La présente invention concerne le domaine technique de la détection de la vitamine D. Plus précisément, l'invention a pour objet l'utilisation d'une association d'un surfactant fluoalkyle et d'un alcool pour libérer la vitamine D et/ou un de ses métabolites de la protéine de liaison de la vitamine D, une solution contenant une telle association, un procédé de détection/quantification in vitro de la vitamine D et/ou d'au moins un métabolite de la vitamine D utilisant une telle association, ainsi qu'un kit de détection/quantification par immunodosage mettant en œuvre une telle association,

La vitamine D est une substance importante ayant de nombreuses implications dans les processus biologiques du corps humain et animal. La vitamine D, biologiquement active, est connue pour réguler entre autre la fixation du calcium à partir de l'intestin, la minéralisation osseuse, et influence un grand nombre d'autres voies métaboliques comme par exemple le système insulinaire. Une déficience ou un excès en vitamine D peut avoir diverses conséquences. En particulier, il est connu qu'une déficience en vitamine D entraîne des maladies sévères telles que l'ostéoporose et le rachitisme.

Par ailleurs, un excès de vitamine D, notamment dû à un surdosage est toxique. En particulier, un taux important de vitamine D peut entraîner une hyper-calcémie causée par une augmentation de l'absorption intestinale du calcium. D'autres effets toxiques de la vitamine D se manifestent par une augmentation de la pression sanguine, des troubles gastro-intestinaux tels que l'anorexie, les nausées, souvent suivies d'une production excessive d'urine, une polydipsie, de la fatigue, de la nervosité, un prurit ou encore une insuffisance rénale.

Comme mentionné dans la demande WO 2012/091569, il a été également mis en évidence, ces dernières années, que la vitamine D modulait la fonction immunitaire et réduisait l'inflammation. Il a été également suggéré que ia vitamine D pouvait prévenir les cancers du côlon, des ovaires et du sein.

Par conséquent, il est important de pouvoir doser ou quantifier, la vitamine D, c'est-à-dire en déterminer sa concentration, de manière à mettre en évidence des éventuelles carences ou excès.

La vitamine D est présente dans l'organisme sous deux formes, à savoir la vitamine D ₂ (ergocalciférol) et la vitamine D ₃ (cholécalciférol) dont les formules (dans lesquelles les positions de la vitamine D sont indiquées conformément à la nomenclature des stéroïdes) sont reprises ci-après.

vitamine D ₂ (ergocalciférol) :

vitamine D ₃ (cholécalciférol) :

La vitamine D ₂ est la forme exogène de la vitamine D, provenant de la nourriture, La vitamine D ₃ est la forme endogène de la vitamine D produite par l'organisme sous l'action sur la peau des rayons ultraviolets de la lumière solaire. La vitamine D ₃ qui est produite au niveau de la peau, se lie à la protéine de liaison de la vitamine D qui la transporte dans le foie. Les deux formes peuvent provenir de suppléments nutritionnels. Différents métaboiites de la vitamine D sont produits. En particulier, une métabolisau ^' on en deux étapes a lieu, la première étape consistant en la production de 25- hydroxyvitamine D (D ₂ ou Di), suivie par la production de 1,25 di- hydroxyvitamine D (D ₂ ou l¾).

La mesure du taux de vitamine D elle-même présente un intérêt limité, étant donné que sa concentration fluctue fortement en fonction de l'alimentation. Il en va de même des métaboiites 1,25-dihydroxyvttamine D qui sont présents en concentration assez faible et qui fluctuent également Les formes circulantes de la vitamine D sont essentiellement Ses métaboiites du type 25-hydroxyvttamtne D. Aussi, le dosage de la 25- hydroxyvitamine D est le mode privilégié pour obtenir des informations sur la concentration globale de vitamine D chez un patient.

La liaison de la 25-hydroxyvitamine D, ou plus généralement de la vitamine D et de ses métaboiites, à la protéine de liaison de la vitamine D (« D Binding Protein » ou DBP) complique le dosage de ces composés. Pour obtenir un dosage adéquat, il est nécessaire de libérer Ittaptène à doser de la DBP, en obtenant ieur dissociation. Aussi, différentes solutions ont été proposées pour obtenir la libération de la vitamine D et de ses métaboiites, après dissociation de la DBP, avant détection de ces derniers.

Différentes techniques listées dans la demande de brevet WO 2007/039194 et dans la demande de brevet WO 2012/091569 ont été développées. Seules quelques-unes seront listées ici.

Une technique ancienne, notamment utilisée dans la demande WO 99/67211, consiste à préparer un échantillon de plasma ou de sérum pour la détermination de la vitamine D par précipitation à l'éthanoi. Les précipités sont ensuite éliminés, pour récupérer te surnageant éthanolique contenant les métabot ^' ttes solubles de la vitamine D. La précipitation par un alcool ou un autre solvant organique tel que l'acétonltrile a été couramment utilisée par le passé. Cependant, cette technique ne peut être automatisée et nécessite de nombreuses opérations manuelles (ajout de solvants au sérum, mélange, centrifugation, récupération de la phase organique, séchage sur colonne ou autre, re-suspension dans un solvant liquide), ce qui la rend obsolète de nos jours du fait de la très grande variation inter-opérateurs observée,

La demande de brevet WO 2007/039194 propose, quant à elle, d'utiliser une solution contenant de 5 à 30% en volume d'un ou plusieurs réactifs amphiphiies choisis parmi le diméthylsulfoxyde (DMSO) et les amides organiques liquides, et optionneilement de 0,7 à 8 % en volume d'un alcool à chaîne courte (en Q-C3). Les composés amphiphiies utilisés dans ce document sont des produits toxiques, voire dangereux dans le cas du DMSO.

Les demandes de brevet WO 2011/122948 et WO 2012/091569 au nom de Future Diagnostics décrivent un immunodosage et un agent permettant de libérer la vitamine D de sa protéine de liaison qui utilise un surfactant fluoroalkyle. La Demanderesse qui a utilisé cette solution, a cependant constaté que la dissociation obtenue était encore insuffisante.

L'objectif de l'invention est de proposer une technique de dissociation plus performante, qui soit facile à mettre en œuvre et qui conduise à une libération efficace de la vitamine D et de ses rm_tabolir.es, après dissociation de la protéine de liaison de la vitamine D (DBP), permettant ensuite une détection et quantification adéquate de ces derniers.

Dans le cadre de la présente invention, l'objectif est de fournir une nouvelle solution pour dissocier la vitamine D ou un de ses métabolites, de la protéine de liaison de la vitamine D (DBP), qui soit plus efficace que les techniques proposées dans l'art antérieur par Future Diagnostics dans ses demandes de brevet WO 2011/122948 et WO 2012/091569. En outre, la solution décrite dans la présente invention ne présente pas les problèmes de toxicité des solutions notamment proposées dans la demande de brevet WO 2007/039194. Dans ce contexte, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un surfactant fluoroalkyle, et en particulier perfluoroafkyle, et d'au moins un alcool comportant de 1 à 4 atomes de carbone, pour dissocier, de ta protéine de liaison de ia vitamine D, la vitamine D et/ou un métabolite de la vitamine D. Une telle utilisation conjointe permet d'augmenter significativement le taux de dissociation de la vitamine D ou d'un de ses métaboiites, de la protéine de liaison de la vitamine D, par rapport à une utilisation similaire différant uniquement par l'absence d'alcool. Dans l'utilisation selon l'invention, le surfactant fluoroalkyle, et en particulier perfluoroaikyle, et l'alcool comportant de 1 à 4 atomes de carbone, sont incorporés dans un éc antillon liquide comportant la vitamine D et/ou un métabolite de la vitamine D (nommé analyte ou analyte de la vitamine D), associé à la protéine de liaison de la vitamine D. L'analyte à dissocier est donc en contact à la fois avec le surfactant fluoroalkyle et l'alcool qui, utilisés ensemble, vont permettre une dissociation plus importante, par comparaison avec l'utilisation du même surfactant fluoroalkyle seul. L'utilisation conjointe de surfactant fluoroalkyle, et en particulier perfluoroalkyle, et d'alcool comportant de 1 à 4 atomes de carbone, entraîne une dissociation efficace entre, la protéine de liaison de la vitamine D, et la vitamine D et/ou un de ses métabolites.

En particulier, le surfactant fluoroalkyle et l'alcool sont utilisés en quantités telles que le rapport multiplié par 100 de la masse de surfactant, quand ce dernier est un solide, ou du volume de surfactant, quand ce dernier est un liquide, sur le volume d'alcool, appartient à la gamme allant de 10 à 60%, de préférence à la gamme allant de 15 à 40 %, et préférentiel iement dans la gamme allant de 15 à 30%. Le caractère solide ou liquide s'apprécie à température ambiante (à 22°C notamment) et à pression atmosphérique (notamment à 1013 hPa).

De manière avantageuse, le surfactant fluoroalkyle est choisi parmi les acides perfluorocarboxyliques, les acides perfluorosulfoniques et leurs sels, et notamment parmi l'acide perfluorohexanoïque, l'acide perfluoroheptanoïque, l'acide perfluorooctanoïque et leurs sets. L'acide perfluorohexano ^' ique est également appelé acide perfluorocaproïque ou encore acide undécafluorohexanoïque ; son numéro CAS (« Chemical abstracts service registration number ») est 307-24-4. L'acide perfluorooctanoïque est également appelé acide perfluorocaprylique ou encore acide pentadécafluorooctanoïque ; son numéro CAS est te 335-67-1. En général, les se!s de ces acides perfluoroalkyles sont solides, alors que les acides libres correspondants sont liquides.

L'acide perfluorobexanoïque, éventuellement sous forme de sel, est le surfactant fluoroalkyle préféré, car il présente une meilleure dégradabilité par rapport aux surfactants fluoroalkyles à chaîne plus longue,

De manière préférée, l'alcool utilisé comporte de 1 à 3 atomes de carbone et est choisi parmi le méthanol, l'éthanol, le /?-propanol et Yiso- propanol. Le méthanol est l'alcool préféré dans le cadre de l'invention car il permet d'obtenir des meilleures performances en termes de reproductibilité des résultats de dosage mis en œuvre après dissociation, et offre un bon compromis au regard de l'amélioration de la dissociation et de la reproductibilité des résultats obtenus.

De manière particulièrement avantageuse, ta dissociation sera réalisée avec de l'acide perfiuorohexanoïque et du méthanol.

Dans le cadre de l'invention, la dissociation pourra être réalisée en présence d'un surfactant additionnel choisi, notamment, parmi les copolymères blocs à base d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène, les polysorbates et les éthers de polyéthylène glycol.

L'invention est, par exemple, mise en œuvre pour dissocier la protéine de liaison de la vitamine D, de la 25-hydroxyvitamine D, et en particulier de ia 25-hydroxyvitamine D ₂ et/ou de la 25-hydroxyvitamine D .

L'alcool et le surfactant fluoroalkyle peuvent être incorporés séparément a l'échantillon dans lequel on souhaite obtenir la dissociation, ou incorporés en même temps. Dans ce cas, on utilisera une solution unique, nommée solution de dissociation, afin de minimiser les manipulations.

L'invention a également pour objet de telles solutions comprenant au moins un surfactant fluoroalkyle, et en particulier perfluoroalkyle, et au moins un alcool comportant de 1 à 4 atomes de carbone. De tel!es solutions peuvent être qualifiées d'aqueuses et comporteront une part importante d'eau, représentant en général plus de 80% en volume, par rapport au voiume total de la solution.

De manière avantageuse, une telle solution comprendra un pourcentage de surfactant fluoroalkyle, exprimé en volume lorsque ce dernier est liquide, ou en masse lorsque ce dernier est solide, par rapport au voiume total de ia solution, de 0,1 à 3%, de préférence de 1 à 2%. De manière également préférée, une telle solution comprendra un pourcentage en volume d'alcool, par rapport au volume total de la solution, de 0,5 à 10%, de préférence de 2 à 7%.

Les mêmes préférences, quant au choix de l'alcool et du surfactant fluorolakyle et à leur quantité relative, données en relation avec l'utilisation, s'appliquent aux solutions de dissociation selon l'invention.

Selon une variante avantageuse, les solutions de dissociation selon l'invention contiennent, en outre, un autre surfactant choisi parmi les copolymères blocs à base d'oxyde d'éthyiène oxyde et d'oxyde de propylène, les polysorbates et les éthers de polyéthylène glycol. Sans vouloir être lié par une quelconque interprétation des résultats, un tel surfactant additionnel pourrait améliorer la solubilité de la vitamine D ou de ses métabolites à doser. L'utilisation d'un tel surfactant additionnel, tel que le Pluronic® F-127, qui est un polyol correspondant à un copolymère bloc à base d'oxyde d'éthyiène oxyde et d'oxyde de propylène, permet notamment d'améliorer la reproductibilité des résultats. Il en ressort que le dosage final est plus fiable. A titre d'exemple non limitatif, on pourra utiliser le Pluronic® F-127 avec une concentration dans la solution de dissociation, qui se situe, de préférence, entre 0,1% et 3% (en volume/volume final de la solution de dissociation).

En général, les solutions de dissociation selon l'invention seront tamponnées, notamment à un pH appartenant à la gamme allant de 6 à 8.

Les tampons classiquement utilisés dans le domaine du diagnostic, pourront être incorporés dans la solution, de manière à obtenir et stabiliser le pH dans la gamme souhaitée. A titre d'exemple, un tampon PBS (tampon phosphate salin) ou tris (trls-hydroxymé^ lamînornéthane) pourra être utilisé- Une base pourra être incorporée pour ajuster le pH. Une telle base peut être toute base classiquement utilisée à cette fin, telle que KOH, NaOH, UOH ou Na ₂ HP0 ₄ .

Une telle solution de dissociation peut être préparée en mélangeant un tampon dont la concentration se situe, de préférence, entre 1 et 500 mM, un surfactant fiuoroalkyle dont la concentration se situe, de préférence, entre 0 l% et 3% (en masse ou en volume en fonction du caractère solide ou liquide du surfactant/volume final de la solution de dissociation ) et un alcool dont la concentration se situe, de préférence, entre 0,5% et 10% (volume/volume final de la solution de dissociation) dans de l'eau déminéralisée. Le pH de la solution de dissociation est ajusté selon le tampon choisi, par ajout d'acide ou par ajout de base à une valeur comprise entre 4 et 8, de préférence autour de 7. Quand la solution de dissociation contient un surfactant additionnel, ce dernier peut être introduit à n'importe quel stade.

De manière avantageuse, de telles solutions de dissociation ne contiennent aucun des composés suivants : diméthyl sulfoxyde, diméthylformamide, Ν,Ν-diméthylacétamïde, tetraméthyiurée, N- méthylpyrrolidone, l,3^in éthyl-3,4,5,6-tétrahydro-2(lH)-pyrimidone, acide triamide hexaméthyiphosphorique.

L'invention a également pour objet un procédé de détection et de quantification, in vitro, de la vitamine D et/ou d'au moins un métabolite de la vitamine D, dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :

a) une étape de traitement de l'échantillon par incorporation d'au moins un surfactant fiuoroalkyle et d'au moins un alcool comportant de 1 à 4 atomes de carbone, de manière à dissocier, la comportant au moins un surfactant fiuoroalkyle et au moins un alcool comportant de 1 à 4 atomes de carbone, de la protéine de liaison de la vitamine D, b) une étape de détection et de quantification de la vitamine D et/ou d'au moins un de ses métabolites.

L'étape a) de dissociation sera effectuée avant l'étape b) de détection et de quantification.

De manière avantageuse, dans un tel procédé de détection et de quantification, le traitement de l'étape a) est réalisé par mélange de l'échantillon avec une solution de dissociation selon l'invention. Le plus souvent, de 1 à 20 volumes de solution de dissociation, de préférence de 5 à 10 volumes, de préférence encore de 6 à 8 volumes, et notamment environ 7 volumes de solution, sont utilisés pour 1 volume d'échantillon. Le choix du volume est fonction de la concentration présumée en vitamine D et/ou m tabolite de la vitamine D à détecter (nommé analyte à détecter).

De manière avantageuse, le procédé de détection et de quantification selon l'invention sera mis en œuvre sur un échantillon de sang, de sérum ou de plasma.

Le procédé de détection et de quantification est notamment adapté à la détection et à la quantification de la 25-hydroxyvitamine L¾ et/ou de la 25- hydroxyvitamine D ₃ .

A l'étape b), la détection et la quantification sont effectuées, de manière préférée, par mise en œuvre d'un immunodosage, ou encore par spectrométrie de masse.

L'invention concerne également une trousse de détection et de quantification, de la vitamine D et/ou d'au moins un métabolite de la vitamine D, par immunodosage, comprenant une solution de dissociation selon l'invention. Une telle trousse pourra comporter, en outre, un partenaire de liaison à la vitamine D ou à un de ses métabolites et/ou une phase solide sur laquelle est lié un haptène analogue à la vitamine D et/ou au(x) métabolite(s) de la vitamine D à détecter, qui est reconnu par l'anticorps marqué.

Dans le cadre de l'invention, les métabolites de la vitamine D englobent tous les composés qui contiennent le squelette de la vitamine D ₂ ou le squelette de la vitamine D ₃ , et notamment : - la 25-hydroxyvitamine D qui désigne les métabol ^' rtes de la vitamine D hydroxylés en position 25, c'est-à-dire la 25-hydroxyvitamine D ₂ et la 25- hydroxyvitamine D3 ;

- les formes 1,25 et 24,25-dihydroxyvitamine D qui désignent les métaboiltes de la vitamine D dihydroxylés, respectivement en positions 1 et

25, et en positions 24 et 25,

Dans les procédés et utilisations selon l'invention, la dissociation peut être effectuée en incorporant dans l'échantillon à analyser le surfactant fluoroalkyle et l'alcool en C1-C4, de préférence en C1-C ₃ , sélectionnés, ensemble ou séparément. Après cette incorporation, aucune séparation n'est nécessaire, la détection pouvant être effectuée directement sur l'échantillon ainsi obtenu. De préférence, pour limiter les manipulations, une solution déjà préparée contenant le surfactant fluoroalkyle et l'alcool en C1-C4, de préférence en C _J -C3, sélectionnés, et en particulier une solution conforme à l'invention, sera incorporée à l'échantillon.

De manière à favoriser la dissociation, un mélange sera opéré sur l'échantillon contenant le surfactant fluoroalkyle, et notamment le surfactant perfluoroalkyle, et l'alcool en C1-C4, de préférence en C1-C3, sélectionnés. Un tel mélange peut être effectué avec tout dispositif adapté, et notamment au moyen d'un cône de réaction jouant le rôle de pipette, comme dans la technologie VIDAS® de la Demanderesse (VIDAS® Manuel Instrument, 2005, Chapitre 2 Description fonctionnelle, 2-1 à 2-16, bioMérieux France).

La détection de la vitamine D ou d'un de ses métabolites pourra être effectuée selon toute technique connue de l'homme du métier, et notamment, par mise en œuvre d'un test utilisant un partenaire de liaison de l'analyte à détecter, et en particulier un test immunologique (également nommé immunodosage), ou encore par spectrométrie de masse.

Bien entendu, le préfixe « immuno » dans le terme « immunodosage », par exemple, n'est pas à considérer dans la présente demande comme indiquant strictement que le partenaire de liaison est nécessairement un partenaire d'origine immunoiogique, tel qu'un anticorps ou un fragment d'anticorps. En effet, comme cela est bien connu de l'homme du métier, ce terme est plus largement utilisé pour désigner des tests et procédés dans lesquels le partenaire de liaison n'est pas uniquement un partenaire d'origine/de nature immunologique mais consiste, par exemple, en un récepteur de l'analyte que l'on souhaite détecter et/ou quantifier, la condition étant que le partenaire de liaison concerné soit capable de se lier à l'analyte recherché, de préférence de manière spécifique. Ainsi, il est connu de parler du dosage EUSA pour des dosages qui utilisent des partenaires de liaison non immunologiques stricto sensu, appelés plus largement en anglais « ligand binding assay », que l'on pourrait traduire en langue française par « dosage utilisant la liaison à un ligand », alors que le terme « immuno » est inclus dans l'intitulé in extenso correspondant à l'acronyme EUSA, Dans un souci de clarté et d'uniformité, le terme « immuno » est employé dans la présente demande pour désigner toute analyse biologique utilisant au moins un partenaire de liaison adapté pour se lier à l'analyte recherché et détecter et/ou quantifier ce dernier, de préférence de manière spécifique, même quand ledit partenaire de liaison n'est pas de nature ou d'origine immunologique au sens strict.

Le test immunologique sera, de préférence, un dosage par compétition qui est un dosage largement connu de l'homme du métier et utilisé lorsque l'analyte est un haptène. Il consiste à doser l'analyte, ici la vitamine D et/ou au moins un de ses métabolites, dans l'échantillon, en créant une compétition entre l'analyte de l'échantillon et un analogue de cet analyte. La réaction immunologique est alors mise en évidence grâce à la présence d'un traceur.

L'analogue de l'analyte peut être utilisé dans la réaction de compétition sans couplage préalable ou après couplage à un marqueur pour former un conjugué ou traceur.

Un dosage immunologique par compétition nécessite également la mise en uvre d'un partenaire de liaison de l'analyte vis-à-vis duquel l'analogue de l'analyte et l'analyte entrent en compétition. Lorsque l'analogue de l'analyte n'est pas couplé à un marqueur (il n'est pas le traceur mais le partenaire de capture), le partenaire de liaison est alors marqué pour constituer le traceur de la réaction. Lorsque l'analogue de l'anaîyte est couplé à un marqueur (il est alors le traceur), le partenaire de liaison devient alors le partenaire de capture.

Le signal mesuré émis par le traceur est alors inversement proportionnel à la quantité d'analyte de l'échantillon.

Par marqueur, on entend toute molécule contenant un groupement réactif avec le partenaire de capture ou l'analogue de l'anaiyte, selon le format, directement sans modification chimique, ou après modification chimique pour inclure un tel groupement, laquelle molécule est capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Un tel groupement réactif est notamment une aminé primaire. Une liste non limitative de ces marqueurs de détection directe consiste en :

• les enzymes qui produisent un signal détectable, par exemple, par colorimétne, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β-galactosîdase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase,

• les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,

» les molécules radioactives comme fe ³ P, le ³ ¾ ou le ¹²⁵ I,

· les molécules fluorescentes telles que les Aiexa ou les phycocyanines, et

• (es sels électrochimiluminescents tels que des dérivés organo-métalliques à base d'acridinium ou de ruthénium.

Des systèmes indirects de détection peuvent aussi être utilisés, comme, par exemple, des ligands capables de réagir avec un anti-iigand. Le ligand correspond alors au marqueur pour constituer, avec l'analogue de l'anaiyte ou le partenaire de liaison, le traceur.

Les couples ligand/anrj-!igand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas, par exemple, des couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anrjcorps, antigène/anticorps, peptide/antjcorps, sucre/lectine, pofynudéotide/complémentaire du polynucléotlde.

L'antHigand peut alors être détectable directement par les marqueurs de détection directe décrits précédemment ou être lui-même détectable par un autre couple ligand/anti-ligand, et ainsi de suite.

Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR 2781802 ou WO 95/08000 de la Demanderesse.

Selon le type de marquage utilisé, l'homme du métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage ou l'émission d'un signal détectable par tout type d'appareil de mesure approprié, comme, par exemple, un spectrophotomètre, un spectrofluorimètre ou encore une caméra haute définition.

Par partenaire de liaison à la vitamine D ou à l'un de ses métabolites, voire a plusieurs de ces composés, on entend toute molécule capable de se lier à la vitamine D ou à l'un de ses métabolites, voire à plusieurs de ces composés (appelés de façon générale « anar te de vitamine D »). A titre d'exemple de partenaire de liaison de l'analyte de vitamine D, on peut citer les anticorps, les fractions d'anticorps, les nanofltines, les récepteurs à l'analyte de vitamine D, ou toute autre protéine qui est connue pour avoir une interaction avec l'analyte de vitamine D.

Les anticorps partenaires de liaison sont, par exemple, soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux.

Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec, comme immunogène, l'analyte de vitamine D cible, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment fimmunogène.

Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes largement connue de l'homme du métier. Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple de fragments d'anticorps, on peut citer ies fragments Fab, Fab', F(ab')2 ainsi que les chaînes scFv (de l'anglais « Single chain variable fragment »), dsFv (de l'anglais « Double-stranded variable fragment *>). Ces fragments fonctionnels peuvent notamment être obtenus par génie génétique.

Les nanofltines (nom commercial) sont de petites protéines qui, comme les anticorps, sont capables de se lier à une cible biologique permettant ainsi de la détecter, de la capturer, ou tout simplement de la cibler au sein d'un organisme.

Les partenaires de liaison utilisés peuvent être spécifiques ou non de l'anaiyte de vitamine D. Ils sont dits spécifiques, quand ils sont capables de se lier de façon exclusive, ou quasi exclusive, à Tanalyte de vitamine D. Ils sont dits non spécifiques lorsque la sélectivité de liaison à i'analyte de vitamine D est faible et qu'ils sont alors capables de se lier à d'autres ligands, tels que d'autres protéines ou anticorps. Selon un mode de réalisation préféré, on préfère tes partenaires de liaison spécifiques.

Des anticorps anti-analyte de vitamine D sont connus et notamment décrits dans Hollis, Clin. Chem. 31/11, 1815-1819 (1985) et Holis, Clin. Chem. 39/3, 529-533 (1993) et dans le brevet EP 1931711, Ils peuvent également être obtenus auprès de diverses Sociétés telles que la Société Bioventix (Angleterre),

Les partenaires de liaison ou les analogues de vitamine D, lorsqu'ils sont utilisés en capture, peuvent être liés ou non à un support, tel que des plaques de micro-titrage, des latex, des cônes de réaction, des billes dont le diamètre est de l'ordre de la centaine de micromètres au nanomètre, par toute technique largement connue de l'homme du métier. Les analogues de vitamine D seront, de préférence, immobilisés sur une phase solide.

Il est possible notamment d'utiliser un support fonctionnalisé avec de l'avk ine et/ou de la streptavidine et de venir lier sur cette phase solide un analogue d'analyte biotinylé. Les techniques de fonctlonnalisation sont bien connues de l'homme du métier et il pourra y être fait référence. De manière classique, pour déterminer la quantité de vitamine D et/ou d'au moins un de ses métabolites, te signal, inversement proportionnel à la quantité d'analyte de l'échantillon, pourra être comparé à une courbe de calibration obtenue au préalable par des techniques largement connues de l'homme du métier. Ainsi, par exemple, la courbe de calibrabon est obtenue en effectuant un dosage immunologique utilisant le même partenaire de liaison, ainsi que des quantités croissantes connues de vitamine D, Une courbe est ainsi obtenue en mettant en abscisse la concentration en vitamine D et en ordonnée le signal correspondant obtenu après dosage immunologique.

Le procédé de détection/quantification selon l'invention peut être directement appliqué au format de tests commerciaux disponibles pour la détection/quantification de la vitamine D. De tels formats de dosage de la vitamine D et/ou d'un de ses métabolites sont notamment commercialisés par Abbott (Architect 25-OH Vitamine D, réf. 3L52), DiaSorin (LIAISON® 25- OH Vitamin D Total assay, réf. 310600), IDS (IDS-iSYS 25-Kydroxy Vitamin D assay, réf. IS-2700), Siemens (ADVIA Centaur® Vitamin D Total, réf. 10491 94), Roche (Elecsys Vitamin D total).

La mise en œuvre d'un immunodosage, de manière classique, inclut donc des réactifs nécessaires à la détection immunologique tels que décrits ci-dessus, lesquels seront incorporés dans l'échantillon. De manière avantageuse, ia dissociation, et donc l'incorporation dans l'échantillon à étudier du surfactant fluoroalkyfe et de l'alcool en Ci -G», de préférence en C C ₃ , sélectionnés, sera effectuée avant l'incorporation de tels réactifs.

La spectrométrie de masse pourra également être utilisée pour réaliser l'étape de détection/quantification, une fois la dissociation obtenue. Cette technique est une technique d'analyse qui permet la détermination de la masse molaire des composés analysés, ainsi que l'identification de leur structure moléculaire, voire leur quantification. Appliquée à un mélange complexe comme un fluide biologique, elle nécessite d'être couplée à une technique séparative qui permet d'en réduire la complexité. Il s'agit, le plus souvent, de la chromatographie en phase gazeuse (GC) ou de la chromatographie en phase liquide (LC). La spectrométrie de masse en tandem (MS/ S) combine 2 analyseurs et pourra être utilisée aux fins de détection/quantification. Les composés ioniques sélectionnés dans le premier analyseur sont analysés de manière plus fine que dans le second. Cette double analyse permet d'augmenter de manière significative la spécificité de la méthode. Pour cette technologie, on pourra notamment se référer à Van den Broek et al., 1 Chromatogr. B 929 161-179 (2013).

L'échantillon biologique avec lequel le procédé de l'invention peut être mis en œuvre est tout échantillon biologique animal, de préférence humain, susceptible de contenir de l'analyte (vitamine D ou un de ses rnétabolites), dans lequel un immunodosage ou une analyse en spectrométrie de masse peuvent être mis en œuvre. Ces échantillons sont largement connus de l'homme du métier. Les échantillons mis en œuvre dans le procédé de dosage peuvent être préalablement modifiés ou non avant leur utilisation. A titre d'exemple de tels échantillons non préalablement modifiés, on peut citer les fluides biologiques tels que sang total, et à titre d'exemples d'échantillon préalablement modifié, également appelé dérivé d'échantillon, on peut citer le sérum, le plasma, les cellules que l'on récupère à partir d'une biopsie, ou suite à une chirurgie, et que l'on met en culture in vitro. Le dosage de la concentration de vitamine D ou d'un de ses rnétabolites pourra alors être réalisé dans le surnageant de culture, ou encore dans le lysat cellulaire.

Les exemples ci-après permettent diliustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif.

Les tableaux présentés dans les exemples rapportent pour chaque condition expérimentale testée, le signal de fluorescence (RFV= « relative fluorescence value ») déterminé par l'automate VIDAS® (bioMérieux). Souvent, plusieurs mesures indépendantes ont été effectuées pour chacune des conditions. La « moyenne RFV » correspond à la moyenne arithmétique de ces mesures indépendantes.

Pour vérifier l'efficacité des solutions de dissociation, les résultats obtenus avec deux échantillons biologiques ayant des concentrations différentes en 25-OH vitamine D sont comparés, en calculant le rapport en % entre les deux signaux obtenus (noté RFV ^2/ RFV _n° i, l'échantillon n°l étant celui ayant la concentration la plus faible en 25-OH vitamine D). En cas de mesures indépendantes répétées, ce rapport est calculé à partir des moyennes RFV. Plus ce rapport est faible, meilleure est la dissociation,

Le coefficient de variation (CV) est défini comme le rapport entre l'écart-type et la moyenne. Il est souvent exprimé en pourcentage (CV%). Le CV% est une mesure de dispersion relative et reflète la reproductibilité des résultats. Une diminution de la valeur obtenue est signe d'une amélioration de la reproductibilité.

Certaines des expériences présentées font partie de plans d'expériences d'optimisation qui ont été construites en utilisant des tables de Tagushi, Dans le cas où l'optimum est une valeur nominale, comme pour une étude de reproductibilité (valeur de signal fixée), la variance autour de cette valeur peut être considérée comme le résultat des facteurs de bruit, donc comme nuisant à la reproductibilité. A partir des données expérimentales répétées, le ratio signal-sur-bruit (S/B) peut être calculé et est défini selon la formule 10 x logio(moyenn€ ² /ecart-type ² ). Le ratio S/B, appelée parfois constante de Taguchi, reflète la reproductibilité des résultats. Une augmentation de la valeur obtenue est signe d'une amélioration de la reproductibilité.

Le ratio B/B0% est le signal obtenu pour le point de gamme testé divisé par le signal obtenu pour fe point de gamme 0 ng/mL d'analyte, multiplié par 100.

Dans les différents Tableaux, à l'exception du Tableau 5, qui vont suivre, les acides perfluoroalkyle utilisés étant liquides, leurs pourcentages sont donnés en volume par rapport au volume total de la solution de dissociation. Pour l'alcool utilisé, dans tous les cas, les pourcentages sont donnés en volume par rapport au volume total de la solution de dissociation. EXEMPLE 1 -Intérêt d une dissociation par un mélange méthanol /acide perHuorohexanoîQue Bài rapport à LâiirfS perfiuorohexanoïQue seul

Préparation des solutions de dissociation

Solution de dissociation comparative : les composants pour préparer le tampon PBS (5 mM de hydrogénophosp ate de sodium ( a ₂ HP04), 1,5 mM de dihydroçénophospnate de potassium (KH ₂ PO ₄ ), 131 mM de NaCI) et 0,75% d'acide perfluorobexanoïque sont dissous dans de l'eau déminéralisée par agitation pendant environ 30 minutes. Le pH est ajusté à 7,2 avec du NaOH 6N.

Solution de l'invention : les composants pour préparer le tampon PBS (5 mM de hydrogénophospnate de sodium ( a ₂ HP0 ₄ ), 1,5 mM de dihydrogénophosphate de potassium (KH ₂ P0 ₄ ), 131 mM de NaCI), 0,75% d'acide per luorohexanoïque et 5% de méthanol sont dissous dans de l'eau déminéralisée par agitation pendant environ 30 minutes. Le pH est ajusté à 7,2 avec du NaOH 6N.

Procédé de quantification de la 25-OH vitamine D totale.

Les dosages immunologiques ont été réalisés en utilisant l'automate dlmmunoanalyse VIDAS® (bioMérieux). Le cône è usage unique sert à la fois de phase solide pour la réaction et de système de pipetage. La cartouche est composée de 10 puits recouverts d'une feuille d'aluminium scellée et étiquetée. Le premier puits comporte une partie prédécoupée pour faciliter l'introduction de l'échantillon. Le dernier puits est une cuvette optique dans laquelle la fluorescence du substrat est mesurée. Les différents réactifs nécessaires à l'analyse sont contenus dans les puits intermédiaires. Toutes les étapes du test sont réalisées automatiquement par l'instrument Elles sont constituées d'une succession de cycles d'aspiration/refoulement du milieu réactionnei

a) Sensibilisation et passivabon des cônes

Les cônes ont été sensibilisés avec 300 pL d'une solution d'anticorps anti-protéine porteuse diluée à 10 pg/mL dans un tampon MES 50 mM, pH 6,1. Après 6 h d'incubation à + 18/25°C, un lavage est effectué avec une solution de NaCI 9 g/L. Ensuite, 300 pL d'une solution de vitamine D couplée à la protéine porteuse, diluée à 150 ng/mL dans un tampon tris 200 m M, pH 6,2 contenant de l'albumine humaine sont ajoutés, La sensibilisation / passivation se poursuit à +18/25°C sur la nuit. Les cônes sont vidés, séchés, puis conservés à +4°C jusqu'à utilisation, à l'abri de l'humidité.

b) Pré-traitement de l'échantillon

L'échantillon à doser (100 pL) est introduit dans le premier puits de la cartouche. L'échantillon et le réactif de pré-traitement (solution de dissociation comparative ou de l'invention) sont mis en présence pour séparer la vitamine D contenue dans l'échantillon de sa protéine de liaison. L'automate VIDAS® mélange 48 pL de l'échantillon avec 340 pL de la solution de dissociation ; ce mélange est incubé à 37°C pendant 5 minutes. c) Mode opératoire de la réaction dlmmunodosage

L'échantillon pré-traité (environ 0,9 volume) est transféré dans le puits contenant 1 volume d'un anticorps anti-vitamine D marqué à la phosphatase alcaline (conjugué, bioMérieux). Le conjugué anticorps-phosphatase alcaline est dilué au préalable à environ 10 pg/mL dans un tampon tris 100 mM pH 7,1, NaCI 300 mM contenant de l'albumine humaine, Le mélange échantillon/conjugué est incubé dans le puits pendant environ 5-7 minutes. Puis, le mélange échantillon/conjugué est incubé dans le cône pendant environ 5-7 minutes supplémentaires, durant lesquelles il s'effectue une compétition entre l'antigène présent dans l'échantillon et l'antigène vitamine D fixé sur le cône vis à vis des sites de l'anticorps spécifique anti-vitamine D conjugué. Ensuite, 3 lavages successifs avec un tampon Tris 200 mM pH 8,4, NaCI 300 mM, Tween® 20 0,2% sont effectués afin d'éliminer les composés non fixés. Lors de l'étape finale de révélation, le substrat 4- méthylombeiliferyl phosphate est aspiré puis refoulé dans le cône ; l'enzyme du conjugué catalyse la réaction d'hydrolyse de ce substrat en 4- méthylornbelllferone dont la fluorescence émise est mesurée à 450 nm. La valeur du signal de fluorescence est inversement proportionnelle à la concentration de l'antigène présent dans l'échantillon. Le Tableau 1 ci-dessous récapitule les signaux de fluorescence (RFV) déterminés par l'automate VIDAS® en fonction de la solution de dissociation utilisée, en utilisant 3 échantillons différents de sérum humain. Pour chaque condition expérimentale, 4 mesures indépendantes ont été réalisées.

Tableau 1 :

échantiilon n'2 à 20 ng/ml

2863 3430

3290 3189

Signal en RFV

3496 3316

3072 3H9 moyenne RFV 3180 3271

CV% 9% 4%

Ratio S/B 21 ,32 28. 7 rapport % RFV ^RFV^ 91 % 85% échantillon n'3 a 36 ng mL

2642 2420

2440 2349

Signai en RFV

2761 2490

2815 2433 moyenne RFV 2655 2423

CV% 6% 2%

Ratio S/B 24, 1 32,43

rapport % RFV ^RFV^ 76% 63%

On constate que l'ajout d'alcool entraîne une amélioration de la dissociation (le rapport de signaux en % diminue), tout en améliorant la reproductibilité (augmentation du ratio signal-sur-bruit et diminution du CV%).

EXEMPLE 2 - Comparaison de différents alcools

Les solutions de dissociation utilisées dans cet exemple ont été préparées selon le mode opératoire expliqué dans l'exemple 1, dans un tampon PBS à pH 7,2. Les natures et concentrations du surfactant fluoroalkyle et de l'alcool sont variables et sont précisées dans !es Tableaux 2 et 3.

Pour le reste, on opère comme à l'exemple i.

Tableau 2 : Utilisation d'acide perfluorohexanoïque

Solution de dissociation co mparative : PBS + acide perfluorohexanoïque 1 % sans alcool

22

On constate que l'ajout d'alcool, quel qu'il soit, entraîne une amélioration de la dissociation (le rapport de signaux en % diminue).

Tableau 3 : utilisation d'acide perfluorooctanoïque

Solution de dissociation comparative ; PBS + acide perfluorooctanoïque 0,75% sans alcool

On constate que l'ajout d'alcool, que! qui! soit, entraîne une amélioration de la dissociation (le rapport de signaux en % diminue). EXEMPLE 3 - INFLUENCE DE LA CONCENTRATION EN ACIDE

PERFLUOROALKYLE

Les solutions de dissociations utilisées dans cet exemple ont été préparées selon le mode opératoire expliqué dans l'exemple 1, dans un tampon PBS à pH 7,2.

Pour te reste, on opère comme à l'exemple 1. 23

Tableau 4 :

I! apparaît que la dissociation augmente, en présence d'aicooi, dans tous les cas. On constate également qu'en augmentant Sa concentration en acide perfiuoroalkyle, on augmente encore la dissociation,

EXEMPLE 4 - INFLUENCE DE LA CONCENTRATION EN ALCOOL

Les solutions de dissociation utilisées dans cet exemple ont été préparées selon le mode opératoire expliqué dans l'exemple 1, dans un tampon PBS à pH 7,2. Les natures et concentrations du surfactant fluoroalkyle et de l'alcool sont variables et sont précisées dans le Tableau 5. Le peiiluorooctanoate d'ammonium étant solide, dans ce cas, les pourcentages sont donnés en masse de r^rfluorooctanoate d'ammonium par rapport au volume total de la solution.

Pour le reste, on opère comme à l'exemple 1. 24

Tableau 5 :

I! apparaît que la dissociation augmente avec la concentration en rnéthanol, parfois au détriment de la reproductibilité, si cette concentration est trop élevée. La concentration en rnéthanol sera donc ajustée par l'homme du métier, de manière à trouver un compromis entre la quantité de surfactant perfluoroalkyle et d'alcool.

EXEMPLE 5 - AJPVT PE PLURONIC® F127

La solution de dissociation de l'invention utilisée dans cet exemple a été préparée selon le mode opératoire expliqué dans l'exemple 1, dans un tampon Tris 50 m à pH 7,5, à ceci près que le surfactant fluoroaikyie est l'acide perfiuorohéxanoïque à 1,5% et l'alcool est le rnéthanol à 5%. Le Pluronic® F 127 a été utilisé à une concentration de 0,25%, ou il n'a pas été utilisé. Les résultats sont donnés dans le Tableau 6 ci-dessous.

Pour le reste, on opère comme à l'exemple 1. 25

Tableau 6 :

L'ajout d'un surfactant additionne! tel que le Pluronic® F127 permet d'améliorer la reproductibilité (diminution du CV%). L'amélioration de la reproductibilité est plus importante pour les échantillons à forte concentration en Vitamine D.

EXEMPLE 6 - INFLUENCE PU TAMPON UTILISE

Les solutions de dissociation comparative et de l'invention portant l'indication P8S, utilisées dans cet exemple, ont été préparées selon le mode opératoire expiiqué dans l'exemple 1, dans un tampon PBS à pH 7,2. Les natures et les concentrations du surfactant fluoroalkyle et le cas échéant de l'alcool sont indiquées dans tes Tableaux 7 (solution comparative) et 9 (solution de l'invention).

Les solutions de dissociation comparative et de l'invention portant l'indication Ths contiennent 50 mM de Tris, le surfactant fluoroalkyle, avec ou sans alcool. Ces composants sont dissous dans de l'eau déminéralisée par agitation pendant environ 30 minutes. Le pH est ajusté à 7,5 avec du NaOH 6N. Les natures et les concentrations du surfactant fluoroaikyle et le cas 26 échéant de l'alcool sont indiquées dans les Tableaux 8 (solution comparative) et 9 (solution de (Invention).

Tableau 7 :

Tableau 8 :

Tableau 9 :

Il apparaît que la nature du tampon n'a pas d'influence significative sur le rapport de RFV, et donc sur la dissociation obtenue.

La Figure unique présente le ratio B/B0% obtenue sur une gamme de ng/mL d'anafyte dans les deux cas (tampon PE3S et tampon TRIS). Le ratio B/B0% est le signal obtenu pour le point de gamme testé divisé par le signa! obtenu pour le point de gamme 0 ng/mL d'analyte, multiplié par 100.

II apparaît que le choix du tampon utilisé n'a aucune influence significative sur les résultats obtenus, que ce soit en termes de dissociation ou de reproductibilité.