RESUMEN

[001] La presente invención proporciona versiones en miniatura de la enzima convertidora de angiotensina 2 (min¡ACE2) con unión mejorada a la proteína espiga SARS-CoV-2 que, al unirse a esta, permiten bloquear la interacción del virus SARS- CoV-2 con el receptor natural en la célula huésped humana. La invención contempla también el uso de las min¡ACE2 para tratar o prevenir la infección por coronavirus con min¡ACE2 en humanos o animales y para ser usados como sustrato de captura de partículas virales. La invención también comprende receptores de antígeno quiméricos (CAR) diseñadas a partir de las min¡ACE2 para reconocer específicamente células infectadas por SARS-CoV-2 que pueden ser incorporados en células NK. Los min¡ACE2 o las células NK con CAR basadas en las min¡ACE2 pueden ser administradas a personas con COVID-19 para inducir una respuesta inmune celular contra las células infectadas con SARS-CoV-2.

LISTADO DE SECUENCIAS

[002] El listado de secuencias asociado con esta solicitud se proporciona en formato de texto (.txt) y es incorporado por referencia a la descripción de la presente solicitud.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

[003] La invención pertenece al campo técnico de la ingeniería celular y molecular. Más concretamente, la invención se relaciona con el diseño y construcción de versiones en miniatura de la enzima convertidora de angiotensina 2 humana que se unen específicamente a la proteína espiga del virus SARS-CoV-2 y evita o neutraliza la infección causada por el mismo. Asimismo, la invención describe el diseño y la obtención de receptores quiméricos de antígeno relacionados con dichas versiones en miniatura. ANTECEDENTES

[004] El primer paso que el virus causante del síndrome respiratorio agudo severo tipo 2 (SARS-CoV-2) debe dar para infectar a las células es unirse a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2, por su nombre en inglés “Angiotensin- Converting Enzyme 2”), presente en la superficie de las células de los pulmones, arterias, corazón, riñones e intestinos. Dicha unión se lleva a cabo a través de la interacción de ACE2 con el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espiga o “spike” (proteína S) de SARS-CoV-2, la cual se encuentra en la superficie de la envoltura viral, y activa la endocitosis del virus y pérdida de la ACE2.

[005] La ACE2 sirve como receptor de entrada de SARS-CoV-2 y protege al pulmón de lesiones. La ACE2 se expresa principalmente en la superficie de las células epiteliales alveolares de tipo II y en múltiples tejidos extrapulmonares, incluidos el corazón, los riñones, los vasos sanguíneos y el intestino, por lo que SARSCoV-2 también puede infectar estos tejidos.

[006] Esta proteína contiene un dominio N-terminal con actividad metalo-peptidasa M2 (aminoácidos 19-615) y un dominio C-terminal de colectrina transportador de aminoácidos renales (aminoácidos 616-768) que finaliza con una única hélice o anclaje transmembranal y un segmento intracelular. El dominio de cuello, cerca del anclaje transmembranal (aminoácidos 616-726), media su dimeñzación. El dominio C- terminal es un dominio de anclaje a membrana que expone al dominio peptidasa sobre la superficie celular. El domino peptidasa N-terminal consiste en dos subdominios o lóbulos que forman entre ellos el sitio activo de la enzima y que se unen por una alfa hélice. La hidrólisis del dominio extracelular de la ACE2 resulta en una proteína soluble que es liberada a la circulación sanguínea que disminuye la presión sanguínea mediante la hidrólisis de la angiotensina I (un vasoconstrictor) en angiotensina heptapeptídica 1 -7 (un vasodilatador).

[007] La proteína S es una glicoproteína trimérica que sobresale en la superficie del virión de SARS-COV-2 y que es responsable de mediar el reconocimiento del receptor ACE2 y la fusión a la membrana de las células humanas. Cada monómero tiene dos subunidades (S1 y S2) separadas por un sitio de escisión que es reconocido por las proteasas de la célula huésped. Durante la infección viral, la proteína S se escinde en las subunidades S1 y S2. La subunidad S1 contiene el dominio de unión al receptor (RBD), que se une directamente al dominio de peptidasa de la ACE2, mientras que la subunidad S2 es responsable de la fusión de membranas. El dominio RBD se compone de una lámina beta antiparalela de 5 hebras entre las hebras (34-7 y es una inserción extendida de hebras [35-6 cortas. La extensión lleva el motivo de unión al receptor (RBM) que se une al receptor ACE2 para entrar en las células.

[008] Durante la unión de la proteína S a la ACE2, una superficie exterior cóncava en el RBD acomoda la hélice N-terminal de ACE2. La mayoría de los puentes de hidrogeno que median la interacción entre la ACE2 y la proteína S del virus involucran la hélice 1 (aminoácidos 20-52) y el extremo C-terminal de la hélice 2 (aminoácidos 56-82). Se conoce que un total de 16 residuos del RBD de SARS-CoV-2 entran en contacto con 20 residuos de la ACE2. Los residuos enterrados en la interfase tienden a ser conservados, mientras que los residuos en la periferia de la interfase o en la hendidura de unión al sustrato son tolerantes a las mutaciones y se conocen que al menos 12 mutaciones de ACE2 en la interfase mejoran la unión a RBD.

[009] Algunas de las estrategias para combatir al SARS-CoV-2 se han enfocado en impedir la entrada del virus a las células mediante el bloqueo de la interacción de la proteína S viral con su receptor celular ACE2. Entre estas estrategias se han estudiado a los anticuerpos neutralizantes (entre ellos, el plasma de pacientes convalecientes y anticuerpos monoclonales dirigidos a RBD) y versiones solubles de la ACE2 que pueden actuar como señuelo para unirse a la proteína S del SARS-CoV-2, evitando así la entrada del virus.

[010] Pese a que se ha aislado una amplia colección de anticuerpos neutralizantes muy potentes, el virus muestra una rápida acumulación de mutaciones de escape cuando está bajo presión selectiva. Por el contrario, el virus parece tener un potencial limitado para escapar de la neutralización mediada por la ACE2 soluble sin disminuir simultáneamente la afinidad por el receptor ACE2 nativo, por lo que se prevé que la administración de ACE2 soluble previene la ocurrencia de variantes de escape del virus. Además se cree que la administración de la proteína ACE2 recombinante en personas infectadas con SARS-CoV-2 puede también ayudar a mitigar el daño pulmonar, cardíaco y renal causado por COVID-19 dada la función de la ACE2 soluble en la regulación de la presiona arterial.

[011] Los fragmentos solubles de la ACE2 se han empleado, por ejemplo, en soluciones de lavado de boca y nariz que inactivan el virus y permiten deshacerse del mismo. Estas soluciones de lavado permiten prevenir la infección en personas que han estado expuestas a personas infectadas durante un corto periodo de tiempo, o a disminuir la carga viral en la boca y nariz de personas altamente infecciosas para reducir el riesgo de transferencia. Entre estas, el documento de patente WO 2021/228854 divulga la neutralización del virus SARS-COV-2 por medio de una solución de lavado que comprende un fragmento soluble del receptor ACE2, el cual comprende el dominio peptidasa o un fragmento y/o derivado del mismo. Dichos fragmentos del receptor ACE2 solubles son modificados introduciendo mutaciones en al menos 13 posiciones del dominio PD para inactivar la actividad catalítica de la ACE2, mientras que los aminoácidos de la región de unión a la proteína S permanecen sin modificación.

[012] Otras alternativas de proteínas ACE2 solubles se han divulgado en documentos no patente, tales como el de Monteil et al. (2020) divulga una ACE2 humana soluble, de grado clínico, producida de manera recombinante por Polymun Scientific, que ha sido probada en ensayos clínicos de fase 1 en voluntarios sanos y en fase 2 en pacientes con síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Los resultados muestran que la ACE2 humana soluble, puede inhibir la infección por SARS-CoV-2 en las etapas tempranas de infección de manera dependiente de la dosis y reducir dramáticamente la proliferación del virus a los capilares sanguíneos y riñón.

[013] Otro ejemplo podemos encontrarlo en el documento de Romano et al. (2020) describe la creación de una miniproteína modificada expresada de manera recombinante en E. coli (denominada Spikeplug), que actúa como un tapón soluble y estable de la proteína S. La miniproteína de este documento fue diseñada usando la región Hélice 1 -Hélice 2 de ACE2 como andamio básico y se incluyeron una serie de mutaciones para aumentar su estabilidad y la solubilidad y para compensar las interacciones faltantes mediadas por residuos fuera de las hélices H1 y H2. También se adicionó una hélice extra para garantizar el plegamiento a helical de la miniproteína en solución. Como resultado de estas modificaciones, el tapón soluble puede interactuar con el RBD de la proteína S del SARS-CoV-2 con afinidad nanomolar de 14.7 nM con una constante de disociación de 40 nM.

[014] Similarmente, el documento de Chan et al. (2020) divulga el diseño de una proteína ACE2 humana dimérica con unión optimizada a la proteína S de SARS-CoV- 2 de diferentes aislados del virus, que compite con anticuerpos de pacientes convalecientes. La ACE2 soluble se fusionó con superfolder proteína verde fluorescente (spGFP), uniendo el dominio de proteasa de ACE2 (aminoácidos 1 -615) al sfGFP mediante un enlazador rico en aGy/Ser (GSGGSGSGG) y se introdujeron mutaciones combinadas para aumentar aún más la afinidad de unión. El receptor resultante muestra una afinidad en el orden subnanomolar (600 pM) y una eficacia subnanomolar para neutralizar la infección por SARS-CoV-2 en células VeroE6.

[015] Otras alternativas de agentes terapéuticos relacionados con ACE2 son los péptidos de unión a la proteína espiga. Ejemplos de estas alternativas se pueden encontrar en el documento WO2021188966A1 , que describe péptidos de 6-100, 6-70 o 6-25 aminoácidos que se unen específicamente a un dominio de unión al receptor (RBD). Asimismo, el documento WO2021216845A1 proporciona péptidos antivirales de entre 20 y 100 aminoácidos de longitud que inhiben de la interacción entre la hélice 1 de ACE2 y el dominio de unión al receptor de virus tipo SARS-CoV-2.

[016] De otro lado, también se han proporcionado alternativas relacionadas con proteínas quiméricas derivadas de ACE2. Así, el documento W02021203098A2 proporciona proteínas de unión que pueden incluir la porción extracelular de ACE2, excluyendo el dominio de la colectrina, y un enlazador flexible de polipéptido flexible que acopla la porción ACE2 a un dominio Fe.

[017] Dado que la administración de ACE2 puede potencialmente reducir la presión arterial de manera excesiva y afectar la función renal, existe la necesidad de producir versiones solubles de alta afinidad que puedan ser usadas en bajas dosis con pocos efectos adversos. Así, el desarrollo de versiones de la proteína ACE2 con una unión mejorada a RDB puede ayudar a disminuir la cantidad de proteína que necesita ser administrada y a disminuir la ocurrencia de efectos adversos. Adicionalmente, se ha observado que el uso de versiones cortas de ACE2 pueden ser particularmente útiles para prevenir y/o tratar la enfermedad renal asociada con COVID1 -9.

[018] Por otra parte, existe también la necesidad de lograr inmunidad a largo plazo y memoria inmunológica contra SARS-CoV-2 mediante estrategias que promuevan la presentación de péptidos virales por parte de los antígenos principales de histocompatibilidad de clase 1 activa las células T CD8+ para el desarrollo de funciones efectoras contra las células huésped que presentan determinantes virales. Entre estas estrategias está el desarrollo de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) que combinan, en una única proteína quimérica, un dominio de reconocimiento de antígeno específico (por ejemplo, derivado de un anticuerpo o de un receptor) con un dominio intracelular activador del receptor de las células T. Esta estrategia permite dotar a las células T de un paciente con la habilidad de reconocer y matar a las células infectadas directamente. Además, las células T con CAR (células T-CAR) tiene la habilidad de multiplicarse in vivo, por lo que se les considera un principio activo viviente.

[019] Ejemplos de este tipo de desarrollos se encuentran en Guo et al. (2021 ), que reporta el diseño de un CAR específico contra la proteína S de SARS-CoV-2 basado en la secuencia de un anticuerpo de un paciente convaleciente que reconoce específicamente al RBD de la proteína S de SARS-Cov-1 y SARS-Cov-2, expresada en células T CD8 primarias. Las células T-CAR resultantes se activaron y mataron selectivamente diferentes tipos de células diana que expresan la proteína S del SARS- CoV-2 en su superficie, mostrando que las células T-CARs pueden usarse para redirigir las células inmunitañas citotóxicas hacia las células huésped infectadas por SARS-CoV-2 y para neutralizar las variantes del virus. Otro documento relacionado con esta alternativa es el de Dogan et al. que describe la modificación mediante ingeniería genética de células T CD8 humanas primarias para expresar CAR específicos de la proteína S con el dominio extracelular de ACE2 (ACE2 CAR) a partir de la secuencia obtenida en Ensembl Gene Browser, los cuales matan selectivamente las células que expresaban la proteína S. [020] La terapia con células natural killer (células NK) que expresan un CAR (células NK-CAR) puede servir como una alternativa a la terapia con células T-CAR porque las células NK-CAR tienen considerablemente menos problemas de seguridad, como efectos por fuera del objetivo. En las células NK-CAR los dominios de señalización extracelular, transmembrana e intracelular están presentes como lo están en las células CAR-T. Adicionalmente, las células NK-CAR a menudo tienen CD3 como dominio de señalización inicial y CD28 o CD137 (4-1 BB) como dominio coestimulador para formar un motivo de señalización intracelular, los cuales aumentan la capacidad citotóxica de las células NK y la producción de citoquinas aumenta a través de dos moléculas coestimuladoras más, a saber, NKG2D y CD244.

[021] La inmunoterapia con células CAR-T puede tener efectos secundarios, tales como el síndrome de liberación de citocinas y agotamiento de las células T. Otra desventaja potencial podría ser que la ACE2 en el ACE2 CAR puede interactuar con sus ligandos fisiológicos e interferir con la regulación de la presión arterial. En consecuencia, el desarrollo de células NK con ACE2 CAR que tengan una afinidad mejorada por la proteína S puede contribuir a disminuir dichos efectos secundarios.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCIÓN

[022] La presente tecnología se refiere al diseño y construcción de versiones en miniatura de la enzima convertidora de angiotensina 2 humana (hACE2), denominadas min¡ACE2, a partir de las regiones de la superficie molecular de la ACE2 que median la interacción de ACE2 con el dominio RBD de la proteína espiga de SARS-CoV-2.

[023] Las min¡ACE2 neutralizan la inferíase de contacto de la proteína S de SARS- CoV-2 al interactuar con los aminoácidos de esta que se unen al receptor natural de las células (hACE2), por lo que se predice que las mutaciones que potencialmente le permitan al virus evadir la interacción con las min¡ACE2, impacten negativamente la capacidad de unión al receptor natural ACE2 y por tanto afecten su capacidad de infectar a las células humanas. Por lo tanto, un efecto adicional del uso de las min¡ACE2 es prevenir la ocurrencia de variantes de escape del virus SARS-CoV-2. [024] Las min¡ACE2 de la invención también pueden ser usadas para retener selectivamente el virus SARS-CoV-2, mediante la unión por afinidad a la proteína S del SARS-CoV-2, esto puede ser explotado en la producción de pruebas diagnósticas o métodos para concentrar el virus a partir de muestras biológicas o ambientales.

[025] La invención también se refiere a las sales, solvatos, hidratos, isómeros y tautómeros de las miniACEs de la invención.

[026] Asimismo, la presente solicitud proporciona composiciones que comprenden las min¡ACE2 de la invención, o una sal, solvato, hidrato, isómero o tautómero de las mismas. Dichas composiciones están especialmente formuladas para permitir que las min¡ACE2 puedan ser infundidas en la circulación de los pacientes infectados con SARS-CoV-2 para neutralizar la infectividad del virus, disminuir la carga viral y prevenir los efectos severos causados por el COVID19. Las min¡ACE2 solubles aquí divulgadas, al interactuar fuertemente con el RBD de la proteína S en la superficie viral, recubren el virus de manera que bloquean su interacción con el receptor natural ACE2 en la superficie de las células humanas y por tanto neutralizan la capacidad infectiva del virus SARS-CoV-2 (véase la Figura 1 ).

[027] La presente invención también contempla el diseño y desarrollo de receptores quiméricos de antígeno (CAR por su nombre en inglés “Chimeric antigen receptor”), los cuales comprenden dominios de superficie basados en las min¡ACE2. Dichos CAR pueden ser incorporado en células Natural Killer (células NK) para conferirles la capacidad de reconocer células infectadas que presenten en su superficie celular a la proteína S y eliminarlas de manera específica, reduciendo así los reservónos del virus SARS-CoV-2 y los efectos secundarios en células diferentes a las células blanco. Asimismo, los métodos para producir los CAR de la invención y las composiciones que los comprenden también hacen parte de la presente solicitud.

[028] La presente invención también contempla modificar genéticamente células mesenquimales para inducir en estas la secreción de las min¡ACE2 con el fin de reducir los efectos pulmonares severos en los casos graves de COVID19. De igual forma la modificación genética de células mesenquimales puede ser beneficiosa ya que estas tienen tropismo principalmente pulmonar, lo que permitiría concentrar las min¡ACE2 en uno de los órganos más afectados por la COVID19.

[029] De otro lado, la presente invención también proporciona células NK y células mesenquimales modificadas para expresar los CAR o las miniACEs de la invención.

[030] Otro aspecto de la presente solicitud se refiere al uso de las min¡ACE2 y los CAR de acuerdo con las realizaciones de la presente invención en métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia, como una vacuna o en métodos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o cuerpo animal.

[031] Aún otro aspecto de la presente invención se refiere a metodologías de diagnóstico de SARS-CoV-2 a partir de diferentes tipos de muestras basadas en la retención del virus por afinidad mediante las min¡ACE2 aquí divulgadas.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[032] Las siguientes figuras sirven para ¡lustrar la invención:

[033] La Figura 1 muestra un esquema de la neutralización de SARS-CoV-2 por las min¡ACE2 de la invención. Las min¡ACE2 solubles de la presente invención interactúan fuertemente con la proteína espiga de SARS-CoV-2 bloqueando la interacción del virus con el receptor ACE2 expresado en la superficie de las células humanas.

[034] La Figura 2 muestra un alineamiento múltiple de la secuencia parcial del dominio N-terminal de la proteína ACE2 nativa (correspondiente a los residuos 1 a 420) y las secuencias de las tres min¡ACE2 de la invención BP2 (SEQ ID NO: 9), BP2 (SEQ ID NO: 13) y BP12 (SEQ ID NO: 17), en donde se observan las 3 regiones conformacionales discontinuas (R1 , R2 y R3) de la ACE2 nativa y las regiones R1 , R2 y R3 de las min¡ACE2 de la invención, encerradas cada una dentro de los respectivos recuadros negros, con sus correspondientes secuencias conectoras (SC1 -2, SC2-3, y SC1 -3). El alineamiento enseña también la posición de R1 , R2 y R3 con respecto a la estructura del receptor ACE2 nativo, y señala los residuos que participan directamente en la interacción (residuos subrayados), así como los aminoácidos que han sido sustituidos o eliminados con respecto a la secuencia de la ACE2nativa (residuos en negrilla). Así, se observa que R1 abarca las hélices H2, H3, H4 y H5 de ACE2; R2 abarca la hélice H19; y, R3 abarca dos hojas plegadas (C), unidas por un puente disulfuro y una horquilla beta, y la hélice H20.

[035] La Figura 3 muestra constructos para la expresión de los CAR de la invención en células NK. A) pEF1 -BP2-CAR1 (SEQ ID NO: 61 ), B) pEF1 -BP2-CAR2 (SEQ ID NO: 62), C) pEF1 -BP2-CAR3 (SEQ ID NO: 63), D) pEF1 -BP2-CAR4 (SEQ ID NO: 64), E) pEF1 -BP2-CAR5 (SEQ ID NO: 65), F) pEF1 -BP9-CAR1 (SEQ ID NO: 66), G) pEF1 - BP9-CAR2 (SEQ ID NO: 67), H) pEF1 -BP9-CAR3 (SEQ ID NO: 68), I) pEF1 -BP9- CAR4 (SEQ ID NO: 69), J) pEF1 -BP9-CAR5 (SEQ ID NO: 70), K) pEF1 -BP1 1 -CAR1 (SEQ ID NO: 71 ), L) pEF1 -BP1 1 -CAR2 (SEQ ID NO: 72), M) pEF1 -BP1 1 -CAR3 (SEQ ID NO: 73), N) pEF1 -BP1 1 -CAR4 (SEQ ID NO: 74), y O) pEF1 -BP1 1 -CAR5 (SEQ ID NO: 75).

[036] La Figura 4 muestra constructos para modificación de células mesenquimales.

A) pCDH-EF1 -BP2 (SEQ ID NO: 55). B) pCDH-EF1 -BP9 (SEQ ID NO: 56), y C) pCDH-EF1 -BP1 1 (SEQ ID NO: 57).

[037] La Figura 5 muestra constructos para expresión inducible de proteína en células CHO. A) pCW-Cy_BP2_Apo (SEQ ID NO: 58). B) pCW-Cy_BP9_HB (SEQ ID NO: 59), y C) pCW-Cy_BP11_HB (SEQ ID NO: 60).

[038] La Figura 6 muestra constructos para expresión inducible de proteína en levaduras del género Pichia spp. A) pZ-H-Xa-BP2 (SEQ ID NO: 49). B) pZ-H-Xa-BP9 (SEQ ID NO: 50), y C) pZ-H-Xa-BP1 1 (SEQ ID NO: 51 ).

[039] La Figura 7 muestra constructos para expresión inducible de proteína marcada con RFP en levaduras del género Pichia spp. A) pZ-H-RFP-Xa-BP2 (SEQ ID NO: 52).

B) pZ-H-RFP-Xa-BP9 (SEQ ID NO: 53), y C) pZ-H-RFP-Xa-BP1 1 (SEQ ID NO: 54).

[040] La Figura 8 muestra la estructura tridimensional de las miniACEs de la invención A) BP2, B) BP9 y C) BP1 1 . [041] La Figura 9 muestra la estructura tridimensional de los CARs de la invención A) BP2-CAR1 , B) BP9-CAR1 , C) BP11-CAR1 , D) BP2-CAR2, E) BP9-CAR2, F) BP11 - CAR2, G) BP2-CAR3, H) BP9-CAR3, I) BP11-CAR3, J) BP2-CAR4, K) BP9-CAR4, L) BP11 -CAR4, M) BP2-CAR5, N) BP9-CAR5, y O) BP11 -CAR5.

DEFINICIONES

[042] Como se usa en la presente solicitud, el término "SARS-CoV-2" se refiere al coronavirus 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo, que es el virus que causa una enfermedad respiratoria conocida como enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Este virus pertenece a la familia Coronaviridae, una familia de virus de ARN de sentido positivo con cubierta lipídica. Como se usa en este documento el término "SARS-CoV-2" se refiere preferiblemente a todas las variantes de SARS-CoV- 2, pero también a todas las vahantes que muestran mutaciones únicas o mutaciones múltiples o combinaciones de mutaciones, pero todavía se nombran como SARS- CoV-2.

[043] El término "ACE2” o “ACE2 nativa” se refiere a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) soluble o unida a membrana. Preferiblemente, ACE2 comprende una secuencia de 805 aminoácidos reportada en UniProtKB con el ID Q9BYF1. La ACE2 comprende un dominio con actividad metalopeptidasa N-terminal M2 (aminoácidos 19-615), un dominio transportador de aminoácidos renales de colecthna C-terminal (aminoácidos 616-768), un dominio de cuello (aminoácidos 616- 726), un anclaje transmembranal y un segmento intracelular.

[044] El término "receptor AC E2 nativo" hace referencia a la ACE2 humana que no ha sido modificada.

[045] Los términos "dominio peptidasa deACE2" o "dominio peptidasa" se refieren al dominio de peptidasa de ACE2 y consiste de dos subdominios o lóbulos que forman entre ellos el sitio activo de la enzima y que se unen por una hélice alfa. El dominio peptidasa de ACE2 carece del dominio del cuello de ACE2. [046] El término “proteína S” se refiere la glicoproteína trimérica que sobresale en la superficie del virión de SARS-CoV-2, en la cual cada monómero tiene dos subunidades (S1 y S2) separadas por un sitio de escisión.

[047] Los términos “dominio RBD de la proteína S” o “dominio RBD” se refieren al dominio de unión al receptor (RBD) contenido en la subunidad 1 (S1 ) de la proteína S que se une directamente al dominio peptidasa de la ACE2. El dominio RBD se compone de una lámina beta antiparalela de 5 hebras entre las hebras (34-7 y es una inserción extendida de hebras [35-6 cortas. La extensión lleva el motivo de unión al receptor (RBM) que se une al receptor ACE2 para entrar en las células.

[048] El término “inferíase de contacto” se refiere a la(s) región(es) particular(es) del dominio peptidasa de ACE2 y del dominio RBD de la proteína S en donde las proteínas interactúan/asocian entre sí. La interfase de contacto comprende uno o más residuos de aminoácidos que son capaces de interactuar con los residuos de aminoácidos correspondientes que entran en contacto o asociación cuando se produce la interacción proteína-receptor. Generalmente, la interacción esta mediada por la formación de puentes de hidrogeno.

[049] El término “regiones conformacionales discontinuas de ACE2”, denominadas aquí como R1 , R2 y R3, se refiere a las regiones de la ACE2 nativa que forman estructuras tridimensionales que participan en la interfase de contacto con el dominio RBD de la proteína S. Las tres regiones conformacionales se localizan de manera discontinua en la secuencia lineal de la ACE2 entre una y otra, separadas por segmentos conectores de aminoácidos que no participan directamente en la interfase de contacto.

[050] El término “regiones conformacionales discontinuas de las miniACE2”, denominadas aquí como R1 , R2 y R3, se refiere a las regiones conformacionales discontinuas de las min¡ACE2 de la invención que pueden comprender sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de la ACE2 nativa que mejoran la afinidad de la min¡ACE2 con el dominio RBD de la proteína S. [051] El término "miniACE2" se refiere a proteínas quiméricas bloqueadoras de la interacción de SARS-CoV-2 con el receptor ACE2 nativo. Es una versión en miniatura de la ACE2. Las min¡ACE2 pueden comprender dos o tres de las regiones conformacionales discontinuas R1 , R2 y R3 de ACE2, en donde uno o más aminoácidos han sido modificados o eliminados con respecto a secuencia de la ACE2 nativa con el objetivo de mejorar la interacción de la min¡ACE2 con RBD. En las min¡ACE2, R1 , R2 y R3 están unidas mediante dos o tres segmentos conectores de aminoácidos. Cuando la min¡ACE2 comprende R1 , R2 y R3, estas se conectan por dos segmentos conectores. Cuando las min¡ACE2 comprende R1 y R3, estas se conectan por un segmento conector. Las min¡ACE2 pueden ser clonadas y expresadas de manera recombinante a partir de genes que codifican para la respectiva secuencia de aminoácidos mediante técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica, por ejemplo, mediante sistemas de expresión en células de mamífero, tales como células CHO, HEK293 o células mesenquimales, y en levaduras, tales como levaduras del género Pichia.

[052] El término “segmentos conectores de aminoácidos” se refiere al menos tres segmentos de aminoácidos que conectan cada una de las regiones conformacionales discontinuas de las min¡ACE2 y que permiten que la min¡ACE2 mantenga la estructura tridimensional de la inferíase de contacto con el dominio RBD. Los segmentos conectores de aminoácidos se seleccionan de modo tal que se garantice el correcto plegamiento de las min¡ACE2s de la invención y se maximice su la interacción con RBD. Los segmentos conectores de aminoácidos pueden son de longitud variable. Por ejemplo, los segmentos de segmentos conectores de aminoácidos pueden comprender entre 1 a 15 aminoácidos. Las min¡ACE2 comprenden uno o dos segmentos conectores dependiendo de si la min¡ACE2 comprende dos o tres regiones conformaciones de ACE2. Así, el segmento conector que conecta R1 con R2 se denomina SC1 -2. El segmento conector que conecta R2 con R3 se denomina SC2-3 y el segmento conector que conecta R1 con R3 se denomina SC1 -3.

[053] El término “afinidad de unión in silico” se refiere a la fuerza de la interacción entre ACE2 y RBD evaluada usando el servidor PRODIGY (PROtein binDIng enerGY prediction). [054] El término “receptor de antígeno quimérico (CAR) miniACE2” o “CAR- miniACE2” se refiere a una proteína quimérica que comprende una min¡ACE2 de la invención como dominio extracelular de reconocimiento de antígeno, unido por medio de una región conectora o bisagra a una región transmembranal, seguido de un dominio intracelular de señalización que activa el funcionamiento de la célula inmune.

[055] El término “células NK con CAR-miniACE2’ se refiere a células natural killer (células NK) modificadas genéticamente para expresar un CAR-miniACE2 como dominio extracelular de reconocimiento de antígeno unido a un dominio de señalización intracelular a través de una región conectora o bisagra proveniente de la proteína CD8, CD28, CD16, ICOS, CD137 o lgG1 y una región transmembranal seleccionada de CD8, CD28, CD16, 0X40 o ICOS. Adicionalmente, las células NK con CAR-miniACE2 tienen además un dominio coestimulador de CD16, CD28 CD137, 0X40 o ICOS y un dominio CD3z como dominio de señalización intracelular. Las células NK con CAR-miniACE2 son obtenidas generalmente a partir de células NK autólogas del paciente a ser tratado o a partir de sangre de cordón umbilical. Debido a que las células NK no requieren compatibilidad HLA, pueden usarse como células efectoras alogénicas.

[056] El término “células mesenquimales con CAR-miniACE2’ se refiere a células mesenquimales modificadas genéticamente para expresar un CAR-miniACE2 como dominio extracelular de reconocimiento de antígeno unido a un dominio de señalización.

[057] El término "sustitución" como se usa aquí se refiere a la presencia de un residuo de aminoácido en cierta posición de la secuencia derivada que es diferente del residuo de aminoácido que está presente o ausente en la posición correspondiente en la secuencia de referencia. Un derivado de la presente invención puede exhibir 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de tales sustituciones.

[058] El término "que comprende" tal como se utiliza en el presente documento no debe interpretarse como limitado al significado "que consiste en" (es decir, excluyendo la presencia de otra materia adicional). Más bien, "que comprende" implica que, opcionalmente, puede estar presente materia adicional. El término "que comprende" incluye realizaciones particularmente previstas que caen dentro de su alcance "que consisten en" (es decir, excluyen la presencia de otra materia adicional) y "que comprenden pero no consisten en" (es decir, requieren la presencia de otra materia adicional), con el primero siendo más preferido.

[059] El término "porcentaje de identidad de secuencia" se refiere al valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de forma óptima (p. ej., secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos) en una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, lagunas) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece el residuo de nucleótido o aminoácido idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Los métodos para alinear secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica.

[060] En el contexto de la presente invención la expresión "terapéuticamente aceptable" se refiere a compuestos (o sales, profármacos, tautómeros, formas zwitteriónicas, etc.) que son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un paciente sin excesiva toxicidad, irritación o respuesta alérgica, con un beneficio/hesgo razonable, y que son efectivos para el uso previsto.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[061] En una primera realización, la invención se refiere a versiones en miniatura o fragmentos solubles de la enzima convertidora de angiotensina 2 humana (hACE2), denominadas min¡ACE2, que se unen específicamente a la proteína S de SARS-CoV- 2. Más específicamente, las min¡ACE2 de la invención se unen específicamente al dominio RBD de la proteína S. [062] Las min¡ACE2 de la invención muestran una mayor afinidad por el dominio RBD en comparación con ACE2 nativa. En particular, la fuerza de unión del receptor ACE2 nativo y el RBD en términos de afinidad de unión ( A G) es de: -1 1 ,9 y la constante de disociación (Kd) es de 3,8x10’ ⁹ . Mientras que el A G para las min¡ACE2 es más negativo: BP2 (-12,6), BP9 (-13,7), BP1 1 (-14,2). De igual forma, los valores de Kd son más bajos que para ACE2 nativa: BP2 (1 ,3x10’ ⁹ ), BP9 (1 ,9x10’ ¹⁰ ), BP1 1 (9,4x10’ ¹¹ ).

[063] Las min¡ACE2 de la invención comprenden al menos tres regiones conformacionales discontinuas de ACE2, denominadas R1 , R2 y R3 que pueden estar o no modificadas con respecto las regiones R1 , R2 y R3 de la ACE2 nativa (que corresponden a las SEQ ID Nos: 1 , 2 y 3). Preferiblemente, las regiones conformacionales discontinuas R1 , R2 y R3 de las min¡ACE2 comprenden secuencias de aminoácidos que forman estructuras tridimensionales que participan en la inferíase de contacto con el RBD, pero la secuencia de aminoácidos no es consecutiva entre una y otra. En algunas modalidades, R1 , R2 y R3 de las min¡ACE2 comprenden sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos con respecto a la ACE2 nativa que mejoran la afinidad de las min¡ACE2 por el receptor nativo, y que facilitan su correcto plegamiento. En particular, las regiones conformacionales discontinuas de la min¡ACE2 comprenden los aminoácidos en las posiciones R1a: 24 - 45, R1 b: 62 - 96; R2: 324 - 334; R3a: 341 - 359, y R3b: 363 - 385 de la ACE2 nativa (Figura 2). En modalidades particulares, las modificaciones introducidas eliminan sitios de N- glicosilación.

En una primera modalidad preferida, la min¡ACE2 contiene una región R1 : 20 - 96, sin alteraciones en la secuencia con respecto a la ACE2 nativa, una región R2: 324 - 334 con la sustitución de thptófano por serina en la posición 328 (W328S), y una región R3: 341 - 362 sin alteraciones en la secuencia con respecto a la ACE2 nativa.

[064] En una segunda modalidad preferida, la min¡ACE2 contiene R1 : 21 - 96, con una sustitución de asparagina por glutamina en las posiciones 53 y 90 (N53Q y N90Q), eliminando así sitios de N-glicosilación , y R3: 341 - 385 con una sustitución de lisina por glicina en la posición 341 (K341 G) y de metionina por serina en la posición 360 (M360S). En una tercera modalidad preferida, la min¡ACE2 contiene R1 : 21 - 96, con sustitución de asparagina por glutamina en la posición 90 (N90Q), eliminando así un sitio de N-glicosilación , y R3: 341 - 385 con una sustitución de lisina por glicina en la posición 341 (K341 G) y de metionina por serina en la posición 360 (M360S).

[065] Mas preferiblemente, R1 tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 4, R2 tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 6, y R3 tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NO: 8.

[066] Las min¡ACE2 de la invención comprenden regiones conformacionales discontinuas R1 , R2 y R3 unidas entre sí por segmentos conectores de aminoácidos, con longitudes entre 1 y 15 aminoácidos, más preferiblemente longitudes entre 1 a 10 aminoácidos. Mas preferiblemente, las regiones R1 , R2 y R3 se unen mediante uno o dos segmentos conectores de aminoácidos. Preferiblemente, los segmentos conectores de aminoácidos se seleccionan de manera que se favorezca el correcto plegamiento de las min¡ACE2s y se maximice la interacción con RBD. Más preferiblemente, los segmentos conectores comprenden secuencias de aminoácidos que mejoran su afinidad con el dominio RBD de la proteína S a la vez que mantiene la estructura conformacional de la inferíase de unión de la ACE2. En modalidades preferidas los conectores comprenden entre 1 y 10 residuos de aminoácido, seleccionados preferiblemente de serina y glicina. En algunas modalidades el conector tiene un único aminoácido.

[067] En algunas modalidades, la min¡ACE2 comprende un primer segmento conector que conecta R1 y R2 y un segundo segmento conector que conecta R2 con R3. En otras modalidades, la min¡ACE2 comprende un segmento conector que conecta R1 y R3. En modalidades preferidas, el primer segmento conector puede tener la secuencia NGTIYSTG (SEQ ID NO: 5) y el segundo segmento conector la secuencia S (SEQ ID NO: 7). En otra modalidad preferida, el segmento conector puede tener la secuencia LQALQQNSGSG (SEQ ID NO: 1 1 o 15).

[068] En algunas modalidades, la min¡ACE2 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 90% de identidad con las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 14. En realizaciones preferidas de la invención, la min¡ACE2 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 14.

[069] En una segunda realización, la invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico (CAR) que reconoce la proteína S. Más específicamente, el CAR de la invención se une específicamente al dominio RBD de la proteína S. Dichos CAR pueden ser usados en células NK para conferirles la capacidad de reconocer la proteína S en células infectadas y eliminarlas específicamente para reducir los reservónos celulares del virus SARS-CoV-2.

[070] En realizaciones preferidas de la invención, el CAR de la invención comprende un dominio de reconocimiento de antígeno específico que tiene al menos 90% de identidad con una de las min¡ACE2 de las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 14. En realizaciones preferidas de la invención, el CAR-miniACE2 de la invención comprende un dominio de reconocimiento de antígeno específico con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 14.

[071] Adicionalmente, el CAR de la invención comprende una región conectora o bisagra derivada de la proteína CD8 (SEQ ID NO: 35), CD28 (SEQ ID NO: 36), CD16 (SEQ ID NO: 37), ICOS (SEQ ID NO: 38), CD137 o lgG1. El CAR de la invención también comprende una región transmembranal derivada de CD8 (SEQ ID NO: 39), CD28 (SEQ ID NO: 40), CD16 (SEQ ID NO: 41 ), 0X40 (SEQ ID NO: 42) e ICOS (SEQ ID NO: 43). El CAR de la invención también comprende un dominio coestimulador derivado de las proteínas CD16 (SEQ ID NO: 44), CD28 (SEQ ID NO: 45), CD137 (SEQ ID NO: 47), 0X40 (SEQ ID NO: 46), CD137 (SEQ ID NO: 47) o ICOS (SEQ ID NO: 48). El CAR de la invención también comprende el dominio CD3z para la transducción de señales (SEQ ID NO: 49), y un péptido guía derivado de CD8 (SEQ ID NO: 33) o CD16 (SEQ ID NO: 34).

[072] El CAR-miniACE2 de la invención es expresado en células NK por medio de la transducción con vectores de lentivirus o retrovirus. Preferiblemente, las células NK con CAR-miniACE2 comprenden el gen quimérico que codifica para la proteína CAR seguido corriente abajo por el gen completo de la interleucina 15 (IL-15), incluyendo una diana de reconocimiento para fuhna corriente arriba de la secuencia que codifica para el péptido guía con el fin de que la proteína sea escindida correctamente para que sea secretada por las células NK con CAR-miniACE2.

EJEMPLOS

[073] Se entiende que los siguientes ejemplos y realizaciones descritos en este documento son solo para propósitos ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugestivos para los expertos en la técnica y deben incluirse dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas a la misma.

[074] Ejemplo 1. Diseño y construcción de las proteínas miniACE2

[075] Estudio de la inferíase de contacto

Esta invención inicio con el estudio de la interfase de contacto reportada en las estructuras tridimensionales (3D) 6VXX, 6LZG, 6VSB y 6M0J, publicadas en el PDB. Mediante el estudio y entendimiento de la interacción RBD/hACE2 nativo a nivel molecular, apoyándose en las estructuras depositadas en el PDB, se identificaron las regiones relevantes para la interacción proteína-receptor junto con los aminoácidos circundantes. En particular, se identificaron las 3 regiones conformacionales discontinuas del receptor ACE2 nativo, denominadas R1 , R2 y R3, que interactúan con el dominio RBD de la proteína S de SARS-CoV-2, y sus respectivas secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 1 , 2 y 3) las cuales se muestran en la Tabla 1 y en la Figura 2.

[076] Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de las regiones conformacionales discontinuas del receptor ACE2 nativo que interactúan con el dominio RBD de la proteína S de SARS-CoV-2. Regiones conformac ionales de Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

ACE2 nativa

R1 TIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENV _{|-n |n 1}

QNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQ ^{I U 1}

R2 TQGFWENSMLT SEQ ID NO: 2

KAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHI SEQ ID NO: 3 ó QYDMAY

[077] Diseño de proteínas miniACE2

Se diseñaron aproximadamente 100 secuencias diferentes de proteínas bloqueadoras min¡ACE2 que comprendían una, dos o todas las regiones R1 , R2 y R3 del receptor ACE2 nativo modificadas o sin modificación y unidas mediante segmentos conectores de aminoácidos derivadas del dominio peptidasa de la ACE2 nativa para poner juntas las regiones R1 , R2 y R3 modificadas y no modificadas. Dichas modificaciones podían comprenden sustituciones de aminoácidos o eliminaciones. Por ejemplo, sustituciones para retirar sitios de N-glicosilación.

Las secuencias de las min¡ACE2 resultantes fueron usadas para modelar la estructura 3D mediante el servicio de predicción de estructuras de proteínas Robetta (https://robetta.bakerlab.orq/) y el programa Phyre2. Luego de la predicción de las estructuras de las min¡ACE2, se realizó un alineamiento estructural sobre los modelos de la ACE2 nativa disponibles en la base de datos de Protein Data Bank (PDB) (6VXX, 6LZG, 6VSB, 6M0J), con ayuda del software Pymol.

A partir de esto se hizo una evaluación preliminar de la interacción que pueden tener estas estructuras con el RBD de la proteína S. Las proteínas que pasaron el filtro anterior fueron sometidas a dinámica molecular (DM) en interacción con el RBD, usando el programa AMBER. Los archivos obtenidos como resultados de la DM fueron corregidos, ya que AMBER renombra las histidinas (HID o HIE) en función de si están protonadas en 5 o £ y también renombra como CYX las cisteínas que forman puentes disulfuro. Una vez corregidos, estos archivos fueron evaluados usando el servidor PRODIGY (PROtein binDIng enerGY prediction), para conocer los valores estimados de energía libre de interacción (AG) y la constante de disociación (Kd). Adicionalmente, se evaluó la solubilidad potencial de las proteínas a pH=7, mediante la herramienta “CamSol in silico solubility score”. Teniendo en cuenta la energía libre de interacción, la constante de disociación y la estimación in silico de la solubilidad, las tres proteínas min¡ACE2 con las mejores características fueron seleccionadas, denominadas como BP2, BP9 y BP11. La estructura completa de BP9, BP11 y BP12, juntos con la estructura de sus respectivas regiones R1 , R2 y R3, se muestra en la Tabla 2.

[078] Tabla 2. Secuencias de las min¡ACE2 seleccionadas [079] Los valores de energía libre de interacción y constante de disociación y se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Valores estimados de energía libre de interacción (AG) y la constante de disociación (Kd). para las tres min¡ACE2s seleccionadas.

Afinidad de Constante de

MiniACE2s unión (AG) in disociación (Kd) silico

BP2 -12,6 1 ,3x10 ⁹

BP9 -13,7 1 ,9x10- ¹ °

BP11 -14,2 9,4x10 ¹¹

[080] La estructura tridimensional las miniACEs BP2, BP9 y BP1 1 se muestra en la Figura 8.

[081] Ejemplo 2. Clonación y expresión de las proteínas min¡ACE2

[082] Se construyeron los genes sintéticos para expresar las secuencias de aminoácidos de las proteínas min¡ACE2 de acuerdo con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7, 11 y 14 en un sistema de células CHO o HEK293 (ver Figura 5), en levaduras del género Pichia (Ver Figura 6) o células mesenquimales (ver Figura 4).

[083] Expresión en levaduras:

[084] Para la expresión en levaduras, la secuencia de aminoácidos de las min¡ACE2 candidates fueron usadas para construir los genes correspondientes, incluyendo dianas de restricción para facilitar su clonación y la secuencia de nucleótidos de estas se optimiza para expresión en Pichia pastoris, se incluye también la señal de secreción del factor a de Saccharomyces cerevisiae, la cual promueve la translocación eficiente y secreción de la proteína recombinante al medio de cultivo, en el N terminal de cada proteína se adiciona una cola de 6 histidinas que facilita el proceso de purificación. La expresión de los genes está bajo el control del promotor del gen AOX1 inducible por metanol. Los genes fueron subclonados en el vector de expresión pPICZaA. [085] Se construyeron los ADNs plasmídicos: pZ-H-Xa-BP2 (SEQ ID NO: 49), pZ-H- RFP-Xa-BP2 (SEQ ID NO: 50), pZ-H-Xa-BP9 (SEQ ID NO: 51 ), pZ-H-RFP-Xa-BP9 (SEQ ID NO: 52), pZ-H-Xa-BP1 1 (SEQ ID NO: 53) y pZ-H-RFP-Xa-BP1 1 (SEQ ID NO: 54) (ver Figuras 6 y 7), usando como esqueleto el vector de expresión pPICZaA, secuencias para facilitar el proceso de detección y purificación de la proteína recombinante fueron incluidas en los constructos de ADN plasmídico como la inclusión de la secuencia que codifica para la proteína roja fluorescente (RFP), una cola de 6 histidinas y un sitio para corte con la proteasa Xa.

[086] El vector de expresión recombinante para cada una de las proteínas de interés fue linealizado por digestión con la enzima de restricción Pmel para transformar células competentes de Pichia pastorís GS1 15 mediante electroporación. Los clones de P. pastorís recombinantes fueron seleccionados en placa YPDS (medio YPD con sorbitol 1 M) con una concentración de zeocina de 100 pg/mL, y las células se incubaron durante 3 días, a 30° C. La integración exitosa del plásmido recombinante se confirmó mediante POR y secuenciación de los productos amplificados.

[087] Las proteínas expresadas y aisladas fueron evaluadas in vitro para evidenciar su afinidad por el RBD mediante el kit de detección de anticuerpos de neutralización “GenScript ePass™ SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Detection Kit” (Datos no mostrados).

[088] Expresión en células CHO o HEK293:

[089] Para la expresión en células CHO o HEK293, con el objetivo de obtener grandes cantidades de proteína para ser purificada, la expresión del gen está bajo el control de un promotor TET-ON, para incrementar la estabilidad y la expresión del ARNm, se adicionará al gen combinaciones de la región 5’ UTR del gen humano del citocromo P450 (NCBI RefSeq: NM_000773.4) y las regiones 3’ UTR de los genes para la apolipoproteína A2 (NCBI RefSeq: NM_001643.2) y la subunidad alfa 2 de la hemoglobina (NCBI RefSeq: NM_000517.6), (ADNs plasmídicos: pCW-Cy_BP2_Apo (SEQ ID NO: 58), pCW-Cy_BP9_HB (SEQ ID NO: 59) y pCW-Cy_BP1 1_HB (SEQ ID NO: 60), que se muestran en la Figura 5). [090] Expresión en células mesenquimales:

[091] Para aumentar los niveles de expresión de la PB en células mesenquimales, la expresión del gen estará bajo el control del promotor fuerte para el factor de elongación 1 a (eF1 a), (ADNs plasmídicos: pCDH-EF1 -BP2 (SEQ ID NO: 55); pCDH- EF1 -BP9 (SEQ ID NO: 56); pCDH-EF1 -BP1 1 (SEQ ID NO: 57), que se muestran en la Figura 4).

[092] Ejemplo 3. Obtención de células NK modificadas genéticamente con la expresión de CAR-miniACE2 para eliminar células infectadas que actúan como reservorio del virus.

[093] Las células NK reconocen las células infectadas con virus SARS-Cov-2 debido a la presencia de la proteína S en su superficie. El dominio de superficie del CAR que confiere el reconocimiento fue diseñado de manera que correspondiera a cada una de las min¡ACE2 de las SEQ ID NO: 9, 13 y 17, seguido por una región conectora o bisagra proveniente de la proteína CD8 (SEQ ID NO: 35), CD28 (SEQ ID NO: 36), CD16 (SEQ ID NO: 37), ICOS (SEQ ID NO: 38), CD137 o lgG1. La región transmembranal se seleccionó de entre las regiones transmembranales de CD8 (SEQ ID NO: 39), CD28 (SEQ ID NO: 40), CD16 (SEQ ID NO: 41 ), 0X40 (SEQ ID NO: 42) o ICOS (SEQ ID NO: 43). El dominio coestimulador se seleccionó de entre los dominios coestimuladores de CD16 (SEQ ID NO: 44), CD28 (SEQ ID NO: 45), 0X40 (SEQ ID NO: 46), CD137 (SEQ ID NO: 47) o ICOS (SEQ ID NO: 48). El péptido guía se derivó de CD8 (SEQ ID NO: 33) o CD16 (SEQ ID NO: 34). El dominio CD3z (SEQ ID NO: 39) fue incluido como dominio de reconocimiento para fuñna corriente arriba de la secuencia que codifica para el péptido guía con el fin de que la proteína sea escindida correctamente para que sea secretada por las células NK. La secuencia de aminoácidos completa de los CARs aquí diseñados se muestra en la Tabla 4.

[094] A partir de las secuencias de los CAR-miniACE2, se construyeron los siguientes ADNs plasmídicos para expresión en células mesenquimales: pEF1 -BP2-CAR1 (SEQ ID NO: 61 ), pEF1 -BP2-CAR2 (SEQ ID NO: 62), pEF1 -BP2-CAR3 (SEQ ID NO: 63), pEF1 -BP2-CAR4 (SEQ ID NO: 64), pEF1 -BP2-CAR5 (SEQ ID NO: 65), pEF1 -BP9- CAR1 (SEQ ID NO: 66), pEF1 -BP9-CAR2 (SEQ ID NO: 67), pEF1 -BP9-CAR3 (SEQ ID NO: 68), pEF1 -BP9-CAR4 (SEQ ID NO: 69), pEF1 -BP9-CAR5 (SEQ ID NO: 70), pEF1 -BP1 1 -CAR1 (SEQ ID NO: 71 ), pEF1 -BP1 1 -CAR2 (SEQ ID NO: 72), pEF1 - BP1 1 -CAR3 (SEQ ID NO: 73), pEF1 -BP1 1 -CAR4 (SEQ ID NO: 74), y pEF1 -BP1 1 - CAR5 (SEQ ID NO: 75), en los cuales la expresión de los CAR se encuentra bajo el promotor EF-1 a.

[095] La estructura de los vectores empleados para la expresión de los CAR de la invención en células NK se puede observar en la Figura 3, mientras que, por su parte, las estructuras tridimensionales de las CAR de la invención pueden observarse en la Figura 9.

[096] En particular, se evaluó el potencial de las proteínas min¡ACE2 para inhibir la infección de células VERO-E6 por parte de lentivirus pseudotipo de la proteína S (Datos no mostrados).

[094] Tabla 4. Secuencias de aminoácidos de los CAR desarrollados a partir de las min¡ACE2. La secuencia de las ACE2 usadas como punto de partida. Se muestra subrayadas (BP2, BP9 y BP11 ).