MEMORIA DESCRIPTIVA

La presente invención se relaciona con la rama química, la rama farmacéutica y específicamente con lo referente a la obtención de nuevas entidades moleculares, variantes sintéticas espiroesteroidales de formula general :

Para los compuestos de fórmula general I, II, III, IV, l , R2 y R4 representa H, grupo hidroxilo, cetal, alcoxi, alcanoiloxi, alquenoiloxi y alcoxicarboniloxi (preferiblemente grupos alquilos de hasta 8 átomos de carbono de cadena lineal o ramificada, como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, y los isómeros de cadena de todos los anteriores).

Para los compuestos de fórmula general I, II, III , IV, R l , R2 y R4 también representan un grupo amino, sustituido preferencialmente con grupos alquilaminos, dialquilaminos, alquenilaminos, dialquenilaminos, aminocarboniloxi, alquinilaminos y dialquinilamino. Los grupos alquilo tendrán preferencialmente hasta 8 átomos de carbono de cadena lineal o ramificada, como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, y los isómeros de cadena de todos los anteriores. Para los compuestos de fórmula general I, II, III, IV, Ri , R2 y R4 también representan grupos amido, tioles, sulfinilos, sulfonamidos y sulfontlos. Los grupos sulfonilos están preferiblemente sustituidos con grupos alquilarilos, alcanoiloxiarilos, alquenoiloxiarilos y alquenilarilos. Los grupos alquilo tendrán preferencialmente hasta 8 átomos de carbono de cadena lineal o ramificada, como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, y los isómeros de cadena de todos los anteriores.

Para los compuestos de fórmula general I, II, III, IV, Ri , R2 y R4 también representan grupos ciano, tiociano. isotiociano, ... smtit íd.o.s_preferencialmente— con— grupos— a Iquilos— az oarquilos, alcanoiloxialquilos, arilalquilos, heteroarilalquilos, arilalquenilos, heteroarilalquenilos, arilquinilos, arilquilalquinilos, alcanoiloxiarilquilalquinilos, heteroariloxialquinilos, oxoalquinilos o con un grupo cetal, por tanto los sustituyentes cianoalquinilos podrán estar sustituidos a su vez por heteroarilalquinilos, hidroxialquinilos, alcoxialquinilos, aminoalquinilos y aciloaminoalquinilos. Los grupos alquilo tendrán preferencialmente hasta 8 átomos de carbono de cadena lineal o ramificada, como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, y los isómeros de cadena de todos los anteriores. Para los compuestos de fórmula general I, II, III, IV, Ri , R2 y R4 también representan un grupo fosforil, sustituido preferencialmente con alquilarilos, alcanoiloxiarilos, alquenoiloxiarilos y alquenilarilos. Los grupos alquilo tendrán preferencialmente hasta 8 átomos de carbono de cadena lineal o ramificada, como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, y los isómeros de cadena de todos los anteriores. Para los compuestos de fórmula general I, II, III, IV, R3 representa H y grupo hidroxilo.

Para los compuestos de fórmula general I, II, III, IV, R5 representa H y grupos hidroxilos, cetales, amino, tioles y cíanos.

Para los compuestos de fórmula general I, II, III, IV, Re representa un grupo metilo, cadenas lipídicas derivadas de ácidos grasos mono y poliinsaturados de hasta 24 átomos de carbono, sitio de unión a proteínas. Para los compuestos de fórmula general III y IV, Rx representa grupos alquilos de hasta 8 átomos de carbono de cadena lineal o ramificada, como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, y los isómeros de cadena de todos los anteriores, cuando x es diferente de cero.

Para los compuestos de fórmnla ^~ general III y IV, R _x también representa grupos alquilarilos, alcanoiloxiarilos, alquenoiloxiarilos y alquenilarilos. Los grupos alquilo tendrán preferencialmente hasta 8 átomos de carbono de cadena lineal o ramificada, como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, y los isómeros de cadena de todos los anteriores, cuando x es diferente de cero.

Este nuevo tipo de compuestos pueden servir de base a medicamentos con aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de enfermedades cerebrovasculares, así como condiciones inflamatorias crónicas y agudas.

Los compuestos del tipo I, II , III, y IV se obtienen mediante reacciones de tosilación del grupo 3β- hidroxi, hidroxilacion del grupo 6β -ona en presencia de carbonatos, que puede ser oxidada empleando como agentes oxidantes el reactivo de Jones (CrCb- H2SO4), el reactivo de Collins (CrCb-acetona), el clorocromato de piridinio, según el método de Aburatani, o con sales de oxoamonio-yodo III.

Los esteroides constituyeron una de las primeras entidades farmacológicas con actividad antiinflamatoria demostrada científicamente. En general, la mayor parte de las moléculas esteroidales actúan como agentes inmunosupresores mediante mecanismos moleculares que incluyen efectos genómicos y no genómicos rápidos. Sin embargo, los esteroides, entre los que se pueden mencionar la hidrocortisona, cortisona, prednisona, prednisolona, fludrocortisona, desoxicorticosterona, metilprednisolona, triamcinolona, parametasona, betametasona, dexametasona, acetónido de triamcinolona, acetoxiprenolona, entre otros, provocan efectos farmacotoxicológicos notables en diferentes órganos. Por esta razón, tanto su empleo clínico como la interrupción de su uso, causan varios efectos adversos, algunos de ellos severos. Entre dichos efectos tóxicos se encuentran aquellos que afectan el tejido óseo y por tanto inducen alteraciones metabólicas celulares y alta incidencia de osteoporosis; también se incluyen afectaciones al sistema cardiovascular, como la hipertensión, y aquellos que alteran el aparato gastrointestinal. Por otro lado, los llamados neuroesteroides presentan propiedades sedantes, anestésicas y anticonvulsivas en animales y humanos. Dicha actividad se produce mediante la modulación de la excitabilidad neuronal, principalmente a través de la interacción con receptores de membrana y canales iónicos, fundamentalmente el receptor GABAA, el cual forma parte de un sistema bidireccional inhibitorio conectado entre diversas áreas del Sistema Nervioso Central (SNC). En la invención descrita, la presencia de estructuras de naturaleza esteroidal brinda la posibilidad de emplear está nueva entidad química como potencial agente terapéutico, para el tratamiento de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas,, neurai n flamatorias, neurodegenerativas, neuropsiquiátricas y neurológicas.

Después de realizar un análisis estructural de las moléculas ensayadas y el comportamiento sobre la vitalidad de la línea neuronal PC 12 como indicativo de su potencialidad neuroprotectora, se justifica el empleo de las variantes sintéticas esteroidales para el tratamiento de enfermedades, cerebrovasculares, neurodegenerativas, neuropsiquiátricas y neurológicas.

La novedad de la presente invención consiste principalmente en sistemas moleculares hexacíclicos conformados por un derivado esteroidal fusionado a anillos espirostánicos, con posible aplicación en el tratamiento de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, neuroinflamatorias, neurodegenerativas, neuropsiquiátricas y neurológicas, así como la posibilidad de obtener los mismos mediante un procedimiento sintético sencillo, empleando como material de partida sapogeninas esteroidales tipo diosgenina, hecogenina y solasodina.

Existen varias patentes que describen derivados esteroidales para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y del SNC, sin embargo, en ningún caso se describe la fusión de estos núcleos o inclusión de sistemas espirostanos para formar una nueva entidad farmacológica. A continuación se relacionan patentes que emplean diferentes sustituyentes del núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno, sin que tengan relación con el objeto de nuestra invención.

Las patentes US6909007, US 186708 y US5 1 16829 describen la obtención de moléculas derivados esteroidales como potenciales anti-inflamatorios menos tóxicos que los convencionales, pero emplea sustituyentes de tipo hidrogeno, cadenas alquílicas, alquenílicas y anillos aromáticos tipo fenilos, carboxifenilos, acetoxifenilos, metoxicarboxifenilos y dimetilcarboxifenilos, grupos amidas, dioxolanos, alcoxilos, aciloxilos y alquilidendioxilos . La patente 5599807 describe la producción de derivados esteroidales con una estructura éster entre el grupo carboxilo del acido quinoloncarboxílico y el grupo hidroxilo alcohólico en posición 21 , con actividad antkbacteriana y anti-inflamatoria sin la ocurrencia de inmunosupresión a largo plazo. La patente US20030092692 describe la obtención química y aplicación de moléculas 7<x-hidroxi esteroidales conocidas y nuevas en la citoprotección in vitro de células neurales y en el tratamiento de condiciones agudas que afectan el SNC. Sin embargo, los sustituyentes de dichas ennuaues moleculares incluyen solamente H, grupos hidroxilos, hidroxilos esterificados, alquilos, aminos, alquilaminos y dialquilaminos. Las patentes US2003301 86953, US20090227551 y US201001304559 también describen la síntesis y utilización en enfermedades neurológicas, de 3- hidroxi-7 - hidroxi esteroides y ciertos derivados cetónicos, aunque los sustituyentes descritos no incluyen grupos espirostánicos.

La patente US20040072806 describe solamente los métodos, combinaciones y composiciones para el tratamiento, prevención y reducción de neurotoxicidad y enfermedades neurológicas empleando derivados de 22R-hidrox¡ esteroides de origen natural, y sustituidos con grupos spirost-5-en-3-oles.

Las variantes sintéticas espirosteroidales objeto de la presente invención mostraron acción sobre células neurales en mayor o menor grado. Sin embargo, en dependencia de la naturaleza de los sustituyentes R.2 de la posición 3 y del R.4 de la posición 6 del núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno, la acción mostrada es mayor o menor. Condiciones experimentales generales.

Las temperaturas de fusión se determinaron con un equipo de placa caliente con capilar de la firma

Electrothermal 9100. Los espectros IR se realizaron en un espectrofotómetro Philips Analitical PU

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9600 FTIR en pastillas de KBr. Los espectros de RMN H y R N C se registraron en un espectrómetro Brucker ACF - 250 operando a 250.13 MHz y 62.50 MHz respectivamente, como disolvente se empleó CDCb y como referencia interna TMS, y todos los registros se determinaron a 26°C. Las asignaciones espectrales en RMN se realizaron con el empleo adicional del espectro de correlación (HHCOSY y HCCOSY) para algunos compuestos, la técnica de edición DEPT y la comparación con datos de espectros de compuestos reportados en la bibliografía.

Ejemplos de realización

EJEMPLO 1 . SÍNTESIS DE LOS όβ-HIDROXI DERIVADOS Y 6-ONA POLI-HIDROXILADOS

La obtención de los compuestos con estructura 3a,5-ciclo-6-ona, se realizó mediante el método de Aburatani, el cual consta de tres etapas fundamentales y utilizando como material de partida el sistema 5-εη-3β-ο1. Dichas etapas experimentales se realizan de forma continua y son las siguientes:

Tosilación de diosgenina/hecogenina.

Mesilación con MsCl, trietilamina y butanona.

Isomerización con solución acuosa de NaHC03 para formar el -esteroide.

Oxidación con reactivo de Jones del grupo hidroxilo en C-6 para obtener el 3a,5-ciclo-6-ona derivado.

-Isomerización de i-sistemas a sistemas espirostánicos Δ ² en presencia de Li ₂ C0 ₂ /CaC0 ₃ /DMFA/HMFTA.

-Dihidroxilación en condiciones catalíticas (CHC13/NaOH/bromuro de ceriltrimetilamonio), catálisis por ácidos sólidos bentoníticos y cenizas pirípicas.

-Esterificación catalítica con acetato niobilo-vanadilo/anhídrido acético.

-Apertura epóxido con bentonita-cenizas pirípicas y agua a reflujo.

EJEMPLO 2: CARACTERIZACIÓN QUIMICA Y ESTRUCTURAL DE LOS 6P-HIDROXI DERIVADOS Y 6-ONA POLI-HIDROXILADOS

Los datos espectroscópicos reportados corroboran las estructuras propuestas. En los espectros FTIR se observan las bandas características en zona de 1350 a 850 cm ¹ debido a vibraciones propias del sistema espirocetálico que están asociadas con los estrechamientos de los enlaces C-C y C-0 lo que indica que no se produjeron cambios estructurales degradativos en los anillos E y F. Todos los compuestos sintetizados pertenecen a la serie 25R y esta corroborado porque la banda en 880-899 cm ¹ es aproximadamente dos veces más intensa que la de 925-910 cm ^{" 1} . Para los acetoderivados sintetizados es típica la zona de frecuencias 1713- 1735 cm ^{' 1} correspondiente al grupo acetoxi CFL- CO-O-. Para el tosil derivado es característica la banda en 1360 y 1 170- 1 175 cm ^{" 1} que corresponde a las vibraciones asimétricas y simétricas del grupo SO2 ( v SO2 s y as.). A esta agrupación corresponde la banda 1588 cm ¹ asignable a v C=C aromático.

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La espectroscopia de R1VTN- H y C resulto ser muy informativa para facilitar la elucidación estructural de los compuestos sintetizados. Entre las señales significativas comunes se encuentran la de los protones de los grupos metilo (CH3) 18, 19, 21 y 27, y la de los protones H2-

26 y H-16a. La señal Fh-26 es compleja y corresponde a dos corrimientos químicos (H-26a y 26β y prácticamente no varía en la serie de compuestos estudiados. H-26a (axial) es un triplete δ = 3,32 ppm y su multiplicidad se debe a un doble acoplamiento cuasi degenerado geminal

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y vecinal axial-axial (J = J = 10,6 Hz). Η-26β es un doble doblete con δ =3,5 ppm. Su

2 3 multiplicidad se debe al acoplamiento geminal (J = 10,6 Hz) y vecinal ecuatorial -axial (J ea =

2,6 Hz). Para H-16a, con un corrimiento químico de δ = 4,4 ppm, es típica la apariencia de un doble doblete debido al acoplamiento con los protones 15β (ecuatorial), 15a y 17β (cuasi- ecuatoriales)

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En compuestos Δ -6- oxo esteroidales son características las señales de los protones olefínicos H-2 y H-3 con δ = 5,5 y 5,7 ppm respectivamente. Las señales de los protones 7β y 5a aparecen

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superpuestas en 2,3-2,4 ppm. En RMN- C las señales de C-2 y C-3 se desblindan hacia δ = 124,4 y 124,5 ppm respectivamente, mientras que C-4 se blinda hacia los 21 ,7 ppm.

Tabla 1: Corrimientos químicos (δ , ppm) de los átomos de carbono de los anillos A y B y del carbono 19 de los (25R)-3a.5-ciclo-espirostan-6^ol (Gl) y (25R)-2,3-dihidroxi-espirostan-6fi-ona (G2).

EJEMPLO 3: EFECTO DE LA SERIE DE ESPIROSTEROIDES SINTÉTICOS SOBRE LA VITALIDAD DE CÉLULAS PC 12 SOMETIDAS O NO A DAÑO GLUTAMATÉRGICO

Las células PC 12 constituyen una línea celular de tipo neural, que ha sido ampliamente utilizado en modelos in vitro de diversas enfermedades neurológicas y neuroinflamatorias. Los mecanismos fisiopatológicos que pueden ser modelados con estas células, permiten su empleo en la evaluación de candidatos terapéuticos. Entre ellos se encuentra reportado el ensayo de protección frente al daño glutamatérgico, donde las células son expuestas a altos niveles de L- glutamato, el cual es un neurotransmisor que en altas concentraciones produce neurotoxicidad.

La serie de espirosteroides sintéticos (ΙΟμΜ de cada uno) se evaluó en células PC 2 tratadas con 50mM de L-glutamato durante 24h. Dichas células se cultivaron rutinariamente en medio RPMI suplementado con suero equino (10%) y suero fetal bovino (10%), en atmosfera de 37°C y 5% de CO2. para luego ser sembradas al momento del ensayo en placas de 96 pocilios a una densidad de 150000 células/mL. Transcurrido el tiempo de los tratamientos se determinó la vitalidad celular mediante el empleo del bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5- difeniltetrazol (MTT), el cual es metabolizado por deshidrogenasas mitocondriales en las células vivas.

Los resultados obtenidos en la evaluación (Tabla 2) muestran un comportamiento anti- glutamatérgico y neuroprotector de las diferentes moléculas (E) ensayadas, donde el aumento de la vitalidad celular no fue idéntico en todos los casos. Dichas diferencias tienen su fundamento en las variaciones estructurales entre todas las moléculas de la serie, donde existen algunas con mayor actividad que otras. Específicamente, entre las moléculas más activas estuvieron la 2- alfa,3-alfa-dihidroxi-(25R)-espirostan- 6-ona y la 3,6- diona-(25R)-espirostan. La concentración empleada en el presente ensayo para cada molécula de la serie, no afecta la vitalidad de las células PC 12 no sometidas al daño, lo cual evidencia que a esa dosis los espiroesteroides no provocan citotoxicidad (datos no mostrados). Tabla 2. Efecto anti-glutamatérgico de una serie de espiroesteroides sintéticos.

EJEMPLO 4: EFECTO DE LA SERIE DE ESPIROSTEROIDES SINTÉTICOS SOBRE LA PRODUCCIÓN DE OXIDO NITRICO EN CELULAS GLIALES ESTIMULADAS

La línea celular C6 se estableció a partir de un glioma de rata y constituye un sistema de evaluación in vitro de compuestos anti-neuroinflamatorios, debido a su fenotipo glial. Esta última característica les otorga la capacidad de responder ante diversos estímulos con una marcada expresión de marcadores y factores solubles inflamatorios, que simulan la físiopatología de numerosas enfermedades cerebrovasculares, neurológicas y neuroinflamatorias. Dentro de dichos estímulos se encuentran el lipopolisacárido (LPS) bacteriano, que es detectado por las células mediante los receptores tipo Toll 4, y el interferón gamma (IFNy)como segunda señal inflamatoria. En estas condiciones las células C6 producen altos niveles de óxido nítrico (ON) y citocinas pro-inflamatorias como la interleucina (IL) Ib y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF a, según sus siglas en inglés).

Las células C6 se cultivaron rutinariamente en medio Eagle modificado de Dulbeccos (DMEM, según sus siglas en inglés), suplementado con suero fetal bovino (5%), suero equino (15%) y L-glutamina (2mM). Al inicio del ensayo, las células se sembraron en placas de 96 pocilios a una densidad de 20000 celulas/mL y se incubaron durante 8h en atmósfera de 37°C y 5% de CO2. Cada espiroesteroide anti-glutamatérgico de la serie se administró a una concentración de Ι ΟμΜ, lh antes de añadir el estímulo inflamatorio (^g/mL de LPS y 100U7mL de IFNy). Luego de aplicar el estímulo los cultivos de células se incubaron durante 24h en atmósfera de 37°C y 5% de CO2 Finalmente se determinaron los niveles de nitritos en los sobrenadantes de cultivo de cada grupo de tratamiento, mediante el ensayo de Griess y una curva patrón con concentraciones conocidas de nitrito de sodio.

Los resultados obtenidos en el ensayo (Tabla 3) muestran un comportamiento antiinflamatorio de las diferentes moléculas (E) ensayadas, dado por la inhibición en la producción de ON observada. Específicamente entre las moléculas más activas estuvieron la 2-alfa,3-alfa-dihidroxi-(25R)-espirostan-6-ona y la 3,6-diona- (25R)-espirostan. La concentración empleada en el presente ensayo para cada molécula de la serie, no afecta la vitalidad de las células C6 no sometidas al estímulo, lo cual evidencia que a esa dosis los espiroesteroides anti-glutamatérgicos no provocan citotoxicidad (datos no mostrados).

Tabla 3. Efecto anti-inflamatorio in vitro de una serie de espiroesteroides sintéticos.