DILϋEUR DE SPERME COMPRENANT UN DERIVE D'INDOLE.

La présente Invention est relative à l'utilisation de dérivés d'indole pour améliorer la survie des spermatozoïdes et leur aptitude à la fécondation, en vue de l'insémination artificielle ou de toute autre pratique de reproduction assistée.

Les techniques d'insémination artificielle qui sont de plus en plus utilisées actuellement, posent des problèmes de conservation du sperme en attente de l'insémination.

Chez certaines espèces, ces problèmes sont partiellement résolus en procédant à la congélation du sperme. Néanmoins, chez d'autres espèces, cette congélation est difficile, voire impossible, dans la mesure où elle entraîne la destruction ou 1 ' inactivation d'un nombre trop important de spermatozoïdes. Même chez les espèces où la congélation est possible, on observe toujours une perte notable dans le pourcentage de spermatozoïdes mobiles. Pour remédier à cette situation, il a été proposé d'agir sur la composition du milieu dans lequel le sperme est dilué suite à son prélèvement, et préalablement à son utilisation ou à sa congélation (ce milieu sera ci-après dénommé "dilueur") . Différents dilueurs de sperme ont été ainsi préconisés, dans le but d'améliorer la conservation et la capacité fécondante des spermatozoïdes. Tous ces dilueurs doivent tenir compte d'un certain nombre d' impératifs physico-chimiques tels que : - avoir une pression osmotique isotonique,

- contenir des substances tampons capables de maintenir le pH voisin de la neutralité, contenir des substances nécessaires au métabolisme du spermatozoïde, - être dépourvus d'agents bactériens.

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On citera par exemple les compositions suivantes qui sont les plus couramment utilisées :

1) Dilueurs utilisés dans 1 ' espèces porcine : De nombreux dilueurs ont été utilisés pour la conservation de la semence de verrat à l'état liquide. Leur composition est souvent similaire qualitativement, mais présente des différences notables au point de vue des concentrations, ce qui entraîne des variations importantes de pH et de pression osmotique. D'une manière générale, ces dilueurs sont composés des éléments suivants :

Le glucose, mieux assimilé par les spermatozoïdes que le fructose, est la meilleure source d'énergie. Il contribue également au maintien de l'équilibre osmotique du milieu.

- Le citrate de sodium, le bicarbonate de sodium, et le Tris (trihydroxyméthylaminométhane) , sont les tampons préférentiellement utilisés pour la semence de verrat. - L'EDTA, contenu dans la plupart des dilueurs, jouerait un rôle de stabilisateur du volume cellulaire [BREDDERMAN et FOOT, Expl. Cell. Res. , vol. 66, p. 458-464 (1971)]. En outre, par ses propriétés chélatrices, il préviendrait la peroxydation des phospholipides membranaires, néfaste pour le maintien du pouvoir fécondant [SHANON et CORSON, J. Dairy Sci., vol. 5, p. 614-620, (1992) ] .

Tous ces éléments sont dissous dans de 1 'eau distillée. Pour apprécier l'efficacité des différents dilueurs, on procède classiquement à la détermination du pourcentage de spermatozoïdes mobiles et de leur pouvoir fécondant, après conservation pendant une période donnée dans le dilueur considéré. Actuellement, le dilueur dénommé BTS, dont la composition est indiquée ci-dessous, est celui qui a donné les meilleurs résultats pour la

dilution et la conservation à 15'C de la semence porcine, que celle-ci soit prélevée à la ferme ou dans un centre de reproduction. Il peut être utilisé jusqu'au 3ème jour après la récolte sans chute significative de la fertilité ou de la prolificité.

Composition du BTS :

Glucose 37 g

Citrate de sodium , 2H20 6,0 g Bicarbonate de sodium 1,25 g

EDTA 1,25 g

Chlorure de potassium 0,75 g

Eau distillée qsp 1000 ml

2) Dilueurs utilisés dans l'espèce caprine Deux types de dilueurs ont été principalement étudiés

- Les dilueurs composés exclusivement de sels minéraux

- Les dilueurs à base de lait ou de jaune d' oeuf.

Le jaune d'oeuf protégerait les spermatozoïdes des chocs thermiques. Cette action serait liée aux composés lipoprotéiques et lipidiques de 1 ' oeuf [KAUPSCHMIDT, J. Dairy Sci., vol. 34, p. 44-51, (1953)] .

Le lait, riche en protéines, matières grasses et sucres, est un élément nutritif de choix pour les spermatozoïdes à condition d'être préalablement chauffé à 56'C pendant 15 minutes afin de détruire certaines protéines spermicides qu'il contient. Cependant, des travaux récents semblent montrer l'existence d'une interaction entre une triglycéride lipase du plasma séminal et les triglycérides du lait, entraînant une diminution de la motilité des- spermatozoïdes [PELICER- RUBIO et COMBARNOUS, Communication 7èmes journées Internationales de Reproduction Animale ; Murcie ; Juillet 1994] .

La comparaison des différents dilueurs, par 1'évaluation du pourcentage de spermatozoïdes mobiles et par leur pouvoir fécondant après conservation, a permis d'aboutir aux constatations suivantes : Les dilueurs salins, d'une manière générale, donnent de mauvais résultats [DAUZIER, International Encyclopedia, Vet. Médecine, p. 269-271, (1966)].

Les dilueurs à base de jaune d'oeuf donnent de très mauvais résultats. Il a été montré que le plasma séminal de l'espèce caprine contient une phospholipase A qui hydrolyse la lécithine du jaune d'oeuf en lysolécithine et acides gras, lesquels ont un effet spermicide.

Les meilleurs résultats ont été obtenus avec le dilueur à base de lait, dont la composition est indiquée ci-dessous, et qui est actuellement utilisé classiquement pour des durées de conservation allant jusqu'à 12 heures, sans qu'il y ait chute de la prolificité ou de la fertilité. Composition du dilueur caprin à base de lait :

. Lait écrémé reconstitué 10 g . Glucose 194 mg

. Eau distillée qsp 100 ml Le mélange est porté à ébullition pendant 15 minutes avant utilisation.

3) Dilueur utilisé dans l'espèce ovine

Les études de conservation effectuées sur la la semence ovine sont sensiblement les mêmes que celles qui ont été menées dans l'espèce caprine. La composition du dilueur classiquement utilisé pour les ovins, indiquée ci-dessous, est similaire à celle du dilueur caprin, et comprend en outre des antibiotiques. Ce dilueur permet de conserver le pouvoir fécondant du sperme ovin pendant 8 heures à 15"C.

Composition du dilueur ovin :

100 ml eau distillée chauffée à 60"C 0,33 g de sulfamides refroidir à 20-25"C 11,1 g de lait écrémé reconstitué bain marie 15 min à 60"C refroidir à température ambiante + 0,11 g de streptomycine et 100000 UI de pénicilline. 4) Dilueur utilisé dans l'espèce bovine

Le dilueur le plus classiquement utilisé chez les bovins est un dilueur à base de lait écrémé reconstitué à partir du lait en poudre, qui est commercialisé sous le nom de LAICIPHOS ND. Le lait a un effet protecteur accru s'il est additionné de 10% de jaune d'oeuf de poule et d'antibiotiques.

Ce dilueur permet une conservation de la semence jusqu'à 72 heures à 5 ^* C.

5) Dilueur utilisé chez le lapin Le dilueur utilisé par la majorité des éleveurs est un dilueur à base saline commercialisé par la société IMV sous le nom de DYLAP 2000.

Ce dilueur permet une conservation de la semence de lapin pendant 6 à 8 heures. 6) Dilueurs utilisés chez les poissons

(salmonidés)

Une solution minérale simulant la composition du liquide séminal de truite (dénommé MMLS, et dont la composition est indiquée ci-dessous) constitue un milieu qui permet une conservation satisfaisante, à une température voisine de 0 ^* C, de la fertilité des gamètes de truite arc-en-ciel. La fécondance des spermatozoïdes subsiste sans diminution pendant 30 minutes.

Composition du MMLS

NaCl 110 mmol/1

KC1 28,3 mmol/1

MgS04 (7H20) 1,1 mmol/1 CaC12 (2H20) 1,8 mmol/1.

Ce dilueur de conservation permet une bonne survie des gamètes aussi bien avant qu' après insémination.

Toutefois, dans ce milieu, les spermatozoïdes restent immobiles, surtout du fait des fortes concentrations en ions potassium [SCHLENK et KAHMANN, Biochem. Z., vol. 295, p. 283-301, (1937) ; BILLARD et JALABERT, Ann. Biol. Anim. Bioch. Biophys. , vol. 14, p. 601-610, (1974) ] . Pour permettre une reprise de la motilité des spermatozoïdes lors de l'addition des ovules, il est préférable d'avoir recours à un dilueur d'insémination, constitué par une solution de NaCl (posm 250, pH 9 à 9,5) . Celui-ci est ajouté au sperme (préalablement dilué dans le MMLS) et aux ovules lors de l'insémination.

Cette technique qui fait intervenir deux dilutions successives permet d'obtenir un pourcentage de fécondation maximum.

7) Dilueurs utilisés chez les volailles Le sperme des oiseaux domestiques ne reste que quelques minutes (pintades) à quelques dizaines de minutes (coq) à l'optimum de son pouvoir fécondant s'il est stocké à l'état pur et à température ambiante. Le refroidissement du sperme à température comprise entre 2 et 12 'C permet d'augmenter ce délai, à condition d'utiliser, de plus, des dilueurs capables de maintenir ce pouvoir fécondant. Leur composition (pH, pression osmotique, espèce chimique) , a manifestement un rôle primordial, mais n'a pu être définie qu'empiriquement. Les solutions actuellement existantes

(dilueurs utilisés à raison de 1 à 2 volumes par volume

de sperme, avec ou sans aération du mélange) permettent une conservation satisfaisante pour un délai ne dépassant pas 6 heures. Au delà, il y a le plus souvent une diminution de 5 à 25 points ou plus du taux de fécondation des oeufs, qui ne peut dans la plupart des cas, être compensée par un plus grand nombre de spermatozoïdes inséminés.

Deux types de dilueurs ont été préconisés : - des dilueurs comprenant de nombreux cations (Na+, K+, Mg++... ) et anions organiques (acétate, glucose, glutamate) , tels que le dilueur dénommé BPSE, dont la composition est donnée ci-dessous. Composition du BPSE : citrate de potassium 0,64 g . glutamate de potassium 8,67 g acétate de sodium 4,3 g chlorure de magnésium 0,34 g fructose 5,0 g dipotassium hydrogénophosphate 12,7 g . monophosphate de potassium 0,65 g

TES 2,5 g

Eau distillé qsp 1000 ml. des dilueurs plus simples tels qu'une solution de tampon TES (Tris-EDTA-Saline) , dont la composition est indiquée ci-dessous.

Composition du tampon TES : . TES 6,56 g

. NaOH 7,00 ml

. eau distillée qsp 100 ml. Quelle que soit leur composition, les dilueurs connus ne permettent une conservation du pouvoir fécondant des spermatozoïdes de coq que pendant une durée n'excédant pas quelques heures à 4"C.

Les Inventeurs ont maintenant découvert que l'addition de dérivés d'indole dans le milieu de dilution du sperme permettait d'augmenter de façon très

significative, par rapport aux dilueurs connus dans l'art antérieur, aussi bien la durée de conservation du sperme, que la motilité des spermatozoïdes, et/ou le taux de fécondation observé. Les dilueurs ainsi obtenus sont en outre efficaces chez un grand nombre d'espèces.

La présente Invention a pour objet un dilueur de sperme comprenant les constituants habituels convenant pour la dilution du sperme d'une espèce déterminée, et caractérisé en ce qu'il comprend en outre un dérivé d' indole.

Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit dérivé d'indole répond à la formule générale (I)

dans laquelle :

Ri représente : - un atome d'hydrogène, un groupement acétamide, un groupement acyle en C- _j __4, lequel peut être substitué en position 2 par un groupement a iné ou par un groupement cétone, un groupement alcool aliphatique primaire en 1-.4, un groupement alkylamine primaire en Cχ. ,

R2 représente :

- un atome d'hydrogène, un groupe méthyle, un groupe hydroxy ou un groupe méthoxy,

R3 représente :

- un atome d'hydrogène.

Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit dérivé d'indole est c-.oisi dans le groupe constitué par l'acide indol-3-carboxylique, l'acide indol-3-pyruvique, l'acide indol-3-butyrique, l'acide indol-3-propionique, l'acide indol-3-glyoxalique, et l'acide indol-3-acétique.

Preferentiellement, ledit dérivé d'indole est l'acide indol-3-acétique.

Selon un autre mode de réalisation préféré d'un dilueur de sperme conforme à l'Invention, ledit dérivé d'indole est présent à une concentration comprise entre 1 μg/ml et 1 pg/ml, preferentiellement entre 1 et 100 ng/ml.

La présente Invention a enfin pour objet un procédé de préparation du sperme en vue de sa conservation, caractérisé en ce que ledit sperme est dilué dans une solution comprenant, outre les constituants habituels des solutions utilisées pour diluer le sperme de l'espèce considérée, un dérivé d'indole tel que défini ci-dessus.

La mise en oeuvre de l' Invention améliore nettement la conservation du sperme en vue de l'insémination artificielle ou de toute autre pratique de reproduction assistée.

Le sperme préparé conformément à 1 ' Invention peut être conservé soit à des températures positives (la température de conservation dépend dans ce cas de l'espèce considérée), soit par congélation, .

La présente Invention : ira mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'utilisation d'un dilueur conforme à l'Invention chez différentes espèces. II doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de

l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 - ESPECE OVINE : EFFET DE L'ACIDE INDOL-3- ACETIQUE SUR Lλ CONSERVATION DE SEMENCE DE BELIER λ L'ETAT LIQUIDE PENDANT 8 HEURES

1. Protocole expérimental a) Animaux

Un groupe de brebis Lacaune (race laitière) réparties en 4 lots de 105 à 136 animaux chacun, a été utilisé pour cette expérimentation.

L'expérimentation a été réalisée sur une période de 2 mois (Juin à Août) . b) Traitement de la semence

La semence est diluée à une concentration finale de 1,4 x 10^ spermatozoïdes/ml :

- ou bien dans du lait écrémé reconstitué à partir de lait en poudre ; ou bien dans du lait écrémé additionné d'acide indol-3-acétique (AIA) , à une concentration de 10 ng/ml.

Le sperme dilué est conservé à une température de +15'C pendant 8 heures.

2. Résultats à la mise bas

Pour chacun des deux groupes testés, le nombre de femelles inséminées (N _] _) , le pourcentage de gestations menées à bien (nombre de mises bas = n) , et le nombre d'agneaux nés (N2), sont notés, permettant le calcul des taux de prolificité, de fertilité et de fécondité, selon les formules suivantes : - taux de fertilité ≈ 100 x (n/Nι_) :

- taux de prolificité = 100 x 2/n)

- taux de fécondité ≈ 100 x ^/N^)

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Les résultats sont indiqués dans le Tableau I ci-dessous

TABLEAU I :

Lait témoin Lait + AIA Effet

8h 8h AIA

Femelles inséminées : 132 136

Mises bas : 84 92

Agneaux nés: 144 159

Fertilité (%) 63,6 67,6 + 6,3%

Prolificité (%) 171,3 172,6 + 0,7%

Fécondité (%) 109,1 116,9 + 7,3%

Ces expériences montrent que lorsque 1'insémination a été réalisée avec des spermatozoïdes conservés en présence d'AIA, la fertilité des brebis a été augmentée de 6,3% et la prolificité de 0,7%.

Au total, le cumul des effets sur ces deux paramètres conduit à une augmentation de 7,3% de la fécondité (nombre d'agneaux nés par femelle inséminée). EXEMPLE 2 - ESPECE CAPRINE : EFFET DE L'ACIDE INDOL-3- ACETIQUE SUR LE POUVOIR FECONDANT DU SPERME DE BOUC SUR QUINZE HEURES.

Pour obtenir un taux élevé de fécondation des ovocytes de femelles donneuses dans l'espèce caprine, l'insémination doit être réalisée in utero par endoscopie environ 24 heures après le début observé de l'oestrus.

La variabilité du moment d'apparition de l'oestrus après traitement de superovulation étant importante, le moment optimal pour l'insémination artificielle peut s'étaler parfois sur 12 à 15 heures. Il est donc important de pouvoir conserver les spermatozoïdes au moins pendant cette durée d'utilisation. Or, lorsqu'ils sont conservés à +4'C dans un dilueur classique à base de lait, on observe une

diminution de la fécondance des spermatozoïdes au-delà de 4 heures de conservation.

Aï ESSAIS D'INSEMINATION ARTIFICIELLE

1. Protocole expérimental a) Semence

Des éjaculats de boucs Alpins produits en fin de saison sexuelle par des mâles soumis à un traitement photopériodique favorable sont utilisés.

Après récolte, chaque éjaculat est divisé en 2 parties, lesquelles sont diluées à +30"C : l'une avec le dilueur à base de lait reconstitué à partir de lait en poudre ;

-l'autre avec le dilueur à base de lait reconstitué à partir de lait en poudre, additionné d'AIA à une concentration de 1 μg/ml.

La semence est mise en paillettes (0.2 ml), contenant 100 x 10^ spermatozoïdes totaux, et conservée à 4 ^* C avant la fécondation. b) insémination L'on procède à l'insémination in utero, sous contrôle endoscopique, de 3 lots de 18 chèvres Alpines et Saanen (100 x 10^ spermatozoïdes par corne utérine), 22 à 26 heures après le début observé de l'oestrus.

L'insémination des chèvres est effectuée en alternance, dans l'ordre des venues en oestrus, avec la semence conservée en présence d'AIA, ou avec celle conservée dans le lait. c) Collecte des embryons

La collecte est effectuée par voie chirurgicale, à J7 ou J8. après insémination. Seuls les embryons jugés de bonne qualité ont été congelés pour être conservés dans l'azote liquide.

2. Résultats

La fécondance du sperme est déterminée par le rapport du nombre d'ovocytes fécondés (embryons précoces)

au nombre total de structures collectées (embryons + ovocytes non-fécondés) .

Les résultats sont indiqués dans le Tableau II ci-dessous : TABLEAU II

LAIT LAIT + AIA

Temps de conservation % ovocytes % ovocytes de la semence fécondés fécondés

1 à 6 .. ures 72 ± 36 66 ± 42 (7) (11)

8,5 à 14,5 heures 58 ± 45 71 ± 35 (16) (12)

Les nombres entre parenthèses indiquent le nombre de femelles de chaque lot.

L'intérêt de l'addition d'AIA au dilueur classique utilisé pour 1 ' insémination des caprins apparaît pour des temps de conservation de la semence assez longs (8,5 à 14,5 heures) où, (malgré une grande variabilité) , on observe que le taux de structures fécondées par rapport au taux de structures collectées est supérieur de plus de 10% dans le cas d'une conservation en présence d'AIA .

B) ETUDE DE LA CONSERVATION DES SPERMATOZOÏDES IN VITRO

1. Procole expérimental

Des boucs de race Saanen et Alpine sont utilisés. La collecte de la semence est effectuée par un opérateur utilisant une chèvre "boute-en-train" et un vagin artificiel maintenu à 37 ^* C.

Différents milieux sont essayés :

. Lait seul (écrémé reconstitué à partir de lait en poudre du commerce)

. Lait + AIA à 1 μg/ml (5.7 x 10 ^"6 M)

Lait + AIA à 1 ng/ml (5.7 x 10 ^" M)

. Lait + AIA à 1 pg/ml (5.7 x 10 ^"12 M) Aussitôt après la récolte, 100 μl de sperme sont dilués dans 2 ml de chacun des milieux ci-dessus, préalablement portés à 37 ^* C. L'ensemble est refroidi et conservé à 4'C dans une chambre froide. 2. Résultats

La semence est examinée afin de déterminer le pourcentage de spermatozoïdes mobiles et la motilite individuelle, immédiatement après dilution, et après 3, 24, 48, et 72 heures de conservation à +4"C.

Pour chaque échantillon, les spermatozoïdes sont observés dans un volume de 7 μl déposé entre lame et lamelle sur la platine chauffante du microscope.

Pour chacun des lots de spermatozoïdes, les caractéristiques suivantes sont déterminées :

. Pourcentage de spermatozoïdes vivants,

Motilite avant insémination artificielle. Pour ce paramètre la vitesse et la qualité du déplacement des spermatozoïdes sont appréciées par un système de cotation chiffrée de 0 à 5 [échelle de BISHOP et al., J. Agric. Science, vol. 44, p. 127, (1954)] selon les appréciations suivantes :

0 : aucun mouvement, tous les spermatozoïdes sont immobiles ; 1 : le spermatozoïde tremble mais ne se déplace pas ; un mouvement flagellaire existe mais ne permet pas le déplacement ;

2 : le spermatozoïde tremble et se déplace sur de très petites distances sans traverser le champ microscopique ;

3 le spermatozoïde est encore tremblant et se déplace sur une trajectoire circulaire dans le champ microscopique ;

4 : le spermatozoïde ne tremble plus et se déplace sur une trajectoire rectiligne ;

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5 : le spermatozoïde se déplace d'une manière fléchante sur le champ microscopique.

Les résultats sont illustrés par les figures 1 et 2 : La Figure 1 représente l'effet de différentes concentrations d'AIA sur le pourcentage de spermatozoïdes mobiles, en fonction du temps, au cours de la conservation à 4"C durant 72 heures des spermatozoïdes de boucs (cercle blanc : lait sans AIA ; carré blanc : lait + lmg/μl d'AIA ; triangle blanc : lait + lng/ml d'AIA ; triangle blanc inversé: lait + lpg/ml d'AIA).

La Figure 2 représente l'efi t de différentes concentrations d'AIA sur la motilite, en fonction du temps, au cours de la conservation à 4'C durant 72 heures, des spermatozoïdes de boucs (cercle blanc lait sans AIA ; carré blanc : lait + lmg/μl d'AIA ; triangle blanc : lait + lng/ml d'AIA ; triangle blanc inversé: lait + lpg/ml d'AIA) .

En ce qui concerne l'évolution du pourcentage de spermatozoïdes mobiles, la diminution régulière de ce paramètre est identique jusqu'à 24 heures, quelles que soient les concentrations d'AIA présentes dans les milieux.

La motilite décroît de façon comparable entre lots au cours des 72 heures de conservation quel que soit le milieu de conservation.

Cependant, il existe des différences significatives entre les milieux utilisés (p<0,01) . En présence d'AIA, on observe un meilleur maintien à 24 heures de la motilite, la concentration de 1 ng/ml étant la plus efficace.

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EXEMPLE 3 : ESPECE PORCINE : EFFET DE L'ACIDE INDOL-3- ACETIQUE SUR LA CONSERVATION DE LA SEMENCE DE VERRAT

A. - ESSAIS EN SPERME FRAIS

1) Protocole expérimental L'essai est effectué sur trois lots de truies multipares, en double insémination : une première insémination après 5 jours de conservation (J5) , et une seconde insémination le lendemain. L'expérimentation est effectuée en éjaculats partagés. Lot témoin : Dilueur BTS ; double dose (D) = 6 x 10 ⁹ spermatozoïdes par insémination.

Lot 1 : Dilueur BTS + AIA ; double dose (D) = 6 x 10 ⁹ spermatozoïdes par insémination Lot 2 : Dilueur BTS + AIA ; simple dose (S) = 3 x 10 ⁹ 5 spermatozoïdes par insémination.

2. Résultats

Les résultats après insémination, soit avec les spermatozoïdes dilués dans le dilueur classique BTS, soit avec les spermatozoïdes dilués dans le dilueur 0 conforme à l'Invention, sont présentés dans le Tableau III.

TABLEAU III

Lot témoin Lot 1 Lot 2

BTS(D) BTS+AIA (D) BTS+AIA (S)

J5 J5 J5

Total inséminées 53 86 79

Total mises bas 37 66 65

% Mises bas 69,8 76,7 82,5

Porcelets nés Moyenne/truie 11,3 12,2 11,2 ayant mis bas

Nés vivants Moyenne/truie 10,3 11,2 10,7 ayant mis bas

Nés vivants Moyenne/truie 7,2 8,6 8,8 inséminée

La Figure 3 représente le taux de fertilité de truies inséminées avec du sperme conservé pendant 5 jours dans du dilueur BTS, en absence d'AIA, et à double dose de spermatozoïdes (rectangle hachuré en croisillons) , ou en présence d'AIA, et à simple (rectangle hachuré horizontalement) ou double dose (rectangle hachuré verticalement) de spermatozoïdes.

La Figure 4 représente le taux de prolificité de truies inséminées avec du sperme conservé pendant 5 jours, dans du dilueur BTS, en absence d'AIA et à double dose de spermatozoïdes (rectangle hachuré en croisillons) , ou en présence d'AIA, et à simple (rectangle hachuré horizontalement) ou double dose (rectangle hachuré verticalement) de spermatozoïdes.

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Les augmentations cumulées du nombre de mises- bas et du nombre de porcelets vivants par portée dans les lots inséminés à J5 par de la semence conservée en présence d'AIA (lot 1 par rapport au lot témoin) conduisent à une augmentation très substantielle du nombre final de porcelets vivants par truie inséminée (1,4 porcelet soit +19%) .

Les résultats avec une simple dose de spermatozoïdes (lot 2) avec l'AIA sont aussi bons que ceux obtenus avec une double dose (lot 1), et par conséquent, meilleurs que ceux observés avec une double- dose en absence d'AIA (témoin);

B. ESSAIS EN SPERME CONGELE

1) Protocole expérimental La semence de 5 verrats est congelée selon la méthode de PAQUIGNON (PAQUIGNON, 1974, Technologie de congélation de la semence de verrat, Journée de la recherche porcine, 6, 71-74) . Elle est conservée dans le dilueur BTS, auquel est ou non ajouté l'AIA, soit uniquement dès le début du processus de congélation, soit dès le début du processus de congélation et également au moment du dégel (concentration de 10 ng/ml) . Les doses ainsi préparées ont été utilisées sur des cochettes.

La détection des chaleurs est réalisée de façon précise grâce à un mâle "souffleur". Le moment d'ovulation est déterminé a posteriori par le profil de la courbe de concentration de progestérone plasmatique.

Les cochettes sont inséminées avec la semence congelée (2,5 à 3,0 x 10 ⁹ spz) , en double insémination à 12 heures d'intervalle (1ère insémination, 24 heures après le début des chaleurs) .

Des échographies sont réalisées 21 jours après la première insémination et les cochettes sont abattues à environ 30 jours de gestation afin de réaliser le comptage des embryons et des corps jaunes.

Cette expérience est menée sur 4 lots de 25 femelles chacun :

Lot 1 BTS (—) Lot 2 BTS+AIA (10 ng/ml) au dégel (-+) Lot 3 BTS+AIA (10 ng/ml) à la congélation (+-) ot 4 BTS+AIA (10 ng/ml) à la congélation et au dégel (++)

2. Résultats

Les résultats sont présentés dans le Tableau IV ci-après :

TABLEAU IV

Lot 1 : Lot 2 : Lot 3 : Lot : 4

—- +- ++

Femelles inséminées 23 21 22 20

Femelles gestantes 12 9 13 13

% femelles gestantes 52 49 59 65

(Moyenne) (50,5) (62)

Porcelets/ femelle (moy. ) 8, 6±3 , 2 9, 8±3 , 2 10,4±3,0 10,5±3,2

Porcelets vivants/femelle 8, 0±2, 6 9, 3±2,7 10,1±2,8 10,2±3,3

(Pourcentage) (93 %) (95 %) (97 %) (97 %)

Corps jaunes/ femelle (moy. ) 15,6±3,0 15,2±2,2 16,0±3,4 15,0±3,1

Total vivants/ total femelles inséminées 4,2 4,0 6,0 6,6

(Moyenne) (4,1) (6,3)

Ces résultats montrent que lorsque l'AIA est présent dans le dilueur dès la première étape du processus de congélation (lots 3 et 4), on observe une augmentation des performances de reproduction par rapport

aux lots où l'AIA est toujours absent (lot 1) ou introduit seulement à la décongélation (lot 2) . Plus précisément on observe :

1. Une augmentation du pourcentage de femelles gestantes de 50.5% (moyenne des lots 1 et 2) à 62%

(moyenne des lots 3 et 4). Ces résultats favorables ne sont pas dus aux taux d'ovulation des truies puisque les nombres de corps jaunes sont identiques pour les femelles des quatre lots. L'effet mis en évidence est donc bien dû au traitement de la semence.

2. Une augmentation de la taille des portées de 9.2 (lots 1 et 2) à 10.4 (lots 3 et 4) soit 1.2 porcelets supplémentaires par portée (+ 13%) .

3. Une augmentation des pourcentages de porcelets vivants de 94% (moyenne des lots 1 et 2) à 97%

( lots 3 et 4) soit une augmentation de plus de 3%.

Tous ces effets favorables cumulés conduisent à l'obtention, en moyenne, de 4,1 porcelets vivants par truie inséminée pour les lots 1 + 2 (sans AIA avant congélation), contre 6.3 porcelets vivants par truie inséminée pour les lots 3 + 4 (présence de 10 ng/ml d'AIA dans le dilueur de congélation) .

C'est une augmentation de 65% du nombre de porcelets vivants par femelle inséminée par du sperme congelé qui est ainsi observée lorsque l'AIA est présent dès le début de la procédure de congélation.

EXEMPLE 4 : VOLAILLES : EFFET D'UN DILUEUR CONTENANT DE

L'ACIDE INDOLE-3-ACETIQUE SUR LA CONSERVATION DU SPERME

DE VOLAILLE 1. - Conditions expérimentales

Les essais sont effectués en conditions d'élevage et d'insémination standardisées, notamment :

. Durée d'éclairement : 16 heures (de 1 heure du matin à 17 heures) ; . Période favorable à l'insémination : l'après midi, après 13 heures ;

Insémination effectuée entre 14 et 15 heures, une fois par semaine et par poule ; oeufs collectés du 2ème au 9ème jour après insémination ; . Nombre de poules par lot : 40 ;

Nombre standardisé de spermatozoïdes par dose (100 ±15) x 10 ⁶ .

2 expériences ont été effectuées. 550 à 665 oeufs par lot ont été récoltés.

Dilution du sperme : aussitôt après la récolte, 1/2 (V/V) dans les dilueurs essayés. . Conservation : 24 heures à 4"C. . Lot 1 : TES . Lot 2 : TES + AIA

2. Résultats

Les résultats après insémination soit avec les spermatozoïdes dilués dans le dilueur classique BTS, soit avec les spermatozoïdes dilués dans le dilueur conforme à l'Invention, sont présentés dans le Tableau V :

TABLEAU V

TES TES + AIA

24h / 4'C 24h / 4'C

1ère expérience 67, O± 1,9 70, O± 1,9

(% fécondation)

2ème expérience 65, O± 1,9 77, O± 1,7

(% fécondation)

moyenne 66,0% 73,5%

(% fécondation)

Dans l'élevage industriel des volailles, il est souhaitable de différer le moment de la collecte du sperme de celui de la mise en place chez les femelles. Le délai souhaité peut être de quelques heures seulement, de manière à pouvoir consacrer à la seule mise en place du sperme les heures de la journée les plus favorables à la

réussite des inséminations. Mais ce délai peut atteindre et dépasser les 24 heures. Par conséquent, il existe une demande croissante de méthodes de conservation in vi tro du pouvoir fécondant du sperme des volailles. Les résultats reportés ci-dessus montrent un effet favorable (+11%) de l'AIA sur les taux de fécondation des oeufs de poule, après conservation de 24 heures du sperme de coq. EXEMPLE 5 : LAPINS : EFFET DE L'ACIDE INDOL-3-ACETIQUE SUR LA SEMENCE DE LAPIN

Des essais de l'AIA ont été réalisés sur un troupeau de lapines Hyper. Dans un premier temps, il a été vérifié que l'AIA n'avait pas d'incidence négative sur le sperme de lapin. Protocole expérimental

Les animaux disponibles sont répartis en 2 lots comparables (stade physiologique, âge) .

- Mâles : Après récolte, chaque éjaculat est conservé au bain-marie à 30 ^* C. Ceux qui sont sélectionnés après contrôle biologique, sont fractionnés en 2 parts égales et placés dans 2 tubes contenant :

- l'un : le dilueur sans AIA l'autre : le dilueur avec AIA (à une concentration de 1 μg/ml) . Dans les deux cas, la dilution est effectuée au 6ème : 5 volumes d'éjaculat/1 volume de dilueur.

Les dilueurs ont été préalablement placés dans le bain-marie (30"C) .

Aussitôt après homogénéisation douce, la semence diluée est placée à température ambiante en attendant le moment de l'insémination.

- Femelles : Les lapines du lot témoin sont inséminées avec 0,5 ml de semence diluée dans le dilueur témoin (IMV Dilap 2000) . Les femelles du lot AIA sont inséminées avec 0,5 ml de semence diluée dans le même dilueur contenant 1 μg/ml d'AIA. Avant insémination, la

couleur de la vulve des lapines des deux lots a été systématiquement enregistrée. L'insémination est réalisée selon la méthode classique, l'ovulation étant induite par l'injection de 0,2 ml de RECEPTAL.

2) Résulta β

Les résultats portent sur la couleur de la vulve, la taille des portées à la naissance et au sevrage ainsi que le poids au sevrage. Ils sont indiqués dans le Tableau VI ci-dessous.

TABLEAU VI

Nombre Mises Nés Nés Nés

Femelles bas totaux/ vivants/ vivants/ portée Portée femelle inséminée

Dilap 14

2000 23 (61%) 8,2 7,1 4,3

Dilap 19

2000 + 24 (79%) 7,4 7,1 5,6

AIA

L'effet de l'AIA se manifeste essentiellement au niveau du pourcentage de lapines mettant bas, qui donnent naissance dans les deux cas, à des portées de 7, 1 petits vivants en moyenne. Il en résulte que le nombre total de lapereaux vivants rapporté au nombre de femelles inséminées est de 30% supérieur dans le lot avec AIA par rapport au lot témoin.

Cette expérimentation a permis de mettre en évidence un effet favorable de l'AIA, dans les conditions classiques d' insémination chez le lapin.