΙ d'une solution 95% H20, 5% ACN et 0,5% acide formique puis solubilisé pendant 2 minutes.

Un volume de 40μΙ de l'échantillon obtenu est injecté et analysé selon les conditions suivantes :

Chaîne chromatographique 1290 de la société Agilent (Les Ulys, France)

Colonne Phenomenex Aeris peptide C18, 2,1 mm de diamètre interne, 100mm de long, taille de particule de 3,6mm

Solvant A : H20 + 0,1 % acide formique

Solvant B : ACN + 0,1 % acide formique

Gradient de chromatographie liquide suivant :

L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans un détecteur à barrette de diode 1290 de la société Agilent. L'absorption en UV est mesurée à une longueur d'onde de 205 nm. Le résultat est représenté sur la figure 1 , Exemple 3 - Gamme de Gentamycine (figure 2)

Pour réaliser la solution qui sera déposée sur les billes, la gentamicine 10mg/ml sera diluée 5000 fois. 100μΙ de la solution mère sont mis dans 900μΙ d'H20. 100μΙ de la solution générée sont mis dans 900μΙ d'H20. 500μΙ de la solution générée sont mis dans 500μΙ d'H20 pour obtenir une solution à 100μg ml. 40μΙ de la solution à 100μg ml sont mis dans 960μΙ de méthanol. Le greffage de la gentamicine sur les billes de saccharose de 3mm s'effectue comme décrit dans l'exemple 1.

Une gamme de concentration est réalisée par la reprise d'une bille dans :

- 1 ml d'une solution de Methanol/H20 (70%/30%, v/v)

- 750μΙ d'une solution de Methanol/H20 (70%/30%, v/v)

- 500μΙ d'une solution de Methanol/H20 (70%/30%, v/v) Un volume de 20μΙ de l'échantillon obtenu est injecté et analysé selon les conditions suivantes :

Chaîne chromatographique 1290 de la société Agilent (Les Ulys, France)

- Colonne Xbridge Hilic amide 2,1 mm * 100, 3,5μηΊ colonne de WATERS

- Solvant A : H20 + 0,1 % acide formique

- Solvant B : ACN + 0,1 % acide formique

Gradient de chromatographie liquide suivant :

L'éluat en sortie de colonne chromatographique peut également être directement injecté dans la source d'ionisation du spec- tromètre de masse de type QTRAP® 5500 de la société Sciex (Foster City, Etats Unis d'Amérique). Les paramètres machine utilisés sont les suivants :

Type de balayage: MRM

Polarité: Positive

Source d'ionisation: Turbo V (Sciex)

Précurseur: 478,4

Ion fragment: 322,4

Ion fragment: 160,0

Réglage Ql: Filtrage avec résolution unitaire

Réglage Q3: Filtrage avec résolution unitaire

Tension de cône: 5500 V

Température de source: 500,00 °C

Gaz de nébulisation: 50,00 psi

Gaz chauffant: 40,00 psi

Gaz rideau: 50,00 psi

Les résultats sont représentés sur la figure 2.

Exemple 4 Gammes réalisées à deux semaines d'intervalles avec des billes produites à partir de solutions mères de concentration différentes (figures 3A et 3B)

Une solution mère de peptide est réalisée par la reprise de 200μg de peptide GDVAFVK marqué aux isotope lourd 13C et 15N sur la lysine (K) par 1 ml d'une solution de méthanol 0,5% d'acide formique. 350μΙ de la solution mère sont dilué dans 350μΙ de méthanol 0,5% d'acide formique pour obtenir une solution mère à 100 g/ml. 350μΙ de la solution mère à 100 g/ml sont dilué dans 350μΙ de méthanol 0,5% d'acide formique pour obtenir une solution mère à δθμς/ιτιΐ. 350μΙ de la solution mère à 50 g/ml sont dilué dans 350μΙ de méthanol 0,5% d'acide formique pour obtenir une solution mère à 25 g/ml.

350μΙ de la solution mère à 25 g/ml sont dilué dans 350μΙ de méthanol 0,5% d'acide formique pour obtenir une solution mère à 12,5 g/ml. 350μΙ de la solution mère à 12,5 g/ml sont dilué dans 350μΙ de méthanol 0,5% d'acide formique pour obtenir une solution mère à 6,25 g/ml.

Chacune des solutions mères est utilisé pour le greffage sur des billes de saccharose selon le protocole cité en exemple 1.

Chacune des billes greffées avec des quantités de peptide GDVAFVK allant de 1 ^g à 12,5ng est reprise dans 500μΙ d'une solution 95% H20, 5% ACN et 0,5% acide formique puis solubilisé pendant 2 minutes.

Un volume de 40μΙ de chaque échantillon obtenu est injecté et analysé selon les conditions suivantes :

Chaîne chromatographique 1290 de la société Agilent (Les Ulys, France)

Colonne Phenomenex Aeris peptide C18, 2,1 mm de diamètre interne, 100mm de long, taille de particule de 3,6mm

- Solvant A : H20 + 0,1 % acide formique - Solvant B : ACN + 0,1 % acide formique

Gradient de chromatographie liquide suivant

L'éluat en sortie de colonne chromatographique est directement injecté dans un détecteur à barrette de diode 1290 de la société Agilent. L'absorption en UV est mesurée à une longueur d'onde de 205 nm.

Les résultats représentés sur les figures 3A et 3B confirment la reproductibilité de la méthode selon l'invention.

Exemple 5 - Quantification de l'apolipoprotéine E dans du plasma par le peptide LGPLVEQGR marqué en 13C et 15N sur la valine (V). Les billes de polymère sont préparées à partir d'une solution mère du peptide LGPLVEQGR à 1 μg/ml selon le protocole décrit dans l'exemple 1 .

Digestion enzymatique du plasma selon le protocole suivant :

1 ml_ of plasma dilué dans 4ml_ d'urée à 8M

- 550 μΙ_ of DTT à 150mM

- 1700 μΙ_ IAA à 150mM

30 ml_ de bicarbonate d'ammonium à 50 mM pH8

1 ml_ de trypsine à 2mg/ml_ dans 50mM de bicarbonate d'ammonium à pH8.

1 ml_ H2O+0.5%FA sont ajouté à 10 ul de plasma hydrolysé

Une bille de polymère greffé avec 6 ng de peptide LGPLVEQGR est ajoutée

Dessalage et concentration des échantillons par extraction sur phase solide selon le protocole suivant :

Equilibrage des colonnes HLB Oasis Waters avec Iml de méthanol puis 1 ml FbO/acide formique 0,1 %

Dépôt de l'échantillon qui s'écoule par gravité

Lavage avec 1 ml FbO/acide formique 0,1 %

Elution avec 1 ml de méthanol 80% dans un mélange FbO/acide formique 0,1 % Evaporation à sec et reprise dans 200μΙ d'une solution 95% H20, 5% ACN et 0,5% acide formique.

Un volume de 20μΙ de l'échantillon obtenu est injecté et analysé selon les conditions suivantes :

Chaîne chromatographique 1290 de la société Agilent (Les Ulys, France)

Colonne Phenomenex Aeris peptide C18, 2,1 mm de diamètre interne, 100mm de long, taille de particule de 3,6mm

Solvant A : H20 + 0,1 % acide formique

Solvant B : ACN + 0,1 % acide formique

Gradient de chromatographie liquide suivant

L'éluat en sortie de colonne chromatographique peut également être directement injecté dans la source d'ionisation du spec- tromètre de masse de type QTRAP® 5500 de la société Sciex (Foster City, Etats Unis d'Amérique). Les paramètres machine utilisés sont les suivants :

Type de balayage: MRM

Polarité: Positive

Source d'ionisation: Turbo V (Sciex)

Réglage Ql: Filtrage avec résolution unitaire Réglage Q3: Filtrage avec résolution unitaire Tension de cône: 5500 V

Température de source: 500,00 °C

Gaz de nébulisation: 50,00 psi

Gaz chauffant: 40,00 psi

Gaz rideau: 50,00 psi

Les valeurs des masses et les paramètres du chemin optique sont les suivants

Exemple 6 - Conservation de l'activité enzymatique

Des billes greffées par de la trypsine ont été préparées partir d'une solution mère du de trypsine à 1 mg/ml selon le protocole décrit dans l'exemple 1 .

L'activité trypsique des protéines après dissolution des billes dans un tampon approprié est observée par l'hydrolyse de l'albumine selon la méthode d'identification des peptides résultants de l'hydrolyse trypsique par spectrométrie de masse. Les peptides issus de l'hydrolyse trypsique sont monitorés spécifiquement afin de déterminer leur présence dans les échantillons.

Les résultats obtenus montrent que l'activité de la trypsine est conservée après le greffage sur les billes, le procédé selon l'invention n'ayant pas d'action de dénaturation de la protéine. Une comparaison avec l'activité de la trypsine non greffée montre une activité similaire, voire supérieure avec la solution de trypsine préparée à partir des billes greffées.

Ces résultats confirment qu'il est possible de préparer des billes de quantités prédéterminées de protéines ou d'enzymes, permettant de faciliter la préparation de solutions dosées avec des protéines, en particulier pour la préparation de solutions d'enzymes.

REFERENCES

EP 1 456 227,

WO 2010/035504

WO 2014/066284