B e s c h r e i b u n g

Spezifisch Amyloid-Beta bindende Peptide und deren Verwendung für die Therapie und Diagnose der Alzheimerschen Demenz

Die Erfindung bezieht sich auf spezifisch Amyloid-Beta bindende Peptide und deren Verwendung für die Therapie und Diagnose der Alzheimerschen Demenz.

Stand der Technik

Aus WO 02/081505 A2 ist das D-enantiomere Peptid mit dem Namen "D3" bekannt. Es wurde durch eine Spiegelbild-Phagendisplay-Selektion gegen überwiegend monomeres Aß(1-42) identifiziert mit dem Plan, dieses durch die Bindung zu stabilisieren und seine Umwandlung in toxische Aß-Aggregate zu verhindern. Nach derzeitigem Kenntnisstand wandelt D3 bevorzugt die besonders toxischen Aß- Oligomere in nicht-toxische, nicht-amyloidogene und ThT-negative, amorphe

Aggregate um. Im Tiermodell wird selbst durch eine orale Verabreichung von D3 mit dem Trinkwasser erreicht, dass behandelte transgene AD-Mäuse deutlich weniger Plaques enthalten und signifikant verbesserte kognitive Fähigkeiten besitzen.

Noch immer existiert aber kein zugelassenes Medikament für eine ursächliche Behandlung der Alzheimerschen Demenz (AD). Typischerweise findet man in den Gehirnen von AD-Patienten post-mortem Ablagerungen des sogenannten beta- Amyloid-Peptides (Aß) in Plaques. Deshalb werden schon lange verschiedene Formen des Aß, z.B. Fibrillen, für die Entstehung und das Fortschreiten von AD verantwortlich gemacht.

Seit wenigen Jahren werden besonders die kleinen, frei diffundierbaren Aß- Oligomere als hauptsächliche Verursacher für die Entstehung und den Fortschritt der AD verantwortlich gemacht. Monomeres Aß entsteht während unseres ganzen Lebens ständig in unserem Körper durch sequentielle Proteolyse des Vorläuferproteins APP (Amyloid Precursor Protein) durch ß- und γ-Sekretasen (Haass and Selkoe 1993) und ist per se nicht toxisch. Es gibt sogar immer mehr Hinweise, dass monomeres Aß eine physiologische, vielleicht sogar neuroprotektive Funktion im Gehirn besitzt (Puzzo and Arancio 2013).

Es wird spekuliert, ob sich Aß-Monomere abhängig von ihrer Konzentration (die sich letztlich durch Bildungs- und Abbau-Raten im Körper ergibt) zufällig und damit mit zunehmendem Alter immer wahrscheinlicher spontan zu Aß-Oligomeren zusammen lagern. Einmal entstandene Aß-Oligomere könnten sich dann durch einen Phon- ähnlichen Mechanismus vermehren und letztlich zur Krankheit führen.

Aufgrund dieser Überlegungen sollte es das Ziel einer ursächlichen Behandlung sein, die Bildung toxischer Aß-Oligomere zu verhindern, bzw. bereits vorhandene

Oligomere vollständig zu eliminieren und/oder deren Prion-ähnliche Vermehrung zu verhindern und ohne dabei die Aß-Monomerkonzentration zu reduzieren.

Somit existiert kein ursächlich wirkendes Medikament für die Behandlung der

Alzheimersche Demenz. Eingesetzte Medikamente sind bestenfalls in der Lage, einige Symptome zu mildern, können aber den Krankheitsfortschritt nicht

verlangsamen, geschweige denn aufhalten.

Es existieren zwar einige Substanzen, die auf verschiedenste Art und Weise die Konzentration von Aß-Monomeren verringern, z. B. durch gamma-Sekretase- Modulatoren, Aß-bindende Liganden und so weiter. Da jedoch für monomeres Aß eine physiologische, vielleicht sogar neuroprotektive Funktion im Gehirn postuliert wird, ist es aufgrund der neuesten Erkenntnisse zum Wirkmechanismus der

Alzheimerschen Demenz erfolgsversprechender nicht die Aß-Konzentration der Monomere zu verringern, sondern die der Aß-Oligomere.

Diese Hypothese wird auch durch die bisheringen negativen Ergebnisse klinischer Studien (Phasen II und III) am Menschen mit Wirkstoffen, die die Monomer

Konzentration verringern, bestätigt.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es daher A) Peptide für die ursächliche Therapie von Morbus Alzheimer durch das Verhindern der Bildung von toxischen Amyloid-ß (Aß)-Oligomeren oder Aggregaten oder deren Enttoxifizierung bereit zu stellen. Ferner sollte

B) Das aus dem Stand der Technik bekannte Spiegelbildphagendisplay-Verfahren hierzu modifiziert werden, und es sollten

C) Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Peptide aufgezeigt werden. Lösung der Aufgabe

Die Aufgabe wird gelöst mit dem Peptid, dem Kit und der Zusammensetzung gemäß der Hauptansprüche sowie den Verfahren und Verwendungen gemäß den Nebenan- Sprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.

Beschreibung der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst mit Liganden bzw. Peptiden, welche spezifisch an bestimmte A-Beta-Spezies binden. Es werden insbesondere Peptide bereit gestellt, die spezifischer an als an oligomeres und/oder fibrilläres Aßi-42 binden.

Im Weiteren werden die Begriffe Zielmolekül und Köder synonym verwendet.

Die Spezifität, oft auch Selektivität genannt, bedeutet dabei Folgendes. Bindet der zu betrachtende erfindungsgemäße Ligand bzw. das erfindungsgemäß Peptid zwei verschiedene Moleküle, die z. B. als„Köder" und„Kompetitor" bezeichnet werden, dann kann jedem Bindungspaar, das heißt Ligand-Köder und Ligand-Kompetitor, unter der Annahme eines 1 :1 -Bindemodells jeweils eine Dissoziationskonstante (K _D ) oder eine Assoziationskonstane (K _A = 1/K _D ) zugeordnet werden. Je höher der K _A - Wert ist, desto affiner ist die jeweilige Bindung. Die Spezifität des Liganden für den Köder gegenüber dem Kompetitor drückt sich durch einen möglichst großen Quotienten der Affinitäten zum Köder und zum Kompetitor aus. Erfindungsgemäße Liganden weisen einen Quotienten der K _A -Werte des Liganden zum Köder und zum Kompetitor auf der umso größer ist, je größer die Spezifität ist.

In diesem Sinn ist von relativer Spezifität die Rede, wenn der Quotient der KA-Werte des Liganden, bzw. Peptids zur Spezies A (Köder) und des Liganden zur Spezies B (Kompetitor) mindestens größer als 1 ist, bevorzugt größer als 1 ,2, oder 1 ,5, bevorzugt größer als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere 100, wobei als Spezies A und Spezies B die verschiedenen A-Beta-Spezies wie z. B. Monomere, Oligomere und Fibrillen angenommen werden können.

Dabei kann jeder Zwischenwert angenommen werden. Rundungen der Zahlenwerte führen zu den oben genannten Zahlenwerten. Das Modell lässt sich prinzipiell erweitern auf mehrere Kompetitoren, die sich jeweils einzeln oder im Gemisch betrachten lassen, auch wenn letzteres nicht besonders elegant ist.

Gelöst wird diese Aufgabe insbesondere durch spezifisch Amyloid-Beta-Spezies bindende Peptide für die Therapie der Alzheimerschen Demenz. Die Spezifität, oft auch Selektivität genannt, bedeutet dabei, dass der erfindungsgemäße Ligand bzw. ein erfindungsgemäßes Peptid grundsätzlich verschiedene A-Beta-Spezies, z.B. A- Beta-Monomer oder A-Beta-Oligomer oder A-Beta-Fibrillen binden kann. Jedem Bindungspaar (z. B. Ligand zu A-Beta-Monomer und Ligand zu A-Beta-Oligomer und Ligand zu A-Beta-Fibrillen) wird unter der Annahme eines 1 :1-Bindemodells jeweils eine Dissoziationskonstante (K _D ) oder eine Assoziationskonstane (K _A = 1/KD) zugeordnet. Je höher der K _A -Wert ist, desto affiner ist die jeweilige Bindung.

Die Spezifität des Liganden für den Köder gegenüber dem Kompetitor drückt sich durch einen möglichst großen Quotienten der Affinitäten zum A-Beta-Monomer und zum A-Beta-Oligomer bzw. A-Beta-Fibrillen aus. Erfindungsgemäß werden zur Ermittlung der Spezifität also Quotienten der KA-Werte des Liganden zum A-Beta-Monomer und zum A-Beta-Oligomer (bzw. A-Beta- Fibrillen) gebildet. Je größer der Quotient ist, umso größer ist die Spezifität.

Die Spezifität oder Selektivität ist dabei nicht mit der Affinität zu verwechseln, die sich aus der Bindungsstärke von Liganden an eine der Spezies ergibt. Konkurrieren verschiedene Liganden um das gleiche Zielmolekül, so kann der weniger spezifische oder selektive die größere Bindungsaffinität besitzen. Erfindungsgemäß soll derjenige Ligand ermittelt werden, welcher besonders spezifisch an eine Spezies wie Monomer oder Oligomer oder Fibrillen bindet. Die Biomoleküle sollen als therapeutische Mittel und Heilmittel geeignet sein. Die auf diese Weise erhaltenen Liganden bzw.

Peptide haben die gewünschten Eigenschaften und lösen die Aufgabe der Erfindung.

Mit Hilfe einer optimierten Spiegelbild-Phagendisplay-Selektion wurden Peptide selektiert, die z. B. spezifischer an monomeres Aß(1-42) als an oligomeres oder fibrilläres Aß(1-42) binden. Um Peptide als Liganden zu identifizieren, die möglichst spezifisch an monomeres Abeta binden, aber gleichzeitig möglichst unspezifischer für Abeta-Oligomere und/oder Fibrillen sind, wurde ein Spiegelbildphagendisplay entwickelt und

angewandt, in dem ein positiver Selektionsdruck für die Monomer-Bindung und ein negativer Selektionsdruck für die Bindung an Oligomere und Fibrillen besteht. Außerdem wurde durch abwechselnde Verwendung verschiedener

Oberflächenmaterialien und/oder durch die abwechselnde Verwendung und

NichtVerwendung von Blocking-Reagenzien dafür gesorgt, dass keine

Oberflächenkombination zweimal verwendet wurde, um das Anreichern von

Liganden zu vermeiden, die eine hohe Affinität für das Oberflächenmaterial zeigen. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass das Spiegelbild-Phagendisplay nach dem Stand der Technik nachteilig auch zu Oberflächen- oder Blocking-Reagenz- bindenden Liganden führt oder aber zumindest zu Liganden, die sowohl als auch an die Oberfläche als auch an den Köder gebunden haben. Es sei angemerkt, dass das Verfahren zum Spiegelbildphagendisplay neben der hier angegebenen Selektion von spezifisch Monomerbindern selbstverständlich auch zum Auffinden von spezifisch Oligomerbindern oder sogar zum Auffinden von Liganden gegenüber anderen bei Proteinfehlfaltungserkrankung auftretenden Spezies genutzt werden kann.

Durch das erfindungsgemäße Selektionsverfahren werden insbesondere D-Peptide identifiziert, die eine oder mehrere der gewünschten Eigenschaften besitzen.

Die Eigenschaften sind unter anderem die Bindungsspezifität für Abeta Monomere, die Inhibition der Abeta-Fibrillenbildung, die Inhibierung der Abeta-Zytotoxizität, die Eliminierung von Abeta-Oligomeren, die Umwandlung von Abeta-Oligomeren in nicht-toxische, nicht-amyloide Spezies.

Durch die Optimierung des Spiegelbildphagendisplay mit Kompetition gegen die aggregierten Aß1-42-Spezies (Aß1-42 Oligomere, Fibrillen und hochmolekulare Aggregate) werden z. B. spezifisch A-Beta-Monomer bindende Liganden bzw.

Peptide ermittelt. Werden A-Beta-Oligomere als Köder verwendet, so kann mit einer Kompetition mit A-Beta-Monomeren spezifische Liganden für A-Beta-Oligomere ermittelt werden.

Im Spiegelbild-Phagendisplay wird z. B. eine rekombinante Bibliothek von

randomisierten Peptidsequenzen, präsentiert am gp3 Protein des M13-Phagen und codiert in dessen Genom, gegen das genaue Spiegelbild (D-enantiomer) eines natürlich vorkommenden L-enantiomeren Zielmoleküls (z. B. Aß1-42) selektiert.

Die Peptidsequenz wird vorteilhaft am N-Terminus des gp3-Proteins des M13- Phagen präsentiert und liegt codiert in dessen Genom vor.

Das gp3-Molekül auch gene product 3 genannt, ist ein Protein, welches in der Hülle des Phagen sitzt und für den Kontakt mit der Wirtszelle benötigt wird.

Die DNA-Sequenz des p3-Gens eines selektierten Phagen enthält die genetische Information über die korrespondierende Peptidsequenz am gp3-Molekül und kann sequenziert werden. Nach der Sequenzierung kann die genomische Sequenz in eine Aminosäuresequenz umgeschrieben werden und als D-enantiomeres Peptid, welches an die physiologische L-enantiomere Form des Zielmoleküls (z. B. Aß1-42) bindet, synthetisiert werden.

Es können sogenannte panning-Runden durchgeführt werden, z. B. sechs Runden. Dabei wird die Phagenbibliothek mit einem fixierten Zielmolekül, auch Köder genannt, in Kontakt gebracht und bindende Phagen aus dem milliardenfachen Hintergrund anderer, nicht-bindender Phagen isoliert.

Beispielhaft wird die Menge an Phagen reduziert, die bevorzugt an oligomere oder fibrilläre Spezies von Aß1-42 binden, indem eben diese Spezies z. B. ab der zweiten panning-Runde als Gegenselektanten bzw. Kompetitoren zugegeben werden.

Phagen, die eine erhöhte Affinität zu Aß1-42-Oligomeren und -Fibrillen zeigen, können auf diese Weise aus dem Phagenpool entfernt werden, so dass sich z. B. Aß1-42 Monomer spezifische Phagen anreichern. Das Verfahren kann

selbstverständlich in analoger Weise angepasst werden, um spezifisch A-Beta- Oligomer bindende Liganden und Peptide zu ermitteln.

Um eine Anreicherung von Plastik-, BSA- oder Streptavidin-affinen Phagen zu verringern, werden erfindungsgemäß zudem in vorzugsweise allen panning-Runden verschieden behandelte Oberflächen verwendet und ein weiterer kompetitiver Schritt mit z. B. Biotin, einem hochaffinen Stretpavidinbinder, eingesetzt. In den

aufeinanderfolgenden Selektionsrunden wurde sukzessive der Selektionsdruck erhöht. Dazu wurden, während die Konzentration eines biotinylierten Zielmoleküls (z. B. monomeres D-enantiomeres Aß1-42) stabil blieb, ab der 2. Selektionsrunde kontinuierlich höhere Konzentrationen der als Gegenselektanten fungierenden und nicht biotinylierten Kompetitoren, z. B. D-enantiomeren Aß1-42-Oligomere und Aß1- 42-Fibrillen) gegeben.

Des Weiteren wird in jeder Runde des Spiegelbildphagendisplay eine andere

Substratoberfläche angeboten. Dies kann z. B. durch verschiedene Plastik-Spezies, wie z. B. Polystyren, Polypropylen und Polycarbonat erfolgen. Beispielhaft kann zwischen einer BSA-blockierten Polystyrenoberfläche in Runde 1 , einer Polypropylen-Oberfläche in Runde 2, einer BSA-blockierten Polycarbonat- Oberfläche in Runde 3, einer Polystyren-Oberfläche in Runde, einer BSA-blockierten Polypropylen-Oberfläche in Runde 5 sowie einer Polycarbonat-Oberfläche in der Runde R6 gewechselt werden.

Es können Blockierschritte mit z. B. 1 % BSA in TBST für eine Stunde bei

Raumtemperatur vor der Immobilisierung des Zielpeptids und beispielsweise nur in Runden 1 , 3 und 5, gegebenenfalls weiteren Runden durchgeführt werden.

Der Wechsel zwischen verschiedenen Substraten und abwechselndem Blockieren und Nicht-Blockieren der Oberfläche steigert die Spezifität für das Zielmolekül bzw. den Köder, gegenüber der Oberfläche. Außerdem erfolgt neben der Kompetition mit nahe verwandten Kompetitoren auch eine Verringerung der Liganden, die unspezifisch an Plastikoberflächen oder BSA (Blockierschritt) binden.

Die Kompetitoren und Zielmoleküle bzw. Köder werden gleichzeitig mit der Bibliothek in Kontakt gebracht. Das Verfahren ist somit gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Bereitstellen eines immobilisierten Köders auf einem Substrat. b) In Kontakt bringen des als Köder fungierenden immobilisierten Moleküls mit einer Lösung, die eine Bibliothek von Molekülen enthält. c) In Kontakt bringen der mit den Molekülen besetzten immobilisierten Köder mit mindestens einem Kompetitor als Spezifitätswaschschritt. d) Trennung und Vermehrung der nach dem in Kontakt bringen der mit den

Molekülen besetzten immobilisierten Köder mit Kompetitoren weiterhin an den Köder gebundenen Moleküle. e) Wiederholung der genannten Schritte, wobei bei jeder Wiederholung ein unterschiedliches Substrat verwendet wird, f) Identifizierung der Struktur der nach der Wiederholung auf den Köder verbleibenden Moleküle.

Ein unterschiedliches Substrat wird z. B. durch den Wechsel der Substratart und/oder dessen Blockierung oder Nichtblockierung mittels Reagenzien genutzt. Als Köder wird ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden, RNA, DNA, m-RNA und chemischen Verbindungen eingesetzt. Als Köder werden insbesondere verschiedene A-Beta-Spezies verwendet.

Als Oberfläche, an die der Köder immobilisiert wird, wird z. B. eine Komponente aus der Gruppe bestehend aus Mikrotitterplatten, Magnetpartikel, Agarose- oder Sepha- rosekügelchen eingesetzt.

Als Kompetitoren werden vorzugsweise ein Gemisch mit mindestens einer Komponente aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Proteinen, RNA, DNA und m-RNA eingesetzt. Kompetitoren sind dabei köderähnliche Moleküle, deren Bindestellen Ähnlichkeiten mit denen des immobilisierten Köders aufweisen. Als Kompetitoren werden insbesondere die A-Beta-Spezies verwendet die nicht als Köder verwendet werden.

Bibliothek und Kompetitoren werden vorzugsweise gleichzeitig zum immobilisierten Köder in Kontakt gebracht.

Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die immobile Phase beim Spezifitätswaschschritt mit einer Lösung, die Kompetitoren enthält, gespült wird.

Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass beim Spezifitätswaschschritt die Lösung mit der Bibliothek von Molekülen durch eine Lösung ausgetauscht wird, die Kompetitoren enthält.

Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass der immobilen Phase beim Spezifitätswaschschritt eine Lösung mit Kompetitoren zugefügt wird. Der Spezifitätswaschschritt und die Zugabe der Bibliothek von Molekülen erfolgt quasi gleichzeitig. Sollten Phagen prinzipiell eine Affinität zu A-Beta-Monomeren und -Oligomeren als Köder und Kompetitoren haben, gibt es gleichzeitig und nicht erst hintereinander die Möglichkeit an beide Ziele zu binden. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass nur die Liganden angereichert, die auch bei gleichzeitiger Exposition von Köder und Kompetitor bevorzugt an den Köder binden.

Die Konzentration an Kompetitoren wird je Selektionsrunde vorzugsweise erhöht.

Bei dem Köder nach Punkt a) handelt es sich also um eine Verbindung, an die das zu selektierende Biomolekül gebunden werden soll. Er wird nach dem Stand der Technik bekannten Methoden an eine erste Oberfläche fixiert. Beispielhaft aber nicht beschränkend können als Köder Proteine, Peptide, RNA oder DNA-Moleküle genannt werden, insbesondere A-Beta-Monomer. Als mögliche Oberflächen können beispielhaft Mikrotiterplatten, Magnetpartikel, Agarose- oder Sepharosekügelchen verwendet werden. Im zweiten Schritt b) wird der immobilisierte Köder mit einer randomisierten Bibliothek von Molekülen - speziell Biomolekülen - in Kontakt gebracht. Diese Biomoleküle konkurrieren um die Bindung an den Köder. Bei der randomisierten Bibliothek handelt es sich um eine Mischung von sehr vielen, beispielsweise 10 ¹² , aber auch 10 ⁴ oder nur 100 verschiedenen Molekülen in einer Mischung. Eine solche Bibliothek kann beispielsweise jeweils aus Peptiden, Proteinen, DNA, RNA oder m-RNA bestehen, welche an bestimmten Vehikeln gebunden vorliegen, und die an Köder anbinden können. Als Vehikel kommen beispielsweise Phagen, Polysomen oder Bakterienoberflächen in Betracht. Die Bibliothek kann aus artifiziellen oder aus der Natur isolierten Bestandteilen oder aus einer Mischung von beidem bestehen. Unter artifi- ziell im Sinne der Erfindung sind beispielsweise aus der Oligonukleotidsynthese hergestellte Verbindungen zu verstehen.

Erfindungsgemäß wird der mit Biomolekülen besetzte immobilisierte Köder in Schritt c) mit Kompetitoren in Kontakt gebracht. Hierzu wird in Schritt c) ein Spezifitätswaschschritt durchgeführt, bei dem der Lösung Kompetitoren zugefügt werden, bzw. die immobile Phase mit einer Lösung, die Kompetitoren enthält, gespült wird oder die Lösung mit der Bibliothek von Biomolekülen vorzugsweise wiederholt durch eine Lösung ausgetauscht wird, die Kompetitoren enthält. Bei den Kompetitoren handelt es sich um köderähnliche Moleküle, deren Bindestellen Ähnlichkeiten mit denen des immobilisierten Köders aufweisen. Die in Lösung vorliegenden Kompetitoren konkur- rieren im Waschschritt um die schon an den immobilisierten Köder gebundenen Bibliotheksmoleküle. Somit werden diejenigen Bibliotheksmoleküle, welche dem eigentlich„besten" Bibliotheksmitglied für den immobilisierten Köder ähnlich sind, jedoch besser an einen der freien Kompetitoren binden, dem immobilisierten Köder wieder entzogen. Die Schnelligkeit der Ablösungsreaktion der bindenden Biblio- theksmoleküle wird dabei hauptsächlich durch die unterschiedlichen Dissoziationskonstanten (koff-Werte) der einzelnen Moleküle bestimmt. Solche mit einem kleinen koff-Wert bleiben statistisch gesehen am längsten am immobilisierten Köder gebunden und haben damit eine geringere statistische Wahrscheinlichkeit, eine Bindung mit den angebotenen Kompetitormolekülen eingehen zu können. Solche Biblio- theksmoleküle zeigen letztendlich eine spezifische bzw. selektive Bindung an den Köder. Beispielhaft aber nicht beschränkend können Proteine, Peptide, DNA oder RNA als Kompetitoren genannt werden. Die die Kompetitoren enthaltende Flüssigkeit ist vorzugsweise wässrig und kann einen pH-Puffer enthalten.

Weitere fakultative Komponenten der Lösung für den Spezifitätswaschschritt sind Salze, Detergentien oder Reduktionsmittel.

Die Trennung in Schritt d) erfolgt z. B. durch Elution von Phagen vom Köder, um sie vermehren zu können. Die Phagen enthalten die Peptide.

Bei der nachfolgenden Vermehrung der noch am Köder verbliebenen Bibliotheksmoleküle nach dem Spezifitätswaschschritt nach Schritt d) werden die gebundenen Biomoleküle vom Köder getrennt und nach bekannten Methoden vermehrt. Hierzu können beispielsweise nach den Schritten a) bis c) gewonnene Phagenpartikel in Zellen eingebracht und vermehrt werden. Die Trennung kann beispielsweise durch Änderung des pH-Wertes, Erhitzen oder Änderung, insbesondere Erhöhung der Salzkonzentration erfolgen. Bei Schritt e) ist die Konzentration der selektierten Biomoleküle in der Lösung, die dem Köder nach Schritt a) zugeführt wird, erhöht.

Vorzugsweise werden 3 bis 6 Selektionsrunden, die die Schritte a) bis e) enthalten, durchgeführt. Es können aber auch 1- >10 oder 1- >20 Wiederholungen durchgeführt werden. Auch die dabei vorzugsweise vorgenommene Erhöhung der Kompetitoren- konzentration in Schritt c) bei zunehmender Zyklenzahl führt zu einer verbesserten Selektion. Die Konzentration der Kompetitoren kann anfangs beispielsweise bei 1 nmol/l liegen. Die Konzentrationsänderung der Kompetitoren kann in Schritten von Verdopplung bis Verzehnfachung oder mehr erfolgen. Typische Endkonzentrationen liegen bei 1 pmol/l.

Im Sinne der Erfindung sind diese spezifisch an einen Köder bindenden Liganden Moleküle, die gegenüber einem bestimmten Köder eine erhöhte Selektivität aufweisen, das heißt, an einen bestimmten Köder spezifischer jedoch nicht unbedingt stärker binden als zum Köder ähnliche Ködermoleküle. Bevorzugt binden die Liganden ausschließlich an einen bestimmten Köder. Bei Anwesenheit konkurrierender oder kompetitierender Moleküle soll der durch das Verfahren selektierte Ligand bzw. das Peptid bevorzugt an das Zielmolekül binden.

Ein besonders relevantes Spiegelblldphagendisplay sieht N-terminal biotinyliertes D- enantiomeres A-Betai _-4 2 -Monomer in Schritt a) vor, eine rekombinante Phagenbibli- othek in Schritt b) sowie D-enantiomere A-Beta-i _-4 2 -Oligomeren und/oder D- enantiomeren A-Beta^ -Fibrillen in Schritt c) als Kompetitor, neben A-Beta^- Monomer als Köder. Eine Eluierung als Trennschritt erfolgt z. B. über pH-Wert- Erniedrigung als Trennschritt und Phagen-Amplifikation als Vermehrung.

Auf diese Weise wurden 21 Peptide die spezifisch gegen A-Beta-Monomer binden (Mosd 1-21) entwickelt. a) "Mosdl "(freier N-terminus, amidierter C-terminus): YS YLTS YH MVWR b) "Mosd2" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): HTWTTYDYVWRL c) "Mosd3" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): GTMLKFSGMNLT d) "Mosd4" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): HNWFYWTTEPYD e) "Mosd5" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): HNWSWEWWYNPN f) "Mosd6" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): STLHFYTAFLNK g) "Mosd7" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): FSHSHHTWFTWN h) "Mosd8" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): HFWSWTSLSMTR i) "Mosd9" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): H LSWYWE KYLTS j) "MosdIO" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): HTWTHWFSWNVP k) "Mosd11" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): LSMNITTVHRWH I) "Mosd12" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): VHWDFRQWWQQS m) "Mosd13" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): YSFHFEMNMGNY n) "Mosd14" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): EHWDFGQWWQQS o) "Mosd15" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): GQWDFRQWWQPC p) "Mosd16" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): DWSSRVYRDPQT q) "Mosd17" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): ERSQWGHRDPQS r) "Mosd18" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): DRSKGDHRITQM s) "Mosd19" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): DLRFSSLWKLSH t) "Mosd20" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): VHWDFRQWWQPS u) "Mosd21" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): FSWSMVMPWPTA Diese erfindungsgemäßen Peptide werden als SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 21 beansprucht und können auch als Doppelpeptide oder aber zyklisiert genutzt werden.

Die Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1-21 können durch die spezifische Bindung an A-Beta-Monomere, als mögliches Medikament gegen die Alzheimersche Demenz genutzt werden.

A-Beta-Monomere werden hochspezifisch von erfindungsgemäßen Peptiden insbesondere dem Peptid der SEQ ID NO: 1 gebunden, wodurch sich Oligomere auflösen.

Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass die existierenden Aß-Monomer- bindenden Substanzen nachteilig auf die Reduktion der Aß-Monomere abzielen. Es wurde erkannt, dass es ein Ziel sein muss, spezifische Binder des Amyloid-Beta- Monomers zu entwickeln, die nicht die Konzentration des Monomers verringern, sondern eine Stabilisierung der Monomere bewirken, um deren protektive

Eigenschaften zu erhalten. Die erfindungsgemäßen Peptide erfüllen die Aufgabe, indem sie die Amyloid-Beta- Oligomer Konzentration verringern und gleichzeitig die Amyloid-Beta-Monomere stabilisieren. Die Spezifität für A-Beta-Monomere kann im ELISA gezeigt werden.

Zum einen verhindern die genannten erfindungsgemäßen Liganden (bzw. Peptide), die spezifisch an A-Beta-Monomere binden, die Bildung von A-Beta-Oligomeren, ohne dabei zu einer Reduktion der Monomerkonzentration zu führen. Zum anderen werden bereits entstandene A-Beta-Oligomere durch eine Behandlung mit einem erfindungsgemäßen Monomer stabilisierenden Wirkstoff bzw. Peptid aus dem dynamischen Gleichgewicht der verschiedenen Aggregatspezies entfernt. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass die Oligomere zu Monomeren abgebaut werden. Insbesondere wird die Bildung von Oligomeren de novo verhindert als auch schon entstandene Oligomere entfernt und zwar in erster Linie zu Monomeren als auch zu großen, nicht-fibrillären und nicht-toxischen Aggregaten. Gelöst wird die Aufgabe auch durch ein Peptid enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 1-21 und/oder Homologe, Fragmente und Teile davon. Dieses Peptid bindet vorteilhaft an ebenfalls Amyloid-Beta-Monomer.

In einer Variante der Erfindung werden solche Peptide eingesetzt, die an ein A-Beta- Monomer von höchstens 500 μΜ, bevorzugt 250, 100, 50 μΜ, besonders bevorzugt 25, 10, 6 μΜ, insbesondere 4, 2, 1 μΜ oder sub-μΜ bindet.

Gelöst wird die Aufgabe insbesondere auch durch Polymere, die aus zwei oder mehreren der oben genannten erfindungsgemäßen Peptide bestehen und/oder deren Homologe oder Fragmente und Teile davon. Dimere sind aus zwei der erfindungs- gemäßen Peptide aufgebaut, die jeweils an Amyloid-Beta-Spezies binden. Dabei können gleichartige (z. B. zwei Peptide der SEQ ID NO: 1 ) oder zwei unterschiedlich erfindungsgemäße Peptide herangezogen werden (z. B. ein Dimer aus den Peptiden gemäß SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2). Polymere weisen noch mehr erfindungsgemäße Peptide auf. Die erfindungsgemäß aufgebauten Polymere aus erfindungsgemäßen Peptiden, die ihrerseits an A-Beta-Monomere binden, zeigen vorteilhaft synergetische Effekte in Bezug auf ihre Spezifität zu dem A-Beta-Monomer. Mit anderen Worten: Die erfindungsgemäßen Polymere sind den Einzelpeptiden, aus denen sie aufgebaut sind, überlegen. Synergetische Effekte im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Effekte, die eine höhere Spezifität bezüglich des A-Beta-Monomer zeigen.

In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wirken die Polymere und insbesondere Dimere im Tiermodellversüch (in vitro bzw. in vivo) vorteilhaft effizienter als die einzelnen Peptid-Einheiten.

In einer Variante der Erfindung werden solche Peptide oder Polymere eingesetzt, die an ein A-Beta-Monomer mit einer Dissoziationskonstante (K _D -Wert) von höchstens 500 μΜ, bevorzugt 250, 100, 50 μΜ, besonders bevorzugt 25, 10, 1 μΜ, besonders bevorzugt mit einer Dissoziationskonstante (K _D -Wert) von höchstens 500 nM, 250, 100, 50, besonders bevorzugt 25, 10, 1 nM, 500pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pM bis sub-pM bindet, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.

In einer Ausgestaltung der Erfindung ist die Affinität der Bindung der Peptide über die Dissoziationskonstante (K _D -Wert) definiert. Die Dissoziationskonstante (K _D -Wert) eines erfindungsgemäßen Peptids ist dabei in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung vorteilhaft erniedrigt. Damit verbunden sind verbesserte Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide, wie höhere Affinität der Bindung und höhere Effektivität des Abbaus und / oder der Verhinderung der Bildung toxischer Amyloid-Beta-Oligomer. Dies betrifft insbesondere aber nicht ausschließlich einen niedrigeren K _D -Wert an der high affinity Site des A-Beta- Monomer.

Fragmente und Teile zeigen vorteilhaft eine ähnliche beziehungsweise identische Wirkung wie die erfindungsgemäßen Peptide.

In einer Variante der Erfindung bestehen die erfindungsgemäßen Peptide der SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 , SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 und/oder SEQ ID NO: 21 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon im Wesentlichen, bevorzugt mindestens 50%, 60%, 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus D-enantiomeren Aminosäuren.

Ein Polymer im Sinne der Erfindung ist gebildet aus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr Peptiden, die an sich an Amyloid-Beta- Monomer binden. Die Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1-21 sind in einer Ausgestaltung der Erfindung am freien C-terminus mit einer Säureamidgruppe versehen. Die erfindungsgemäßen Peptide, beispielweise die Peptide gemäß SEQ ID NO: 1-21 sind dann an der Positi- on 12 am freien C-terminus amidiert. Dimere hieraus sind an Position 24 am freien C- terminus amidiert und so weiter.

Die Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1-21 sind in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung am freien C-terminus mit dem freien N-terminus kovalent miteinander verbunden und liegen dann entsprechend zyklisiert vor. Auch durch den Ringschluss wird vorteilhaft bewirkt, dass die Carboxylgruppe am freien C-terminus nicht mehr vorhanden ist.

Das erfindungsgemäße Peptid weist vorteilhaft eine Aminosäuresequenz auf, bei der die Zyklisierung des linearen Moleküls z. B. durch eine kovalente Bindung der ersten mit der letzten Aminosäure, z.B. über eine Kondensationsreaktion, erfolgt ist. Selbstverständlich existieren weitere Möglichkeiten der Zyklisierung, z. B. indem andere Aminosäuren miteinander verknüpft werden. Lediglich beispielhaft sei die Verknüpfung der zweiten Aminosäure mit der letzten Aminosäure genannt. Genauso denkbar ist jede mögliche andere Verknüpfung.

Im Falle, dass die erste und die letzte Aminosäure des Peptids miteinander verknüpft werden, wird vorteilhaft bewirkt, dass keine offenen Enden in der Peptidkette (Aminosäuresequenz) vorliegen.

Diese Maßnahme bewirkt ferner, dass alle Peptide mit linearen Aminosäuresequenzen, die nach der Zyklisierung die gleiche, nicht mehr unterscheidbare Ami- nosäure-Reihenfolge ergeben, in diesem Sinne identisch sind.

Beispiel: Die lineare Aminosäuresequenz des bekannten Peptids D3 ist rprtrlhthrnr. Das entsprechende durch eine Amidbindung zwischen der N-terminalen Aminogrup- pe und der C-terminalen Carboxylgruppe verknüpfte, zyklisierte Peptid„cD3" ist nicht mehr zu unterscheiden von den zyklisierten Peptiden prtrlhthrnrr, rtrlhthrnrrp, trlhthrn- rrpr, rlhthrnrrprt, Ihthrnrrprtr, hthrnrrprtrl, thrnrrprtrlh, hrnrrprtrlht, mrrprtrlhth, nrrprtrlhthr, oder rrprtrlhthm. Aus jeder dieser Sequenzen lässt sich das cD3 weiterhin auch ableiten. Die erfindungsgemäß beanspruchten Effekte der höheren Spezifität, gegebenenfalls Affinität und Effektivität treten darüber hinaus gegenüber einem, vorzugsweise sogar jedem linearen, bindenden Peptid auf, aus dem sich ein zyklisiertes bzw. anderweitig modifiziertes, erfindungsgemäßes Peptid ableiten lässt. Die Herstellung zyklisierter Peptide ist im Übrigen Stand der Technik, und kann beispielweise nach dem Verfahren wie es in DE 102005049537 A1 beschrieben ist, erfolgen.

Vorteilhaft bewirkt die Zyklisierung über die erste und letzte Aminosäure des Peptids, dass keine„offenen" Enden der Peptidkette mehr existieren, die oft Angriffspunkte für Peptid-abbauende Aktivitäten in Zellen, Tieren oder Menschen sind, z. B. durch Ami- nopeptidasen und Carboxypeptidasen.

Mittels erfindungsgemäßer zyklisierter Peptide, wie z. B. Mosdl gemäß der SEQ ID NO: 1 und wird zusätzlich vorteilhaft bewirkt, dass diese erfindungsgemäßen zykli- sierten Peptide, bzw. Polymere als Seiteneffekt unter Umständen auch nicht leicht abgebaut werden, wenngleich dieser Effekt nicht ausschlaggebend ist. Er gilt im

Übrigen, wie gezeigt wurde, auch nur für den Fall einer head-to-tail- oder tail-to-head- Zyklisierung, bei dem entsprechend beide Enden des linearen Peptids miteinander verknüpft werden.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind die Polymere aus identischen Peptiden, wie z. B. Mosdl aufgebaut oder aus einer Kombination von 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 unterschiedlichen, verschiedenen der oben genannten Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1-21 , als sogenannte Kombinations-Polymere. Die Peptide können auch teilweise identisch sein. Die Anzahl der identischen Peptide in den Kombinations- Polymeren ist frei wählbar. Polymere können beispielsweise über chemische Synthese bzw. Peptidsynthese hergestellt werden. In einer Ausführung der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide kovalent miteinander verknüpft. In einer weiteren Ausführung sind die Monomere nicht kovalent miteinander verbunden.

Eine kovalente Verbindung bzw. Verknüpfung der Peptid-Einheiten liegt im Sinne der Erfindung vor, falls die Peptide Kopf an Kopf, Schwanz an Schwanz oder Kopf an Schwanz linear miteinander verknüpft werden, mit oder ohne dazwischen eingefügte Linker oder Linker-Gruppen.

Eine nicht kovalente Verknüpfung im Sinne der Erfindung liegt vor, falls die Peptide beispielsweise über Biotin und Streptavidin, insbesondere Streptavidin-Tetramer miteinander verknüpft sind.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung können die Peptide linear miteinander verknüpft sein, insbesondere wie oben beschrieben. In einer anderen Variante sind die Peptide verzweigt miteinander zu dem erfindungsgemäßen Polymer verknüpft.

Bei einem verzweigten Polymer kann es sich erfindungsgemäß um ein Dendrimer handeln, bei dem die Monomere kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.

Alternativ können die Peptide auch mit einem Plattform-Molekül (wie z.B. PEG oder Zucker) verknüpft sein und so ein verzweigtes Polymer bilden.

Alternativ sind auch Kombinationen dieser Optionen möglich. Die erfindungsgemäßen Peptide und Polymere daraus werden im Folgenden als erfindungsgemäße Peptide bezeichnet.

In einer Variante der Erfindung handelt es sich um ein Peptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 , SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 und/oder SEQ ID NO: 21 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon mit einer Identität von mindestens 50%.

„Homologe Sequenzen" oder "Homologe" bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz eine Identität mit einer der oben genannten Aminosäuresequenz der Monomere von mindestens 50, 55, 60, 65, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ,100 % aufweist. Anstelle des Begriffs "Identität" werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe "homolog" oder "Homologie" gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T.F. und Waterman, M.S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen durch die Identität der Nukleinsäuresequenz / Polypeptid- equenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von Needleman, S.B. und Wunsch, CD. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3.

Zwei Aminosäuresequenzen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung identisch wenn sie dieselbe Aminosäuresequenz besitzen. Unter Homologe sind in einer Variante die entsprechenden retro-inversen Sequenzen der oben genannten Monomere zu verstehen. Mit dem Begriff "retro-inverse Sequenz" wird erfindungsgemäß eine Aminosäuresequenz bezeichnet, die sich aus Aminosäuren in der enantiomeren Form zusammensetzt (invers: Chiralität des alpha- C-Atoms invertiert) und bei der zusätzlich die Sequenzreihenfolge zur ursprünglichen Aminosäuresequenz umgekehrt wurde (retro = rückwärts). In einer weiteren Variante binden die erfindungsgemäßen Peptide an Teile des Amyloid Beta-Peptids.

In einer weiteren Variante weisen die erfindungsgemäßen Peptide Sequenzen auf, die sich von den angegebenen Sequenzen um bis zu drei Aminosäuren unterscheiden.

Ferner werden als Peptide auch Sequenzen eingesetzt, die die oben genannten Sequenzen enthalten.

In einer weiteren Variante weisen die Peptide Fragmente der oben genannten Sequenzen auf oder weisen homologe Sequenzen zu den oben genannten Sequenzen auf.

Erfindungsgemäß handelt es sich um ein Peptid zur Verwendung in der Medizin, bevorzugt zur Behandlung der Morbus Alzheimer.

In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung besteht das Peptid im Wesentlichen aus D-Aminosäuren.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „im Wesentlichen aus D- enantiomeren Aminosäuren", dass die erfindungsgemäß einzusetzenden Monomere mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70% bevorzugt 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus D-enantiomeren Aminosäuren aufgebaut sind.

In einer weiteren Variante handelt es sich um ein erfindungsgemäßes Peptid zur Hemmung der Fibrillenbildung von Amyloid-Beta-Oligomeren. Die erfindungsgemäßen Peptide enttoxifizieren die A-Beta-Oligomere oder daraus gebildete Polymere, sowie Fibrillen, indem sie nicht daran binden sondern an A-Beta-Monomer binden und durch des Gleichgewichts zur Reduktion der A-Beta-Oligomere führen und diese somit in nicht toxische Verbindungen überführen. Demgemäß ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Enttoxifizierung der A-Beta- Oligomeren, daraus gebildeten Aggregaten oder Fibrillen. Gegenstand der Erfindung sind in einer Ausführung auch erfindungsgemäße Peptide, die mit einer weiteren Substanz verknüpft sind.

Bei der Verknüpfung handelt es sich im Sinne der Erfindung um eine chemische Bindung wie sie in Römpp Chemie Lexikon, 9. Auflage, Band 1 , Seite 650 ff, Georg Thieme Verlag Stuttgart definiert ist, bevorzugt um eine Hauptvalenz Bindung, insbesondere eine kovalente Bindung.

Bei den Substanzen handelt es sich in einer Variante um Arzneimittel oder Wirkstoffe, definiert gemäß Arzneimittelgesetz §2 beziehungsweise. §4 (19), Stand September 2012. In einer Alternative sind Wirkstoffe therapeutisch aktive Stoffe die als arz- neilich wirksame Stoffe verwendet werden. Bevorzugt werden Entzündungshemmer eingesetzt.

Bei den Substanzen handelt es sich in einer weiteren Variante um Verbindungen die die Wirkung der Peptide verstärken.

In einer Alternative sind solche Verbindungen Aminopyrazol und/oder Aminopyrazol- derivate. Aminopyrazolderivate im Sinne der Erfindung ist 3-Aminopyrazol-5- carbonsäure oder 3-Nitropyrazol-5-carbonsäure sowie alle Abkömmlinge, in denen die heterocyclische CH-Gruppe gegen -CR- oder -N- oder -O- oder -S- ausgetauscht wurde, sowie alle daraus abgeleiteten peptidischen Dimere, Trimere oder - Tetramere, bevorzugt Aminopyrazol-Trimer. In einer weiteren Alternative handelt es sich um Verbindungen, die die Löslichkeit der Peptide und/oder die Passage der Blut-Hirn-Schranke verbessern.

In einer Alternative haben die Peptide erfindungsgemäß jede beliebige Kombination von mindestens zwei oder mehr Merkmalen der oben beschriebenen Varianten, Ausführungen und/oder Alternativen. Im Rahmen der Erfindung wurde weiterhin erkannt, dass amidierte und/oder zyklisier- te Peptide im Vergleich zu linearen, bindenden Peptiden, bei denen der freie C- terminus, also die C-terminale Carboxylguppe, nicht modifiziert ist und entsprechend eine negative Ladung trägt, mit einer höheren Affinität an Abeta-Monomer binden. Das heißt, dass der K _D -Wert bei den modifizierten Peptiden niedriger ist, als bei linearen Peptiden, bei denen der freie C-terminus, also die C-terminale Carboxylgup- pe, nicht modifiziert ist und entsprechend eine negative Ladung trägt. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist daher die Affinität der Bindung der erfindungsgemäß modifizierten Peptide ohne negative Ladung am C- terminus im Vergleich zu linearen Peptiden mit negativer Ladung am C-terminus aber im Übrigen gleicher Aminosäuresequenz, um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere 100%, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 , 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 , 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171 , 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 , 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 , 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, insbesondere 200 %, 201 , 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211 , 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251 , 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 , 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 , 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, insbesondere 300%, 301 , 302, 303, 304, 305, 306, 307,

308, 309, 310, 311 , 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321 , 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 , 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341 , 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351 , 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361 , 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371 , 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 , 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391 , 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, insbesondere 400%, 401 , 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411 , 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431 , 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441 , 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 , 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 , 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471 , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491 , 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, vorteilhaft sogar 500%, 501 , 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511 , 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521 , 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531 , 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541 , 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551 , 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561 , 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571 , 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581 , 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591 , 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, besonders vorteilhaft 600%, 601 , 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611 , 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621 , 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631 , 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641 , 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651 , 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661 , 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671 , 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681 , 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691 , 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, besonders vorteilhaft 700%, 701 , 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711 , 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721 , 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731 , 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741 , 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751 , 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761 , 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771 , 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781 , 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791 , 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, ebenfalls besonders vorteilhaft 800%, 801 , 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811 , 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821 , 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831 , 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841 , 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851 , 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861 , 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871 , 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881 , 882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891 , 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, ebenfalls besonders vorteilhaft 900%, 901 , 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911 , 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921 , 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931 , 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941 , 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951 , 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961 , 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971 , 972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981 , 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991 , 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, oder sogar um 1000 %, oder sogar um 10000% oder sogar um bis zu 100000% oder 1000000% erhöht, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann. Dies betrifft insbesondere die erhöhte Affinität zu der high affinity Site des A-Beta-Monomer.

Dies wird durch einen entsprechend erniedrigten K _D -Wert angezeigt. Der K _D -Wert als Maß für die Affinität der Bindung eines modifizierten, insbesondere zyklisierten Peptids an Amyloid-Beta-Monomer ist im Vergleich zu einem linearen, bindenden Peptid mit negativer Ladung am freien C-terminus, um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere 99,1 , 99,2, 99,3, 99,4, 99,5%, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 bis zu 99,99 oder sogar 99,999% erniedrigt, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.

Diese niedrigeren K _D -Werte beziehen sich vorteilhaft insbesondere aber nicht ausschließlich auf die high affinity site von A-Beta-Spezies-Monomer. Die modifizierten Peptide können daher noch effizienter als Sonden für diagnostische Zwecke verwendet werden, als lineare, bindende Peptide mit negativer Ladung am freien C-terminus, insbesondere auch effizienter als ihre linearen Peptid-Pendants mit identischer Aminosäuresequenz verwendet werden.

Sie können aber insbesondere auch effizienter als Therapeutika verwendet werden, als lineare, bindende Peptide mit negativer Ladung am freien C-terminus, insbesondere effizienter als ihre linearen Peptid-Pendants mit identischer Aminosäuresequenz.

Im unmittelbaren Vergleich eines modifizierten Peptids zu einem Peptid mit negativer Ladung am C-terminus schneidet das erfindungsgemäße Peptid besser in Hinblick auf Affinität und Effektivität ab. Im Rahmen der Erfindung wurde weiterhin erkannt, dass die modifizierten Peptide im Vergleich zu Peptiden mit negativer Ladung am freien C-terminus, insbesondere aber im Vergleich zu ihren Peptid-Pendants mit identischer Aminosäuresequenz, zusätzlich auch mit einer höheren Effektivität bzw. Effizienz die Bildung besonders toxischer Amyloid-Beta-Oligomere verhindern oder deren Zerstörung und / oder Endtoxifizie- rung bewirken. Diese Effektivität ist insbesondere um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, besonders vorteilhaft sogar um 100% erhöht.

Eine Probe mit den verschiedenen A-Beta-Konformeren wird testweise im einfachsten Fall z. B. fraktioniert. In jeder Fraktion werden entsprechend des Fraktionierungs- schritts verschiedene Konformere, wie Monomere, Oligomere, Fibrillen oder höhere Aggregate angereichert und können sodann exakt bestimmt werden.

Der Begriff„exakt bestimmt" umfasst einen Kalibrierungsschritt bei der Fraktionierung durch Moleküle bekannter Art und Verhaltens. Nach der Fraktionierung liegt in jeder Fraktion nur eine bestimmte Art an Konformeren des A-Beta vor, z. B. Monomere, Oligomere oder Fibrillen und so weiter. Beispielweise werden die Konformere bei einer Dichtegradientenzentrifugation als Fraktionierungsschritt nach ihrem s-Wert oder Sedimentationskoeffizienten aufgetrennt. Moleküle unterschiedlicher Größe können einen identischen hydrodynamischen Radius besitzen, haben aber dennoch unterschiedliche s-Werte und werden danach auch aufgetrennt. Durch eine Kalibration mit Molekülen von bekanntem s- Wert sind die mittels Dichtegradientenzentrifugation erhaltenen A-Beta Konformere exakt nach ihrem s-Wert bestimmt.

Im Weiteren werden die erhaltenen Fraktionen mit und ohne Wirkstoff behandelt und z. B. durch RP-HPLC bestimmt. Auf diese Weise kann man die Effektivität des Wirkstoffs bestimmen. Ein weiteres Verfahren wird nachfolgend vorgestellt. Zur Quantitativen Analyse von Wirkstoffen kann der sogenannte QIAD-Test eingesetzt (quantitative determination of jnterference with Aß aggregate size distribution). Das Verfahren zur quantitativen Analyse des Einflusses eines Wirkstoffs auf die Partikelgrößenverteilung amyloider Peptide und / oder Proteine in einer Probe, weist dabei nachfolgende Schritte auf. Zunächst lässt man A-Beta unter kontrollierten Bedingungen aggregieren, so dass je verschiedene A-Beta-Aggregate entstehen. Die Bedingungen werden so gewählt, dass besonders viele, kleine, besonders cytotoxische A-Beta-Oligomere gebildet wurden. Als nächstes wird die zu untersuchende Substanz, z.B. eines der erfin- dungsgemäßen modifizierten Peptide zu der Probe zugegeben. Der Wirkstoff ändert die Partikelgrößenverteilung in der Probe. Diese Änderung wird quantitativ festgestellt. Die Änderung ist ein Maß für die Reduktion oder sogar für die vollständige Eliminierung bestimmter toxischer Spezies einer bestimmten Partikelgröße. Durch das QIAD-Verfahren wird die Zunahme oder die Abnahme von A-Beta-Aggregaten einer bestimmten Partikelgröße gemessen. Während einige A-Beta-Aggregate mit einer bestimmten Größe anfänglich in der Probe vorhanden waren, werden diese unter Einfluss des Wirkstoffs reduziert oder sogar vollständig eliminiert. Andere Partikelgrößen nehmen unter dem Einfluss des Wirkstoffs zu oder bleiben konstant. Die Partikel, die aus dem A-Beta gebildet sind, werden vorzugsweise nach ihrem hydro- dynamischen Radius der Partikel voneinander getrennt. Auf diese Weise wird vorteilhaft bewirkt, dass aus der Probe eine Mehrzahl an Fraktionen erhalten wird. In den Fraktionen sind die Partikel an amyloiden Peptiden und / oder Proteinen mit einer bestimmten Aggregatgröße angereichert. Diese Trennung der Partikel kann mittels einer Dichtegradientenzentrifugation vorgenommen werden. Die Fraktionen werden räumlich voneinander getrennt, z. B. durch Abpipettieren. Abschließend wird die

Konzentration an A-Beta in der jeweiligen Fraktion durch eine vollständige Denaturierung der A-Beta-Spezies während einer im Anschluss an die Fraktionierung durchgeführten Umkehrphasen (RP-) HPLC bestimmt. Die Denaturierung der Aggregate kann z. B. mit 30 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure bei einer Säulentempera- tur von 80 °C vollständig erfolgen und auf einer C8-Säule nach Hydrophobizität aufgetrennt werden. Eluierendes A-Beta wird mittels der UV-Absorption bei 215 nm detektiert. Die Peakflächenintegration kann mittels Agilent Chemstation Software erfolgen. Die Verrechnung daraus entstandener Werte mit einer zuvor durchgeführ- ten Kalibrierung erlaubt die Berechnung der Konzentration des in der jeweiligen Fraktion vorhandenen A-Beta. Je Fraktion kann der Mittelwert aus mehreren z. B. sechs voneinander unabhängig durchgeführten Experimenten mit der sich ergebenen Standardabweichung berechnet werden. Der Vorteil der HPLC-Analyse liegt darin, dass man unabhängig vom Aggregationszustand und eines Lösungsmittels sehr sensitiv detektieren (z. B. ca. 20 nM oder 1 ,8 ng Aß1-42) und zuverlässig quantifizieren kann. Ein entscheidender Vorteil des Verfahrens besteht in der Kopplung von Dichtegradientenzentrifugation und Umkehrphasen HPLC, welche eine zuverlässige Quantifizierung auch von A-Beta-Oligomeren möglich macht. Der erfindungsgemäße Effekt einer gesteigerten Effektivität der Eliminierung (bzw. der Bildung) von Amyloid-Beta-Spezies und insbesondere Amyloid-Beta-Oligomeren kann mit einem dieser Verfahren, aber nicht ausschließlich mit diesen Verfahren erfolgen.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung treten die Effekte der gesteigerten Spezifität gegenüber A-Beta-Monomer und damit verbundene gleichzeitige Effektivität der Eliminierung, Enttoxifizierung von A-Beta-Oligomeren (bzw. der Bildung) auch in vitro und / oder in vivo auf.

Die Erfindung betrifft ferner auch eine Zusammensetzung enthaltend das erfindungsgemäße Peptid, insbesondere zur Behandlung von Morbus Alzheimer. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Zusammensetzung enthaltend das erfindungsgemäße Peptid, insbesondere zur Reduktion vorhandener toxischer A-Beta-Oligomere und Verhinderung der Bildung toxischer A-Beta-Oligomere.

Die erfindungsgemäße„Zusammensetzung" kann z. B. ein Impfstoff, ein Medikament (z. B. in Tablettenform), eine Injektionslösung, ein Nahrungs- oder Nahrungsergän- zungsmittel sein, enthaltend das erfindungsgemäße Peptid in einer aufgrund des Fachwissens herzustellenden Formulierung.

Die Erfindung betrifft ferner auch ein Kit enthaltend einen erfindungsgemäßen Liganden, bzw. Peptid. In einem solchen Kit können die erfindungsgemäßen Peptide in Behältern ggf. mit/in Puffern oder Lösungen verpackt sein. Alle Komponenten des Kits können in demselben Behälter oder getrennt voneinander verpackt sein. Ferner kann das Kit Anweisungen für dessen Gebrauch enthalten. Ein solches Kit kann beispielsweise die erfindungsgemäßen in einer Injektionsflasche mit Stopfen und/oder Septum enthalten. Ferner kann darin beispielsweise auch eine Einmal-Spritze enthalten sein.

Die erfindungsgemäßen Peptide können als Sonden zur Bindung an A-Beta- Monomer dienen. Solche molekularen Sonden enthalten das erfindungsgemäße Peptid bzw. Polymer und gegebenenfalls Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, radioak- tive Isotope, (PET etc.), Gadolinium (MRI), sowie alternative Stoffe geeignet für die Bildgebung der Sonden und können den Patienten z.B. intravenös injiziert werden. Nach Passage über die Bluthirnschranke können die Sonden an A-Beta-Monomer und/oder Plaques binden. Die so markierten A-Beta-Monomere und/oder Plaques können mittels bildgebender Verfahren wie z.B. SPECT, PET, CT, MRT, Protonen- MR-Spektroskopie usw. sichtbar gemacht werden.

Ferner betrifft die Erfindung auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids zur Verhinderung von Amyloid-Beta-Oligomeren und/oder Amyloid-Beta-Peptid- Aggregaten und/oder Amyloid-Beta-Fibrillen.

Das erfindungsgemäße Peptid wird auch zur Enttoxifizierung von toxischen Amyloid- Beta-Oligomeren und/oder Aggregaten verwendet. Insbesondere wird es verwendet, um an Amyloid-Beta-Monomere zu binden und durch Verschiebung des Gleichgewichts amorphe, nicht toxische Aggregate zu bilden.

Diese Aggregate können aus gebundenen Monomeren bestehen und das Gleichgewicht wird verschoben, und zwar in erster Linie weg von den Oligomeren. Es können amorphe, nicht toxische Aggregate gebildet werden wodurch eine Reduktion der toxischen Spezies erreicht wird. Andere Peptide stabilisieren die A-Beta-Monomere durch die Monomer-Spezifität im ELISA-Versuch, wie in Figur 2 gezeigt wird.

Es wurde erkannt, dass wenn bereits A-Beta-Oligomere vorhanden sind, es das Ziel einer Behandlung sein muss, diese durch Substanzen zu adressieren, die eine mög- liehst hohe Spezifität zu A-Beta-Monomer besitzen. De facto kann die Spezifität gegenüber A-Beta-Monomer im Vergleich zu A-Beta-Oligomer gar nicht groß genug sein und das entsprechende Verhältnis ist jedenfalls größer als 1.

Es wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass A-Beta-Monomere, als Bausteine der A-Beta-Oligomere, ständig im menschlichen Körper entstehen und vermutlich per se nicht toxisch sind. Es besteht sogar die Möglichkeit, dass Monomere eine positive Funktion besitzen. A-Beta-Monomere können sich in Abhängigkeit von ihrer Konzentration zufällig zusammen lagern. Die Konzentration ist abhängig von ihrer Bildungsund Abbaurate im Körper. Findet mit zunehmendem Alter eine Erhöhung der Kon- zentration an A-Beta-Monomeren im Körper statt, ist eine spontane Zusammenlagerung der Monomere zu A-Beta-Oligomeren immer wahrscheinlicher. Die so entstandenen A-Beta-Oligomere könnten sich analog zu den Prionen vermehren und letztendlich zur Morbus Alzheimer-Krankheit führen.

Es wurde ferner erkannt, dass ein wichtiger Unterschied zwischen Prävention und Behandlung oder gar Heilung der Alzheimerschen Demenz in der Tatsache liegt, dass eine Prävention möglicherweise schon durch die Verhinderung der Bildung der ersten A-Beta-Oligomere erreicht werden kann. Hierzu sind einige, wenige hochspezifische A-Beta-Monomer Liganden ausreichend, die gleichzeitig wenig affin und selektiv bezüglich der A-Beta-Oligomere sind. Die Bildung der A-Beta-Oligomere aus vielen Monomeren ist eine Reaktion hoher Ordnung und damit in hoher Potenz von der A-Beta-Monomer-Konzentration abhängig. Somit führt schon eine kleine Verringerung der aktiven A-Beta-Monomer- Konzentration zu einer Verhinderung der Bildung der ersten A-Beta-Oligomere. Auf diesem Mechanismus basieren vermutlich die bisher sich in der Entwicklung befindli- chen eher präventiven Therapie-Konzepte und Substanzen.

Bei der Behandlung der Alzheimerschen Demenz ist jedoch von einer völlig veränderten Situation auszugehen. Hier liegen A-Beta-Oligomere oder evtl. auch schon größere Polymere oder Fibrillen vor, die sich durch Prionen-ähnliche Mechanismen vermehren. Diese Vermehrung ist jedoch eine Reaktion niederer Ordnung und ist kaum noch von der A-Beta-Monomer-Konzentration abhängig. Sind also A-Beta-Oligomere bereits entstanden, muss es das Ziel einer Behandlung sein, diese durch Substanzen zu adressieren, die diese besonders effizient eliminieren und / oder die Bildung besonders effizient verhindern bzw. diese enttoxifizieren.

Diese Anforderungen in Hinblick auf die Therapie der Alzheimerschen Demenz sind mit der Bereitstellung der erfindungsgemäßen Peptide erfüllt. Die erfindungsgemäßen Peptide binden im Sinne der Therapie spezifisch die Amyloid-Beta-Monomere mit entsprechend niedriger Dissoziationskonstante. Weiterer Gegenstand ist somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide als Therapeutikum von Morbus Alzheimer. Die erfindungsgemäßen Peptide binden besonders gut an A-Beta an lösliche A-Beta- Monomere.

Mittels des Thioflavin-T-Tests kann gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Peptide die Fibrillenbildung von A-Beta-Peptiden sehr effizient hemmen, besonders das Peptid mit der SEQ ID NO: 1 - 21 , insbesondere das Peptid gemäß der SEQ ID NO: 1.

Weiterer Gegenstand ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide in einem Verfahren zur Behandlung (in vitro, ex vivo) von Blut, Blutprodukten und/oder Organen, dadurch gekennzeichnet, dass das Blut, die Blutprodukte und/oder Organe dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen werden und A-(Amyloid)-Beta- Oligomere entfernt und/oder enttoxifiziert werden.

Die Spezifität eines Peptids ergibt sich aus der prozentualen Differenz der Absorptionswerte für das Zielmolekül bzw. den Köder (z. B. A-Beta-Monomer) zu den normierten Absorptionswerten für die Kompetitoren (z. B. A-Beta-Oligomere und - Fibrillen) im Einzelphagen-ELISA. Die Absorptionswerte stellen dann die Affinität von Phagen-Einzelklone für eine jeweilige immobilisierte A-Beta-Spezies dar. Die Spezifität ist dabei nicht abhängig von der Stärke der Affinität, sondern nur von der Differenz der Affinitäten zwischen den Spezies. Je größer die prozentuale Differenz von der Signalstärke für das Zielmole- kül (z. B. Aß _1-4 2-Monomer) gegenüber der Signalstärke für die sogenannten Kompeti- toren und -Fibrillen) ist, desto spezifischer bindet der jeweilige Phage an das Zielmolekül. Die Begriffe„Kompetitoren" und„Zielmolekül" bzw.„Köder" werden wie unten angegeben definiert. Peptide gelten im Sinne des oben genannten Spezifitätsbegriffs dann als spezifisch, wenn die prozentuale Differenz der normierten Absorptionswerte (mit Zielmolekül z. B. monomeres Aßi-4 ₂ = 100%) mindestens 40%, 45%, besser 50%, vorzugsweise besser als 70%, insbesondere besser als 80% oder 90%, und besonders bevorzugt 100% beträgt, wobei alle Zwischenwerte angenommen werden können. Wechselnde Substrate erhöhen zunächst die allgemeine Spezifität für das Zielmolekül aber auch„Verwandte". Mit Hilfe wechselnder Substrate und deren abwechselnder Blockierung und Nicht-Blockierung wird die Spezifität für das Zielmolekül gegenüber unspezifisch bindenden Phagen (Bindung an Substrat (Plastikoberflächen), Streptavidin oder BSA (Blockier-Reagenz)) erhöht. Durch die abwechselnde Verwendung unterschiedlicher Substrate können Phagen die zum Beispiel in Runde X an Substrat A gebunden haben in der folgenden Runde X+1 nicht mehr ihren bevorzugten Bindepartner Substrat A binden, weil dieser durch Substrat B ersetzt worden ist, dadurch gehen Substrat A bindende Phagen verloren.

Zusätzlich zu dieser ersten, groben Spezifizierung erfolgte mit Hilfe des Einsatzes der Kompetitoren, die z. B. Polymere des Zielmoleküls darstellen können, eine Steigerung der Spezifität für eine klar definierte Form des Zielmoleküls (z. B. Monomere).

Auf diese Weise konnte nicht nur die zuvor häufig aufgetretene unspezifische Bindung an Zielmolekül und Substrat oder die bevorzugte Bindung an Substrat deutlich reduziert werden, sondern es konnte die Spezifität zu einer klar definierten strukturel- len, monomeren Variante des Zielmoleküls gesteigert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit vorteilhaft besonders geeignet zur Identifikation von Liganden gegenüber A-Beta-Monomer oder A-Beta-Oligomer als Köder mit der jeweils anderen Spezies als Kompetitor. Beispiel: Es ist nahezu unmöglich, eine gleiche Immobilisierungseffizienz für z. B. verschiedene Aßi _-42 -Spezies für ELISA-Experimente zu gewährleisten, weshalb auf jeder 96-well-Mikrotiterplatte eine Immobilisierungskontrolle eingesetzt werden sollte. Diese kann darin bestehen, dass statt der amplifizierten Einzelphagenklone ein (Aßi_ 2-) spezifischer Antikörper (z. B. 6E10) zu den jeweiligen Kontroll-Reaktionswannen (wells) gegeben werden kann. Das gemessene Absorptionssignal, dessen Stärke von der Bindung eines Antikörpers an die angebotene Oberfläche mit oder ohne immobilisierte Αβτ ^-Spezies abhängig ist, kann im Anschluss an das Experiment als Maß für die Immobilisierungseffizienz verwendet werden. Als weitere Kontrolle kann eine mögliche Kreuzreaktion des Phagen-spezifischen Antikörpers mit den immobilisierten Molekülen oder der Oberfläche der Reaktionswanne untersucht werden. Der Phagen-spezifische Antikörper wird normalerweise den Ansätzen zugegeben in denen Einzelphagen getestet werden, um deren Bindung an die jeweils gegebene Zielstruktur (z. B. Oberfläche, Aßi _-4 2-Monomere, und -Fibrillen) zu quantifizieren. Dafür muss jedoch bekannt sein, wie stark der Phagen-spezifische Antikörper unspezifisch an andere mögliche Ziele bindet, z. B. an die oben genannten potentiellen Zielstrukturen der Phagen selbst, um diese sogenannten Kreuzreaktionen gegebenenfalls in die Interpretation der erhaltenen Daten mit einzubeziehen.

Ein Verfahren zur Normierung der erhaltenen Werte sollte daher vorgenommen wer- den. Von allen Absorptionswerten der Einzelphagenklone im Einzelphagen-ELISA können dabei die Werte des auf Kreuzreaktion getesteten Phagen-Antikörper als Hintergrund abgezogen werden. Dies geschieht entsprechend der zuvor immobilisierten Spezies. Die Signalwerte des Phagen-Antikörpers können hierzu aus den Reaktionswannen mit immobilisierten Aß _1-42 -Oligomeren von den Signalwerten der Einzel- phagenklone aus den Reaktionswannen mit immobilisierten abgezogen werden. Analog wird dann für Aßi _{- 2} -Monomere vorgegangen. Auf diese Weise kann zunächst ein mögliches Hintergrundsignal des Phagenantikörpers aus den Signalen der Einzephagenklone herausgerechnet werden. Im Anschluss daran wird anhand der Kontrolle mit Aß^ ^-spezifischem 6E10-Antikörper die Immobilisierungs- effizienz der unterschiedlichen verwendeten Aß _1-42 -Spezies vermessen und verglichen. Dadurch wird vorteilhaft (siehe auch Figur 1) eine effektivere Immobilisierung des Gemisches aus und -Fibrillen gegenüber den Aß _-42 - Monomeren bewirkt. Daher werden in den Reaktionswannen, in denen Aßi_42- Oligomere und -Fibrillen immobilisiert sind, mehr potentielle Bindepartner für die Einzelphagenklone angeboten und das Ergebnis verzerrt. Daher wurden die Werte der 6E10-Kontrolle aus den Reaktionswannen in welchen Aß _1-42 -Oligomere und - Fibrillen immobilisiert waren auf den Gehalt an Aß^ in den Reaktionswannen in denen Aßi ^-Monomere immobilisiert waren normiert. Daraus ergibt sich für jede verwendete Mikrotiterplatte ein spezifischer Faktor, mit welchem die Werte für die Bindung an Aß _-4 2-Oligomere und -Fibrillen jedes Einzelphagenklons multipliziert wurden. Nur so ist eine gleichwertige Interpretation der Ergebnisse vor allem in Hinblick auf die Bewertung der Spezifität der Einzelphagenklone möglich (siehe Figur 2).

Ausführungsbeispiele

Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren näher erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Beschränkung der Erfindung kommen soll.

Es zeigen:

Figur 1 : Immobilisierungskontrolle verschiedener

Figur 2: Einzelphagen-ELISA.

Figur 3: Modulation der Aßi _-42 -Aggregation durch Mosd-Peptide - ThT-Versuch.

Figur 4: Modulation verschiedener Aßi _-4 2-Spezies durch Mosd-Peptide.

Figur 5: Modulation verschiedener Aßi _-4 2-Spezies durch Mosdl .

Figur 6: Quantifikation der Modulation verschiedener Aßi .«-Spezies durch

Mosdl mittels RP-HPLC.

Figur 7: TEM-Aufnahmen von 10 μΜ Aß _1-42 inkubiert mit und ohne 10 μΜ

Mosdl . Figur 8 MTT-Reduktionsversuch: Einfluss von Mosdl auf Aßi _-4 2 -induzierte

Zelltoxizität.

Figur 9 Einfluss on Mosdl auf APP-exprimierende Zellen.

Kompetitives Spiegelbildphagendisplav am Beispiel von A-Beta-Monomer als Köder: Das Ziel des kompetitiven Spiegelbildphagendisplav war die Selektion spezifisch Aß^ ₄ 2-Monomer bindender Peptide. Sechs sogenannte panning-Runden wurden ausgeführt, wobei eine panning-Runde dem Prozess entspricht, in welchem die Phagenbib- liothek mit dem immobilisierten Zielmolekül/Köder, Aß _1-42 -Monomere, in Kontakt gebracht wird. Um die Anzahl der Phagen zu reduzieren, die eine erhöhte Spezifität zu anderen Αβι-42-Spezies, das heißt Oligomeren und Fibrillen aufweisen, wurden eben diese Spezies ab der zweiten panning-Runde als Kompetitoren eingesetzt.

Auf diese Weise konnte die Anzahl der Phagen, die eine erhöhte Affinität zu Αβ-ι^- Oligomeren und -Fibrillen aufweisen, vermindert werden und die Anzahl der Phagen mit erhöhter Spezifität für monomers Aßi- 2 gleichzeitig angereichert werden.

Mit dem weiteren Ziel, die Anreicherung Plastik-bindender Phagen sowie Phagen mit einer Spezifität für das Blockierreagenz BSA (bovines Serumalbumin) zu verringern, wurde das Zielmolekül auf unterschiedlichen, sich von Runde zu Runde abwechselnden, Stretpavidin-beschichteten Kunststoffen/Oberflächen immobilisiert (Polysty- ren/Polypropylen/Polycarbonat).

Die Polystyren-Oberflächen wurden entsprechend den Herstellerangaben vor der Immobilisierung des Zielmoleküls gewaschen. Zusätzlich erfolgte abwechselnd von einer zur nächsten Runde eine und keine Blockierung der Oberfläche mit 150 μΙ 1x TBS/0.1 % (v/v) Tween-20/1% (w/v) BSA vor der Immobilisierung des Zielmoleküls für eine Stunde bei Raumtemperatur. Auf diese Weise wurde keine Kombination aus Kunststoffoberfläche und Blockierung während der 6 panning-Runden mehr als einmal verwendet (siehe Tabelle X). Dieser Schritt wurde durchgeführt, um unspezifische Bindung an die Kunststoffe und BSA zu reduzieren, da z.B. Phagen die an BSA gebunden haben in der darauf folgenden panning-Runde, die entsprechend obiger Erklärung ohne BSA durchgeführt wird, keine Bindepartner vorfinden und dementsprechend in den Waschschritten entfernt werden.

Nach der Vorbehandlung der Oberfläche wurden D-enantiomere, N-terminal biotiny- lierte Aßi _-4 2-Monomere in 1x TBS auf eine Konzentration von 63 nM verdünnt und als Zielmolekül auf der jeweiligen Oberfläche immobilisiert. Der monomere Status der Aß _{1 -4} 2-Moleküle wurde über Größenausschlusschromatographie garantiert. Die ge- nutzte Konzentration von 63 nM entspricht der Belegung von 1/3 aller Streptavidin- Bindungsstellen pro genutzter Oberfläche, ausgehend von der Oberfläche mit der geringsten Anzahl freier Streptavidin-Bindungsstellen. 100 μΙ der auf 63 nM eingestellten Lösung von monomerem Aßi _-42 in 1x TBS wurden auf die Streptavidin beschichtete Oberfläche gegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Oberfläche dreimal mit 150 μΙ 1x TBS gewaschen.

Daraufhin wurden in der ersten panning-Runde 90 μΙ 1x TBS mit 10 μΙ der kommerziell erhältlichen, rekombinanten Phagenbibliothek auf die Oberfläche gegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde abgenommen und durch 100 μΙ 10 μΜ Biotin in 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 ersetzt. Dieser Schritt diente dem kompetitiven Verdrängen von Phagen, die an noch freie Streptavidin- Bindestellen gebunden haben, durch den hochaffinen Streptavidin-Bindepartner Biotin und wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Oberfläche wurde danach viermal mit 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 gewaschen.

Die nach wie vor gebundenen Phagen wurden durch einen pH-Schritt abgetrennt. Hierfür wurden 100 μΙ einer 0.2 M Glycin/HCl Lösung mit einem pH-Wert von 2.2 auf die Oberfläche gegeben und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung inklusive der eluierten Phagen wurde abgenommen und zur Neutralisation zu 25 μ1 1 M Tris/HCI mit einem pH-Wert von 9.1 gegeben und vermischt.

20 μΙ dieses Ansatzes wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt und dienten weiterhin zur Bestimmung des Phagentiters nach Elution (sogenannter Output-Titer). Die übrigen 105 μΙ wurden zur Amplifizierung der eluierten Phagen verwendet. Sowohl Titrierung als auch Amplifikation erfolgten nach Angaben des Herstellers der Phagenbibliothek (Stand der Technik).

Die amplifizierten Phagen wurden analog zu den eluierten, nicht amplifizierten Pha- gen titriert (Input-Titrierung). Die Anzahl Plaque-bildender Einheiten (plaque forming units = pfu) pro Milliliter wurde unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors ermittelt. Die Phagenanzahl wurde anhand dieser Zahl für jede Runde auf 1x 10 ¹¹ Phagen in 100 μΙ 1x TBS eingestellt. Für jede Folgerunde wurden die amplifizierten Phagen der Vorrunde verwendet und entsprechend verdünnt. Während die Konzentration des Zielmoleküls bzw. Köders (monomeres Aß _-42 ) in allen Runden stabil bei 63 nM lag, wurden die Kompetitoren in von panning-Runde zu panning-Runde ansteigender Konzentration zugegeben. Als Kompetitoren dienten D-enantiomere Aßi _-4 2-Oligomere (aufgereinigt, das heißt von anderen Αβϊ ^-Spezies getrennt über Größenausschlusschromatographie) und (aufgereinigt mittels Dichtegradientenzentrifugation). Diese Kompetitoren waren nicht biotinyliert, da sonst eine Bindung an die Oberfläche möglich wäre. Das Ziel aber war, Kompeti- toren-bindende Phagen von den Phagen, die an das immobilisierte Zielmolekül gebunden haben, zu trennen, indem sie bei den Wasch schritten abgewaschen werden. Der Anstieg der Konzentrationen war für beide Kompetitor-Spezies gleich und wie folgt: Runde 1 = 0 nM - Runde 2 = 1 nM - Runde 3 = 5 nM - Runde 4 = 10 nM - Runde 5 = 50 nM - Runde 6 = 500 nM.

Durch die Einführung des Kompetitionsschrittes wurde der oben beschriebene Ablauf einer panning-Runde ab Runde 2 angepasst: 1x 10 ¹¹ Phagen aus der vorherigen Runde wurden fortan nicht in 100 μΙ 1x TBS verdünnt sondern in 60 μΙ. Die restlichen 40 μΙ wurden direkt danach mit 20 μΙ 1x TBS inklusive dem Fünffachen der oben für jede Runde angegebenen Konzentration Aß^-Oligomere sowie 20 μΙ 1x TBS inklusive dem Fünffachen der oben angegebenen Konzentration aufgefüllt. Die Verfünffachung der oben angegebenen Konzentrationen ergibt sich aus der Tatsache, dass die Konzentration auf das Gesamtvolumen von 100 μΙ berechnet wurden, da jeweils nur ein Fünftel des Gesamtvolumens (20 μΙ) aus Kompetitor- Lösungen bestehen, entspricht die Konzentration der Kompetitoren im Gesamtansatz den genannten Werten.

Nach 5 Minuten wurde die Lösung aus Phagen und Kompetitoren entfernt. Es folgten der schon beschriebene Kompetitionsschritt mit 10 μΜ Biotin und die Waschschritte, deren Anzahl sich ebenfalls von einer zur nächsten panning-Runde erhöhte (Runde 1 = 4 Waschschritte - Runde 2 = 6 - Runde 3 = 8 - Runde 4 = 10 - Runde 5 = 12 - Runde 6 = 15).

Tabelle 1 : Parameter aller 6 durchgeführten panning-Runden.

Zu Tabelle 1 : Für das Spiegelbildphagendisplay wurden die nachfolgenden Parame- ter festgelegt. Innerhalb von 6 panning-Runden wurden 3 verschiedene Kunststoffe abwechselnd als Oberfläche verwendet (PS= Polystyren, PP= Polypropylen, PC= polycarbonate). Zusätzlich wurde in jeder zweiten Runde beginnend mit der ersten die Oberfläche mit BSA blockiert bevor das Zielmolekül immobilisiert wurde. Auf diese Weise sollte eine Anreicherung von Phagen mit einer Spezifität für einen der Kunststoffe oder BSA verringert werden. Nachdem die naive Phagenbibliothek (naiv heist hier, sie war bisher noch nicht mit dem Zielmolekül in Kontakt) die Möglichkeit hatte in der ersten panning-Runde an das immobilisierte Zielmolekül (Aßi-42- Monomer) zu binden, wurde ab der zweiten panning-Runde ein Kompetitionsschritt eingeführt. Dieser Schritt bestand aus der Zugabe ansteigender Konzentrationen von Kompetitoren, namentlich Aßi _-4 2-Oliomere und -Fibrillen. Auf diese Weise sollten Phagen, die unspezifisch an verschiedene Aß _1-42 -Spezies binden, entfernt werden, so dass letztendlich nur die Phagen übrig bleiben, die a) spezifisch an D- enantiomeres Αβ-ι^ und nicht an Kunststoffoberflächen, BSA oder Biotin binden und dabei b) spezifisch für monomers, D-enantiomeres Aß _{1- 2} sind. Die Rigorosität beim Waschen wurde gesteigert, indem die Anzahl der Waschschritte pro Runde erhöht wurde, dadurch sollten sehr schwach an das Zielmolekül bindende Phagen entfernt werden.

Einzelphagenamplifikation: Aus den panning-Runden gingen Ansammlungen von verschiedenen, zunehmend spezifischer an das Zielmolekül bindenden Phagen her- vor. Aus diesen Ansammlungen wurden einzelne Phagenklone vermehrt, um diese dann untereinander zu vergleichen (Sequenzierung der DNA und Einzelphagen- ELISA). Hierfür wurden von den Output-Titerplatten der bevorzugten Runden des Spiegelbild-Phagendisplays (panning-Runden 3-6) einzeln vorliegende Plaque formende Einheiten entnommen und vermehrt. Die Vermehrung erfolgte gemäß eines Protokolls des Herstellers der rekombinanten Phagenbibliothek.

Einzelphagen-ELISA: Die Affinität einzelner Phagenklone gegenüber dem Zielmolekül und den Kompetitoren wurde mittels ELISA untersucht. Hierfür wurden alle drei Spezies in biotinylierter Form auf einer Polystyrenoberfläche an darauf gebundenes Stretpavidin immobilisiert. Da während der panning-Runden Oligomere und Fibrillen zur selben Zeit als Kompetitoren zugegeben worden sind, wurden diese beiden Spezies im Einzelphagen-ELISA ebenfalls gemischt immobilisiert. Die Aßi _-42 -Spezies wurden nach demselben Prinzip wie im Spiegelbild-Phagendisplay aufgereinigt und zu 320 nM immobilisiert (bei wurde eine 1 :1 Mischung beider Spezies mit einer Gesamtkonzentration von 320 nM hergestellt und immobilisiert). Für jeden Klon und jede im späteren Verlauf des Protokolls erwähnte Kontrolle wurden in jeweils 2 Reaktionswannen (Fachausdruck, prinzipiell auch im Deutschen: "well": 96 davon auf einer Polysteren-(oder anderer Kunststoff)-Platte) Αβι-42-Monomere, oder keine der beiden Ansätze immobilisiert. Die Reaktionswannen ohne immobilisiertes Aßi-4 ₂ dienten später dem Nachweis, ob die Phagen oder die zur Detektion der Phagen bzw. des Aß _1-42 verwendeten Antikörper unspezifisch an die Plastikoberfläche binden. Die Streptavidin- beschichteten Mikrotiterplatten wurden wie vom Hersteller angegeben vorgewaschen. Die Αβι-42-Monomere beziehungsweise die und -Fibrillen wurden zu einer Konzentration von jeweils 320 nM in 1x TBS verdünnt. Zur Immobilisierung wurden pro Reaktionswanne 100 μΙ eingesetzt und für 15 Minuten bei Raum- temperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen der gesamten Platte(n) mit 150 μΙ 1x TBS pro Reaktionswanne folgte ein Blockierschritt mit 150 μΙ 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20/1% (w/v) BSA für eine Stunde bei Raumtemperatur. Es folgten drei Waschschritte mit 150 μΙ 1x TBS/0.1 % (v/v) Tween-20 pro Reaktionswanne. Die amplifizierten Einzelphagenklone wurden 1 :1 mit 1x TBS/1 % (w/v) BSA vermischt. Der Antikörper 6E10 wurde 1 : 10.000 in 1 x TBS/0.1 % (v/v) Tween-20 verdünnt. 100 μΙ einer jeden Einzelphagenklonverdünnung, einer Probe ohne Phagen (LB-Medium 1 :1 mit 1x TBS/1% (w/v) BSA) und der Antikörperverdünnung wurden auf jeweils 2 Reaktionswannen ohne immobilisiertes Aßi _-42 , 2 Reaktionswannen mit immobilisiertem monomeren Aßi _-4 2 und 2 Reaktionswannen mit immobilisiertem oligome- ren/fibrillären Aß _-42 gegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach fünfmaligem Waschen mit 150 μΙ 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 pro Reaktionswanne, wurden in jede Reaktionswanne 200 μΙ 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 gegeben und die Platte(n) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösungen wurden abgenommen und wie folgt ersetzt. In alle Reaktionswannen, die zuvor mit Einzelphagenklon-Verdünnungen oder dem Ansatz ohne Phagen inkubiert worden sind, wurden nun 100 μΙ eines 1 :5.000 in 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 verdünnten Phagenantikörpers gegeben. An diesen Antikörper ist das Enzym Merrettichperoxi- dase (horse radish peroxidase = HRP) gekoppelt, welches später der Umsetzung eines Substrates (TMB) dient. Diese Umsetzung hat eine Farbreaktion zur Folge deren Stärke proportional zur Bindung des Antikörpers an sein Ziel (Phagen) und damit wiederum zur Bindung der Phagen an die immobilisierte Spezies bzw. die Oberfläche ist. Gleichzeitig wurden in allen Reaktionswannen, die zuvor mit der Verdünnung des 6E10-Antikörpers inkubiert worden sind, nun 100 μΙ eines 1 :1.000 in 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 verdünnten Zweitantikörpers gegeben, welcher in der Lage ist, den aus der Maus stammenden 6E10-Antikörper zu erkennen und zu binden. Auch dieser Antikörper ist HRP-gekoppelt und erlaubt somit eine Quantifizierung der Bindung des ersten Antikörpers an die immobilisierten Zielmoleküle bzw. die Kunst- stoffoberfläche der Reaktionswanne. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte(n) 10 mal mit 150 μΙ 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 pro Reaktionswanne gewaschen. Die Detektion des Signals erfolgte durch Zugabe des Substrates 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB). TMB wird von HRP umgesetzt, wobei es zu einem Farbumschlag in der Lösung kommt. Die Stärke der Farbreaktion ist ein Maß für die Bindungsstärke der Phagen bzw. des Antikörpers. 50 μΙ der TMB-Lösung werden dafür nach dem Waschen pro Reaktionswanne aufgetragen. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe von 50 μΙ 2 M H ₂ S0 ₄ gestoppt, sobald die Lösungen in den Reaktionswannen türkis wird. Die Absorption bei 450 nm wird anschließend automatisch ausgelesen. Die im Einzelphagen-ELISA erhaltenen Werte für die Affinität zu

und -Fibrillen wurden zunächst anhand der Ergebnisse der Immobilisierungskontrolle mit Αβι-42-spezifischem Antikörper 6E10 (siehe Figur 1 , Immobilisierungskontrolle) auf den Aß _1-42 -Gehalt der Aß _1-42 -Monomer-beschichteten Reaktionswannen normiert. Anschließend wurden für jeden Klon die Werte der Signalstärke für Aß-i _-42 -Monomer- beschichtete Reaktionswannen auf 100% gesetzt. Die Differenz der Signalstärke für Αβι-42-Oligomer und -Fibrillen-beschichteten Reaktionswannen zu den Werten für Αβ-ι-42-Monomer-beschichtete Reaktionswannen ist in der nachfolgenden Tabelle 2 prozentual angegeben. Je höher der Wert ist, desto größer ist die Differenz und umso spezifischer ist die Bindung an Es werden verschiedene Klone nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert (Klon 5.60 - 6.135), gefolgt von weiteren getesteten, aber nicht ausgewählten Klonen (6.262 - 6.85). Klon 6.84 wurde zum Beispiel nicht für weitere Experimente gewählt, da zwar die Spezifität zu Aßi _-42 -Monomeren gegeben war, aber die Signalstärke extrem niedrig lag.

Tabelle 2: der Einzelphagenklone entsprechend Einzel- phagen-ELISA.

Mit dem erfindungsgemäßen Spiegelbildpliagendisplay sind mit Mosdl bis Mosd21 spezifisch A-Beta-Monomer bindenden Peptide ermittelt worden.

Tabelle 1 : Ausgewählte spezifisch bindende Peptidsequenzen, die mittels erfindungsgemäß kompetitiven Spiegelbild-Phagen-Display selektiert wurden. Klonnummer Name SEQ ID NO: Aminosäuresequenz

>5.60 Mosdl 1 YS YLTS YH MVWR

>5.80 Mosd2 2 HTWTTYDYVWRL

>5.57 Mosd3 3 GTMLKFSGMNLT

>5.81 Mosd4 4 H NWFYWTTEPYD

>6.216 Mosd5 5 HNWSWEWWYNPN

>6.249 Mosd6 6 STLHFYTAFLNK

>6.247 Mosd7 7 FSHSHHTWFTWN

>6.227 Mosd8 8 HFWSWTSLSMTR

>6.239 Mosd9 9 HLSWYWEKYLTS

>6.242 MosdIO 10 HTWTHWFSWNVP

>6.245 Mosdl 1 11 LSMNITTVHRWH

>6.141 Mosdl 2 12 VHWDFRQWWQQS

>6.113 Mosdl 3 13 YSFHFEMNMGNY

>6.197 Mosdl 4 14 EHWDFGQWWQQS

>6.255 Mosdl 5 15 GQWDFRQWWQPC

>6.139 Mosdl 6 16 DWSSRVYRDPQT >6.240 Mosd17 17 ERSQWGHRDPQS

>6.257 Mosd18 18 DRSKGDHRITQM

>6.190 Mosd19 19 DLRFSSLWKLSH

>6.167 Mosd20 20 VHWDFRQWWQPS

>6.135 Mosd21 21 FSWSMVMPWPTA

Die Nummer des jeweiligen Phagenklons, aus welchem die Sequenz isoliert wurde ist angegeben mit dem Namen der korrespondierenden Aminosäuresequenz des Peptids, welche im Ein-Buchstaben-Code ebenfalls dargestellt ist, sowie der entsprechenden SEQ ID NO:.

Zu Figur 1 : Für ELISA-Experimente wurden biotinylierte, D-enantiomere Aßi _-42 - Monomere sowie eine Mischung aus biotinylierten D-enantiomeren Aß-i-42- Oligomeren und -Fibrillen in einer jeweiligen Konzentration von 320 nM auf Strep- tavidin-beschichteten 96-well Mikrotiterplatten immobilisiert. Um eine korrekte Auswertung des folgenden Einzelphagen-ELISA-Experiments gewährleisten zu können, wurde die Effizienz der Immobilisierung mittels eines fa ^-spezifischen Antikörpers (6E10) getestet. Die Absorption bei 450 nm wurde gemessen und auf der Y-Achse aufgetragen. Es wurden auf allen verwendeten Platten (A, B, C) sowohl Aßi _-42 - Monomere als auch eine Mischung aus Αβι-42-Oligomeren und -Fibrillen immobilisiert, was aus den erhöhten Absorptionswerten im Vergleich zu den Werten der wells hervorgeht, in denen kein Aßi_4 ₂ immobilisiert worden ist. Aß _1-42 -Oligomere und -Fibrillen weisen eine höhere Immobilisierungseffiezienz auf als

Dies bedeutet zum einen, dass die Immobilisierung der verschiedenen Aßi_4 ₂ - Spezies erfolgreich war. Die Menge des immobilisierten Aßi-4 ₂ unterscheidet sich jedoch zwischen den Spezies, so dass für die weitere Auswertung des Experiments (Figur 2) eine Normalisierung der Werte für Aßi _-42 -Monomere und Aß _1-42 -Oligomere & -Fibrillen notwendig wird. Zu Figur 2: Amplifizierte Einzelphagenklone wurden auf ihre Bindungsaffinität für immobilisierte Aßi ^-Monomere, Aß _1-42 -Oligomere und -Fibrillen sowie die Streptavi- din-beschichtete Plastikoberfläche hin untersucht. Die Absorption bei 450 nm wurde gemessen. Von links nach rechts wurden die Klone der Reihenfolge entsprechend Tabelle 1 dargestellt (5.60 - 6.135), gefolgt von weiteren getesteten, aber nicht ausgewählten Klonen (6.262 - 6.85). Die Werte der Y-Achse geben die normalisierten Absorptionswerte der Einzelphagenklone gegen monomers Aßi_42 (schwarz), oligo- meres und fibrilläres Αβ-ι^ (dunkelgrau) und die Streptavidin-beschichtete Plastikoberfläche (hellgrau gestreift) an. Nach Abzug der Werte der Pufferkontrolle wurde, auf Grund der in Figur 1 aufgezeigten Unterschiede in der Immobilisierungseffizienz der unterschiedlichen Aßi _-42 -Spezies, die Absorption der wells die mit Aß _1-42 - Oligomeren und -Fibrillen immobilisiert worden sind, auf den Aß^-Gehalt der Aß 42-Monomer-beschichteten wells normalisiert.

Aus den Absorptionswerten wird ersichtlich, dass alle getesteten Phagen bevorzugt an monomeres Aß _-42 binden. Alle Phagen weisen höhere Werte für monomeres Aßi. ₄₂ auf als für Aßi _-42 -Oligomere und -Fibrillen sowie für die Aß _1-42 -freie Plastikoberfläche. Daraus ist zu schließen, dass mit dem Kompetitionsschritt im hier angewandten Verfahren sowohl eine höhere Spezifität für monomeres Aß _1-42 gegenüber Aßi _-42 - Oligomeren und -Fibrillen erreicht worden ist als auch mit Hilfe der wechselnden Substratoberflächen eine reduzierte Anreicherung von Plastik-, BSA- oder Streptavi- din-bindender Phagen erzielt werde konnte. Klon 5.60, welcher die Peptidsequenz von Mosd enthält, sticht dabei besonders heraus. Der Klon weist nicht nur die höchsten Absorptionswerte für monomeres Aßi _{- 2} aller getesteten Klone auf. Er zeichnet sich außerdem durch die größte Differenz der Absorptionswerte für mono- meres Aßi_4 ₂ zu oligomerem und fibrillärem Aßi-42 aus. Das ist gleichbedeutend mit einer sehr hohen Spezifität für monomeres Αβ-ι^.

Zu Figur 3: Die gemittelte relative Fluoreszenz aus sieben unabhängig durchgeführten ThT-Experimenten mit Standardabweichung ist gegeben. Der Farbstoff Thioflavin T (ThT) bindet an ß-Faltblattstrukturen im Ansatz und ändert daraufhin sein Fluores- zenzspektrum. Im Laufe der Aggregation von Aßi _-42 entstehen vermehrt ß-

Faltblattstrukturen, die somit durch einen Anstieg der ThT-Fluoreszenz direkt gemes- sen werden können. Die relative Fluoreszenz einer 10 μΜ Aßi _-4 2-Probe (schwarz) diente als Referenz. Der Zeitpunkt indem der logarithmische Anstieg des Fluoreszenzsignals in eine stationäre Phase übergeht, wurde auf 100 % gesetzt. Der Einsatz equimolarer Konzentrationen verschiedener Peptide beeinflusste die ThT- Fluoreszenz und damit Aggregation und Fibrillenbildung des ebenfalls im Ansatz enthaltenen Αβ-ι^ zu eben diesem Zeitpunkt. Dargestellt sind die relative Fluoreszenzeinheiten für die Coinkubation von Aßi _-4 2 mit Mosd 1 (hellgrau), Mosd2 (dunkelgrau), Mosd3 (grau, diagonal gestreift) und Mosd4 (grau, gepunktet) in equilmolaren Anteilen im Vergleich zu einem Ansatz der nur Aß _{1- 2} enthielt (schwarz). Während Mosd2 und 3 die ThT-Fluoreszenz am genannten Zeitpunkt erhöhen, ist davon auszugehen, dass diese Peptide die Bildung von ß-Faltblattstrukturen fördern. Dahingegen hat Mosd4 nur einen sehr geringen Einfluss auf die Entstehung von ß- Faltblattstrukturen. Mosdl ist in der Lage, die relative Fluoreszenz, die das Maß für die Anteil an ß-Faltblattstrukturen in der Probe ist, zu reduzieren. Da keines der ge- testeten Peptide in diesem Versuch Eigenfluoreszenz aufweist, ist davon auszugehen, dass die erhöhten Fluoreszenzwerte ausschließlich durch die Entstehung fib- rillären, und damit ß-Faltblattstrukturen enthaltenden, Aß zuzuschreiben ist. Daraus kann geschlossen werden, dass Mosdl den Anteil an fibrillärem Aß reduziert, womöglich durch die Stabilisierung von Aß-Monomeren oder die Bildung großer, ThT- negativer Aggregate. Die Peptide Mosd2 und Mosd3 scheinen die Fibrillierung von Aß hingegen zu beschleunigen. Das ist allerdings nicht zwangsläufig ein negativ zu bewertendes Ergebnis, da die Entstehung fibrillären Aß auch bedeutet, dass Oligo- mere, als notwendige Vorstufe aus dem Gleichgewicht entzogen werden.

Zu Figur 4: Der Einfluss verschiedener Mosd-Peptide auf eine breit gefächerte Mi- schung verschieden großer Aß _-42 -Spezies wurde mittels Dichtegradientenzentrifuga- tion, Fraktionierung des Gradienten nach Zentrifugation und Analyse der Fraktionen mittels Tris-Tricin-SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert.

80 μΜ Aß _{1- 2} wurde ohne Zugabe von Peptid für 4.5 Stunden bei 600 rpm und 25 °C inkubiert, um ein breites Spektrum unterschiedlicher Aßi ^-Spezies zu erhalten. Anschließend wurde der Ansatz entweder mit oder ohne Zugabe von Peptid für wei- tere 40 Minuten inkubiert und im Anschluss auf einen lodixanol-Dichtegradienten aufgetragen. Der Gradient wurde anschließend zentrifugiert wobei die Inhaltsstoffe der Probe (verschieden große Aßi ^-Spezies) entsprechend ihrer Größe und Form in den Gradienten diffundieren. Der Gradient wird nach der Zentrifugation in 15 Fraktio- nen fraktioniert (1-15) und die ersten 14 einzelnen Fraktionen auf ein Tris-Tricin- SDS-Gel aufgetragen. Die Trennung der Inhaltsstoffe pro Fraktion erfolgte elektro- phoretisch. Die Banden der denaturierten Proteine (Aßi _-42 bei 4.5 kDa, siehe Marker (M)) wurden mittels Silberfärbung sichtbar gemacht. Die Methode erlaubt keine quantitative Analyse, die Stärke des Signals korreliert jedoch mit der Konzentration der Proteine, so dass ein stärkeres Signal in der Regel auf eine höhere Proteinkonzentration hinweist.

Der Einfluss der Peptide Mosd1-4 in einer Konzentration von 40 μΜ wurde untersucht. Das Bild zeigt im obersten Abschnitt die Verteilung der Aßi _-42 -Spezies ohne Coinkubation mit Peptid. Ein breites Spektrum verschieden großer Aß _1-42 -Spezies befindet sich in der Probe. Die Peptide Mosd1/2 und 3 erhöhen die Anteile an hochmolekularen Aß _1-42 -Spezies (Fraktionen 10-14) und reduzieren vor allem die oligome- ren Aßi ^-Spezies (Fraktionen 4-7), die als toxisch gelten.

Zu Figur 5: Der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von Mosdl auf eine breit gefächerte Mischung verschieden großer wurde mittels Dichtegradi- entenzentrifugation, Fraktionierung des Gradienten nach Zentrifugation und Analyse der Fraktionen mittels Tris-Tricin-SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert.

80 μΜ Aß _-42 wurde ohne Zugabe von Peptid für 4.5 Stunden bei 600 rpm und 25 °C inkubiert, um ein breites Spektrum unterschiedlicher zu erhalten.

Anschließend wurde der Ansatz entweder ohne (A) oder mit Zugabe von unter- schiedlichen Konzentrationen Mosdl (B = 10 μΜ Mossdl ; C = 20 μΜ Mosdl ; D = 40 μΜ Mosdl ; E = 80 μΜ Mosdl) für weitere 40 Minuten inkubiert und im Anschluss auf einen lodixanol-Dichtegradienten aufgetragen. Der Gradient wurde anschließend zentrifugiert wobei die Inhaltsstoffe der Probe (verschieden große Aßi ^-Spezies) entsprechend ihrer Größe und Form in den Gradienten diffundieren. Der Gradient wird nach der Zentrifugation fraktioniert (1-15) und die einzelnen Fraktionen auf ein Tris-Tricin-SDS-Gel aufgetragen. Die Trennung der Inhaltsstoffe pro Fraktion erfolgte elektrophoretisch. Die Banden der denaturierten Proteine (Aß _1-42 bei 4.5 kDa, siehe Marker (M)) wurden mittels Silberfärbung sichtbar gemacht. Die Methode erlaubt keine quantitative Analyse, die Stärke des Signals korreliert jedoch mit der Konzent- ration der Proteine, so dass ein stärkeres Signal in der Regel auf eine höhere Proteinkonzentration hinweist.

Der Einfluss verschiedener Konzentrationen des Peptids Mosdl wurde untersucht. Das Bild zeigt im obersten Abschnitt (A) die Verteilung der Aßi _-4 2-Spezies ohne Coinkubation mit Peptid. Ein breites Spektrum verschieden großer

befindet sich in der Probe. Die Modulation der Aß _1-42 -Spezies durch Mosdl ist konzentrationsabhängig (B-E). Niedrige Konzentrationen (B & C) von Mosdl verändern die Zusammensetzung der Aßi _-42 -Spezies nur geringfügig, jedoch verringern sie den Anteil toxischer Oligomere (Fraktionen 4-7) im Vergleich zur unbehandelten Αβι^- Probe und erhöhen den Anteil hochmolekularer Aggregate. Höhere Konzentrationen von Mosdl (D & E) reduzieren den Anteil kleiner Aß _{1- 2} -Spezies und toxischer Oligomere deutlich und führen zu einer Modulation der Aß _1-42 -Spezies hin zu hochmolekularen Aggregaten.

Mosdl ist in der Lage, vorhandene toxische Aß-Oligomere aus dem Pool verschiedener Aß-Spezies zu entfernen und die Entstehung nicht toxischer, hochmolekularer Aggregate zu fördern. Dieser Prozess ist konzentrationsabhängig. Schon der Einsatz von 20 μΜ Mosdl verringert die Signalstärke der Oligomerbanden und verstärkt das Signal der Aß-Banden in den Fraktionen 11-14 im Vergleich zu unbehandeltem Aß. Höhere Konzentrationen verstärken diesen Effekt, sorgen jedoch auch für einen Abfall der Signalstärke in den Fraktionen 1-2, die mit monomerem Aß korrespondie- ren.

Zu Figur 6: Der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von Mosdl auf eine breit gefächerte Mischung verschieden großer Aß _1-42 -Spezies wurde mittels Dichtegradi- entenzentrifugation, Fraktionierung des Gradienten nach Zentrifugation und Analyse der Fraktionen mittels Tris-Tricin-SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert (Figur 5). Proben jeder Fraktion aus dem in Figur 5 gezeigten Experiment wurden mit mittels reversed-phase HPLC aufgetrennt und quantifiziert. Hierfür wurden die Proben in einer mobilen Phase (30% (v/v) Acetonitril, 0.1 % (v/v) TFA in ddH ₂ 0) über eine Zorbax 300SB-C8-Säule bei erhöhter Säulentemperatur (80 °C) denaturiert und aufgetrennt. Für jede Fraktion wurden Proben aus 3 unabhängig voneinander durch- geführten Experimenten gemittelt und die Standardabweichung errechnet. Die Ergebnisse korrespondieren mit den Ergebnissen der Gelbilder der Figur 5 und erlauben die quantitative Analyse der Daten. Fraktion 15 entspricht dem Pellet nach Dich- tegradienten-Zentrifugation und enthält ebenfalls geringe Mengen Aßi _-42 .

Die Daten der quantitativen Analyse der Proben mittels RP-HPLC bestätigen die qualitativen Aussagen aus Figur 5. Die Konzentrationen von Aß in den Fraktionen, die die toxischen Oligomere enthalten sinken bei steigender Konzentration von Mosdl . Ebenso steigt die Konzentration von hochmolekularen Aß-Spezies (Fraktionen 11-14) gleichzeitig an.

Zu Figur 7: Die vorangegangenen Experimente weisen darauf hin, dass Co- Inkubation von Αβι^ mit Mosd-Peptiden, im konkreten Fall Mosdl , zu einer Modulation der Aßi _-42 -Aggregation hin zu hochmolekularen Aggregaten führt. Zur weiteren Analyse wurde deshalb 10 μΜ Aß _{1- 2} mit und ohne 10 μΜ Mosdl für 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf ein Formvar/Kohlenstoff-Kupfergrid immobilisiert und mit Uranylacetat angefärbt. Die anschließende Analyse via TEM (120 kV) zeigte fibrilläre Strukturen (linkes Bild), wenn Aß _-42 ohne Mosdl inkubiert worden war. Die Co-Inkubation mit Mosdl führte zur Entstehung großer, hochmolekularer Aggregate, die sich deutlich von den fibrillären Strukturen unterschieden (rechtes Bild). Die Maßstabsbalken entsprechen 0.25 pm.

Zu Figur 8: Der Einfluss von Aßi _-42 auf die Lebensfähigkeit von PC-12-Zellen wurde getestet. Eine Mischung verschiedener Aß _1-42 -Spezies (Herstellung siehe Figur 4) wurde zu PC-12 Zellen gegeben. Zusätzlich wurden, wie in Figur 4 beschrieben, Ansätze von Aß^ mit verschiedenen Konzentrationen Mosdl co-inkubiert sowie ein Ansatz der nur Mosdl enthielt, getestet. Die Endkonzentrationen pro well betrugen 1 μΜ Aßi.4 ₂ beziehungsweise 1 oder 0.5 μΜ Mosdl Die Proben wurden ins Kultur- medium der Zellen gegeben und über 24 Stunden mit den Zellen bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen anhand eines MTT-Versuchs. Hierbei wird den Zellen ein Stoffwechsel-Ed ukt zugeführt, welches von metabolisch aktiven Zellen (lebendige Zellen) umgesetzt werden kann. Das Produkt dieser Umsetzung sind farbige Formazan-Kristalle, die aufgelöst werden können. Die Färbung des Mediums nach Solubilisierung entspricht der Umsetzungsrate des Edukts und damit der Lebensfähigkeit der Zellen. Unbehandelte Zellen (medium, weiß kariert) dienten als Lebendkontrolle und der Anteil vitaler Zellen wurde als 100% definiert. Die Werte der anderen Ansätze wurden auf diesen Wert normalisiert. Die Behandlung mit 0.1% TritonX-100 diente als Positivkontrolle für Zelltoxizität (hell- grau), die Menge lebensfähiger Zellen betrug in diesem Ansatz lediglich 1.5%. Die Mischung verschiedener Aßi _-42 -Spezies enthielt, wie vermutet, auch toxische Spezies, so dass sich durch Inkubation der Zellen mit der Aß _1-42 -Mischung die Zahl lebendiger Zellen auf 45% verringerte (schwarz). Mosdl hat keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von PC-12 Zellen. Co-Inkubation von Aß _1-42 und Mosdl jedoch ver- ringert die Toxizität von Aßi _-42 konzentrationsabhängig (grau (1 μΜ Mosdl) und dunkelgrau (0.5 μΜ Mosdl)). 86% beziehungsweise 66% der Zellen überleben, wenn die Aßi.4 ₂ -Mischung vor Zugabe zu den Zellen mit Mosdl co-inkubiert wird.

Dies zeigt, dass Mosdl in der Lage ist, toxische Aggregate in hochmolekulare, nichttoxische Aß _{- 2} -Spezies umzuwandeln oder die toxischen Aßi ^-Spezies aufzulösen. Zu Figur 9: Die murine Neuroblastom-Zelllinie Neuro-2a dient als Modell für neuronale Zellen und ist damit geeignet die Symptome von AD zu analysieren. Die stabile Transfektion von Neuro-2a-Zellen mit humanem APP695 erlaubt außerdem ein Modell, welches humanes APP (amyloid precursor protein) und all seine Prozessie- rungsprodukte, unter anderem das toxische Aßi-4 ₂ , in der Zelle selbst produziert. Auf diese Weise kann der Einfluss natürlich entstandener Aßi ^-Spezies direkt in neuronalen Zellen untersucht werden. Im Experiment wurden Neuro-2a-Zellen ohne APP parallel zu solchen mit der APP-Transfektion kultiviert. Die Produktion von APP und seinen Prozessierungsprodukten zeigt abgerundete und vereinzelte Zellen, die untereinander nur wenig Kontakte ausbilden (linkes Bild). Durch Inkubation mit 10 μΜ oder 100 μΜ Mosdl kann dieser pathologische Phänotyp jedoch umgekehrt werden und die Zellen entwickeln sich entsprechend des physiologischen Phänotyps, der wildtypischen Neuro-2a-Zellen entspricht. Das bedeutet, die Zellenzahl steigt und die Zellen akkumulieren, haben eine polygone Gestalt und bilden zahlreiche Zellkontakte und Ausläufer (mittleres und rechtes Bild).

Dies beweist, dass Mosdl nicht nur in der Lage ist, toxische Aßi _-42 -Spezies ab- oder umzubauen, sondern es kann auch die Bildung toxischer Spezies verhindern.

Die für Mosdl gezeigten Ergebnisse sind auch für die Peptide und Polymere der SEQ ID NO: 2-21 zu erwarten. Die in den Ausführungsbeispielen gezeigten Ergebnisse sind daher analog auch für die Peptide nach allen SEQ ID NO: 1-21 als auch generell für Peptide die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, das heißt dem modi- fizierten Spiegelbildphagendisplay erhalten werden.

Es sei an dieser Stelle darauf verwiesen, dass das angewendete Spiegelbildphagendisplay genauso in die andere Richtung, das heißt zur Identifikation von Liganden an A-Beta-Oligomere ausgeführt werden kann, indem als Köder A-Beta-Oligomere und als Kompetitoren A-Beta-Monomere und/oder A-Beta-Fibrillen eingesetzt werden. Außerdem ist das erfindungsgemäße Spiegelbildphagendisplay selbstverständlich auch auf andere Köder-Kompetitoren-Paare anwendbar.