METAPNEUMOVIRUS HUMANO (HMPV) Y SU USO EN UN METODO DE DIAGNOSTICO

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína M del virus respiratorio Metapneumovirus humano (hMPV), útiles para el desarrollo de métodos de diagnóstico de infección por hMPV en humanos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El Metapneumovirus humano (de ahora en adelante hMPV), es el agente etiológico de un porcentaje representativo de las hospitalizaciones y la morbilidad asociadas a enfermedades respiratorias agudas de los tractos respiratorio superior e inferior, especialmente en infantes, personas de la tercera edad e individuos inmunocomprometidos. La infección por este virus se asocia a una amplia gama de patologías, dentro de las cuales bronquiolitis y neumonía corresponden a los cuadros con mayor impacto socio-económico. Adicionalmente, la infección por hMPV ha sido asociada con gastroenteritis y queratoconjuntivitis. Por ejemplo, Calvo y colaboradores (2008) demostraron en un período de 3 años que la incidencia acumulada de infecciones respiratorias agudas causadas por los virus respiratorios: virus respiratorio sincicial (VRS), adenovirus (ADV) y hMPV, son responsables del 64,5% de las hospitalizaciones de niños menores de 2 años, siendo la incidencia para cada uno de los virus de 35,4%, 19,3% y 9,8% respectivamente. Una característica interesante que hMPV comparte con los otros virus respiratorios de alta incidencia es la producción de infecciones repetidas a lo largo de la infancia, fenómeno posiblemente asociado a una falla en el establecimiento de una respuesta inmune protectora frente a la primera infección durante los primeros meses de vida. No hay estudios hasta el momento del impacto económico específico que ocasiona la infección por hMPV, sin embargo, la incidencia de hospitalización por hMPV se ha estimado en 1 /3 respecto de la incidencia de hospitalización por virus respiratorio sincicial humano (hRSV). Estudios realizados en países desarrollados, estiman que el costo individual de la infección por hRSV es de sobre 3.000 euros ($1 .860.000 pesos chilenos) con un límite superior de hasta 8.400 euros ($5.200.000 pesos chilenos). Los costos por concepto de hospitalización individual se sugieren aproximados, considerando que el proceso patológico que amerita la hospitalización es de similares características. Si bien los virus hMPV y hRSV están agrupados dentro de los géneros

Metapneumovirus y Pneumovirus, respectivamente, el virus hMPV se clasifica en la familia Paramyxoviridae subfamilia Pneumovirinae, la misma en que se clasifica hRSV. El genoma de hMPV está compuesto por ácido ribonucleico de hebra simple (ssRNA) no segmentada de sentido negativo, por lo que las proteínas virales se organizan en sentido 3 ^' a 5 ^' (con respecto a su secuencia) de la siguiente forma: N, P, M, F, M2 (ORF1 y ORF2), SH, G y L. Cinco de estas proteínas son responsables del empaquetamiento del material genético y de definir la estructura propia de la partícula viral, correspondiendo a la proteína de nucleocápside N y la proteína de matriz M, junto a las glicoproteínas de transmembrana F, G y SH, respectivamente. Las otras cuatro proteínas, M2-1 , M2-2, P y L, están involucradas en la replicación y transcripción viral. Existen 2 subtipos de hMPV, clasificados como A y B respecto de dos grupos antigénicos basados en diferencias de secuencia principalmente en las proteínas F y G. Si bien estas proteínas presentan cierto grado de diferencia, existe una alta identidad respecto de las otras proteínas codificadas por el genoma viral.

Actualmente para detectar hMPV se utilizan tres técnicas: el RT-PCR, que amplifica segmentos de los genes F y N directamente de la muestras de hisopados nasofaríngeos, panel respiratorio (método de inmunofluorescencia directa que identifica simultáneamente distintos tipos de virus respiratorios, utilizado de manera rutinaria en laboratorios clínicos) y el cultivo in vitro en células LLC-MK2, para observar un efecto citopático. Estas técnicas poseen una sensibilidad no mayor al 70% y los resultados son discordantes entre ambas. Uno de los problemas que genera la baja sensibilidad y discordancia entre estas técnicas, guarda relación con que las infecciones respiratorias negativas para el panel respiratorio generalmente son tratadas con antibióticos, para evitar posibles sobre-infecciones bacterianas. De este modo, los falsos negativos entregados actualmente por las técnicas disponibles no están recibiendo el tratamiento adecuado y se expone al paciente a un tratamiento por antibióticos innecesario, lo que además aumenta en dicho paciente las posibilidades de generar resistencia a los antibióticos.

Por lo tanto, se hace fundamental contar con un test de diagnóstico eficaz y rápido para hMPV. Ante tal problemática, los anticuerpos monoclonales de la invención aparecen como una alternativa necesaria para suplir dicha necesidad, puesto que permiten el reconocimiento específico de antígenos virales en muestras de pacientes infectados con hMPV. De este modo la presente invención comprende productos, tales como anticuerpos monoclonales, y un método alternativo que los usa para detección y diagnóstico rápido, eficaz y certero en pacientes infectados con hMPV con un 100% de especificidad en muestras clínicas y capaces de detectar por ELISA concentraciones equivalente 1 ,5 ng del antígeno específico. Esto permitirá a los profesionales clínicos determinar un tratamiento temprano y adecuado que pudiera anticipar la evolución de la enfermedad. RESUMEN DEL INVENTO.

La presente invención se refiere a dos anticuerpos monoclonales contra Metapneumovirus humano (hMPV). Concretamente, la presente invención involucra dos anticuerpos monoclonales murinos, correspondientes a anticuerpos monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas denominados 3G8/C1 1 y 7G4/A12, y que reaccionan contra el antígeno M de hMPV. Estos anticuerpos no compiten entre sí por el sitio de unión al antígeno, ni ejercen un impedimento para unirse simultáneamente a este. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser utilizados para ensayos de detección, diagnóstico y/o determinación de infección por hMPV. Estos anticuerpos pueden ser utilizados simultáneamente para incrementar la sensibilidad de detección en muestras clínicas donde existe escasa cantidad de antígeno. Por ejemplo, como se muestra en la figura 6, anticuerpos provenientes de hibridoma 3G8/C1 1 son capaces de capturar eficientemente la proteína M de hMPV en muestras clínicas. Estas proteínas capturadas e inmovilizadas fueron detectadas posteriormente por los anticuerpos generados por el hibridoma 7G4/A12, los cuales se encontraban conjugados a una enzima que actúa sobre un sustrato cromógeno. Esta cualidad permite la combinación de ambos anticuerpos con diferente marca para detectar el mismo antígeno en muestras donde éste se encuentre en escasa cantidad. La invención proporciona métodos de diagnóstico ex vivo o in vitro y detección del antígeno viral M de hMPV, en los cuales se utilizan los anticuerpos monoclonales producidos y secretados por los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12 en ensayos como ELISA, microscopía de fluorescencia e inmunoblot. Las muestras a analizar pueden ser: células in vitro infectadas con hMPV, secreciones nasales, lavados nasales, secreciones faríngeas y/o lavados o secreciones bronquiales, entre otras. La invención proporciona un método de detección de hMPV en muestras biológicas y cultivos celulares, utilizando los anticuerpos monoclonales producidos y/o secretados por las líneas celulares de los hibridomas antes mencionados, acoplados en cualquier tipo de soporte sólido, como nitrocelulosa, membrana de nylon, esferas magnéticas, esferas fluorescentes u otro soporte; o acoplado a cualquier otra molécula, como enzimas, proteínas, fluoróforos, isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico. El invento puede ser usado en kits de detección para hMPV, que comprenda los anticuerpos producidos por los hibridomas mencionados. Además la presente invención comprende dentro de su alcance incorporar cualquier tipo de molécula o sustrato unido químicamente, tales como marcadores, fluoróforos, biotina, radioisótopos, metales, enzimas y/o cualquier elemento químico acoplado a los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12, donde dicha molécula o sustrato unido químicamente permite visualizar o detectar al anticuerpo. De esta manera la invención también provee anticuerpos que reconocen específicamente la proteína M acoplada a moléculas o sustratos o marcadores diferentes del anticuerpo, como parte del método de detección, análisis y/o diagnóstico en muestras biológicas.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Detección de proteína M de hMPV por los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 3G8/C11 y 7G4/A12, mediante un ensayo de ELISA indirecto. La placa fue activada con 50 ng de proteína M de hMPV recombinante purificada, o con 1 x10 ⁶ ufp de hMPV. Como controles negativos, se activaron otros pocilios con 1 x10 ⁶ ufp del Virus Respiratorio Sincicial (VRS) o con 50 ng de proteína BSA; además se incluyeron pocilios control sin antígeno, con anticuerpo primario, con anti-lgG de ratón conjugado con HRP (sin activar) y pocilios sin antígeno ni anticuerpo primario, solo con anticuerpo anti-lgG de ratón (HRP). Posteriormente, los pocilios se incubaron con los anticuerpos anti-M provenientes del hibridoma 3G8/C1 1 , en cantidad de 170 ng (A), el hibridoma 7G4/A12 en cantidad de 170 ng (B) y el anticuerpo comercial Anti- Human Metapneumovirus 75.1 Antibody, clone 1 B7, número de catálogo MAB8510 (EMD Millipore) utilizado en cantidad de 680 ng (C). Los datos mostrados en el gráfico expresan la absorbancia detectada a 450 nm, emitida por la conversión del sustrato Tetrametilbenzidina a un compuesto coloreado, catalizada por la enzima Horseradish peroxidase (HRP) presente en un anticuerpo secundario anti-lgG de ratón que se unió específicamente a los anticuerpos secretados por los hibridomas 3G8/C1 1 , 7G4/A12 y MAB8510 de Millipore. Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar de la absorbancia emitida por cada muestra en al menos dos experimentos independientes. ^** P<0.01 y ^*** P <0.0001 por el test de ANOVA de una vía comparado al control negativo y comprobación mediante comparaciones múltiples de Dunnett's; ns, no hay diferencia significativa comparado con el control negativo. Figura 2: Determinación de sensibilidad de anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 3G8/C11 y 7G4/A12 en la detección de la proteína M de hMPV. Placas de ELISA se activaron con diluciones seriadas 1 :2, iniciando con 50 ng de proteína M y finalizando con 0,04 ng (A), o diluciones seriadas 1 :2 partiendo de un inoculo 1 x10 ⁵ ufp de hMPV hasta la dilución 1 :5120 (B) y diluciones seriadas 1 :2 desde un inoculo 1 x10 ⁶ ufp de hMPV, hasta la dilución 1 :64 (C). Se incluyeron pocilios sin activar como control negativo. Los datos mostrados en el gráfico expresan la absorbancia a 450 nm emitida por la conversión del sustrato Tetrametilbenzidina a un compuesto coloreado catalizada por la enzima Horseradish peroxidase (HRP) presente en los anticuerpos anti-M provenientes de los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12 en cantidad de 170 ng (A y B). El anticuerpo comercial anti-M de hMPV fue utilizado a una cantidad mayor (680 ng) (C). Los valores corresponden al promedio de la absorbancia emitida por cada muestra en al menos dos experimentos independientes.

Figura 3: Ensayo de diluciones seriadas de los anticuerpos monoclonales anti-M de hMPV producidos por los hibridomas 3G8/C11 y 7G4/A12, para la detección de antígenos purificados de hMPV. Se activaron placas de ELISA con 50 ng de proteína recombinante M de hMPV y se detectó el antígeno con diluciones seriadas 1 :2 de los anticuerpos anti-M 3G8/C1 1 o 7G4/A12, partiendo de una concentración de 3,4 μg/ml (170 ng). Los datos se expresan como el promedio del valor de la absorbancia emitida a 450 nm de cada muestra en duplicado, en al menos dos experimentos independientes.

Figura 4. Confirmación de especificidad de anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 3G8/C11 y 7G4/A12, mediante dot blot. Los anticuerpos anti-M de hMPV producidos por los hibridomas 3G8/C1 1 o 7G4/A12 se incubaron por 1 hora con una membrana de nitrocelulosa que contenía las siguientes muestras inmovilizadas (en forma de manchas o "dots"): VRS (1x10 ⁶ UFP), hMPV (1 x10 ⁶ UFP), BSA (1 μς), proteína M de hMPV ^ μ$, 500 ng y 50 ng), y 20 μg de extracto de células LLC-MK2 sin infectar e infectadas con hMPV. Tras la incubación, la membrana se lavó y se incubó por 1 hora con un anticuerpo secundario anti-lgG de ratón conjugado con la proteína HRP. Tras la incubación, la visualización de la unión de los anticuerpos monoclonales al antígeno se realizó mediante la captura de la quimioluminiscencia producida por la catálisis del sustrato comercial "enhanced chemiluminescence Western blot detection system (ECL, Amersham, Uppsala, Sweden). Se observa que los anticuerpos producidos por los hibridoma 3G8/C1 1 o 7G4/A12 se unen sólo a los dots donde se encuentra presente la proteína M de hMPV, el virus hMPV y células infectadas con hMPV, confirmando la especificidad de estos anticuerpos.

Figura 5. Detección de la proteína M-hMPV por immunofluorescencia en células LLC-MK2 infectadas con hMPV. Células LLC-MK2 fueron crecidas in vitro hasta alcanzar confluencia (entre 70-90%), para ser infectadas por 48 horas con hMPV. Posteriormente fueron fijadas con parafolmadehido y preparadas para inmunofluorescencia indirecta. Para ello se utilizó como anticuerpo primario monoclonal derivado del hibridoma 3G8/C1 1 , del hibridoma 7G4/A12 o del anticuerpo comercial MAB8510, de Millipore. Como anticuerpo secundario se utilizó un anticuerpo comercial anti-lgG de ratón conjugado al fluoróforo Alexa Fluor 488, que emite fluorescencia a 519 nm (señal intensa). Los núcleos de las células se tiñeron con el flouróforo TOPRO-3 iodide, que emite fluorescencia a 661 nm (círculos rellenos). Se observa una fuerte reactividad en el citoplasma (flechas blancas) solo en células infectadas cuando se utiliza cualquiera de los tres anticuerpos primarios.

Figura 6: Detección de hMPV en muestras clínicas mediante ELISA en sándwich, utilizando la combinación de los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 3G8/C11 y 7G4/A12. Placas de ELISA fueron activadas con 170 ng de anticuerpo secretado por el hibridoma 3G8/C1 1 , funcionando como anticuerpo de captura. Los pocilios activados con el anticuerpo de captura se incubaron con 50 μΙ de muestras de hisopado nasofaríngeo (HNF) de pacientes que presentaban cuadros respiratorios virales. Como controles negativos se analizaron 10 muestras de pacientes sanos. Se utilizaron 20 muestras de pacientes positivos para hMPV y, como control de especificidad, se incluyeron 20 muestras de pacientes positivos para el Virus Respiratorio Sincicial. Como control positivo se incluyeron pocilios a los que se añadió proteína M-hMPV purificada. Para la detección de la proteína capturada por el anticuerpo 3G8/C1 1 , se utilizaron los anticuerpos producidos por el hibridoma 7G4/A12, conjugados a la enzima Horseradish Peroxidase, en una dilución 1 :2000 (75 ng por pocilio). Los datos mostrados son el promedio +/- la desviación estándar del valor de la absorbancia emitida a 450 nm de cada muestra ( ^** P<0,01 ^*** P <0,0001 y ns no hay diferencia significativa; mediante el test de ANOVA de una vía comparados con pacientes positivos a RSV o pacientes sanos).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO

La presente invención se refiere a dos anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, del isotipo lgG2A, que reconocen específicamente la proteína M (también aquí denominados como anticuerpos anti-M), del Metapneumovirus humano (hMPV).

Un anticuerpo monoclonal es un tipo de anticuerpo homogéneo que se caracteriza por reconocer específicamente un solo antígeno. Son producidos por una única célula híbrida (hibridoma), que es producto de la fusión de un clon de linfocito B y una célula plasmática tumoral. La propiedad de unirse específicamente y con alta afinidad a un antígeno ha impulsado el desarrollo de los anticuerpos monoclonales como una herramienta de gran utilidad para la detección de moléculas que generan un gran interés científico, clínico y de uso industrial. En la actualidad, los anticuerpos monoclonales son ampliamente utilizados, tanto en investigación básica como aplicada, debido a su especificidad y reproducibilidad, lo que permite fundamentar de mejor manera la investigación. Sin embargo, es en el área de la biomedicina donde los anticuerpos monoclonales han tenido enormes aplicaciones prácticas, ya sea para diagnóstico y tratamiento de múltiples enfermedades infecciosas, y como terapia para otras patologías. Si bien es cierto que los anticuerpos monoclonales se utilizan en todo tipo de técnicas de detección y diagnóstico, es en el diseño de kits para diagnóstico in vitro donde se han obtenido los mejores resultados. Para ello, existen en la actualidad diversos kits de detección rápida, tal como el test de embarazo, que se basa en la determinación de los niveles de gonadotrofina coriónica (hCG) en la orina utilizando anticuerpo anti hCG. Además, los anticuerpos monoclonales para uso terapéutico han cobrado gran relevancia. En la actualidad existen tratamientos terapéuticos para distintas patologías, mediante el uso de anticuerpos monoclonales comerciales como: Alemtuzumad, Gemtuzumab ozogamicina, Rituximab, Trastumab, entre otros.

Los inventores de la presente invención han desarrollado dos anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente la proteína M de hMPV. Como ya se indicó, estos anticuerpos son producidos por los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ambas cadenas del anticuerpo producido por el hibridoma 3G8/C11 se describen en las SEQ ID No.:1 para la cadena pesada y SEQ ID No: 2 para la cadena liviana. Las secuencias nucleotídicas que las codifican están descritas en las SEQ ID No: 3 y SEQ ID No: 4, respectivamente. Del mismo modo, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ambas cadenas del anticuerpo producido por el hibridoma 7G4/A12 se describen en las SEQ ID No: 5 para la cadena pesada y SEQ ID No:6 para la cadena liviana. Las secuencias nucleotídicas que las codifican están descritas en las SEQ ID No: 7 y SEQ ID No:8, respectivamente. Un experto en la técnica podría, a partir de estas secuencias variables, construir anticuerpos quiméricos que las comprendan, incluyendo ya sea sólo una de las regiones variables, o mezclándolas en todas las combinaciones posibles. Todas esas realizaciones se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Es decir, la presente invención incluye anticuerpos que comprendan al menos una de las secuencias SEQ ID No: 1 , SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 5 y SEQ ID No: 6 y secuencias similares con hasta un 90%, 95% o 99% de homología o identidad respecto a cualquier de dichas secuencias de aminoácidos. Así como las secuencias nucleotídicas que comprendan al menos una de las secuencias SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No. 7 y SEQ ID No. 8, así como sus reversos complementarios y secuencias similares con hasta un 80%, 85%, 90%, 95% y 99% de homología o identidad respecto a cualquiera de dichas secuencias nucleotídicas. El mayor grado de homología considerado en las secuencias nucleotídicas se basa en la degeneración del código genético. De esta manera, la presente invención también incluye un conjunto de secuencias nucleotídicas que codifican para un anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, que reconoce específicamente la proteína M de hMPV.

Como se muestra en las figuras 1 y 4, estos anticuerpos no reaccionan con otras proteínas o moléculas presentes en virus relacionados o muestras de pacientes con otros virus asociados a infecciones respiratorias. Esto disminuye notablemente la posibilidad de falsos negativos al utilizarlos en métodos de diagnóstico.

A continuación se describen ejemplos que permiten demostrar las distintas aplicaciones de los anticuerpos monoclonales de la invención.

Ejemplo 1 : Determinación de la secuencia nucleotídica que codifica las cadenas livianas (VL) y pesadas (VH) de la región variable del anticuerpo anti M hMPV secretado por el hibridoma 3G8/C11.

El hibridoma 3G8/C1 1 se creció en medio de cultivo DMEM-high glucose suplementado con 3,7 g/L de Bicarbonato de Sodio y 10% de suero fetal bovino, a 37° C con 10% CO2, hasta una densidad celular de 700.000 células/ml. Se obtuvo el RNA total de 3,5 x10 ⁶ células, realizando un tratamiento con el compuesto Trizol (Invitrogen). Se utilizó 0,5 μg de RNA para generar el cDNA mediante reacción de retrotranscripción con el kit Impron II (Promega). Mediante PCR se amplificó la región variable de los genes que codifican las cadenas kappa y lambda de las inmunoglobulinas. Para esto se utilizaron los partidores universales del kit Ig Primer set de Novagen (n ^Q catálogo 69831 -3) y se siguieron las instrucciones del fabricante. La región variable de la cadena liviana se amplificó con los partidores MulgKVL5'-B: 5' G G G AATTC ATGG AG AC AG AC AC ACTC CTG CTAT 3' (SEQ ID NO: 9) y MulgKVL5'-C: 5'ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT3' (SEQ ID NO: 10) y la cadena pesada se amplificó con los partidores MulgVH5'-A: 5' G G G AATTC ATG RASTTS KG G YTM ARCTKG RTTT3' (SEQ ID NO: 1 1 ) y MulgVH5'-F: 5'ACTAGTCGACATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT3' (SEQ ID NO: 12). Los productos de PCR fueron clonados en el vector de clonamiento pTOPO-TA (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y secuenciado por el servicio de secuenciacion de la Pontificia Universidad Católica de Chile en un secuenciador Abl prism 3130x1 (Applied Biosystem). La secuencia de aminoácidos deducida se obtuvo utilizando el programa bioinformático Vector NTI (Invitrogen).

Ejemplo 2: Determinación de la secuencia nucleotídica que codifica las cadenas livianas (VL) y pesadas (VH) de la región variable del anticuerpo anti M hMPV secretado por el hibridoma 7G4/A12. El hibridoma 7GA/A12 se creció en medio de cultivo DMEM-high glucose suplementado con 3,7 g/L de Bicarbonato de Sodio y 10% de suero fetal bovino, a 37° C con 10% CO2, hasta una densidad celular de 700.000 células/ml. Se obtuvo el RNA total de 3,5 x10 ⁶ células con Trizol (Invitrogen) y se utilizó 0,5 μg de RNA para generar el cDNA mediante reacción de retrotranscripción con el kit Impron II (Promega). Mediante PCR se amplificó la región variable de los genes que codifican las cadenas kappa y lambda de las inmunoglobulinas. Para esto, se utilizaron los partidores universales del kit Ig Primer set de Novagen (n ^Q catálogo 69831 -3) y se siguieron las instrucciones del fabricante. La región variable de la cadena liviana se amplificó con los partidores MulgKVL5'-B: 5' G G G AATTC ATGG AG AC AG AC AC ACTC CTG CTAT 3' (SEQ ID NO: 9) y MulgKVL5'-C: 5'ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT3' (SEQ ID NO: 10) y la cadena pesada se amplificó con los partidores MulgVH5'-A: 5' G G G AATTC ATG RASTTS KG G YTM ARCTKG RTTT3' (SEQ ID NO: 1 1 ) y MulgVH5'-F: 5'ACTAGTCGACATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT3' (SEQ ID NO: 12). Los productos de PCR fueron clonados en el vector de clonamiento pTOPO-TA (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y secuenciado por el servicio de secuenciación de la Pontificia Universidad Católica de Chile en un secuenciador Abl prism 3130x1 (Applied Biosystem). La secuencia de aminoácidos deducida se obtuvo utilizando el programa bioinformático Vector NTI (Invitrogen).

Ejemplo 3: Ensayo de detección de antígenos hMPV, determinación de especificidad de los anticuerpos monoclonales anti M hMPV para antígenos purificados de hMPV mediante ensayo de ELISA indirecto. Este ensayo tiene como objetivo demostrar la especificidad por la proteína M de hMPV de los anticuerpos producidos por los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12. La detección del antígeno se llevó a cabo mediante la técnica de ELISA indirecto, donde la placa de ELISA se activó con 50 ng de antígeno purificado por 1 hora a 37°C. De igual manera se activó la placa con 1 x10 ⁶ unidades formadoras de placas (ufp) del hMPV. Como controles negativos se incluyó Virus Respiratorio Sincicial (VRS) bajo las mismas condiciones en que se incubó el hMPV, y además se incluyeron 50 ng de proteína de BSA en un pocilio independiente. Posteriormente, la placa se lavó dos veces con buffer fosfato salino (PBS) /Tween 0,05%. Luego la placa se bloqueó por 2 horas a 37° C con PBS /FBS 10%. Posteriormente se repitieron los lavados y a continuación se incubaron cada uno de los anticuerpos (3G8/C1 1 y 7G4/A12) a una concentración final de 3,4 μg/ml, diluidos en PBS/FBS 10%, por 1 hora a temperatura ambiente (cada anticuerpo en una placa independiente). Bajo las mismas condiciones, en una placa diferente, se realizó un ensayo control utilizando un anticuerpo monoclonal comercial que reconoce la proteína M de hMPV (Anti-Human Metapneumovirus 75.1 Anticuerpo, clone 1 B7, número de catálogo MAB8510, EMD Millipore) a una concentración de 13,6 μg/ml. Transcurrido el tiempo de incubación, se repitieron los lavados y se agregó a cada uno de los pocilios un anticuerpo secundario anti- IgG de ratón marcado con la enzima peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase, HRP) en dilución 1 en 2000 (25 ng por pocilio) en PBS/FBS 10%, por 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se realizaron los lavados y se reveló con 50 μΙ de buffer citrato/Tetrametilbenzidina (TMB, 3-3'-5- 5'tetramethylbenzidine, 1 mg/ml, Becton Dickinson). Para detener la reacción se adicionaron 50 μΙ de H2SO4 2N y el resultado se leyó en un lector de ELISA, a 450nm. Para determinar que la reacción del anticuerpo secundario era especifica en reconocer al anticuerpo primario y además que la señal obtenida no sea provocada por unión inespecífica del anticuerpo secundario al antígeno viral, se realizaron controles en los cuales se utilizó solamente el anticuerpo secundario sin anticuerpo primario ni muestra (pocilio sin activar). Otro control para determinar que la reacción del anticuerpo primario es específica para el antígeno, consistió en el uso de los anticuerpos sobre una placa de ELISA que no ha sido activada con el antígeno (pocilio sin antígeno) o usando los anticuerpos sobre una placa de ELISA que poseía 50 ng de la proteína BSA ó un virus diferente (VRS). Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonales de la invención son capaces de reconocer 50 ng de antígeno purificado, de manera especifica, ya que no reconocen la proteína BSA, ni proteínas de otro virus relacionado (Figura 1 A y 1 B). Por otro lado se observó que el anticuerpo comercial (Figura 1C) utilizado en el ensayo como control, aunque fue específico para la detección del virus, no fue eficiente en detectar la proteína M de hMPV recombinante purificada en nuestro laboratorio.

Ejemplo 4: Ensayo para determinar la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales para la detección de antígenos virales.

El ensayo se realizó para determinar la máxima dilución de proteína y virus que los anticuerpos monoclonales anti-M de hMPV provenientes de los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12 son capacez de detectar mediante ELISA indirecto. Para esto, se ocupó la misma técnica descrita en el ejemplo 4. Se activó la placa con 1 1 diluciones seriadas 1 :2 de proteína M de hMPV, partiendo con 50 ng de antígeno purificado. Respecto al virus, se activó la placa con diluciones seriadas de 1 :2, a partir de 1 x10 ⁵ ufp de virus. Los anticuerpos anti-M 3G8/C1 1 o 7G4/A12, se utilizaron en una concentración de 3,4 μς/ιηΙ (170 ng/pocillo), diluidos en PBS/FBS 10%. Posteriormente se adicionó el anticuerpo de detección anti-lgG de ratón en una dilución de 1 :2.000 (25 ng/pocillo). Los resultados mostraron que el anticuerpo anti-M 3G8/C1 1 es capaz de reconocer hasta 190 picogramos (pg) de la proteína M de hMPV. El anticuerpo anti-M proveniente del hibridoma 7G4/A12, fue más sensible y detectó hasta 90 pg de la proteína M de hMPV (Figura 2A).

En cuanto a la sensibilidad de los anticuerpos representada en su capacidad de detectar el hMPV en altas diluciones, se pudo observar que los anticuerpos anti-M provenientes del hibridoma 3G8/C1 1 pueden detectar diluciones de hasta 1 en 60 del virus, mientras que el anticuerpo proveniente del hibridoma 7G4/A12 es capaz de detectar la proteína en el virus en una dilución de 1 :2.560, lo que sería equivalente a unas 390 partículas virales aproximadamente (Figura 2B).

Se evaluó la capacidad del anticuerpo comercial de Millipore de detectar el virus, realizando diluciones 1 :2 a partir del 1 x10 ⁶ ufp. Se pudo determinar que el anticuerpo es capaz de detectar 1 x10 ⁶ ufp y dos diluciones más, es decir, hasta una dilución de 1 :4 del virus total (Figura 2C). Se incluyeron en todos los ensayos controles que permitieran descartar reacciones inespecíficas tanto de los anticuerpos, los cuales contenían todos componentes del ensayo exceptuando la muestra (proteína M hMPV o virus). Ejemplo 5: Ensayo para determinar la eficiencia de los anticuerpos monoclonales para detectar antígenos virales.

El ensayo se realizó para determinar la máxima dilución de los anticuerpos monoclonales anti-M de hMPV provenientes de los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12, que permiten la detección del antígeno viral. Para esto, se ocupó la misma técnica de ELISA indirecto del ejemplo 4. Se activó la placa con 50 ng de antígeno purificado y los anticuerpos anti-M 3G8/C1 1 o 7G4/A12 se utilizaron en diluciones 1 :2, partiendo de la concentración de trabajo (3,4 μg/ml) hasta la dilución 1 1 en PBS/FBS 10%. En la figura 3 se observa que a todas las diluciones que se utilizaron en el ensayo, los anticuerpos anti-M 3G8/C1 1 y 7G4/A12 son capaces de detectar la proteína M de hMPV.

El control negativo incluido en este ensayo, corresponde a un pocilio que no contiene muestra (proteína M), fue bloqueado con PBS/FBS 10%, no se le adicionó anticuerpo primario (anti-M 3G8/C1 1 ó anti-M 7G4/A12) y sólo contiene anticuerpo anti-lgG de ratón conjugado con HRP.

Ejemplo 6: Ensayo de especificidad de los anticuerpos monoclonales anti M hMPV para antígenos purificados de hMPV, mediante el ensayo de Dot-Blot.

Este ensayo tiene como objetivo confirmar la especificidad por la proteína M de hMPV de los anticuerpos producidos por los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12, utilizando la metodología de immunoblot. La detección del antígeno se llevó a cabo mediante la técnica de dot-blot, donde una membrana de nitrocelulosa es utilizada como soporte sólido para inmovilizar el antígeno presente en una gota de suspensión. Para ello, se depositó sobre la membrana de nitrocelulosa 20 μΙ que contenían cada una: 1 x10 ⁶ ufp de RSV, 1 x10 ⁶ ufp hMPV, proteína M de hMPV purificada (1 μg, 500 ng y 50 ng), 20 μg de extracto de células LLC-MK2 infectadas con hMPV y 20 μg de extracto de células LLC-MK2 sin infectar. Como control negativo se aplicaron 500 ng de BSA, contenidos en 20 μΙ. Se permitió que las soluciones aplicadas sobre la membrana secaran al aire por 15 minutos. Posteriormente, la membrana se bloqueó con BSA al 5% en PBS conteniendo Tween-20 0.05%, por 1 h a 25° C. Las membranas fueron incubadas con 3,4 μg/ml de anticuerpo monoclonal anti-M proveniente del hibridoma 3G8/C1 1 o del hibridoma 7G4/A12 en solución de bloqueo por 1 h a 25° C. Luego se retiró el exceso de anticuerpo no adherido al antígeno mediante tres lavados con PBS-Tween-20 0,05% a 25° C. La detección de los anticuerpos unidos al antígeno se realizó mediante un anticuerpo anti IgG de ratón conjugado a HRP (Invitrogen, Life Technologies #62-6520). Este se incubó por 1 h en solución de bloqueo a 25° C, para posteriormente eliminar el exceso de anticuerpo no unido mediante tres lavados con PBS-Tween-20 0,05% a 25° C. La visualización de la unión de los anticuerpos monoclonales al antígeno se realizó mediante la captura de la quimioluminiscencia producida por la catálisis de sustrato comercial "enhanced chemiluminescence Western blot detection system" (ECL, Amersham, Uppsala, Sweden), mediado por la enzima HRP unida al anticuerpo anti-lgG de ratón. La captura de la quimioluminiscencia se realizó con el sitema de fotodocumentacion MyECL (Thermo Fisher). Como se observa en la figura 4, los anticuerpos proveniente de los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12 sólo se unen a los "dots" que contienen hMPV o proteína M, y no se unen de manera inespecífica a los "dots" que contienen proteínas no relacionadas, otros virus o células no infectadas.

Ejemplo 7: Detección de infección por hMPV en células LLC-MK2 mediante Inmunoflourescencia, utilizando anticuerpos monoclonales anti- M hMPV

Este ensayo fue realizado para ampliar el espectro de técnicas que permiten detectar infección por hMPV, utilizando la invención descrita. Se llevó a cabo un ensayo por microscopía de fluorescencia, donde células LLC-MK2 infectadas o sin infectar con hMPV fueron incubadas con los anticuerpos monoclonales anti-M de hMPV derivados de los hibridomas 3G8/C1 1 o 7G4/A12. El protocolo utilizado fue el siguiente: las células fueron fijadas con paraformaldehido 4% diluido en PBS, por 10 minutos a 25° C. Luego, las células fueron lavadas con PBS y se permeabilizaron con saponina 0,2% diluida en PBS/FBS 10% por 30 minutos a 25° C. Se adicionaron los anticuerpos monoclonales derivados de los hibridomas 3G8/C1 1 o 7G4/A12 a una concentración de 3,4 μς/ιηΙ, diluidos en PBS/FBS 10% por 1 hora a 25° C. Se realizaron posteriormente dos lavados con PBS y se adicionó el anticuerpo secundario anti-lgG de ratón conjugado al fluoroforo Alexa flúor 488 (Life Technologies), en dilución 1 en 200 en PBS/FBS 10% por 1 hora a 25° C, en oscuridad. Se repitieron los lavados y se tiñeron los núcleos con TOPRO-3 iodide 642/661 (Invitrogen, #T3605) a una dilución 1 :5.000 por 15 minutos a 25° C, en oscuridad. Por último se lavó con PBS y se realizó el montaje de los cubreobjeto para su posterior observación en un microscopio de epifluorescencia. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos constituyente de la invención también son útiles para poder reconocer específicamente células infectadas mediante inmunofluorescencia, sin unirse de manera inespecífica a células no infectadas (Figura 5).

Ejemplo 8: Diagnóstico clínico de muestras de pacientes infectados con hMPV, utilizando los anticuerpos monoclonales anti- M hMPV proveniente de los hibridomas 3G8/C11 y 3G8/C11 , mediante la técnica de ELISA de captura o sandwich.

Debido a que la disponibilidad y concentración de las proteínas virales en muestras clínicas obtendidas de hisopados nasofarígeos es baja, fue necesario modificar el método de detección y utilizar el método de ELISA de captura o en sandwich, usando como anticuerpo de captura el anticuerpo anti-M proveniente del hibridoma 3G8/C1 1 y como anticuerpo de detección el clon anti-M 7G4/A12, conjugado con HRP. Para el ensayo se activaron pocilios de una placa de ELISA con 3,4 μg/ml (170 ng /pocilio) del anticuerpo anti-M proveniente del hibridoma 3G8/C1 1 , diluido en PBS, durante 1 hora a 37 ^Q C. Se realizaron 2 lavados con PBS-Tween20 al 0,05% y posteriormente se bloqueó la placa con 200 μΐ de PBS/FBS al 10% durante 2 horas a 37 ^Q C. Se lavó nuevamente y se incubó toda la noche a 4 ^Q C cada pocilio con 50 μΐ de aspirados nasofaríngeos de pacientes positivos para hMPV de acuerdo al método de diagnóstico "D ³ Ultra DFA Respiratory Virus Screening and ID Kit de DHI (Diagnostics Hibryds) USA", denominado de manera rutinaria como "panel viral", y que fueron tratadas como se describe posteriormente ^* . Como controles se incluyeron: 1 ) control de especificidad (50 μΐ de muestra de pacientes diagnosticados con VRS mediante el panel viral), 2) control positivo (50 ng de proteína M hMPV recombiante) y 3) Control negativo correspondiente a muestras de pacientes sanos (negativos para virus mediante el panel viral). Al día siguiente se realizaron los lavados y cada pocilio se incubó por 1 hora a temperatura ambiente con 50 μΙ_ del anticuerpo anti- M proveniente del hibridoma 7G4/A12 conjugado con HRP. Se lavó la placa 2 veces más y se reveló con 50 μΙ_ de solución TMB, se incubó de 10 a 15 minutos en oscuridad. La reacción se detuvo con 50 μΐ de H2SO4 2N. La lectura de la placa se realizó en un lector de ELISA Epoch, certificado para diagnóstico clínico. Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la figura 6, donde se puede observar que la técnica de ELISA en sandwich utilizando el anticuerpo proveniente del hibridoma 3G8/C1 1 como anticuerpo de captura y el anticuerpo proveniente del hibridoma 7G4/A12-HRP como anticuerpo de detección, permite detectar el antígeno en muestras de pacientes infectados con hMPV, los cuales fueron previamente confirmados por Inmunofluorescencia directa en un laboratorio clínico certificado utilizando el panel viral. El número de pacientes incluidos en el ensayo fue de 20, de los cuales 1 8 fueron detectados como positivo por ELISA con una densidad óptica (OD) por encima de 0,1 . Este ensayo demuestra además la versatilidad que presentan los anticuerpos provenientes de los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12, ya que son capases de unirse simultáneamente al antígeno sin competir ni interferir entre sí, permitiendo la captura y posterior detección de la proteína M en muestras de pacientes.

^* : Tratamiento de muestras clínicas. Las muestras que se utilizaron para los ensayos fueron obtenidas a partir de hisopados nasofarígeos contenidos en medio de transporte universal. Se centrifugaron las muestras a 2.000 rpm durante 10 minutos a 4 ^Q C. Posteriormente se separó el sobrenadante (SN1 ) del pellet; este ultimo fue incubado con 100 μΙ_ de Buffer RIPA (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCI, 1 % NP-40, 0,5% Deoxicolato de Sodio, 0,1 %, SDS e un coctel de inhibidores de proteasas) durante 15 minutos a 4 ^Q C, agitando por vortex cada 5 minutos. A continuación se centrifugó a 2.000 rpm durante 10 minutos a 4 ^Q C. Al finalizar se tomó el sobrenadante obtenido (SN2) y se mezcló con el SN1 .

Los ejemplos descritos en esta memoria descriptiva demuestran la especificidad, eficiencia, sensibilidad y versatilidad que tiene estos anticuerpos monoclonales anti-M de hMPV secretado por las líneas celulares de los hibridomas 3G8/C1 1 y 7G4/A12. Los ejemplos aquí presentados constituyen una demostración de algunos de los usos de los anticuerpos monoclonales anti-M de hMPV, pero en ningún caso limitan el alcance de la presente invención.