SPEZIFISCHE IMMUNOPHILIN-LIGANDEN ALS ANTIASTHMATIKA, IMMUNSUPPRESSIVA

Die Erfindung betrifft neue spezifische Immunophihn-Liganden der Formel

Die Reste Ri, R ₂ , R3, R ₄ , X, Y, A, B und D haben folgende Bedeutung

R _T Wasserstoff, (Cι-Cι ₂ )-Alkyl oder (C ₂ -C ₆ )-Alkyloxygruppen, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt ist und durch ein mono- oder bicychsches Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Morphohn, Piperazin, Piperidin, Indol, Indazol, Phthalazine, Thiophen, Furan, Imidazol, ein- oder mehrfach durch einen PhenylÏ€ng substitutiert sein kann Dieser PhenylÏ€ng kann selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (Cι-C ₆ )-Alkyl, (C ₃ -C ₇ )-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (Cι-C ₆ )-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, Tnfluor- methylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen Ammo-gruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl Acetyl substituiert sind, substituiert sein

Ri kann außerdem der Aminrest von folgenden Aminosauremethylestern sein Histidin, Leucin, Valin, Serιn(Bzl), Threonm, Pipecolinsaure, 4- PipeÏ€dincarbonsaure, 3-Pιperιdιncarbonsaure, ε-NH ₂ -Lysιn, ε-Z-NH-Lysm, ε- (2CI-Z)-NH-Lysιn, 2-Pyrιdylalanιn, Phenylalanin, Tryptophan, Glutaminsäure, Argιnιn(Tos), Asparagin, Citruliin, Hcmocitrullin, Ornithin, Prohn, 2-

Indohncarbonsaure, Octahydπndohncarbonsaure,

Tetrahydroisochmohncarbonsaure, 5-Amιnovaleπansaure, 8-Amιnoctansaure

R ₂ Wasserstoff, (d-C^-Alkyl oder (C ₂ -C ₆ )-Alkyloxygruppen, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt ist und durch ein mono- oder bicyclisches Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie MorphohÏ€, Piperazin, Pipendin, Indol, Indazol, Phthalazine, Thiophen, Furan, Imidazol, ein- oder mehrfach durch einen PhenylÏ€ng substitutiert sein kann Dieser PhenylÏ€ng kann selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (Cι-C ₆ )-Alkyl, (C ₃ -C ₇ )-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C^CeJ-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, TÏ€fluor- methylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen Amino-gruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl Acetyl substituiert sind, substituiert sein

R ₃ Wasserstoff, Butyloxycarbonyl, CarboxybeÏ€zyl, mono- bi- oder tÏ€cyclisches Carbonyl-Aryl oder Carbonyl-Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wobei Aryl bzw Heteroaryl selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (Cι-C ₆ )-Alkyl, (C ₃ -C ₇ )-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (Ci-CβJ-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoyl¬ gruppen, TÏ€fluormethylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen, Äminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann Ferner kann R ₃ sein Carboxy-(Cι-C ₆ )-alkyl, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt sein kann und durch ein mono- oder bicyclisches Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Morpholin, Piperazin, Pipendin, Indol, Indazol, Phthalazine, Thiophen, Furan, Imidazol, bzw ein- oder mehrfach durch einen PhenylÏ€ng substitutiert sein kann, wobei dieser PhenylÏ€ng selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (Cι-C ₆ )-Alkyl, (C ₃ -C ₇ )- Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (Ci- C ₆ )-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen,

TÏ€fluormethylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen,

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Benzyloxygruppen, Äminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann

R ₃ kann ferner der Saurerest folgender Aminosäuren sein: Histidin, Leucin, Valin, SeÏ€n(Bzl), Threonin, Pipecolinsäure, 4-PipeÏ€dιncarbonsaure, 3- Piperidincarbonsäure, ε-NH ₂ -Lysιn, ε-Z-NH-Lysm, ε-(2Cl-Z)-NH-Lysιn, 2- Pyridylalanin, Phenylalanin, Tryptophan, Glutaminsäure, Argιnιn(Tos), Asparagin, Citrullm, Homocitrulhn, Ornithin, Prolin, 2-lndolιncarbonsäure, Octahydrindolincarbonsäure, Tetrahydroisochinolin-carbonsäure, 5-

Aminovaleπansäure, 8-Amιnoctansäure, wobei der N-Termmus der Aminosäuren durch Butyloxycarbonyl, Carboxybenzyl oder durch den Säurerest von mono- bi- oder tπcychschen Aryl- oder Heteroarylcarbonsauren mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Methoxyphenylessigsäure, Naphthylessigsäure, Pyπdylessigsäure, Chinazolmonylessigsäure,

Indazolylessigsäure, Indolylgloyxylsäure, Phenylglyoxylsäure,

Isobutylglyoxylsäure, 2-Amιnothιazol-4-glyoxylsäure bzw. durch Carboxy-(Cι- Cι ₂ )-alkyl, Carboxycyclopentan, Carboxycyclohexan, Benzoyl, das ein oder mehrfach substituiert sein kann durch Halogen, Methoxygruppen, Äminogruppen, Carbamoylgruppen, Trifluormethylgruppen, Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (Ci-CβJ-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, substituiert sein kann

R< H, F, OR ₅

R ₅ =Wasserstoff, (C ₃ -C ₇ )-Cycloalkyl, (Cι-C ₆ )-Alkyl oder Carboxy-(Cι-C ₆ )-Alkyl, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt sein kann und durch einen mono- bi- oder tÏ€cyclisches Carbonyl-Aryl oder Carbonyl-Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wobei Aryl bzw. Heteroaryl selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (Cι-C ₆ )-Alkyl, (C ₃ -C ₇ )-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (CrC ₆ )-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, Trifluormethylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen, Äminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl, Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann

A = aromatisch, nicht aromatisch, aromatisch heterocyclisch mit 1-2 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, nicht aromatisch heterocyclisch mit 1-2 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O,

B = CH ₂

D = CH

B-D = CH=C

X = O, S, H ₂

Y = C, Einfachbindung.

Weiterhin betrifft die Erfindung die physiologisch verträglichen Salze der Verbindungen gemäß Formel I, die Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Formel I und ihre pharmazeutische Verwendung

Cyclosporin A (CsA) oder FK 506 sind immunsuppressive, von Pilzen stammende Naturstoffe, die den Ca ⁺² -abhängιgen Signalübertragungsweg in einigen Zelltypen inhibieren. In T-Zellen inhibieren beide Agentien die Transkription einer Reihe von Genen, einschließlich des Gens für IL-2, das durch Stimulierung der T-Zell- Rezeptoren (TCR) aktiviert wird FK 506 und CsA binden beide mit hoher Affinitat an lösliche Rezeptorproteine (G Fischer et al., NatÏ…re 337, 476-478, 1989, M W. Harding et al., NatÏ…re 341, 755-760, 1989). Der FK 506-Rezeptor wurde FKBP, der CsA-Rezeptor Cyclophilm (Cyp) genannt Beide Proteine katalysieren die IsomeÏ€sierung von eis- und trans-AmidbiÏ€dungsrotameren von Peptiden und werden auch häufig als Immunophilme bezeichnet.

Das Übermolekül aus CsA-Cyp bzw FK 506-FKBP bindet Calcineuπn (CN) und inhibiert dessen Phosphataseaktivitat Als zellulares Zielmolekul von CN wurde die cytosolische, phosphorylierte Komponente des Transkriptionsfaktors NF-AT erkannt, das bei fehlender CN-Aktivitat für die Wirkung im Zellkern nicht dephosphoryliert und somit der aktive Transkriptionskomplex am IL-2-Promoter nicht angeschaltet werden kann (M K Rosen, S. L. Schreiber, Angew. Chem. 104 (7992), 413-430; G Fischer, Angew. Chem. 106 {1994), 1479-1501;

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Den allergischen, asthmatischen Erkrankungen hegt eine entzündliche Reaktion zugrunde, die von T-Zellen und ihren Mediatoren gesteuert wird Corticosteroide stellen immer noch das Mittel der Wahl in der Behandlung vieler allergischer Erkrankungen dar Auch CsA und FK 506 erwies sich sowohl im Tierexperiment als auch in klinischen Studien beim bronchiale Asthma und zugrunde liegende Entzündungen als gunstiges Therapeutikum Im Tierexperiment konnte die Blockade von verschiedenen Cytokinen wie IL-2, IL-4 und IL-5, die allergisch induzierte Entzündungen hervorrufen, gezeigt werden

Trotz der Vielzahl von Ansätzen zur Identifikation neuer aktiver Immunophitm- Inhibitoren konnten bisher keine wirksameren Strukturen als CsA, FK 506, Rapamycm bzw Derivate von diesen Naturstoffen hergestellt bzw isoliert werden Das hohe inhibitoπsche Potential von CsA, FK 506, Rapamycm wird jedoch ganz erheblich durch die mannigfaltigen Nebenwirkungen, insbesondere der Nieren und Neurotoxizitat, reduziert (N H Sigal et al , J Exp Med 173, 619-628, 1991) Hintergrund dieser Tatsache ist die Unspezifitat der Wechselwirkung zwischen Immunophihn-Liganden und den zel (spezifischen Bindungsproteinen Dadurch ist die bekannte medizinisch-therapeutische Wirkung dieser Immunsuppressiva erheblich eingeschränkt Ferner erweist sich die fehlende Selektivität der Verbindungen gerade in der Langzeittherapie als problematisch

Der Erfindung hegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit wertvollen pharmakologischen Eigenschaften zu finden und durch gezielte Synthese bereitzustellen

Eine völlig neuartige Substanzklasse, die Immunophihne überraschenderweise spezifisch bindet und die IL-2-Prolιferatιon überraschenderweise inhibiert, wird durch die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I dargestellt Diese Klasse von Verbindungen und deren pharmazeutisch akzeptablen Salze weist eine hohe Affinität zu Immunophilinen wie CypA, CypB, CypC und FKBP12 auf

Diejenigen Verbindungen der Formel I, die asymmetrische Kohlenstoff atome enthalten und deshalb in der Regel als Racemate anfallen, können in an sich bekannter Weise beispielsweise mit einer optisch aktiven Saure in die optisch aktiven Isomeren getrennt werden Es besteht aber auch die Möglichkeit, von vornherein optisch aktive Ausgangsubstanzen einzusetzen, wobei dann als Endprodukt entsprechende optisch aktive bzw diastereoisomere Verbindungen erhalten werden

Die Erfindung umfaßt also von Verbindungen der Formel I, die ein asymmetrisches Kohlenstoffatom enthalten, die R-Form, die S-Form und R, S-Mischungen, sowie im Falle mehrerer asymmetrischer Kohlenstoffatome die diastereoisomeren Formen

In Abhängigkeit der Verfahrensbedingungen und Ausgangsstoffe können die Verbindungen der Formel I als freie Verbindungen oder in Form ihrer Salze erhalten werden Die erhaltenen Salze können in an sich bekannter Weise beispielsweise mit Sauren, Alkali oder Ionenaustauschern in die freien Basen bzw Sauren überfuhrt werden

Die so freigesetzten Verbindungen der Formel I lassen sich mit anorganischen oder organischen Sauren bzw Basen in die entsprechenden physiologisch vertraglichen Saureadditionssalze überfuhren

Sowohl die freien Basen als auch ihre Salze sind biologisch aktiv Die Verbindungen der Formel I können in freier Form oder als Salz mit einer physiologisch vertraglichen Saure bzw Base verabreicht werden Die Applikation kann peroral, parenteral, intravenös, transdermal oder inhalativ erfolgen

Weiter betrifft die Erfindung pharmazeutische Zubereitungen mit einem Gehalt an wenigstens einer Verbindung der Formel I oder deren Salze mit physiologisch vertraglichen anorganischen oder organischen Sauren bzw Basen und gegebenenfalls pharmazeutisch verwendbare Trager- und Hilfsstoffe

Als Apphkationsformen eignen sich beispielsweise Tabletten oder Dragees, Kapseln,

Losungen bzw Ampullen, Suppositoπen, Pflaster oder in Inhalatoren einsetzbare

Pulverzubereitungen

Die Dosierung der vorgenannten pharmazeutischen Zubereitungen hangt vom Zustand des Patienten und von der Apphkationsform ab Die tägliche Wirkstoffdosis betragt zwischen 001-100 mg pro kg Korpergewicht und Tag

Die Herstellung der unter Formel I dargestellten Verbindungen gelingt beispielsweise nach der Festphasensynthese nach B Merπfield, vorzugsweise an einem unlöslichen Polymeren wie zum Beispiel in organischen Losungsmittel quellbares Polystyrolharz in Perlenform (beispielsweise ein Copolymeπsat aus Polystyrol und 1% Divinylbenzol), nach Standardpeptidkupplungsmethoden der Peptid-Festphasensynthese

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I stellt man so dar, daß man zunächst zwei der Funktionalitäten (α-Amino-, evtl ε-Amino- und α-Carbonsauregruppe) mit Schutzgruppen versieht und dann die freie dritte Funktionalität in geeigneter Weise umsetzt Gegebenenfalls kann man auch, wo dies zu besseren Ergebnissen fuhrt, im ersten Schritt intermediäre Schutzgruppen einfuhren, die man nach dem zweiten Schritt gegen die gewünschte Funktionalität austauscht Geeignete Schutzgruppen und Verfahren zum Anbringen derselben sind im Fachgebiet bekannt Beispiele für Schutzgruppen sind in "Pπnciples of Peptide Synthesis", Springer Verlag 1984), im Lehrbuch "Solid Phase Peptide Synthesis" J M Stewart and J D Young, Pierce Chem Company, Rockford, IM, 1984, und in G Barany and R B Merπfield "The Peptides", Ch 1 , S 1-285, 1979, Academic Press Ine beschrieben

Der stufenweise Aufbau erfolgt zum Beispiel, indem man zunächst die Carboxy- terminale Aminosäure, deren α-standige Aminogruppe geschützt ist, an einen hierfür üblichen unlöslichen Trager kovalent bindet, die α-Amino-Schutzgruppe dieser Aminosäure abspaltet, an die so erhaltene freie Aminogruppe die nächste geschützte Aminosäure über ihre Carboxy-Gruppe bindet, und in dieser Weise Schritt für Schritt die übrigen Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptids in der richtigen Reihenfolge verknüpft, und gegebenenfalls weitere vorhandene Seitenfunktions-Schutzgruppen abspaltet und nach Verknüpfung aller Aminosäuren

den fertigen Liganden als immoblisierte Verbindung auf Cyp bzw. FKBP-Bindung hin untersucht. Die stufenweise Kondensation erfolgt durch Synthese aus den entsprechenden, in üblicher Weise geschützten Aminosäuren in herkömmlicher Weise. Ebenfalls ist die Verwendung automatischer Peptid-Synthesizer, zum Beispiel Typ Labortec SP 650 von Fa. Bachem, Schweiz, möglich unter Verwendung der im Handel erhältlichen geschützten Aminosäuren.

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Als Beispiel für Verbindungen der Formel I seien genannt:

Beispiel 1 N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-[S-(N-ε- Boc)-Lysin-methylester]-amid

Beispiel 2 N-[Piperidyl-4-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-[S-(ε-NH ₂ )- Lysinmethyl-ester]-amid

Beispiel 3 N-[1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-[S-(N- ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid

Beispiel 4 N-[lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsaure-[S-(ε-NH ₂ )- Lysin-methylesterJ-amid

Beispiel 5 N-[1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsaure-(S-(N- ε-Z)-Lysιnmethylester)-amid

Beispiel 6 1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-(S-(N-ε-Z)-Lysιnmethylester)-amιd

Beispiel 7 1-Boc-lndohn-2-(R, S)-carbonsäure-(S-Phenylalaninmethylester)-amid

Beispiel 8 N-[N ^' -(4-Methoxyphenylacetyl)-Pιpeπdyl-4-carbonyl]-lndoli n-2-(R, S)- carbonsäuremethylester (als Vorstufe zur Herstellung eines Amides der allgemeinen Formel I)

Beispiel 9 N-(4-Methoxyphenylacetyl)-lndolιn-2-(R, S)-carbonsäuremethylester (als Vorstufe zur Herstellung eines Amides der allgemeinen Formel I)

Beispiel 10 N-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-4-Piperidyl-amid

Beispiel 11 N-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonsaure-[Piperazino-essigsäure-morpholid)- amid

i-

Beispiel 12 N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-[Piperazino- essigsäuremorpholid]-amid

Beispiel 13 N-[N ^' -(4-Methoxyphenylacetyl)-Piperidyl-4-carbonyl]-lndolin -2-(R, S)- carbonsäure-[S-(N-ε-Z)-Lysin-methylester]-amid

Entsprechend der vorliegenden Erfindung können die Verbindungen der Formel auch nach folgendem Verfahren hergestellt werden.

V II MI IV

VI VII VIII

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Erfindungsgemaß werden Verbindungen der Formel I, in der R^ R ₂ , R ₃ , R ₄ , A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, hergestellt, indem man ein IndoldeÏ€vat der Formel II, worin R ₄ , A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, mit einem Alkanol MI der Kettenlange C ₁ -C ₁₂ zu einem IndoldeÏ€vatalkylester IV, worin R ₄ , A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, umsetzt, diesen Ester IV in einer weiterfuhrenden Reaktion mit einer Verbindung V, worin R ₃ , X und Y die genannte Bedeutung haben, zu einer Verbindung VI, worin R ₃ , R ₄ , A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, umsetzt, anschließend diese Verbindung VI einer Verseifung zu einer Verbindung VII, worin R ₃ , R4, A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, unterzieht und danach die Verbindung VII mit einer Verbindung VIII, worin R^ und R ₂ die genannte Bedeutung haben, zu der Zielverbindung I umsetzt

Zur Herstellung der physiologisch vertraglichen Salze werden die Verbindungen der Formel I mit anorganischen oder organischen Sauren, wie z B Chlorwasserstoffsaure, Bromwasserstoff saure, Phosphorsaure, Schwefelsaure, Essigsaure, Weinsaure, Zitronensaure, Fumarsaure, Maleinsäure, Milchsäure oder Embonsaure, oder mit anorganisch oder anorganischen Basen in bekannter Weise umgesetzt

Pharmazeutische Zubereitungen enthalten mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder deren Salze mit physiologisch vertraglichen anorganischen oder organischen Sauren oder Basen und gegebenenfalls pharmazeutisch verwendbare Trager- und Hilfsstoffe

Die Verbindung der Formel I können in freier Form oder als Salz mit einer physiologisch vertraglichen Saure oder Base peroral, parenteral, intravenös, transdermal oder inhalativ appliziert werden

Als Apphkationsformen sind beispielsweise Tabletten oder Dragees, Kapseln, Losungen bzw Ampullen, Suppositoπen, Pflaster oder in Inhalatoren einsetzbare Pulverzubereitungen geeignet

Die Dosierung dieser vorgenannten pharmazeutischen Zubereitungen hangt ab vom Zustand des Patienten und von der Apphkationsform Die tägliche Wirkstoffdosis betragt zwischen 0 01-100 mg pro kg Korpergewicht

Die erfindungsgemaßen Verbindungen gemäß Formel (I) zeichnen sich durch Immunophihn-Bindung aus und hemmen deren Isomeraseaktivitat Diese Prolyl- Isomerase-Aktivitat wird nach einem weltweit üblichen Enzym-Test geprüft G Fischer, H Bang, A Schellenberger, Biochim. Biophys Acta, 791, 87-97, 1984, D H Rieh et al , J Med Chem 38, 4164-4170, 1995)

Ohne daß in jedem Fall die Peptidyl-cis-trans-lsomerase-Aktivitat der Immunophihne beeinflußt wird, inhibieren solche Verbindungen überraschenderweise spezifisch die IL-2-Prolιferatιon aus Mastzellen, Makrophagen und aktivierten T-Zellen Die erfindungsgemaßen Verbindungen lassen sich wie Cyclospoπn A (Sandimmun*, CsA), FK 506 bzw Rapamycm (Tacrohmus) als Immunsuppressiva (R Y Calne et al , Br Med J 282, 934-936, 1981), zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen (R H Wiener et al , Hepatology 7, 1025, Abst 9, 1987, L Fry, J Autoimmun 5, 231-240, 1992, G J Feutren J Autoimmun 5, 183-195, 1992, EP 610,743), allergischer Entzündungen (P Zabel et al , Lancet 343, 1984), Asthma (C Bachert, Atemw - Lungenkrkh 20, 59, 1994), Insulin abhangiger Diabetes Mellitus (C R Stiller, Science, 223, 1362-1367, 1984), Sepsis und auch in Kombination mit bekannten Immunophihn-Liganden wie CsA, FK 506 oder Rapamycm einsetzen (M J Wyvratt, N H Sigal, Perspectives in Drug Discovery and Design, Immunosuppression, 2, 1 , 1994, WO 92/21313, US 5 330 993)

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Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Die verwendeten Abkürzungen hierzu sind:

AcOEt Essigester

Boc tert. Butyloxycarbonyl

(Boc) ₂ O tert. Butyloxycarbonyl-Anhydrid

CN Calcineurin

CsA Cyclosporin A

Cyp Cyclophilin

DMAP N, N-Dimethylaminopyridin

EA Elementaranalyse

EE Essigester

FKBP FK 506-Bindungsprotein

HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie i. ÖPV im Ölpumpenvakuum

Lsg. Lösung

MeOH Methanol

PPIase Peptidyl-Prolin-cis-trans-lsomerase i. RV. im Rotationsverdampfer i. V. im Vakuum

RT Raumtemperatur rac recemisch ent enantio

TFA Trifluoressigsäure

Z Benzyloxycarbonyl

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Beispiel 1

Synthese von N-[1-Boc-Pιperιdyl-4-carbonyl]-lndolιn-2-(R, S)-carbonsaure-[S-(N-ε- Boc)-Lysιn-methylester]-amιd

Stufe 1 (R, S)-lndolιn-2-carbonsauremethylester x HCl

In einem 100 ml Dreihalskolben wurden 5.3 g (32 5 mmol) (R, S)-2- Indohncarbonsaure in 70 ml wasserfreiem Methanol gelost und bei Zimmertemperatur mit 4 25 g (35 75 mmol) Thionylchloπd versetzt Das gelbe Reaktionsgemisch wurde 5h unter Ruckfluß erhitzt und nach dem Abkühlen i V i RV vom Losungsmittel befreit Nach dem Trocknen i OPV erhielt man das Rohprodukt als kristallinen Feststoff, der mit Diethylether verrührt und abgesaugt wurde

Ausbeute 5 4 g (78 %)

Stufe 2 Boc-Pιpeπdιn-4-carbonsaure

In einem 250 mi Einhalskolben wurden 7 g (54 mmol) Pιperιdιn-4- carbonsaure in 50 ml Dioxan und 40,5 ml 2 N NaOH gelöst und auf 0° C gekühlt Dazu wurden innerhalb von 30 min 12,99 g (59 4 mmol) (Boc), O gelost in 30 ml Dioxan zugetropft Anschließend wurde für 24 h bei Raumtemp gerührt Es fiel ein weißer Niederschlag aus Das Dioxan wurde i V i RV entfernt und der Ruckstand mit gesättigter KHSO ₄ -Lsg aufgenommen Die wässrige Phase wurde zweimal mit EE extrahiert Die organische Phase wurde einmal mit gesättigter NaCI-Lsg gewaschen und über MgSO ₄ getrocknet Nach Entfernen des Losungsmittels i V i RV wurden 11 ,93 g (96 %) eines weißen Pulvers erhalten

¹ H-NMR (DMSO-d ⁶ , 270 MHz): 1 ,25- 1 ,5 (m, 11 , Boc, 2-Pιp), 1 ,8 (m, 2 Pip), 2,4 (m, 1 , H-C4), 2,8 (t, 2, H-C3, H-C5), 3,8 (d, 2, H-C2 H-C6), 12,25 (s, 1. COOH)

EA: berechnet für C _Ï€ H, ₉ N, O ₄ (229,1 ) C 57,62, H 8,29, N 6,11 gefunden C 57,89, H 8,36, N 5,86

Stufe 3 N-[1-Boc-Pιperιdyl-4-carbonyl]-lndohn-2-(R, S)-carbonsauremethyl- ester

4,6 g (22 mmol) (R,S)-lndohn-2-carbonsauremethylester x HCl und 7 4 g (32 mmol) Boc-Pιperιdιn-4-carbonsaure wurden in 50 ml CH _: Cl , gelost und innerhalb von 30 min bei Raumtemp zu einer Suspension von 9 27 g (36 mmol) 2-Chloro-l-methylpyÏ€dιnιumjodιd und 8 06 ml (58 mmol) TÏ€ethylamin in 40 ml CH, Cl, zugetropft Anschließend wurde 8 h unter Ruckfluß gekocht Das Losungsmittel wurde i V i RV entfernt, der Ruckstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit wassÏ€ger halb gesättigter KHSO ₄ -Lsg , zweimal mit wassÏ€ger 2 N NaOH-Lsg und einmal mit wassnger gesättigter NaCI- Lsg gewaschen Das Losungsmittel wurde i V i RV entfernt und der Ruckstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH, Cl, /MeOH 95 5 gereinigt Nach Entfernen des Losungsmittels i V i RV wurde nach dem Trocknen i OPV 4,61 g (54 %) eines hellbraunen Pulvers erhalten

Schmp.: 54-56° DC: CH, CI , /MeOH 95 5 R , = 0,61

¹ H-NMR (DMSO-d , 270 MHz): 1 ,35-1 ,85 (m, 15, Boc, 6 Pip), 2,7-2,8 (m,

2, H-C3, H-C5), 3,25 (m, 1 , H-C3-Ind), 3,65 (m, 1 , H-C3 ^' -Ind), 3,8 (s, 3,

COOCH , ), 3,95 (m, 2. H-C6-Pιp), 5,45 (d, 1 , H-C2-Ind), 7,05 (m, 1 , Ar),

7,1-7,3 (m, 2, Ar), 8,1 (d, 1 , Ar)

EA: berechnet für (388,47) C 64,92, H 7,27, N 7,21 gefunden C 65,20, H 7,49, N 7,38

MS: (ESI+) berechnet 388,3, gefunden 389,2

Stufe 4: N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure

In einem 50 ml Einhalskolben wurden 3,3 g (8,51 mmol) N-[1 -Boc- Piperidyl-4-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäuremethylester in 25 ml MeOH gelöst, mit 2.14 g (51 mmol) LiOH x H, 0 versetzt und 2,5 h bei Raumtemp. gerührt. Die Lösung wurde mit halb gesättigter wässriger KHSO ₄ -Lsg. auf pH = 5 angesäuert und zweimal mit EE extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit gesättigter NaCI-Lsg. gewaschen, über MgSO ₄ getrocknet und das Lösungsmittel i.V.i.RV. entfernt. Nach Trocknen i.ÖPV. wurden 3,09 g (97 %) eines hellbraunen Pulvers erhalten.

Schmp.: 118-119°

DC: CH, Cl, /MeOH 95:5 R, = 0,14

¹ H-NMR (DMSO-d" , 270 MHz): 1 ,35-1 ,85 (m, 15, Boc, 6 Pip); 2,7-2,85 (m, 2, H-C3, H-C5); 3,2 (m, 1 , H-C3-Ind); 3,65 (m, 1 , H-C3 ^' -Ind); 3,95 (m, 2, H-C6-Pip); 5,45 (d, 1 , H-C2-Ind); 7,05 (m, 1 , Ar); 7,1-7,3 (m, 2, Ar); 8,1 (d, 1 , Ar); 13,0-13,3 (s, 1 , COOH). MS: (ESI+): berechnet 374,3; gefunden: 375,1

Stufe 5: N-[1-Boc-PiperidyM-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-[S-(N-ε- Boc)-Lysin-methylester]-amid

2 g (5,35 mmol) N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbon- säure und 1.59 g (5,35 mmol) N-t-Boc-Lysinmethylester x HCl wurden in 20 ml CH, Cl, gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 2.81 g (11 mmol, 2,73 g) 2-Chloro-1-methylpyridinium-

- \ Co ~

jodid und 1.62 g (16 mmol) Triethylamin in 30 ml CH, Cl ₂ zugetropft. Anschließend wurde 8 h unter Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter wässriger KHSO ₄ -Lösung, zweimal mit wässriger 2 N NaOH-Lösung und einmal mit gesättigter wässriger NaCI-Lösung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH, Cl ₂ /MeOH 95:5 gereinigt. Nach erneutem Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 2,61 g (79 %) eines hellbraunen Pulvers erhalten.

Schmp.: 83-84°

DC: CH, Cl, /MeOH 95:5 R _f = 0,48

FT-IR (KBr): 3365w (N-H); 2976w (C-H); 1744m (C=O); 1684s (CONH);

1540w (C-O); 1407m (C-H); 1170s (C-O); 755m (C=C);

' H-NMR (DMSO-d ⁶ , 270 MHz): 1,25-1 ,9 (m, 28, 18 Boc + 3 CH ₂ -Lys + 4

Pip); 2,7-3,05 (m, 5, e-CH, -Lys + H-C3-Ind + 2 Pip); 3,55-3,7 (m, 3,

COOMe); 3,9-4,1 (m, 2, Pip); 4,15-4,3 (m, 1 , H-C3-Ind); 5,15 (m ,1 , H-C2-

Ind); 6,8 (m, 1 , Ar-Ind); 7,0 (m, 1 , Ar-Ind); 7,1-7,3 (m, 2, Ar-Ind + α-

NHCO); 8,1 (d, 1 , Ar-Ind); 8,7-8,9 (dd, 1 , NHCO-Boc).

MS: (ESI+): berechnet 616,4 gefunden: 617,5

HPLC: 2 Peaks bei 24,25 und 24,63 min

EA: (berechnet für C ₃ , H _41i N ₄ O _κ : 616,4): C 62,34; H 7,47; N 9,09 gefunden: C 62,08; H 7,67; N 8,86

Beispiel 2:

Synthese von: N-[1-Piperidyl-4-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-[S-(ε-NH ₂ )- Lysinmethyl-ester]-amid

500 mg (0,812 mmol) N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbon-säure-[S-(N-ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid wurden in einem 25 ml Einhals-kolben in 2,8 ml CH, Cl ₂ gelöst. Dazu wurden 15 äq (0,0122 mol, 0,93 ml) Trifluoressigsäure gegeben und zwei Stunden bei Raumtemp. gerührt. Zu der Lösung wurden 10 ml Diethylether gegeben, es fiel ein weißer Niederschlag aus, der abgesaugt und 6 mal mit Diethylether gewaschen wurde. Nach Trocknen i.ÖPV. wurden 513 mg (98 %) eines weißen Pulvers erhalten.

Schmp.: 164-165°

DC (RP): CH ₃ CN/H, O 1 :1 , 1 % TFA R , = 0,61 FT-IR (KBr): 3435W (N-H); 3049w (C-H); 1740w (C=O); 1676s (CONH); 1420m (C-H); 1205m, 1135s (C-O);

¹ H-NMR (DMSO-d , 270 MHz): 1 ,2-2,05 (m, 10, 3 CH, -Lys + 4 Pip); 2,7-3,15 (m, 5, f-CH , -Lys + H-C3-Ind + 2 Pip); 3,55-3,7 (m, 3, COOMe); 4,1-4,25 (m, 1 , C3-Ind); 5,15 (d ,1 , H-C2-Ind); 6,95 (m, 1 , Ar-Ind); 7,1-7,3 (m, 2, Ar-Ind); 7,7-7,85 (s, 3, NH ₃ ^* ); 8,1 (d, 1 , Ar- Ind); 8,7-8,9 (m, 2, NH, ' ).

MS: (ESI+): berechnet 418,2 gefunden: 417,3 und 209,1 für m/2 HPLC: 2 Peaks bei 11 ,54 und 12,65 min

-\ % ~

Beispiel 3:

Synthese von: N-[1-Boc-indolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)- carbonsäure- [S-(N-ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid

Stufe 1 : Boc-(R, S)-lndolin-2-carbonsäure

In einem 250 ml Einhalskolben wurden 5 g (30.8 mmol) (R,S)-lndolin-2- carbonsäure in 30 ml Dioxan und 23 ml 2 N NaOH gelöst und auf 0° C gekühlt. Dazu tropfte man innerhalb von 30 min eine Lösung aus 7.39 g (33.9 mol) (Boc), O in 20 ml Dioxan und rührte 24 h bei Raumtemperatur. Es fiel ein weißer Niederschlag aus. Das Dioxan wurde am i. V. i. RV. entfernt, der Rückstand mit gesättigter KHSO ₄ -Lsg. aufgenommen und zweimal mit EE extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit gesättigter NaCI-Lsg. gewaschen und über MgSO ₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 7,76 g (96 %) eines braunen Pulvers erhalten.

DC: CH, Cl, /MeOH 95:5 + 1 % NEt, R , = 0,91

¹ H-NMR (DMSO-d" , 270 MHz): 1 ,4-1 ,7 (s, 9, Boc); 3,1 (m, 1 , H-C3); 3,5 (m, 1 , H-C3 ^' ); 4,9 (m, 1 , H-C2); 7,0 (m, 1 , Ar); 7,1-7,3 (m, 2, Ar); 7,5-7,9 (m, 1 , Ar) 11 ,5 (m, 1 , COOH)

EA: berechnet für C ₁₄ H ₁₇ N, O ₄ (263,2) C 63,88; H 6,46; N 5,32 gefunden: C 64,05; H 6,53; N 5,41

Stufe 2: N-[1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2- (R, S)-carbonsäure- methylester

5 g (0,023 mol) (R,S)-lndolin-2-carbonsäuremethylester x HCl und 12.11 g (46 mmol) Boc-lndolin-2(R,S)-carbonsäure wurden in 40 ml CH, Cl ₂ gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 12.92 g (51 mmol) 2-Chloro-1-methylpyridiniumjodid und 10.23 ml (74

mmol) Triethylamin in 40 ml CH, Cl, zugetropft. Anschließend wurde 8 h unter Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter wässriger KHSO ₄ -Lösung, zweimal mit wässriger 2 N NaOH-Lösung und einmal mit wässriger gesättigter NaCI-Lösung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH, CI, /MeOH 95:5 gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 5,01 g (51 %) eines dunkelbraunen Pulvers erhalten.

Schmp.: 86° C

DC: CH, Cl, /MeOH 95:5 R , = 0,67 und 0,7

FT-IR (KBr): 3448w (N-H); 2976w (C-H); 1751s, 1707s (C=O); 1680s

(CONH); 1485s (C-H); 1168m (C-O); 1020m (C-O); 752s (C=C);

MS: (ESI+) berechnet: 422,4 gefunden: 423,3

EA (berechnet für C, ₄ H _:t) N, O _< (422,4): C 68,25; H 6,16; N 6,64 gefunden: C 67,96; H 6, 17; N 6,4

Stufe 3: N-[1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure

In einem 50 ml Einhalskolben wurden 2,84 g (6,77 mmol) N-[1-Boc- lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäuremethylester in 20 ml MeOH gelöst. Dazu wurden 1.71 g (41 mmol) LiOH x H, O gegeben und 2,5 h bei Raumtemp. gerührt. Anschließend wurde die Lösung mit halb gesättigter KHSO ₄ -Lsg. auf pH = 5 angesäuert und zweimal mit EE extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit gesättigter NaCI-Lsg. gewaschen, über MgSO ₄ getrocknet und das Lösungsmittel i.V.i.RV. entfernt. Nach Trocknen i.ÖPV. wurden 2,71 g (98 %) eines dunkelbraunen Pulvers erhalten.

-αo-

Schmp.: 118-119°

DC: CH, Cl, /MeOH 95:5 R ^ = 0,14

MS: (ESI+) berechnet: 408,2 gefunden: 409,3

Stufe 4: N-[1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-[S-

(N-ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid

2 g (4,9 mmol) N-[1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)- carbonsäure und 1.45 (4,9 mmol) N-f-Boc-S-Lysinmethylester x HCl wurden in 20 ml CH, Cl ₂ gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 2.51 g (9,8 mmol) 2-Chloro-1- methylpyridiniumjodid und 2.04 ml (14.7 mmol) Triethylamin in 30 ml CH, CL zugetropft. Anschließend wurde 8 h unter Rückfluß erwärmt. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit wässriger halb gesättigter KHSO ₄ -Lösung, zweimal mit wässriger 2 N NaOH-Lösung und einmal mit wässriger gesättigter NaCI-Lösung gewaschen Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH, CL /MeOH 95:5 gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 2,21 g (69 %) eines braunen Pulvers erhalten.

Schmp.: 78-80°

DC: CH _: CL /MeOH 95:5 R , = 0,51

FT-IR (KBr): 3504w (N-H); 2975w (C-H); 1749s, 1690s (CONH, C=O); 1490s (C-H); 1407m (C-H); 1170s (C-O); 757m (C=C); ¹ H-NMR (DMSO-d' , 270 MHz): 1 ,2-1 ,8 (m, 24, 18 Boc, 3 CH, -Lys); 2,8- 3,0 (m, 3, f-CH, -Lys, H-C3-lnd); 3,0-3,2 (m, 1 , H-C3-Ind); 3,4-3,5 (m, 1 , H-C3-Ind); 3,5-3,7 (m, 3, COOMe); 4,2-4,3 (m, 1 , H-C3-Ind); 4,7-4,9 (m, 1 , H-C2-Ind); 5,0-5,5 (m, 1 , H-C2-Ind); 6,7-6,8 (m, 1 , Ar-Ind); 6,85-7,3 (m, 6, Ar-Ind); 7,7-8,9 (m, 3, NHCO, Ar-Ind, α-NHCO). MS: (ESI+) berechnet: 650,2, gefunden: 651 ,4

HPLC: 4 Peaks bei 24,82 min, 29,9 min, 30,3 min, 31 ,2 min

Beispiel 4:

Synthese von: N-[lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure- [S-( ε- NH ₂ )-Lysin-methylester]-amid

500 mg (0,812 mmol) N-[1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)- carbonsäure-[S-(N-ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid wurden in einem 25 ml Einhalskolben in 2,8 ml CH, Cl, gelöst. Dazu wurden 15 äq (0,0122 mol, 0,93 ml) Trifluoressigsäure gegeben und zwei Stunden bei Raumtemp. gerührt. Zu der Lösung wurden 10 ml Diethylether gegeben, es fiel ein weißer Niederschlag aus, der abgesaugt und 6 mal mit Diethylether gewaschen wurde. Nach Trocknen i.ÖPV. wurden 513 mg (98 %) eines weißen Pulvers erhalten.

Schmp.: 164-165°

DC (RP): CH , CN/H, O 1 :1. 1 % TFA R _r = 0,61

FT-IR (KBr): 3435w (N-H); 3049w (C-H); 1740w (C=O); 1676s (CONH);

1420m (C-H); 1205m, 1135s (C-O);

¹ H-NMR (DMSO-d' , 270 MHz): 1 ,2-2,05 (m, 10, 3 CH, -Lys + 4 Pip);

2,7-3,15 (m, 5, ε-CH _: -Lys + H-C3-Ind + 2 Pip); 3,55-3,7 (m, 3, COOMe);

4,1-4,25 (m, 1 , C3-Ind); 5,15 (d ,1 , H-C2-Ind); 6,95 (m, 1 , Ar-Ind); 7,1 -7,3

(m, 2, Ar-Ind); 7,7-7,85 (s, 3, NH , ); 8,1 (d, 1 , Ar-Ind); 8,7-8,9 (m, 2,

NH ₂ ' ).

MS: (ESI+): berechnet 418,2 gefunden: 417,3 und 209,1 für m/2

HPLC: 2 Peaks bei 11 ,54 und 12,65 min

-Z2-

Beispiel 5:

Synthese von: N-[1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-

(S-(N-ε-Z)-Lysin-methylester)-amid

2,5 g (6,13 mmol) N-[1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)- carbon-säure und 2.03 g (6,13 mmol) N-s-Z-Lysinmethylester x HCl wurden in 20 ml CH, Cl, gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 2.35 g (9,2 mmol) 2-Chloro-1 -methyl- pyridiniumjodid und 2.13 ml (15 mmol) Triethylamin in 30 ml CH, CL zugetropft. Anschließend wurde 8 h unter Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter KHSO ₄ -Lsg., zweimal mit 2 N NaOH-Lsg. und einmal mit gesättigter NaCI-Lsg. gewaschen. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH, CL /MeOH 95:5 gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 2,57 g (61 %) eines braunen Pulvers erhalten.

Schmp.: 68°

DC: CH, CL /MeOH 95:5 R ^ = 0,48

FT-IR (KBr): 3329w (N-H); 2935w (C-H); 1701s (C=O); 1485s (C-H);

1260m(C-O); 1149m, 1020m(C-O); 753m(C=C);

MS: (ESI+) berechnet: 684,5, gefunden: 685,4

EA(berechnetfürC^H^N, O _s (684,5): C66,67; H 6,43; N 8,19 gefunden: C64,15; H6,5; N 7,88;

-W-

Beispiel 6

Synthese von 1-Boc-lndohn-2-(R, S)-carbonsaure-(S-(N-ε-Z)-Lysιn-methylester)-

6,36 g (0,0242 mol) 1-Boc-lndohn-2-(R, S)-carbonsaure und 8 0 g (24 2 mmol) N-£--Z-Lysιnmethylester x HCl wurden in 70 ml CH, CL gelost und innerhalb von 30 min bei Raumtemp zu einer Suspension von 9 27 g (36 3 mmol) 2-Chloro-1-methylpyÏ€dιnιumjodιd und 8 41 ml (60 4 mmol) Triethylamin in 60 ml CH, Cl, zugetropft Anschließend wurde 8 h unter Ruckfluß gekocht Das Losungsmittel wurde i V i RV entfernt, der Ruckstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter KHSO ₄ -Lsg , zweimal mit 2 N NaOH-Lsg und einmal mit gesättigter NaCI-Lsg gewaschen Das Losungsmittel wurde i V i RV entfernt und der Ruckstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH, Cl, /MeOH 95 5 gereinigt Nach Entfernen des Losungsmittels i V i RV und Trocknen i ÖPV wurden 10,91 g (84 %) eines hell-braunen Pulvers erhalten

DC: CH, CL /MeOH 95 5 R _y = 0,74

¹ H-NMR (DMSO-d' , 270 MHz): 1 ,3-1 ,75 (m, 15, 9 Boc + 6 CH, -Lys),

2,8-3,0 ( m, 3, CH, -Lys + H-C3-Ind), 3,4-3,55 (m, 1 , H-C3 ^' -Ind), 3,65 (s,

3, COOCH , ), 4,2 (m, 1 , Hα-C-Lys) 4,8 (m, 1 , H-C2-Ind), 5,0 (s, 2, CH, -

Z), 6,85 (m, 1 , Ar-Ind), 7,15 (t, 2, Ar-Ind), 7,2-7,4 (m, 5, Ph-Z), 7,7 (m, 1 ,

NHCO), 8,4 (m, 1 , Ar-Ind)

EA: berechnet für C , _u H „ N , O ₇ (539,4) C 64,56, H 6,86, N 7,79 gefunden C 64,61 , H 7,06, N 7,67,

MS: (ESI+) berechnet 539,4, gefunden 540,3

- 2Λ--

Beispiel 7:

Synthese von: 1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-(S-Phenylalaninmethylester)- amid

Stufe 1 : S-Phenylalaninmethylester x HCl

In einem 100-ml-Einhalskolben wurden zu einer Suspension von 8.0 g (48.4 mmol) S-Phenylalanin in 50 ml MeOH innerhalb von 30 min bei Raumtemp. 5.3 ml (72.6 mmol) Thionylchlorid zugetropft. Anschließend wurde 3 h zum Rückfluß erhitzt. Methanol und überschüssiges Thionylchlorid wurden zuerst mit Wasserstrahlvakuum, dann am Rotationsverdampfer abdestilliert. Der Rückstand wurde in 50 ml MeOH gelöst und mit 800 ml Diethylether versetzt. Es fiel ein weißer Niederschlag aus. Das Lösungsmittel wurde über eine Fritte abgesaugt, es wurden 7,93 g (75 %) eines weißen Pulvers erhalten.

¹ H-NMR (DMSO-d' , 270 MHz): 3,0-3,2 (m, 2, CH, ); 3,65 (s, 3, COOMe); 4,35 (m, 1 , Hα-C); 7,2-7,4 (m, 5, Ph); 8,5-8,7 (m, 3, NH ₃ )

Stufe 2: N-[1-Boc-lndolιn-2-(R, S)-carbonyl]-(S-Phenylalaninmethylester)- amid

3,5 g (16.2 mmol) S-Phenylalaninmethylester-Hydrochlorid und 4.27 g (16.2 mmol) wurden in 70 ml CH, Cl, gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 6.21 g (24.3 mmol) 2-Chloro-1- methyl-pyridiniumjodid und 5.32 ml (40.5 mmol) Triethylamin in 60 ml CH, CL zugetropft. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch 8 h unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter KHSO ₄ -Lsg., zweimal mit 2 N

NaOH-Lsg und einmal mit gesättigter NaCI-Lsg gewaschen Das Losungsmittel wurde i V i RV entfernt und der Ruckstand durch Chromatographie an 400 g Kieseigel mit CH ₂ Cl ₂ /MeOH 95 5 gereinigt Nach erneutem Entfernen des Losungsmittels i V i RV und Trocknen i OPV wurden 7,71 g (62 %) eines hell-gelben Pulvers erhalten

DC: CH, Cl, /MeOH 95 5 R _f = 0,87

¹ H-NMR (DMSO-d ⁽ , 270 MHz): 1 ,2-1 ,5 (m, 9, Boc), 2,3-2,45 (m, 0,5, H- C3-Ind), 2,8-3,5 (m, 3,5, C3-Ind + CH, ), 3,65 (d, 3, COOMe), 4,4-4,65 (m, 1 , C2-Ind), 4,8 (m, 1 , Hα-C), 6,8-7,3 (m, 8, 5 Ph + 3 Ar-Ind), 7,7 (m, 1 , Ar- Ind), 8,55 (m, 1 , NH)

EA: berechnet für C, ₄ H, _R N, O, (424,3) C 67,92, H 6,6, N 6,6 gefunden C 67,94, H 6,79, N 6,59 MS: (ESI+) berechnet 424,4 gefunden 425,2

Beispiel 8

Synthese von N-[N ^' -(4-Methoxyphenylacetyl)-Pιpeπdyl-4-carbonyl]- Indol ιn-2-(R, S)-carbonsauremethylester

(Diese Verbindung kann als Vorstufe für die Herstellung eines Amides der allgemeinen Formel I eingesetzt werden)

1 2 g (3 0 mmol) N-[1-Boc-PιpeÏ€dyl-4-carbonyl]-lndolιn-2-(R, S)- carbonsaure-methylester wurden bei RT in 30 ml CH, Cl ₂ gelost, mit 1 14 g (10 mmol) TFA versetzt und 24 h lang rühren lassen Das Reaktionsgemisch wurde i V i RV eingeengt, mit 100 ml Essigester aufgenommen und 3 mal mit gesättigter wässriger NaHCO ₃ -Losung und 1 mal mit gesättigter wässriger NaCI-Losung gewaschen Die organische Phase trocknete man über MgSO ₄ und entfernte das Losungsmittel i V i RV Der Ruckstand wurde in 30 ml CH ₂ Cl ₂ gelost, mit 1 01 g (10 mmol) Triethylamin, mit 366 mg (3 0 mmol) 4-Dιmethylamιnopyrιdιn versetzt, auf 0° C gekühlt und mit einer Losung von 606 mg (3 3 mmol) 4- MethoxyphenylacetylchloÏ€d in 10 ml CH ₂ CI, versehen Nach 24 h

Ruhren wurde das Reaktionsgemisch i V i RV vom Losungsmittel befreit, mit 100 ml Essigester aufgenommen und 2 mal mit 1n HCI- Losung, 2 mal mit gesättigter wässriger NaHCO ₃ -Losung und 1 mal mit gesättigter wässriger NaCI-Losung gewaschen Nach dem Abdestillieren des Losungsmittels i V i RV wurde der Ruckstand an 80 g Flashgel mit n-Hexan/AcOEt chromatographiert Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und i V i RV vom Losungsmittel befreit und i OPV getrocknet Man erhielt 1 1 g Produkt als weißen Schaum

DC: AcOEt, R _f = 0,22

' H-NMR (DMSO-d ^Λ , 270 MHz): 1 ,35-1 ,85 (m, 13, Boc, 4 Pip), 2,7-2,8 (m, 4, H-C(3), H-C(5)), 3,25 (m, 1 , H-C(3)-ind), 3,65 (m, 1 , H-C(3 ^' )-Ind), 3,8 (s, 3, COOCH , ), 3,95 (m, 1 , H-C(4)-Pιp), 5,45 (d, 1 , H-C(2)-Ind), 7,05 (m, 1 , Ar), 7,1-7,3 (m, 2, Ar), 8, 1 (d, 1 , Ar)

EA: berechnet für C ₂₅ H , ₈ N , O _s (436 51 ) C 68 70, H 6,47, N 6,42 gefunden C 69 97, H 6,98, N 5 27

Beispiel 9

Synthese von N-(4-Methoxyphenylacetyl)-lndohn-2-(R, S)-carbonsauremethylester (Diese Verbindung kann als Vorstufe für die Herstellung eines Amides der allgemeinen Formel I eingesetzt werden)

In einem 100 ml Einhalskolben mit Septum wurden 1 g (R,S)-lndohn-2- carbonsauremethylester x HCl und 1 14 g (9,36 mmol) DMAP in 25 ml trocknem CH , CL vorgelegt Bei 0° C wurden unter Ruhren innerhalb von 30 min 1 04 g (856 μl) 4-Methoxyphenylacetylchloπd mit einer Spritze zugetropft Anschließend ließ man 3 h bei Raumtemp rühren Das Lsgm wurde i V i RV entfernt und der Ruckstand durch Flash-Chromatographie an 150 g Flash-Kieselgel (CH, Cl, /MeOH 9 1 ) gereinigt Nach Entfernen des Lsgm i V i RV wurden 830 mg (59 %) eines hell-grauen Pulvers erhalten

- XI -

DC: CH, CL ; R, = 0,31

¹ H-NMR (DMSO-d ⁶ , 270 MHz): 3,15-3,3 (m, 1 , H-C(3)-Ind); 3,5-3,7 (m,

3, CH, + H-C(3 ^' )-Ind); 5,0 (m, 1 , H-C(2)-Ind); 6,85 (m, 2, Ar-Ind); 7,0 (m,

1 , Ar-Ind); 7,1-7,3 (m, 4, Phenyl); 8,25 (d, 1 , Ar-Ind)

EA: berechnet für C^ H^ N, O ₄ (325,3): C 70,15; H 5,85; N 4,31 gefunden: C 70,34; H 5,78; N 4,22

MS: (ESI+) berechnet: 325,3, gefunden: 326,1

Beispiel 10:

Synthese von: N-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-4-Piperidyl-amid

In einem 100 ml Einhalskolben wurden 2.63 g (10.0 mmol) 1-Boc-(R,S)- lndolin-2-carbonsäure mit 1.13 g (12.0 mmol) 4-Aminopyridin, 1.47 g (12.0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 30 ml CH, Cl, bei 0° C vorgelegt und mit einer Lösung aus 2.48 g (12.0 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml CH, CL versetzt. Nach 48 h wurde das Reaktionsgemisch über Celite filtriert, i. V. i RV. vom Lösungsmittel befreit, der Rückstand mit 100 ml Essigester afgenommen,

2 mal mit 10 % wässriger HCI-Lösung, 2 mal mit gesättigter wässriger NaHCO ₃ -Lösung und 1 mal mit gesättigter wässriger NaCI-Lösung gewaschen. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels i. V. i. RV. wurde der Rückstand an 50 g Flashgel mit n-Hexan/AcOEt chromatographiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels i. V. i. RV. wurde der Rückstand aus AcOEt/Ether kristallisiert, wobei man 2.4 g des Produktes erhielt.

DC: CH, CI, /MeOH = 95/5; R , = 0,19

¹ H-NMR (CDCI ₃ , 270 MHz): 1 ,58 (s, 9H, Boc); 3,43-3,54 (m, 2H, H-C(3)- Ind); 5,0 (m, 1 , H-C2-Ind); 7,02 (m, 1 H, H-C(7)-Ind); 7,17-7,26 (m, 3H, H-

C(6), H-C(5), H-C(4)-Ind); 7,45 (q, 2H, H-C(3), H-C(5)-Py); 7,57 (NH); 8,47 (q, 2H, H-C(2), H-C(6)-Py).

EA: berechnet für C ₁₉ H ₂ ιN ₃ O ₃ (339.40): C 67.84; H 6.29; N 12.49; gefunden: C 67.75; H 6.33; N 12.53.

Beispiel 11 :

Synthese von: N-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-[Piperazino-essigsäure- morpholid]-amid

In einem 100 ml Einhalskolben wurden 2.63 g (10.0 mmol) 1-Boc-(R,S)- lndolin-2-carbonsäure mit 2.56 g (12.0 mmol) Piperazinoessigsäure- morpholid, 1.47 g (12.0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 30 ml CH, Cl, bei 0 ° C vorgelegt und mit einer Lösung aus 2.48 g (12.0 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml CH ₂ Cl ₂ versetzt. Nach 48 h wurde das Reaktionsgemisch über Celite filtriert, i. V. i. RV. vom Lösungsmittel befreit, der Rückstand mit 100 ml Essigester aufgenommen, 2 mal mit 10%iger wässriger HCI-Lösung, 2 mal mit gesättigter wässriger NaHCO ₃ - Lösung und 1 mal mit gesättigter wässriger NaCI-Lösung gewaschen. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels i. V. i. RV. wurde der Rückstand an 50 g Flashgel mit n-Hexan/AcOEt chromatographiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels i. V. i. RV. wurde der Rückstand aus AcOEt/Ether kristallisiert, wobei man 2.4 g des Produktes erhielt.

DC: CH, CL /MeOH = 95/5; R , = 0,19

¹ H-NMR (CDCI ₃ , 270 MHz): 1.48-1.58 (d, 9H, Boc); 3,21 (s, 2H, H- C(2 ^" )); 3,42-3,69 (m, 16H); 5,1 (br, 2H, H-C(3)-Ind); 6,48 (q, 1 H); 6,90 (q, 1 H); 7,14 (m, 1 H), 8,22 (q, 1 H).

EA: berechnet für C ₂₄ H34N ₄ O ₅ (458.56): C 62.86; H 7.47; N 12.21; gefunden: C 63.21 ; H 7.48; N 13.61.

Beispiel 12:

Synthese von: N-[1-Boc-Pipeπdyl-4-carbonyl]-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure- [Piperazinoessigsäure-morpholid]-amid

458.56 mg (1.0 mmol) 1-Boc-lndolin-2-(R, S)-carbonsäure-[Piperazino- essigsäuremorpholid]-amid wurden bei RT in 20 ml CH, CL gelöst, mit 1.14 g (10 mmol) TFA versetzt und 24 h lang rühren lassen. Das Reaktionsgemisch wurde i.V.i.RV. eingeengt, mit 10 ml Essigester aufgenommen und 2 mal mit gesättigter wässriger NaHCO ₃ -Lösung und 1 mal mit gesättigter wässriger NaCI-Lösung gewaschen. Die organische Phase trocknete man über MgSO ₄ und entfernte das Lösungsmittel i.V.i.RV.. Der Rückstand wurde in 10 ml CH, Cl ₂ gelöst, mit 505 mg (5 mmol) Triethylamin, mit 320.7 mg (1.4 mmol) 4-Boc-Piperidincarbonsäure und mit 357.7 mg (1.4 mmol) 2-Chlor-1-methyl-pyridiniumhydrochlorid versetzt, 8 h auf Rückflußtemperatur erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde i. V. i. RV. vom Lösungsmittel befreit, mit 100 ml Essigester aufgenommen und 2 mal mit Wasser, einmal mit 10 %iger wässriger HCI- Lösung, 2 mal mit gesättigter wässriger NaHCO ₃ -Lösung und 1 mal mit gesättigter wässriger NaCI-Lösung gewaschen und über MgSO ₄ getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels i. V. i. RV. wurde der Rückstand aus Essigester/Isopropanol kristallisiert.

EA: berechnet für C ₂₅ H, ₈ N, O _< (557.70): C 62.46; H 7.77; N 12.56 gefunden: C 61.56; H 7.62; N 11.96.

Beispiel 13:

Synthese von: N-[N ^' -(4-Methoxyphenylacetyl)-Piperidyl-4-carbonyl]-lndolin -2-(R, S)-carbonsäure-[S-(N-ε-Z)-Lysin-methylester]-amid

-SO

Stufe 1 N-[1-Boc-Pιpeπdyl-4-carbonyl]-lndolιn-2-(R, S)-carbonsaure-[S-(N-ε-

Z)-Lysιn-methylester]-amιd

3 74 g (10 mmol) N-[1-Boc-PιpeÏ€dyl-4-carbonyl]-lndolιn-2-(R, S)- carbonsaure und 3 31 g (10 mmol) x HCl wurden in 20 ml CH, CL gelost und innerhalb von 30 mm bei Raumtemp zu einer Suspension von 5 11 g (20 mmol) 2-Chloro-1-methylpyÏ€dιnιumjodιd und 4 04 g (40 mmol) Triethylamin in 30 ml CH, Cl, zugetropft Das Reaktionsgemisch wurde nach 8 stundigem refluxieren i V i RV vom Losungsmittel befreit Der Ruckstand wurde in 200 ml Essigester aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter wässriger KHSO ₄ -Losung, zweimal mit wässriger 2 N NaOH-Losung und einmal mit gesättigter wässriger NaCI-Losung gewaschen Nach dem Trockenen über MgSO ₄ wurde das Losungsmittel i V i RV entfernt und der Ruckstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH, CL /MeOH 95 5 gereinigt Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Losungsmittels i V i RV entfernt Nach dem Trocknen i OPV wurden 4 2 g eines hellbraunen Pulvers erhalten

DC: CH, CL /MeOH 95 5 R , = 0,41

EA: (berechnet für C,, H _4S N ₄ O _s 650,78) C 64 60, H 7 13, N 8 61 , gefunden C 64 73, H 7 01 N 8 64

Stufe 2 N-[N ^' -(4-Methoxyphenylacetyl)-PιpeÏ€dyl-4-carbonyl]-lndolÎ ¹n-2-(R,

S)-carbonsaure-[S-(N-ε-Z)-Lysιn-methylester]-amιd

3 25 g (5 0 mmol) N-[1-Boc-Pιpeπdyl-4-carbonyl]-lndolιn-2-(R, S)- carbonsaure-[S-(N-ε-Z)-Lysιn-methylester]-amιd wurden bei RT in 50 ml

~ 2 \ -

CH, Cl, gelöst, mit 2 28 g (20 mmol) TFA versetzt und 4 h gerührt Das Reaktionsgemisch wurde i V i RV eingeengt, mit 100 ml Essigester aufgenommen und 3 mal mit gesättigter wässriger NaHCO ₃ -Losung und 1 mal mit gesättigter wässriger NaCI-Losung gewaschen Die organische Phase trocknete man über MgSO ₄ und entfernte das Losungsmittel i V i RV Der Ruckstand wurde in 30 ml CH, Cl ₂ gelost, mit 1 01 g (10 mmol) Triethylamin, mit 366 mg (3 0 mmol) 4-DιmethylamιnopyÏ€dιn versetzt, auf 0° C gekühlt und mit einer Losung von 1 01 g (5 5 mmol) 4- MethoxyphenylacetylchloÏ€d in 10 ml CH, Cl, versehen Nach 24 h Ruhren wurde das Reaktionsgemisch i V i RV vom Losungsmittel befreit, mit 100 ml Essigester aufgenommen und 2 mal mit wässriger 1 n HCI-Losung, 2 mal mit gesättigter wässriger NaHCO ₃ -Losung und 1 mal mit gesättigter wässriger NaCI-Losung gewaschen Nach dem Abdestillieren des Losungsmittels i V i RV wurde der Ruckstand an 80 g Flashgel mit n-Hexan/AcOEt chromatographiert Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und i V i RV vom Losungsmittel befreit, i OPV getrocknet, wobei das Produkt als weißer Schaum verblieb

EA: berechnet für C∞H^Oe x H ₂ O (716 84) C 65 35, H 6 75, N 7 82, gefunden C 6547, H 6 89, N 7 81

Die aufgeführten Beispiele 1-7 und 10-13 erwiesen sich überraschenderweise als stark bindende Immunophihn-Modulatoren, die als tragerfixierte Form geeignet und in der Lage sind, pathogen wirkende Immunophihne aus Flüssigkeiten, insbesonders Korperflussigkeiten, zu binden

Zum Auffinden von stark bindenden Cyp B bzw FKBP-Liganden der Formel I wurden die immobilisierten Liganden einem SDS-PAGE (Abbildung 1 ) mit Zellhomogenat unterzogen Tragerfixierte Liganden, die eine besondere Affinität gegenüber den Immunophilinen aufweisen, binden diese spezifisch mit einer Affinitat, die hoher ist als CsA beziehungsweise FK 506 Die hohe Affinitat von den mit Formel I dargestellten, tragerfixierten Liganden gegenüber Immunophilinen laßt sich an einem SDS-PAGE zeigen

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Siehe Blatt 1/1.

Erklärung zum SDS-PAGE a) Zellhomogenat b) Zellhomogenat-Eluat nach Equilibπerung mit tragerfixierten Liganden der allgemeinen Formel I c) Ablösung des Cyclophilin B mit SDS von der unter b) genannten Matrix bei 25 °C d) SDS-Kontrolle e) Ablösung des Cyclophilin B mit SDS von der unter b) genannten Matrix bei 95 °C f) Proteinstandard (Sigma 12 kDa,18kDa, 25 kDa, 45 kDa, 66 kDa) g) Zellhomogenat-Eluat nach Equilibπerung mit immobilisiertem CsA h) Ablösung des Cyclophilin B von der unter g) genannten CsA-Matπx mit SDS bei

25 °C i) Ablösung des Cyclophilin B von der unter g) genannten CsA-Matπx mit SDS bei

95 °C k) SDS-Kontrolle

Die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Formel (I) zeichnen sich überraschenderweise durch Immunophihn-Bindung aus und hemmen deren Peptidyl- Prolyl-cis-trans-lsomerase (PPIase)-Aktivität. Für das Eingangsscreening (1 μmol/l Substanz) wird die Inhibition des humanen Cyclophilin B im PPIase-Test bestimmt

33 ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26)

Diese PPIase-Aktivitat wird nach einem weltweit üblichen Enzym-Test geprüft G Fischer, H Bang, C Mech, Biomed Biochim Acta, 43, 1101-1111 , G Fischer, H Bang, A Schellenberger, Biochim. Biophys Acta, 791, 87-97, 1984, D H Rieh et al , J Med Chem 38, 4164-4170, 1995)

Die erfindungsgemaßen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden zusammen mit 10 nmol Cyp B für 15 min bei 4°C pramkubiert Die Enzymreaktion wird nach Zugabe von Chymotrypsin und HEPES-Puffer mit dem Testpeptid Suc-Ala-Ala-Pro- Phe-Nan gestartet Anschließend wird die Extinktionsanderung bei 390 nm verfolgt und ausgewertet Die photometrisch ermittelte Extintinktionsanderung resultiert aus zwei Teilreaktionen a) die schnelle chymotryptische Spaltung des trans-Peptides, b) die nicht-enzymatische cis-trans-lsomeπsierung, die durch Cyclophilme katalysiert ist Die entsprechende PPIase-Aktivitat der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel sind in Tabelle 1 dargestellt

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Tabelle 1

Für die bekannten immunsuppressiven Effekte von CsA scheint die Bildung des Ubermolekules aus CsA-Cyp B-CalαneuÏ€n (Ca ²⁺ -abhangιge Phophatase) verantwortlich zu sein Die erfindungsgemaßen Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden für die Untersuchung auf die Wechselwirkung mit diesem Ubermolekul aus CsA-Cyp B beziehungsweise CsA-Cyp B-CalcmeuÏ€n mit Zellhomogenate einer humanen T-Zelhnie mit ³ H-CsA (100 nmol) mkubiert Nach der Gelfiltration an Superose 12 wurde die Radioaktivität der eluierten Fraktionen gemessen und mit der unbehandelten Kontrolle verglichen Die entsprechende Verdrängung von ³ H-CsA durch die erfindungsgemaßen Verbindungen der

allgemeinen Formel I aus dem Ubermolekul Cyp B-CsA und Cyp-CsA-Calcmeuπn ist in Tabelle 2 dargestellt

Tabelle 2

Der ll-2-Prohferatιonstest beruht auf dem Einbau von H-Thymιdιn in mit OKT-3 (humane antι-CD-3-Antιkorper) stimulierte T-Zellen und wird folgendermaßen durchgeführt

100000 T-Zellen werden in 150 μl Kulturmedium pro Well in Mikrotiterplatten ausgesaht, durch Zugabe von OKT-3 (1 μg/ml) stimuliert und für 45 h mit jeweils einer der erfindungsgemaßen Verbindungen der allgemeinen Formel I mkubiert Nach dieser Inkubationszeit werden in jedes Well 10 μl der ³ H-Thymιdιn-Losung (0 5 μCi) pipettiert Danach wird 6 h bei 37°C in einer 5%-ιgen CO ₂ -Atmosphare mkubiert Nach dem Ernten der Zellen wird die Radioaktivität im ß-Counter quantifiziert Die entsprechende CD3-ιnduzιerte Prohferationshemmung der

Tabelle 3

erfindungsgemaßen Verbindungen der allgemeinen Formel I sind in Tabelle 3 dargestellt

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I zeigen wie CsA, FK 506 beziehungsweise Rapamycin im Tierexperiment die Blockade von Cytokinen wie IL-2, IL-4 und IL-5, die im Krankheitsfalle die allergisch induzierten Entzündungen hervorrufen.

Zur Bestimmung der Zellteilungshemmung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden 50000 humane Tumorzellen in Gegenwart der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I 48 h lang kultiviert, mit 10 μl gelbem Tetrazolium-Salz-Lösung (MTT) versehen und weitere 4 h bei 37 °C in einer CO ₂ -Atmosphäre inkubiert. Die resultierende violette Färbung wurde photometrisch bei 570 nm analysiert. Nach Zugabe von je 100 μl SDS-Lösung wurde nach über Nacht-Inkubation die Färbung photometrisch quantifiziert. Eine allgemeine Zelltoxizität der erfindungsgemäß Verbindungen der allgemeinen Formel I konnte nicht festgestellt werden.

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