BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in wäßriger Lösung unter Verwendung von immuno¬ logisch reaktiven Peptiden oder Polypeptiden und eines Stabili¬ sators dafür sowie die Stabilisierung von Peptiden in wäßriger Lösung.

Der Einsatz von Antigenen und insbesondere von rekombinanten oder chemisch synthetisierten Peptid- oder Polypeptid-Antigenen in immunologischen Bestimmungsverfahren ist aus dem Stand der Technik bekannt. Beim Nachweis von Peptid- oder Polypeptid- Analyten werden Lösungen, die eine bekannte Konzentration des Analyten enthalten, beispielsweise zur Kalibrierung benötigt. In Testsystemen zur Bestimmung von spezifischen Antikörpern werden immunologisch mit dem zu bestimmenden Antikörper reak¬ tive Peptide oder Polypeptide zum qualitativen oder/und quanti¬ tativen Nachweis des Antikörpers verwendet. Bei derartigen immunologischen Bestimmungssystemen ist die Stabilität der Peptide oder Polypeptide von wesentlicher Bedeutung, um einer¬ seits die Linearität des Tests und ein gutes Signal-Rausch- Verhältnis sicherzustellen und andererseits eine zuverlässige Reproduzierbarkeit des Bestimmungsergebnisseε über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten.

Aus dem Stand der Technik ist eine Stabilisierung von Peptiden und Polypeptiden in immunologischen Testlösungen durch Zusatz von unspezifischen Proteinen (z.B. RSA) oder von Puffersystemen (Salz, pH-Wert ^■ etc. ) bekannt. Diese Stabilisierungsmethoden führen jedoch im allgemeinen nicht zu zufriedenstellenden Er¬ gebnissen und insbesondere rekombinante oder chemisch synthe-

tisierte Peptide oder Polypeptide zeigen eine Neigung zur Aggregation und Adsorption, die durch die genannten Stabilisie¬ rungsverfahren nicht ausreichend beseitigt werden kann.

Aus dem Stand der Technik ist auch bekannt, daß Hitzeschock¬ proteine denaturierte Proteine binden können (Ang et al. , J. Biol. Chem. 266 (1991), 24244-24236). Es ist weiterhin bekannt, daß Proteinlösungen durch Zugabe von Hitzeschockproteinen stabilisiert werden können, wobei diese stabilisierende Wirkung insbesondere auf einer Verhinderung der Bildung von unlöslichen Aggregaten beruht.

Es wird jedoch angenommen, daß Proteine, die an Hitzeschock¬ proteine gebunden sind, im allgemeinen nicht in ihrer nativen Konformation vorliegen. Hayer-Hartl et al., EMBO J. 13 (1994), 3192-3202 berichten beispielsweise, daß an GroEL (hsp60 aus E.coli) gebundene Proteine in einer offenen Struktur, der sogenannten "molten globule" Struktur, vorliegen. Aufgrund dieser Konformationsänderung ist nicht gewährleistet, daß Peptide und Polypeptide, die durch Bindung von Hitzeschock¬ proteinen stabilisiert werden, ihre für die Anwendung in immunologischen Testverfahren notwendigen strukturellen Merk¬ male aufweisen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, daß immuno¬ logisch reaktive Bereiche auf Peptiden und Polypeptiden durch die Anwesenheit von Hitzeschockproteinen maskiert werden.

In der DE-OS 42 39 969 ist ein Verfahren zur Stabilisierung von Proteinen in wäßriger Lösung durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine (kleine hsp's) offenbart. Über die immunologischen Eigen¬ schaften von an kleine hsp's gebundenen Proteinen gibt es jedoch keine Daten.

Es war somit die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Stabilisierung von Antigenen in wäßriger Lösung bereitzustellen, bei dem die obengenannten

Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weitgehend beseitigt sind.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in wäßriger Lösung unter Verwendung von immuno¬ logisch reaktiven Peptiden oder Polypeptiden und eines Stabili¬ sators dafür, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Stabilisator ein oder mehrere Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine (kleine hsp) umfaßt.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die kleinen hsp fähig sind, Peptide und Polypeptide in Lösung zu stabilisieren, ohne deren immunologische Eigenschaften zu beeinträchtigen.

Bei der Familie der kleinen Hitzeschockproteine handelt es sich um eine heterogene Gruppe von Proteinen mit einem oder mehreren Vertretern in Hefen (hsp 26), Vertebraten (hsp 24, hsp 28), Drosophila (hsp 22, 23, 26, 28), Maus (hsp 25) und über 20 Proteinen in Pflanzen (Nover & Schaft, Eur. J. Biochem. 139 (1984), 303-313; Lindquist & Craig, Ann. Rev. Genet. 22 (1988), 631-677) . Ihre Molekularmassen liegen je nach Organismus zwi¬ schen 15 und 40 kDa, wobei in den meisten Zellen und Geweben die kleinen hsp's auch in Abwesenheit von Streß synthetisiert werden und als cytosolische Aggregate (Hitzeschock-Granula) mit einer Molekularmasse von über 700 kDa vorliegen (Arrigo et al., Mol. Cell Biol. 8 (1988), 5059-5071). Hitzeschock und chemi¬ scher Streß induzieren die Synthese der kleinen hsp's, die dann bis zu 1 % des Gesamtzellproteins ausmachen können (Österreich et al., Biomed. Biochim. Acta 49 (1990), 219-226) . Zudem bewir¬ ken die oben genannten Streßfaktoren eine Veränderung im Phos- phorylierungsgrad der Proteine sowie in ihrer zellulären Loka¬ lisation (Arrigo et al. , supra Zantema et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 12936-12941) . Die kleinen hps's der verschiedenen Organismen zeigen trotz ihrer Heterogenität übereinstimmende Hydrophobizitätsprofile und kleine Regionen identischer Amino- säuresequenzen (Lindquist & Craig, supra) . Daneben konnten eindeutige Sequenzhomologien mit dem ebenfalls hochmolekulare

Assoziate bildenden α-Kristallin aus Wirbeltieren nachgewiesen werden (Ingolia & Craig, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982), ₂ 360-2364) . Auf DNA-Ebene sind Sequenzhomologien der kleinen hsp's untereinander beschrieben.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind im Prinzip alle Peptide oder Polypeptide geeignet, die durch Hitzeschockproteine stabi¬ lisiert werden können, d.h. im wesentlichen Peptide, Proteine, Glykoproteine, Lipoproteine und dgl. sowie andere Substanzen, die einen Peptidanteil aufweisen. In einer bevorzugten Ausfüh¬ rungsform verwendet man rekombinant oder synthetisch herge¬ stellte Peptide oder Polypeptide. Derartige Substanzen neigen besonders zur Aggregation und Adsorption und können durch das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft stabilisiert werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man das hsp 25 aus Maus, hsp 25 bildet ein 32mer (Mr = 800 kD) (Behlke et al. , FEBS Letters, Vol. 288 Nr. 1,2 (1992) , 119-122) . Das hsp 25-Gen in der Maus steht unter der Regulation eines Hitzeschock-Promotors, so daß durch Hitzestreß die Expression des Proteins induziert wird. Die Klonierung und Sequenzierung einer für hsp 25 kodierenden DNA-Sequenz sowie deren Expression in E.coli wird von Gaestel et al. in Eur. J. Bioche . 179 (1989), 209-213, J. Biol. Chem. , Vol. 266., Nr. 22 (1991), S. 14721-14724 und in der DD-Al 273 071 beschrieben. Besonders vorteilhaft ist hsp 25 u.a. deshalb, da bezogen auf das 32mer der Protein-stabilisierende Effekt bereits bei einem deutlichen Unterschuß auf molarer Basis meßbar ist. Weiterhin ist hsp 25 extrem hitzeresistent, wobei nach Inkubation des hsp allein bei 100°C über 15 Minuten und nachfolgender Abkühlung dessen Ausgangsaktivität wiedergefunden wurde, hsp 25 erscheint daher als ein besonders vorteilhafter Kandidat für das erfin¬ dungsgemäße Verfahren. Durch die Möglichkeit der rekombinanten Herstellung ist es auch in ausreichenden Mengen verfügbar.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung setzt man das kleine hsp in einem molaren Verhältnis von vorzugsweise 0,0001:1 bis 1000:1, besonders bevorzugt von 0,01:1 bis 1000:1 und am meisten bevorzugt von 0,1:1 bis 500:1 bezogen auf das zu stabilisierende Peptid- oder Polypeptid ein. Die Konzentration von hsp25 bezieht sich in diesem Zusammenhang auf eine monomere Einheit.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von kleinen Hitzeschockproteinen zur Stabilisierung von Peptiden in wäßriger Lösung. Mit dem Begriff "Peptid" werden Proteine, umfassend von 6 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt von 6 bis 30 Aminosäuren, bezeichnet.

In einer besonderen Ausführungsform verwendet man die kleinen hsp's zur Verbesserung der Lagerbeständigkeit einer wäßrigen Lösung, die Peptide enthält und insbesondere zur Langzeit- Stabilisierung eines Reagenzes für immunologische Bestimmungs¬ verfahren, das als wäßrige Lösung vorliegt und immunologisch reaktive Peptide enthält. Üblicherweise führt die Instabilität von Peptiden in wäßriger Lösung insbesondere bei Aufbewahrung über einen längeren Zeitraum zu einer Verschlechterung der Meßresultate. Durch den Zusatz von kleinen hsp's wird dagegen die Stabilität der Peptide erheblich verbessert, so daß auch nach einem längeren Zeitraum, z.B. nach mehreren Wochen, keine signifikante Verschlechterung von Meßergebnissen, z.B. in immunologischen Bestimmungsverfahren beobachtet wird.

Ein nochmals weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von kleinen hsp's zur Verbesserung des Signal- Rausch-Verhältnisses bei einem Bestimmungsverfahren, das in Gegenwart mindestens eines Peptids oder/und Polypeptids in wäßriger Lösung durchgeführt wird. Bevorzugt ist das Bestim¬ mungsverfahren ein immunologisches Bestimmungsverfahren, das unter Verwendung von immunologisch reaktiven Peptiden oder/und Polypeptiden durchgeführt wird. Es hat sich nämlich über¬ raschenderweise herausgestellt, daß in Bestimmungsverfahren

durch die Zugabe kleiner hsp's die ermittelten Leerwerte erheb¬ lich reduziert werden können. Obwohl die Ursache hierfür nicht genau bekannt ist, wird davon ausgegangen, daß die Verminderung der Leerwerte auf der verbesserten Stabilisierung der in der Testlösung vorhandenen Peptide oder/und Polypeptide beruht. Durch die Reduzierung der Leerwerte wird die Signaldifferenzie¬ rung verbessert und somit kann bei der erfindungsgemäßen Ver¬ wendung von kleinen hsp's die Meßgenauigkeit erhöht werden.

Der erfindungsgemäße Zusatz von kleinen hsp kann grundsätzlich bei allen Formen von Bestimmungsverfahren eingesetzt werden, wie etwa zur Stabilisierung von Peptid- oder Polypeptidantige- nen in direkten oder indirekten Nachweisverfahren für spezi¬ fische Antikörper, zur Stabilisierung von Analytanaloga in kompetitiven Immunoassays und zur Stabilisierung von Eichlösun¬ gen. Es ist für den Fachmann jedoch offensichtlich, daß die erfindungsgemäße Stabilisierung von Peptiden oder Polypeptiden auch auf andere hierin nicht explizit beschriebene Bestimmungs¬ verfahren angewendet werden kann.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein Ver¬ fahren zur immunologischen Bestimmung eines spezifischen Anti¬ körpers in einer Probeflüssigkeit, wobei man die Probeflüs¬ sigkeit mit mindestens einem Peptid- oder Polypeptid-Antigen, das mit dem zu bestimmenden Antikörper bindefähig ist, inku¬ biert und den Antikörper über eine Bindung mit dem Antigen nachweist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Antigen durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert. Besonders bevorzugt wird ein solches Verfahren als heterogenes Im unoassay in Gegenwart einer reaktiven Festphase durch¬ geführt.

Ein Beispiel für einen solchen heterogenen Immunoassay ist ein indirektes Testformat. Dabei inkubiert man die Probeflüssig¬ keit, die den zu bestimmenden Antikörper enthält, in Gegenwart einer reaktiven Festphase mit einem stabilisierten Antigen, das

in einer an die Festphase bindefähigen Form vorliegt, und einem gegen das Antigen gerichteten Nachweisantikörper, der eine Mar¬ kierungsgruppe trägt. Der qualitative oder/und quantitative Nachweis des zu bestimmenden Antikörpers kann anschließend durch Messung der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase erfolgen. Das an die Festphase bindefähige Antigen kann biotinyliert und die Festphase z.B. mit Streptavi- din oder Avidin beschichtet sein.

Ein weiteres bevorzugtes Testformat für die Bestimmung von Antikörpern ist der Doppelantigenbrückentest. Bei diesem Verfahren inkubiert man die Probeflüssigkeit, die den zu bestimmenden Antikörper enthält, in Gegenwart einer reaktiven Festphase mit mindestens zwei Antigenen AGj und AG ₂ , wobei das erste Antigen AGi in einer an die Festphase bindefähigen Form vorliegt und das zweite Antigen AG ₂ eine Markierungsgruppe trägt. Der zu bestimmende Antikörper wird durch die Bestimmung der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase, bevorzugt jedoch in der Festphase nachgewiesen.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Stabilisierung von Analytanaloga in einem kompetitiven Immuno¬ assay, insbesondere in einem Verfahren zur Bestimmung eines Peptid- oder Polypeptid-Analyten in einer Probeflüssigkeit nach dem Prinzip des kompetitiven Immunoassay, wobei man die Probe- flüsεigkeit mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper und einem mit dem Analyten um den Antikörper konkurrierenden Peptid oder Polypeptid, das eine Markierungsgruppe trägt, inku¬ biert und den Analyten durch Messung der Markierung nachweist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das markierte Peptid oder Polypeptid durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine stabilisiert.

Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Referenzwerten für die Bestimmung eines Peptid- oder Polypeptid-Analyten, wobei man mindestens

eine Testlösung, die eine bekannte Konzentration des zu bestimmenden Analyten enthält, mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper inkubiert und durch Quantifizierung der Immunreaktion zwischen Antikörper und dem in bekannter Konzen¬ tration vorliegenden Analyten mindestens einen Referenzwert bildet, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Antigen in der Testlösung durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert. Der wesentliche Vorteil ist darin begründet, daß mit erfindungs¬ gemäß stabilisierten Testlösungen eine Verbesserung der Linea- rität des Tests erreicht wird und wie vorstehend beschrieben die Haltbarkeit bzw. Langzeitstabilität derartiger Testlösungen erheblich gesteigert werden kann. Zusätzlich kann es wünschens¬ wert sein, auch der Probeflüssigkeit Hitzeschockproteine zuzu¬ setzen, insbesondere wenn das immunologische Bestimmungsver¬ fahren nicht direkt im Anschluß an die Probenentnahme durch¬ geführt wird.

Ein nochmals weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenzienkit zur Verwendung in immunologischen Testver¬ fahren, bei dem Peptide oder Polypeptide durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschock¬ proteine stabilisiert sind. Ein derartiger Reagenzienkit umfaßt somit in räumlich getrennter Form (a) mindestens ein erstes Reagenz, das ein stabilisiertes Peptid oder Polypeptid enthält, (b) mindestens ein zweites Reagenz, das eine weitere immunolo¬ gisch reaktive Komponente, z.B. einen Nachweisantikörper, ent¬ hält und (c) gegebenenfalls weitere Hilfs- und/oder Nachweis¬ reagenzien.

Als Hilfsreagenzien werden Substanzen bezeichnet, die z.B. zum Ansetzen der Testlösungen oder zum Einstellen derer Konzentra¬ tion erforderlich sind, wie z.B. deionisisertes Wasser, Puffer etc. Unter Nachweisreagenzien werden Substanzen verstanden, mit denen ein gebildeter Immunkomplex nachgewiesen werden kann. Bevorzugt enthält ein Nachweisreagenz ein Substrat für eine korrespondierende Markierungsgruppe des Antigens oder Antikör-

pers. Geeignete Verfahren bzw. Substanzen sind aus dem Stand der Technik bekannt.

Ein erfindungsgemäßer Reagenzienkit enthält die Reagenzien in einer Form, die vom beabsichtigten anzuwendenden Verfahren abhängig ist. Demgemäß können Reagenzien bereitgestellt werden, bei denen z.B. das stabilisierte Peptid oder Polypeptid in einer an eine reaktive Festphase bindefähigen Form vorliegt oder eine Markierungsgruppe trägt. Gegebenenfalls kann der Reagenzienkit auch mehrere Reagenzien mit verschiedenen stabilisierten Peptiden oder Polypeptiden enthalten, z.B. ein Reagenzienkit für einen Doppelantigenbrückentest. Weiterhin kann der Reagenzienkit auch ein oder mehrere Reagenzien ent¬ halten, die Peptid- oder Polypeptid-Antigene zur Erstellung von Referenzwerten, z.B. einer Eichkurve, in unterschiedlichen bekannten Konzentrationen enthalten. Die Form, in der die Antigene im erfindungsgemäßen Reagenzkit bereitgestellt werden, ist nicht entscheidend. Es können sowohl Lösungen als auch Lyophilisate verwendet werden, die dann vor dem ersten Gebrauch in eine flüssige Form überführt werden.

Der erfindungsgemäße Reagenzienkit eignet sich in einer Viel¬ zahl von immunologischen Bestimmungsverfahren und die Auswahl des stabilisierten Peptids oder Polypeptids ist dabei nicht kritisch. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß der erfin¬ dungsgemäße Reagenzienkit besonders vorteilhaft bei Verwendung von synthetisch oder rekombinant hergestellten Peptiden oder Polypeptiden eingesetzt wird. In einer bevorzugten Ausführungs¬ form wird der Reagenzienkit zur Bestimmung von viralen Antige¬ nen bzw. von gegen virale Antigene gerichteten Antikörpern ein¬ gesetzt und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Peptide oder Polypeptide aus dem Hepatitis C-Virus, z.B. aus den Bereichen NS-3 bzw. NS-4 oder aus HIV, z.B. aus dem Bereich p24, stabilisiert.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert in Verbindung mit den beigefügten Abbildungen. Es zeigen:

Abb. 1 die Stabilisierung von Testlösungen mit bekannten Konzentrationen an Troponin T durch Zusatz von hsp25,

Abb. 2 die Aminosäuresequenz eines HCV-NS3-Polypeptids (a) , eines synthetischen HCV-NS4-Polypeptids (b) sowie eines rekombinanten HIV-p24 Polypeptids (c) und

Abb. 3 die Verbesserung der Signaldifferenzierung in Ab¬ hängigkeit von der Konzentration an zugesetztem hsp 25.

Beispiel 1

Stabilisierung von Troponin T-Testlösungen

1.1 Herstellung der Lösungen a) Troponin T-Lösung mit 5 Mol hsp25 (32-mer; 160 Mol

Monomer) pro 1 Mol Troponin T: Zu 546 μl Puffer (0,1 mol/1 Tris, pH 8,0 / 100 mmol/1 KCl / 2 mmol/1 Dithiothreitol (DTT) / 0,05 % NaN ₃ ) werden 100 μl Troponin T-Lösung mit einer Konzentration von 0,43 mg/ml (in 5 mmol/1 KP0 _< , pH 7,3 / 2,0 mol/1 Harnstoff / 0,6 mol/1 KCl / 2 mmol/1 DTT / 0,05 % NaN ₃ ) und 354 μl hsp25-Lösung mit einer Konzentration von 14,7 mg/ml (in 0,1 mmol/1 Tris, pH 8,0 / 100 mmol/1 KCl / 2 mmol/1 DTT / 0,05 % NaN ₃ ) gegeben.

Die Herstellung von rekombinantem hsp25 erfolgte wie in DE-A-42 39 969.6 beschrieben.

Bedingungen in der Lösung: Troponin T-Konz.: 0,043 μg/ l hsp25-Konz.: 5,204 mg/ml

b) Kontroll- und Vergleichslösungen:

Troponin T-Lösung ohne hsp25 :

Die Herstellung erfolgte wie unter a) beschrieben. Anstelle der hsp25-Lösung wird aber nur Puffer zugegeben.

Troponin T-Lösungen mit 5 Mol bzw. 10 ol Rinderserumalbumin (RSA) pro 1 mol Troponin T: Herstellung:

Zu 800 bzw. 700 μl Puffer (0,1 mol/1 Tris, pH 8, 0 / 100 mmol/1 KCl / 2 mmol/1 DTT / 0,05 % NaN ₃ ) werden 100 μl Troponin T-Lösung mit einer Konzentration von 0,43 mg/ml (in 5 mmol/1 KPÖ _« , pH 7,3 / 2,0 mol/1 Harnstoff / 0,6 mol/1 KCl / 2 mmol/1 DTT / 0,05 % NaN ₃ ) und 100 bzw. 200 μl RSA-Lösung mit einer Konzentration von 4,2 mg/ml (in 0,1 mol/1 Tris, pH 8,0 / 100 mmol/1 KCl / 2 mmol/1 DTT / 0,05 % NaN ₃ ) gegeben.

Bedingungen in der Lösung:

Troponin T-Konz.: 0,043 μg/ml

RSA-Konz.: 0,42 mg/ml bzw. 0,84 mg/ml

Mit dieser Lösung sollte gezeigt werden, daß es sich bei dem stabilisierenden Effekt von hsp25 nicht um einen unspezifischen Proteineffekt handelt.

hsp25-Lösung:

Die Herstellung erfolgte wie unter a) beschrieben. Anstelle der

Troponin T-Lösung wurde aber nur Puffer eingesetzt.

Mit dieser hsp25-Lösung sollten Auswirkungen des hsp25 auf den Troponin T-ELISA-Test sichtbar gemacht werden.

Die Lösungen wurden alle am gleichen Tag hergestellt und dann unter identischen Bedingungen 5 Tage bei Raumtemperatur gelagert.

1.2 Überprüfung der Stabilität von Troponin T (TN-T) in den obengenannten Lösungen

Die Stabilität von Troponin T in den Lösungen wurde durch Messung der immunologischen Aktivität des Troponin T mit dem Troponin T-ELISA von Boehringer Mannheim bestimmt.

Dazu wurde nach 5 Tagen Lagerung der unter 1.1a) beschriebenen Troponin T-Lösung durch Verdünnen mit TN-T-freiem Humanserum eine Verdünnungsreihe von 0,65 - 12,5 ng/ml (0,65 / 1,8 / 4,8 und 12,5 ng/ml) hergestellt. Die Verdünnungen wurden anschlie߬ end, wie in der Packungsbeilage des Tests beschrieben, im ELISA-Test eingesetzt.

Die unter 1.1b) beschriebenen Kontroll- und Vergleichs-Lösungen wurden entsprechend verdünnt und ebenfalls im ELISA-Test eingesetzt.

Als Vergleichsmaßstab wurde die entsprechende Verdünnungsreihe einer bei -80°C gelagerten Troponin T-Probe im Test mitgeführt.

Testformat

Bei dem Troponin T-ELISA-Test handelt es sich um einen 1-Schritt-Sandwich-Assay. Die Troponin T enthaltende Probe wird in einem Streptavidin-beschichteten Tube mit einem biotinylier- ten anti-TN-T-Antikörper 1 und einem Peroxidase (POD) -markier¬ ten anti-TN-T-Antikörper 2 inkubiert. Es bildet sich ein immu¬ nologischer Komplex (Sandwich) aus den beiden Antikörpern und dem Troponin T, der über das Biotin an die SA- Tubewand gebun¬ den wird. Der Nachweis des Komplexes erfolgt dann nach Zugabe von POD-Substrat (ABTS ^® ) über die Bestimmung der POD-Aktivitä .

1.3. Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Abb. 1 dargestellt.

==> In Abwesenheit von hsp25 ist eine deutliche Verminderung der immunologischen Aktivität im Vergleich zur frisch

aufgetauten Troponin T-Lösung (TN-T bei -80°C) festzustel¬ len.

==> In der Lösung von TN-T mit hsp25 wird keine Abnahme der immunologischen Aktivität beobachtet.

==> RSA hat keinen stabilisierenden Einfluß auf das Troponin T. Die stabilisierende Wirkung von hsp25 beruht also auf einen hsp25-spezifischen Effekt und nicht auf einem reinen Proteineffekt.

==> Der Troponin T-ELISA-Test wird durch die eingesetzte hsp25-Konzentration nicht beeinflußt.

Beispiel 2

Stabilisierung von rekombinanten HCV- und KIV-Antigenen

Die Beispiele wurden mit dem Doppelantigen-Brückentestkonzept erstellt. Bei diesem Verfahren wird die Probenflüssigkeit mit einem biotinylierten Antigen, das an eine Streptavidin-be- schichtete Festphase binden kann, und mit einem Antigen, das eine Markierungsgruppe trägt, inkubiert. Der immobilisierte immunologische Komplex aus zu bestimmendem Antikörper und zwei Antigenen wird anschließend detektiert. Die Markierungsgruppe in den gezeigten Beispielen war hierbei ein Rutheniumkomplex, und der Nachweis erfolgte über eine Elektrochemilumineszenz- Reaktion (ECL-counts) .

Es wurden folgende Antigene verwendet: a) HCV-NS3

Das Antigen entspricht der Helikase-Sequenz des Hepatitis C Virus (HCV) - Nichtstrukturprotein 3 (NS3) und wurde gemäß DE-A-44 28 705.4 rekombinant in E.coli hergestellt. Die Aminosäuresequenz des HCV-NS3-Polypeptids ist in Abb. 2a gezeigt.

b) HCV-NS4

Das Antigen entspricht einer Partialsequenz des HCV-NS4 Proteins und wurde synthetisch hergestellt. Die Aminosäuresequenz des syntetischen HCV-NS4-Peptids ist in Abb. 2b gezeigt (Nie = Norleucin) . c) HIV-p24

Das Antigen entspricht einem Fusionsantigen aus der Sequenz des core-Antigens p24 (Ghrayeb und Chang, DNA 5 (1986) , 93-99) sowie weiterer core-Antigensequenzen pl7 und pl5 von HIV und wurde rekombinant in E.coli herge¬ stellt. Die Aminosäuresequenz dieses rekombinanten Polypeptids ist in Abb. 2c dargestellt.

Das synthetische HCV-NS4-Antigen wurde sowohl in biotinylierter als auch in ruthenilierter Form jeweils mit der Konzentration 30 ng/ml im Reaktionsansatz eingesetzt.

Die rekombinanten Antigene HCV-NS3 sowie auch HIV-p24 wurden sowohl in biotinylierter als auch in ruthenilierter Form jeweils mit der Konzentration 400 ng/ml im Reaktionsansatz eingesetz .

Die Pufferzusammensetzung in allen Experimenten war wie folgt:

Hepes 50 mmol/1, pH 7, 4

Thesit 0,1 %

MIT (N-Methylisothiazolon-HCl) 0,01 %

CAA (2-Chlor-Acetamid) 0,1 %

Mischung von Proteaseinhibitoren

Die hsp25-Konzentration bezogen auf hsp25-Monomer variierte im Bereich von 0/0, 1/1, 1/5, 1/10 Mol Antigen / Mol hsp25.

Die Antigene wurden unmittelbar vor Durchführung der immunolo¬ gischen Reaktion mit dem hsp25-haltigen Puffer versetzt. Die Inkubationszeit von Probenantikörper und Antigenen betrug 20 Minuten bei 37°C.

Die Ergebnisse waren wie folgt

Synthetisches HCV/NS4-Antigen

Probe Puffer Puf fer mi t Puf fer mi t Puffer mi t Puffer mi t Puffer mi t RSA 0, 5 X sp25 1/1 hsp25 1/5 groE l 1 /1 groE l 1/5

Si gnalwieder indung nach einer Lagerung für 3 Wochen bei 35°C in X

1 19 59 106 110 56 54 2 15 23 81 101 48 29

Durch Zusatz von hsp25 wird die Signalwiederfindung gegenüber der Kontrolle (Puffer alleine) und Vergleichsansätzen (RSA und groEl) deutlich verbessert. Besonders bemerkenswert ist die überlegene Wirkung von hsp25 gegenüber dem großen Hitzeschock¬ protein groEl.

b) Rekombinantes HCV/NS3-Antigen

Kontrolle (ohne Zusatz von hsp25!

Signal Signaldifferenzierung

(ECL counts ) (Signal pos. Serum/ Signal neg. Serum)

Puf fer 396000 neg . Serum 88000 pos . Serum 381000

Erfindungsgemäßes Verfahren (mit Zusatz von hsp25)

Signal Signaldifferenzierung

(ECL counts (Signal pos. Serum/ Signal neg. Serum)

Puf fer 36000 neg . Serum 29000 pos . Serum 345000 12

Durch Zusatz von hsp25 wird eine signifikante Leerwertreduktion sowohl bei Puffer als auch bei einem negativen Serum gefunden.

Dies bewirkt eine überraschend hohe Verbesserung der Signal- Rausch-Verhältnisses bzw. der Signaldifferenzierung.

c) Rekombinantes HIV/p24-Antigen

Probe Puffer mit Puffer mit Puffer mit Puffer mit (positiv) RSA 0,5 X hsp25 1/5 hsp25 1/10 hsp25 1/10 ohne Antigen

Signatdifferenzierung pos. Signal/neg. Signal

1 13 15 16 1 2 17 19 23 1 3 18 21 22 1

Auch hier findet man eine deutliche Verbesserung des Signal- Rausch-Verhältnisses bzw. der Signaldifferenzierung, wenn man das Antigen mit hsp25 stabilisiert.

Beispiel 3

Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von hsp25

Die Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von hsp25 bei der Stabilisierung des HCV-NS3 Antigens in einem Doppelantigen¬ brückentest (Durchführung gemäß Beispiel 2) ist in Abb. 3 gezeigt.

Daraus ist ersichtlich, daß die Signalreduktion bei einer negativen Probe bereits deutlich bei einem molaren Verhältnis des Antigens zu hsp25 von 1:1 zu erkennen ist. Selbst bei Zusatz hoher Mengen an hsp25 wird keine signifikante Signalre¬ duktion bei positiven Proben gefunden.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABE : (i) ANMELDER:

(A) NAME: Boehringer Mannheim

(B) STRASSE: Sandhofer Strasse 116

(C) ORT: Mannheim

(E) LAND: Ger any

(F) POSTLEITZAHL: D-68298

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Stabilisierung von Peptiden und Polypeptiden in immunologischen Tests durch Zusatz von kleinen Hitzeschockproteinen (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3 (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0 , Version #1.30 (EPA) (vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 195 02 386.2

(B) ANMELDETAG: 26-JAN-1995

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 282 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Hepatitis C virus

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Val Val Pro Gin Ser 1 5 10 15

Phe Gin Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr

20 25 30

Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gin Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu 35 40 45

Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys

50 55 60

Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr 65 70 75 80

Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp

85 90 95

Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys

100 105 110

His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp

115 120 125

Gin Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr

130 135 140

Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala 145 150 155 160

Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu

165 170 175

Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys

180 185 190

Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala

195 200 205

Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly

210 215 220

Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly 225 230 235 240

Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gin Thr Val

245 250 255

Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Ile Thr Leu Pro

260 265 270

Gin Asp Ala Val Ser Arg Thr Gin Arg Arg 275 280

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 27 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Hepatitis C virus

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO: 2:

Ser Gin His Leu Pro Tyr Ile Glu Gin Gly Nie Nie Leu Ala Glu Gin 1 5 10 15

Phe Lys Gin Gin Ala Leu Gly Leu Leu Gin Thr 20 25

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 328 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Human immunodeficiencyvirus type 1

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Ala Ala Gly Pro Asp Lys Gly Asn 1 5 10 15

Ser Ser Gin Val Ser Gin Asn Tyr Pro Ile Val Gin Asn Leu Gin Gly

20 25 30

Gin Met Val His Gin Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val

35 40 45

Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe

50 55 60

Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu 65 70 75 80

Asn Thr Val Gly Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr

85 90 95

Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala

100 105 110

Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile

115 120 125

Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu Gin Ile Gly Trp Met Thr Asn

130 135 140

Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu 145 150 155 160

Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp

165 170 175

Ile Arg Gin Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe

180 185 190

Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp

195 200 205

Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr

210 215 220

Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr 225 230 235 240

Ala Cys Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala

245 250 255

Glu Ala Met Ser Gin Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gin Arg

260 265 270

Gly Asn Phe Arg Asn Gin Lys Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly

275 280 285

Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly

290 295 300

Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr Glu 305 310 315 320

Arg Gin Ala Asn Phe Leu Gly Asn

325