そこで、本発明は、例えば、水分存在下� ��光照射の条件下であっても、10-(カルボキシ メチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチル� �ミノ)フェノチアジンもしくはその誘導体、� ��たはその塩を安定化可能な安定化剤の提供� ��目的とする。

 本発明の安定化剤は、10-(カルボキシメチル アミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミノ)� ��ェノチアジンもしくはその誘導体、または� ��の塩の安定化剤であって、下記(1)および(2)� ��少なくとも一方の化合物を含むことを特徴� ��する。
(1)炭素数8~16のアルキル基を有する界面活性� �
(2)下記式(I)で表される化合物、下記式(II)で� �される化合物およびフラボノイド系色素か� �なる群から選択される少なくとも一つの色� �物質
    R ¹ -N=N-R ²    ・・・(I)
 前記式(I)において、
R ¹ およびR ² において、
Xは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカ� �ウムであり、各Xは、同一でも異なってもよ� ��、
Yは、水素またはSO ₃ Xであり、各Yは同一でも異なっていても良く� ��
Zは、水素、メチル基またはメトキシ基であ� �、各Zは同一でも異なっていても良い。
前記式(II)において、
Xは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカ� �ウムであって、各Xは、同一でも異なってい� ��も良く、
Yは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカ� �ウムであって、各Yは、同一でも異なってい� ��も良い。

 本発明の発色試薬は、10-(カルボキシメチ ルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミ� �)フェノチアジンもしくはその誘導体、また� ��その塩を含む発色試薬であって、さらに、� ��発明の安定化剤を含むことを特徴とする。

 本発明の安定化方法は、10-(カルボキシメ チルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルア� �ノ)フェノチアジンもしくはその誘導体、ま� ��はその塩を安定化する方法であって、10-(カ ルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(� �メチルアミノ)フェノチアジン塩またはその� ��導体と本発明の安定化剤とを共存させるこ� ��を特徴とする。

 本発明の保存方法は、10-(カルボキシメチ ルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミ� �)フェノチアジンもしくはその誘導体、また� ��その塩の保存方法であって、本発明の安定� ��方法により安定化させた状態で保存するこ� ��を特徴とする。

 本発明の発色反応用キットは、発色剤と� ��て、10-(カルボキシメチルアミノカルボニル )-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンも� ��くはその誘導体、またはその塩を含み、さ� ��に、本発明の安定化剤とを含むことを特徴� ��する。

 本発明において、前記10-(カルボキシメチ ルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミ� �)フェノチアジンもしくはその誘導体、また� ��その塩は、特に示さない限り、「発色剤」� ��もいう。

 本発明者らは、鋭意研究の結果、前述の( 1)または(2)の化合物によれば、前記発色剤と� ��存させることで、前記発色剤の自然発色を� ��制できることを見出した。このため、本発� ��の安定化剤を用いれば、自然発色を抑制し� ��前記発色剤を安定化でき、これによって従� ��困難であった前記発色剤の保存も可能とな� ��。また、本発明の安定化方法によれば、例� ��ば、高感度測定が可能な前記発色剤の自然� ��色を防止することで、安定化を向上できる� ��め、前記発色剤の適用範囲を、さらに広げ� ��ことができる。したがって、本発明は、例� ��ば、臨床検査等において極めて有用といえ� ��。

 本発明において、「前記発色剤の安定化� ��とは、例えば、前記発色剤の自然発色を抑� ��すること、および、前記発色剤の発色剤と� ��ての機能を維持すること等を意味する。本� ��明の安定化剤は、不安定な前記発色剤の自� ��発色を抑制できることから、前記発色剤の� ��然発色抑制剤ということもできる。

 本発明において、前記発色剤は、前述のよ� ��に、10-(カルボキシメチルアミノカルボニル )-3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンも� ��くはその誘導体、またはその塩である。10-( カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス (ジメチルアミノ)フェノチアジンは、下記式� ��表わされ、酸化されるとメチレンブルーを� ��離して、これにより発色を示す。10-(カルボ キシメチルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメ� �ルアミノ)フェノチアジン塩は、例えば、商� ��名DA-67として和光純薬から入手可能である� �前記10-(カルボキシメチルアミノカルボニル) -3,7-ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンの� �導体は、特に制限されず、例えば、発色す� �メチレンブルーまたは発色するメチレンブ� �ー誘導体を、酸化により遊離するものであ� �ばよい。具体的には、例えば、下記式にお� �て、水素原子が、ハロゲンまたは水酸基等� �置換された誘導体等があげられる。また、� �記塩は、特に制限されず、前記塩のカウン� �ーイオンとしては、例えば、ナトリウム、� �リウム等の一価金属イオンがあげられる。

 前記発色剤は、一般的に、試料中の目的� ��分を、酸化還元反応を利用して検出する際� ��使用される。前記発色剤は、例えば、反応� ��に添加すると、前記発色剤と前記反応系に� ��ける酸化物質との酸化還元反応により、フ� ��ノチアジン誘導体色素であるメチレンブル� ��を生成(遊離)する。この遊離したメチレン� �ルーの量は、酸化物質の量に相当すること� �ら、遊離したメチレンブルーの有無や量を� �出することによって、反応系における酸化� �質の有無または量を判断できる。前記酸化� �質は、例えば、検出対象となる目的成分か� �酸化還元反応によって生成させればよい。� �た、目的成分が酸化物質の場合は、これを� �のまま前記発色剤と反応させてもよいし、� �的成分からさらに酸化物質を生成させ、こ� �と前記発色剤とを反応させてもよい。

 本発明の安定化剤は、前述のように、前記� ��色剤を安定化するための安定化剤であって� ��下記(1)および(2)の少なくとも一方の化合物� ��含むことを特徴とする。
(1)炭素数8~16のアルキル基を有する界面活性� �
(2)前記式(I)で表される化合物、前記式(II)で� �される化合物およびフラボノイド系色素か� �なる群から選択される少なくとも一つの色� �物質

 本発明の安定化剤は、例えば、さらに、下� ��(3)および(4)の少なくとも一方の化合物を含� ��でもよい。
(3)炭素数12以上の炭化水素基を有する第4級ア ンモニウムまたはその塩
(4)β-シクロデキストリンまたはその誘導体

 前記(1)の界面活性剤は、前記発色剤のフ� ��ノチアジン骨格との疎水性結合により、前� ��発色剤からのメチレンブルーの遊離を抑制� ��ていると推測される。また、前記(2)の色素� ��質は、フェノチアジン骨格の3位および7位� �ジメチルアミノ基に作用して、前記発色剤� �らのメチレンブルーの遊離を抑制している� �推測される。なお、本発明は、これらのメ� �ニズムにより、何ら制限されない。

 前記(3)の第4級アンモニウムは、前記発色 剤のカルボニル基とのイオン結合および前記 発色剤のフェノチアジン骨格との疎水結合に よって、前記発色剤からのメチレンブルーの 遊離を抑制していると推測される。また、前 記(4)のβ-シクロデキストリンは、前記発色剤 を抱合することで、前記発色剤からのメチレ ンブルーの遊離を抑制していると推測される 。なお、本発明は、これらのメカニズムによ り、何ら制限されない。

 以下に、前記(1)~(4)の化合物について、そ れぞれ説明する。

(1)界面活性剤
 本発明において前記界面活性剤は、炭素数8 ~16のアルキル基を有する界面活性剤である。 前記アルキル基は、例えば、直鎖アルキル基 、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル基等の 置換アルキル基、アルコキシアルキル基等が あげられ、また、直鎖アシル基、分枝鎖アシ ル基等も含む。前記界面活性剤としては、例 えば、下記式(IV)で表される化合物等があげ� �れる。
     R-X   ・・・(IV)

 前記式(IV)において、Rは、例えば、炭素� �が8以上または9以上のアルキル基もしくは置 換アルキル基、または、アシル基もしくは置 換アシル基である。具体例としては、炭素数 9~16の直鎖アルキル基もしくは直鎖アシル基� �炭素数10~40であり主鎖炭素数が9~16である分� �鎖アルキル基もしくは分枝鎖アシル基、ま� �は、シクロアルキルで置換された直鎖アル� �ル基(例えば、シクロアルキルの炭素数が3~8� ��あり、シクロアルキルを除く直鎖の炭素数� ��4~13)等があげられる。前記シクロアルキル� �、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチ� �、シクロブチル等があげられる。

 前記式(IV)において、Xは、糖残基であり� �例えば、単糖または二糖の残基であること� �好ましい。前記単糖としては、例えば、マ� �ノシド、グルコシド、チオグルコシド等、� �糖としては、例えば、マルトシド、フルク� �ピラノシル-グルコピラノシド、チオマルト� ��ド、スクロース等があげられる。これらの� ��の構造は、α、β、D、Lのいずれでもよい。� ��た、糖の環式構造に結合する水素や、OH基� �水素は、例えば、Na、K等の一価金属、ハロ� �ン等で置換されてもよい。なお、本発明に� �いて、前記Rと糖残基の環式構造との結合を� ��している原子(例えば、-O-、-S-等)は、糖残� �の構成要素とする。

 本発明における前記界面活性剤の具体例と� ��ては、例えば、
n-ドデシル-β-D-マルトシド(n-ドデシル-β-D-マ� ��トピラノシド)、
6-シクロヘキシルヘキシル-β-D-マルトシド、
スクロースモノラウレート(β-D-フルクトピラ ノシル-α-D-グルコピラノシドモノドデカノエ ート)、
n-デシル-β-D-マルトシド(n-デシル-β-D-マルト� ��ラノシド)、
n-ノニル-β-D-チオマルトシド(n-ノニル-β-D-チ� ��マルトピラノシド)、
5-シクロヘキシルペンチル-β-D-マルトシド、
ウンデシル-β-D-マルトシド、
n-ドデシル-α-D-マルトシド、
ヘキサデシル-β-D-マルトシド、および、
3-オキサトリデシル-α-D-マンノシド等があげ� ��れる。これらの化合物の化学式を以下に示� ��。本発明において、前記界面活性剤は、い� ��れか一種類でもよいし、二種類以上を併用� ��てもよい。

 これらの中でも、前記式(IV)におけるR(ア� ��キル鎖またはアシル基)の炭素数が12以上で� ��る、n-ドデシル-β-D-マルトシド、スクロー� �モノラウレート、ヘキサデシル-β-D-マルト� �ド等が好ましい。また、Rの炭素数が同じ場� ��(例えば、炭素数が同じアルキル基またはア シル基)、前記Rは、アシル基が好ましい。前� ��界面活性剤としては、例えば、n-ドデシル-� �-D-マルトシド(n-ドデシル-β-D-マルトピラノ� �ド)が好ましい。

(2)色素物質
 本発明における化合物(2)は、前記式(I)で表� ��れる化合物、前記式(II)で表される化合物お よびフラボノイド系色素からなる群から選択 される少なくとも一つの色素物質である。

 前記色素物質としては、例えば、前記式( I)で表される化合物、前記(II)で表される化合 物および前記フラボノイド系色素のうち、い ずれか一種類でもよいし、いずれか二種類を 併用してもよいし、三種類全てを併用しても よい。

     R ¹ -N=N-R ²    ・・・(I)
前記式(I)において、
R ¹ およびR ² において、
Xは、水素、ハロゲン、一価金属(例えば、ナ� ��リウムまたはカリウム)であり、各Xは、同� �でも異なってもよく、
Yは、水素またはSO ₃ Xであり、前記Yは、同一でも異なってもよく� ��
Zは、水素、メチル基またはメトキシ基であ� �、各Zは同一でも異なっていても良い。また� ��各式において、水素は、ハロゲン、一価金� ��(ナトリウムまたはカリウム等)等に置換さ� �てもよい(以下、同様)。

 前記式(I)で表される色素物質の具体例とし� ��は、例えば、以下の化合物があげられる。

 前記式(2)において、R ² は、例えば、下記式(5)が好ましく、前記式(3) において、R ² は、例えば、下記式(6)が好ましく、前記式(4) において、Zは、例えば、それぞれ、メチル� �と、メトキシ基であることが好ましく、R ² は、下記式(5)が好ましい。

 前記式(I)で表される色素物質としては、例� ��ば、
5-ヒドロキシ-1-(4-スルホフェニル)-4-(4-スルホ フェニルアゾ)ピラゾール-3-カルボン酸また� �その塩(例えば、三ナトリウム塩)、
6-ヒドロキシ-5-(4-スルホフェニルアゾ)-2-ナフ タレンスルホン酸またはその塩(例えば、二� �トリウム塩)、
3-ヒドロキシ-4-(4-スルホナフチルアゾ)-2,7-ナ� ��タレンジスルホン酸またはその塩(例えば、 三ナトリウム塩)、
6-ヒドロキシ-5-[(2-メトキシ-5-メチル-4-スルホ ナトフェニル)ジアゼニル]ナフタレン-2-スル� ��ン酸またはその塩(例えば、二ナトリウム塩 )、
7-ヒドロキシ-8-(4-スルホナフチルアゾ)-1,3-ナ� ��タレンジスルホン酸もしくはその塩(例えば 、三ナトリウム塩)またはその水和物(例えば� ��11/2水和物)等があげられる。これらの塩や� �和物としては、例えば、市販品が使用でき� �これらの色素物質は、食用であってもよい� �、非食用であってもよい。具体例としては� �以下のものがあげられる。
黄色3号
  別名:タートラジン、FD&C Yellow No.5
  化学名:5-ヒドロキシ-1-(4-スルホナトフェ� �ル)-4-[(4-スルホナトフェニル)ジアゼニル]-1H- ピラゾール-3-カルボン酸 三ナトリウム塩
黄色5号
  別名:Sunset Yellow FCF
  化学名:6-ヒドロキシ-5-(4-スルホナトフェ� �ルアゾ)-2-ナフタレン-2-スルホン酸 二ナト� �ウム塩
赤色2号
  別名:Amaranth
  化学名:3-ヒドロキシ-4-(4-スルホナト-1-ナ� �チルアゾ)-2,7-ナフタレンジスルホン酸 三ナ トリウム
赤色40号
  別名:Allura Red AC
  化学名:6-ヒドロキシ-5-[(2-メトキシ-5-メチ� ��-4-スルホナトフェニル)ジアゼニル]ナフタ� �ン-2-スルホン酸二ナトリウム
赤色102号
  別名:New Cocine
  化学名:7-ヒドロキシ-8-(4-スルホナト-1-ナ� �チルアゾ)-1,3-ナフタレンジスルホン酸 三ナ トリウム 1・1/2水和物

 前記式(I)で表される色素物質は、例えば� ��いずれか一種類でもよいし、二種類以上を� ��用してもよい。

 前記式(II)において、
Xは、水素、ハロゲン、一価金属(例えば、ナ� ��リウムまたはカリウム)であって、各Xは、� �一でも異なっていても良く、
Yは、水素、ハロゲン、一価金属(例えば、ナ� ��リウムまたはカリウム)であって、各Yは、� �一でも異なっていても良い。

 また、前記式(II)で表される色素物質として は、例えば、
3’,6’-ジヒドロキシ-2’,4’,5’,7’-テトラ� �ードスピロ[イソベンゾフラン-1(3H),9’-(9H)キ サンテン]-3-オンもしくはその塩(例えば、二� ��トリウム塩)または水和物(例えば、一水和� �)、
3’,6’-ジヒドロキシ-2’,4’,5’,7’-テトラ� �ロモ-4,5,6,7,-テトラクロロスピロ[イソベンゾ フラン-1(3H),9’-[9H]キサンテン]-3-オンまたは� ��の塩(例えば、二ナトリウム塩)、
4,5,6,7-テトラクロロ-3’,6’-ジヒドロキシ-2’ ,4’,5’,7’-テトラヨードスピロ[イソベンゾ� ��ラン-1(3H),9’-[9H]キサンテン]-3-オンまたは� �の塩(例えば、二ナトリウム塩)、
2,4,5,7-テトラブロモ-3,6-ジヒドロキシキサン� �ン-9-スピロ-1’-3H-イソベンゾフラン-3’-オ� �またはその塩(例えば、二ナトリウム塩)、
3,6-ジヒドロキシキサンテン-9-スピロ-1'-3’H-� ��ソベンゾフラン-3’-オンまたはその塩(例え ば、二ナトリウム塩)
等があげられる。
これらの塩や水和物としては、例えば、市販 品が使用でき、これらの色素物質は、食用で あってもよいし、非食用であってもよい。具 体例としては、以下のものがあげられる。
赤色3号
  別名:Erythrosine
  化学名:2’,4’,5’,7’-テトラヨード-3’,6� ��-ジヒドロキシキサンテン-9-スピロ-1‘-3H-イ ソベンゾフラン-3’-オン 二ナトリウム
赤色104号
  別名:赤色104-1号、Phloxine B
  化学名:2,4,5,7-テトラブロモ-3,6-ジヒドロキ シキサンテン-9-スピロ-1’-4’,5’,6’,7’-テ� ��ラクロル-3’H-イソベンゾフラン-3’-オン � ��ナトリウム
赤色105号
  別名:赤色105-1号、Rose Bengal
  化学名:2,4,5,7-テトラヨード-3,6-ジヒドロキ シキサンテン-9-スピロ-1’-4’,5’,6’,7’-テ� ��ラクロル-3’H-イソベンゾフラン-3’-オン � ��カリウム
赤色230-1号
  別名:エオシン、アシッドレッド87
  化学名:2’,4’,5’,7’-テトラブロモ-3’,6� ��-ジヒドロキシキサンテン-9-スピロ-1’-3H-イ ソベンゾフラン-3’-オン 二ナトリウム
黄色202-1号
  別名:ウラニン
  化学名:3,6-ジヒドロキシキサンテン-9-スピ ロ-1'-3’H-イソベンゾフラン-3’-オン 二ナト リウム

 前記式(II)で表される色素物質は、例えば 、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を 併用してもよい。

 前記フラボノイド系色素としては、例え� ��、フラボノイドや、フラボノイドの重合体� ��があげられる。前記フラボノイドとしては� ��例えば、市販のカキ色素(Japanese persimmon col or from Diospyros kaki THUMB.)等があげられる。� �記カキ色素は、通常、果実から抽出したフ� �ボノイドを主成分とする。また、前記フラ� �ノイドの重合体としては、例えば、市販の� �カオ色素(Cacao color from Theobroma cacao LINNE.)� ��があげられる。前記カカオ色素は、通常、� ��記フラボノイドの一種であるアントシアニ� ��の重合体を主成分とする。前記アントシア� ��ンの重合体は、例えば、下記式で表される� ��下記式中、nは重合度である。nは、特に制� �されないが、例えば、5以上であり、好まし� ��は6以上である。nの上限は特に制限されな� �。Rは、配糖体ガラクチュロン酸である。

 前記フラボノイド色素は、例えば、いず� ��か一種類でもよいし、二種類以上を併用し� ��もよい。

 本発明において、前記色素物質は、例え� ��、光照射の条件下で前記発色剤を保存する� ��能性がある場合に、特に好ましい。この色� ��物質を前記発色剤と共存させた場合、前記� ��素物質の存在によって、例えば、発色剤に� ��する光の照射が遮断されると考えられる。� ��記発色剤は、光に対して不安定であり、光� ��射によっても自然発色するおそれがあるた� ��、そのような条件下での保存が考えられる� ��には、前記色素物質を本発明の安定化剤と� ��て使用することが好ましい。

(3)第4級アンモニウムまたはその塩
 本発明における化合物(3)は、前述のように� ��炭素数12以上の炭化水素基を有する第4級ア� ��モニウムまたはその塩である。以下、「第4 級アンモニウム」という。

 前記炭化水素基の炭素数は、12以上であ� �ばよく、例えば、13、14、15、16、17、18、19ま たは20等があげられる。前記炭素数は、好ま� ��くは、14以上、16以上、17以上であり、その� ��限は限定されない。前記炭素数の範囲とし� ��は、例えば、14~18の範囲、16~18の範囲があげ られる。

 前記第4級アンモニウムは、例えば、Nに� �結する4つの炭化水素基のうち、いずれが前� ��炭素数の炭化水素基であってもよい。前記� ��4級アンモニウムは、例えば、4つの炭化水� �基のうち、1つのみが前記炭素数の炭化水素� ��であってもよいし、2つ以上が前記炭素数の 炭化水素基であってもよいし、3以上が前記� �素数の炭化水素基であってもよいし、全て� �前記炭素数の炭化水素基であってもよい。� �でも、4つの炭化水素基のうち1つが前記炭素 数の炭化水素基である第4級アンモニウムが� �ましい。

 前記炭化水素基は、例えば、直鎖または� ��枝鎖のアルキル、環状アルキル、直鎖もし� ��は分枝鎖または環状であり、置換基を有す� ��アルキルまたは置換基を有するアリール等� ��あげられる。前記置換基は、例えば、互い� ��同一であっても異なってもよい。前記置換� ��は、例えば、ハロゲン、直鎖もしくは分枝� ��のアルキル、フェニル、ヒドロキシ、直鎖� ��しくは分枝鎖のC1~C6アルコキシ等があげら� �る。前記アリールは、例えば、フェニル等� �あげられる。前記環状アルキルは、例えば� �シクロヘキシル等があげられる。また、こ� �らに代えて、例えば、直鎖または分枝鎖の� �ルキルカルボニル等であってもよい。

 第4級アンモニウムの具体例としては、例え ば、
ベンゼトニウム、
ステアリルトリメチルアンモニウム、
セチルトリメチルアンモニウム、
ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、
ベンザルコニウム、
ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム 、
ミリスチルトリメチルアンモニウム、
ラウリルトリメチルアンモニウム
ドデシルトリメチルアンモニウム、または、
ココナットアミンアセテート等があげられる 。
また、前記4級アンモニウムの塩としては、� �えば、塩化物塩、臭化物塩等があげられ、� �でも塩化物塩または臭化物塩が好ましい。� �れらの具体例としては、例えば、塩化ベン� �トニウム、塩化ステアリルトリメチルアン� �ニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウ� �、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウ� �、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジ� �チルテトラデシルアンモニウム、塩化ミリ� �チルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリ� �トリメチルアンモニウム、塩化ドデシルト� �メチルアンモニウム、塩化ココナットアミ� �アセテート、臭化ベンゼトニウム、臭化ス� �アリルトリメチルアンモニウム、臭化セチ� �トリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシ� �トリメチルアンモニウム、臭化ベンザルコ� �ウム、臭化ベンジルジメチルテトラデシル� �ンモニウム、臭化ミリスチルトリメチルア� �モニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモ� �ウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウ� �、臭化ココナットアミンアセテート等があ� �られる。

 これらの化合物は、いずれか一種類でも� ��いし、二種類以上を使用してもよい。また� ��前記炭素数の炭化水素基を有する第4級アン モニウムは、例えば、異なる炭素数の炭化水 素基を有するアミンと併用してもよく、炭素 数11以下の炭化水素基を有する第4級アンモニ ウム等と併用してもよい。

(4)β-シクロデキストリンまたはその誘導体
 本発明における化合物(4)は、前述のように� ��β-シクロデキストリンまたはその誘導体で� ��る(以下、「β-シクロデキストリン」という )。前記誘導体としては、例えば、
マルトシル-β-シクロデキストリン、
グルコシル-β-シクロデキストリン、
カルボキシメチル-β-シクロデキストリン、
ジメチル-β-シクロデキストリン、
モノアミノ-β-シクロデキストリン、
2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン 、
メチル-β-シクロデキストリン、
グルクロニルグルコシル-β-シクロデキスト� �ン、
ヘプタキス(2,6-ジ-O-メチル)-β-シクロデキス� �リン、
トリ-O-メチル-β-シクロデキストリン、
サクシニル-β-シクロデキストリン、
スルホプロピル-β-シクロデキストリン、
サクシニルヒドロキシプロピル-β-シクロデ� �ストリン、
トリアセチル-β-シクロデキストリン等があ� �られる。本発明において、前記β-シクロデ� �ストリンは、一種類でもよいし二種類以上� �併用してもよい。

 本発明における各化合物は、例えば、その� ��変異性体または立体異性体(例:幾何異性体� �配座異性体および光学異性体等)等の異性体� ��あっても良い。また、前記各化合物は、塩� ��場合、カウンターイオンは特に制限されな� ��が、例えば、六フッ化リン酸イオン(PF ₆ ^- )、四フッ化ほう酸イオン(BF ₄ ^- )、水酸化物イオン(OH ^- )、酢酸イオン、炭酸イオン、リン酸イオン� �硫酸イオン、硝酸イオン、ハロゲン化物イ� �ン、次亜ハロゲン酸イオン、亜ハロゲン酸� �オン、ハロゲン酸イオン、過ハロゲン酸イ� �ン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン(O SO ₂ CF ₃ ^- )、テトラキスペンタフルオロフェニルほう� �イオン(B(C ₆ F ₅ ) ₄ ^- )等のアニオン(陰イオン)があげられる。前記 ハロゲン化物イオンとしては、例えば、フッ 化物イオン(F ^- )、塩化物イオン(Cl ^- )、臭化物イオン(Br ^- )、ヨウ化物イオン(I ^- )等があげられる。前記次亜ハロゲン酸イオ� �としては、例えば、次亜フッ素酸イオン、� �亜塩素酸イオン、次亜臭素酸イオン、次亜� �ウ素酸イオン等があげられる。前記亜ハロ� �ン酸イオンとしては、例えば、亜フッ素酸� �オン、亜塩素酸イオン、亜臭素酸イオン、� �ヨウ素酸イオン等があげられる。前記ハロ� �ン酸イオンとしては、例えば、フッ素酸イ� �ン、塩素酸イオン、臭素酸イオン、ヨウ素� �イオン等があげられる。前記過ハロゲン酸� �オンとしては、例えば、過フッ素酸イオン� �過塩素酸イオン、過臭素酸イオン、過ヨウ� �酸イオン等があげられる。

 本発明において、「ハロゲン」とは、任� ��のハロゲン元素を指す。前記ハロゲンとし� ��は、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨ� ��素等があげられる。また、本発明において� ��「アルキル基」とは、例えば、前述のよう� ��炭素数を限定しない限り、特に限定されな� ��。前記アルキル基としては、例えば、メチ� ��基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピ� �基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル� �、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、 ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル 基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル 基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキ サデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル 基、ノナデシル基、イコシル基等があげられ る。また、本発明において、置換基等に異性 体が存在する場合は、特に制限がない限り、 どの異性体でも良い。例えば、単に「プロピ ル基」という場合は、n-プロピル基およびイ� ��プロピル基のどちらでも良い。例えば、単� ��「ブチル基」という場合は、n-ブチル基、� �ソブチル基、sec-ブチル基およびtert-ブチル� �のいずれでも良い。

 本発明の安定化剤は、例えば、前記(1)お� ��び(2)の化合物のうち、いずれか一種類のみ� ��含有してもよいし、両方を含有してもよい� ��また、本発明の安定化剤は、例えば、さら� ��、前記(3)および(4)の少なくとも一方を含有� ��てもよいし、両方を含有してもよい。本発� ��の安定化剤が、例えば、前記(1)~(4)の化合物 のうち二種類以上を含有する場合、その組み 合わせは、特に制限されないが、例えば、前 記(2)および(3)の組み合わせ、前記(2)~(4)の組� �合わせ、前記(1)~(3)の組み合わせ、前記(1)~(4) の組み合わせ等があげられる。前記(2)および (3)の組み合わせとしては、例えば、タートラ ジンと、ヘキサデシルトリメチルアンモニウ ムおよび塩化ドデシルヘキサデシルアンモニ ウムの少なくとも一方との組み合わせが例示 できる。また、前記(2)~(4)の組み合わせとし� �は、例えば、ヘキサデシルトリメチルアン� �ニウムおよび塩化ドデシルヘキサデシルア� �モニウムの少なくとも一方と、タートラジ� �と、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキス� �リン、β-シクロデキストリン、マルトシル-� �-シクロデキストリン、グルコシル-β-シクロ デキストリンおよびグロクロニルグルコシル -β-シクロデキストリンからなる群から選択� �れた少なくとも一つとの組み合わせがあげ� �れる。また、前記(1)~(3)の組み合わせとして� ��、例えば、n-ドデシル-α,β-マルトシドと、� ��ートラジンと、ヘキサデシルトリメチルア� ��モニウムとの組み合わせがあげられる。前� ��(1)~(4)の組み合わせとしては、例えば、n-ド� ��シル-α,β-D-マルトシドと、タートラジンと� ��ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよ� ��ドデシルトリメチルアンモニウムの少なく� ��も一方と、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロ� ��キストリンとの組合せ等があげられる。

 前記安定化剤の形態は、特に制限されず� ��例えば、液体(ウェット系)でも乾燥体(ドラ� ��系)であってもよい。

 本発明の安定化剤の使用方法は、特に制� ��されず、前記発色剤と共存させればよく、� ��に、前記発色剤を使用時まで保存する際に� ��前記発色剤と共存させることが好ましい。� ��記発色剤をウェット系で保存する場合は、� ��えば、前記発色剤を添加する溶媒に、本発� ��の安定化剤を添加すればよい。なお、前記� ��媒に対する前記発色剤と前記安定化剤の添� ��順序は、特に制限されない。また、前記発� ��剤をドライ系で保存する場合は、例えば、� ��ライ系の前記発色剤とドライ系の安定化剤� ��を混合してもよいし、前記発色剤と安定化� ��とを含む溶媒を乾燥することによって、ド� ��イ系としてもよい。なお、本発明の安定化� ��は、例えば、後述する本発明の発色試薬と� ��様に使用することができる。

 本発明の安定化剤は、前記(1)および(2)の� ��なくとも一方の化合物に代えて、前記(3)お� ��び(4)の化合物を含んでもよい。この場合、� ��記(3)および(4)の化合物の他に、例えば、前� ��(1)および(2)の少なくとも一方の化合物を含� ��でもよい。なお、前記(3)および(4)の化合物� ��使用する以外は、前述と同様である。

<発色試薬>
 本発明の発色試薬は、前記発色剤の保存が� ��能な試薬であって、前記発色剤と本発明の� ��定化剤とを含むことを特徴とする。

 本発明の発色試薬は、前記安定化剤とし� ��、前記(1)および(2)の少なくとも一方の化合� ��を含んでいればよい。具体的には、例えば� ��前記(1)および(2)の化合物のうち、いずれか� ��種類を含んでもよいし、両方の化合物を含� ��でもよい。本発明の発色試薬は、さらに、� ��記(3)および(4)のいずれか一方を含んでもよ� ��し、両方を含んでも。また、前記(1)~(4)の化 合物は、それぞれ、一種類であってもよいし 、例えば、炭素数や置換基が異なる化合物を 、二種類以上を含んでもよい。

 本発明の発色試薬が、例えば、前記(1)~(4) の化合物のうち二種類以上を含有する場合、 その組み合わせは、特に制限されないが、例 えば、前記(2)および(3)の組み合わせ、前記(2) ~(4)の組み合わせ、前記(1)~(3)の組み合わせ、� ��記(1)~(4)の組み合わせ等があげられる。

 本発明の発色試薬において、前記発色剤� ��対する本発明の安定化剤の添加割合は、特� ��制限されないが、前記発色剤(A)と前記安定� ��剤(B)とのモル比(A:B)が、例えば、1:1~1:1,000,00 0の範囲であることが好ましい。

 具体例としては、前記発色剤(A)と前記(1)� ��界面活性剤(B1)とのモル比(A:B1)は、例えば、 1:2~1:50,000の範囲であることが好ましい。前記 発色剤(A)と前記(2)の色素物質(B2)とのモル比(A :B2)は、例えば、1:1~1:100,000の範囲であること� ��好ましく、より好ましくは、1:2~1:50,000の範� ��である。

 前記発色剤(A)と前記(3)の第4級アンモニウ ム(B3)とのモル比(A:B3)は、例えば、1:1~1:100,000� ��範囲であることが好ましく、より好ましく� ��、1:2~1:50,000の範囲である。前記発色剤(A)と� ��記(4)のβ-シクロデキストリン(B4)とのモル比 (A:B4)は、例えば、1:1~1:100,000の範囲であるこ� �が好ましく、より好ましくは、1:2~1:50,000の� �囲である。

 前記発色試薬が乾燥試薬の場合、例えば� ��前記発色剤と前記安定化剤とが共存した乾� ��体等があげられる。前記乾燥試薬は、この� ��うなドライ系の発色試薬は、例えば、前述� ��ような溶媒に前記発色剤および本発明の安� ��化剤を溶解等した後、溶媒を除去すること� ��調製できる。前記ドライ系の発色試薬は、� ��えば、パウダー状であって、容器等に収容� ��れてもよいし、例えば、担体等の担持され� ��状態であってもよい。後者としては、例え� ��、試験用チップ等があげられる。具体的に� ��、前記試験用チップの場合、例えば、前記� ��色剤と前記安定化剤とを前記溶媒に溶解等� ��て、前記液体試薬を準備し、これを前記チ� ��プ基板の所望の領域にアプライしてから、� ��記溶媒を除去することによって調製できる� ��前記試験用チップの基板としては、特に制� ��されず、例えば、ろ紙、多孔質体、プラス� ��ック製基板等があげられる。

 本発明の発色試薬は、例えば、さらに、� ��チレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレント� ��アミン五酢酸(DTPA)およびトランス-1,2-ジア� �ノシクロヘキサン-N、N、N’、N’-テトラ酢� �(CyDTA)、O,O’-ビス(2-アミノエチル)エチレン� �リコール-N,N,N’,N’-テトラ酢酸(GEDTA)または� ��トリロトリ酢酸(NTA)等のキレート剤、アジ� �ナトリウム等を共存させてもよい。これら� �物質を共存させることにより、さらに自然� �色を安定化できる。なお、これらの物質は� �一種類でもよいし二種類以上を共存させて� �よい。

 また、本発明の発色試薬は、用途に応じ� ��、例えば、前記発色剤の発色反応(酸化還元 反応)に必要な添加剤を適宜含有してもよい� �前記添加剤としては、例えば、ペルオキシ� �ーゼ(POD)、オキシダーゼ、プロテアーゼ等の 酵素、緩衝剤、前記酵素の安定化剤、前述の ような溶媒等があげられる。

 前記発色試薬の形態は、特に制限されず� ��例えば、液体試薬(ウェット系)でもあって� �よいし、乾燥試薬(ドライ系)であってもよい 。

 前記発色試薬が液体試薬の場合、前記発� ��試薬における前記発色剤の濃度は、例えば� ��1~10,000μmol/Lの範囲であり、好ましくは5~1,000 μmol/Lの範囲である。なお、本発明の発色試� �における前記発色剤および安定化剤の濃度� �、特に制限されないが、例えば、試料や反� �系等と混合した際に、必要とされる濃度に� �るように設定すればよい。前記発色試薬は� �例えば、反応系への添加により、例えば、1. 2~100倍に希釈されることが好ましく、より好� ��しくは2~20倍である。

 前記発色試薬が液体試薬の場合、例えば� ��前記発色剤と前記安定化剤とを、溶媒に溶� ��、懸濁または分散(以下、「溶解等」ともい う)させることで調製できる。前記溶媒とし� �は、特に制限されないが、例えば、水、緩� �液等の水系溶媒等があげられ、また、水系� �媒と有機溶媒との混合溶媒等も使用できる� �前記緩衝液としては、一般的なものが使用� �き、例えば、Tris緩衝液、Tris-HCl緩衝液、MES� �衝液、MES-Tris緩衝液、MOPS緩衝液、MOPS-Tris緩� �液、ADA緩衝液、Bis-Tris緩衝液、PIPES緩衝液、� ��ン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、HEPES緩衝液� �TAPS緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、グリ� ��ンアミド緩衝液等があげられる。前記緩衝� ��の濃度は、例えば、1~500mmol/Lの範囲であり� �好ましくは5~100mmol/Lの範囲である。前記緩衝 液の中でも、例えば、カルボキシル基やスル ホ基等の酸を有する場合、使用時のpHよりも� ��いpKaを示す緩衝液を使用することが好まし� ��。また、前記緩衝液の中でも、例えば、ア� ��ノ基等のアルカリを有する場合、使用時のp Hよりも高いpKaを示す緩衝液を使用すること� �好ましい。

 前記発色試薬のpHは、特に制限されない� �、例えば、pH3~12であり、好ましくはpH4~10で� �り、より好ましくはpH5~9である。

 前述のように、本発明の安定化剤を共存� ��せることで、前記発色剤を安定化できる。� ��たがって、本発明の発色試薬によれば、本� ��明の発色剤を使用時まで安定に保存するこ� ��が可能である。保存期間は、特に制限され� ��いが、例えば、10日以上であっても、自然� �色を抑制して、従来よりも安定に前記発色� �を保存することができる。保存期間は、好� �しくは20年以内、より好ましくは4年以内で� �る。なお、本発明の安定化剤を共存させず� �液体の発色試薬として保存した場合、例え� �、10日程度で約20~90%が自然発色を起こす。前 記本発明の発色試薬の保存温度は、特に制限 されず、例えば、40℃以下であり、好ましく� ��0~30℃、より好ましくは2~10℃である。

 なお、本発明の発色試薬は、前述のよう� ��、保存時において、酸化還元反応による発� ��を前記安定化剤が抑制していても、使用時� ��は、前述のように、検体等の添加により前� ��安定化剤の濃度は低下するため、使用時に� ��ける発色の抑制は十分に回避可能である。

 また、本発明の発色試薬は、前記(1)およ� ��(2)の少なくとも一方の化合物に代えて、前� ��(3)および(4)の化合物を含んでもよい。この� ��合、前記(3)および(4)の化合物の他に、例え� ��、前記(1)および(2)の少なくとも一方の化合� ��を含んでもよい。なお、前記(3)および(4)の� ��合物を使用する以外は、前述と同様である� ��

<安定化方法>
 本発明の安定化方法は、前記発色剤の安定� ��方法であって、前記発色剤と前記安定化剤� ��を共存させることを特徴とする。

 前記発色剤と前記安定化剤とを共存させ� ��形態は、何ら制限されず、前述のように、� ��体状態で共存させてもよいし、乾燥状態で� ��存させてもよい。また、前記発色剤と前記� ��定化剤との添加割合等も、前述と同様であ� ��。なお、本発明の安定化方法は、例えば、� ��記本発明の安定化剤または本発明の発色試� ��を使用することによっても実現でき、具体� ��な方法は、前述と同様である。

<保存方法>
 本発明の保存方法は、前記発色剤の保存方� ��であって、前述のように、発色剤を、本発� ��の安定化方法により安定化させた状態で保� ��することを特徴とする。本発明においては� ��本発明の安定化剤と発色剤とを共存させた� ��態で保存すればよく、その他の形態や条件� ��、何ら制限されない。また、前記両者の添� ��割合や、保存日数、保存温度等も、前述の� ��りである。

<発色反応用キット>
 本発明の発色反応用キットは、前記発色剤� ��含むキットであって、さらに、本発明の安� ��化剤とを含むことを特徴とする。

 本発明の発色反応用キットにおいて、前� ��発色剤と前記安定化剤とは、前述のように� ��液体状態または乾燥状態で混合されていて� ��よい。また、本発明の発色反応用キットに� ��いて、前記発色剤と前記安定化剤とは、別� ��の容器に収容されてもよい。その場合、前� ��発色剤は、例えば、乾燥状態であることが� ��ましい。そして、例えば、前記乾燥状態の� ��色剤と前記安定化剤とを、溶媒に溶解等す� ��ことで、液体試薬として、前記発色剤を保� ��できる。

 前記発色剤の発色反応に使用する試薬と� ��ては、特に制限されない。具体例として、� ��えば、目的の検出物質から過酸化水素を発� ��させ、前記過酸化水素と前記発色剤とを基� ��として酸化還元反応(発色反応)を行う場合� �、ペルオキシダーゼ(POD)等の酸化酵素等を含 むことが好ましい。また、前記目的の検出物 質から過酸化水素を発生させるための各種酵 素、例えば、プロテアーゼ、酸化酵素、還元 酵素等を含んでもよい。この他にも、前記試 薬としては、例えば、緩衝剤、緩衝液等の溶 媒等があげられる。

<目的成分の測定方法>
 本発明の測定方法は、メチレンブルーの検� ��により試料中の目的成分を測定する方法で� ��って、下記(A)~(E)工程を含むことを特徴とす る。
(A)前記試料中の前記目的成分から酸化物質を 生成させる工程
(B)前記試料に、本発明の発色試薬を添加する 工程
(C)前記酸化物質と前記発色試薬中の発色剤と の酸化還元反応により、前記発色剤からメチ レンブルーを遊離させる工程
(D)遊離したメチレンブルーを検出して、前記 メチレンブルーの生成の有無または生成量を 測定する工程
(E)前記測定結果から、前記試料中の目的成分 の有無または量を決定する工程

 本発明は、前記発色剤を、本発明の安定� ��剤と共存させることが特徴であって、その� ��の工程や条件は何ら制限されない。つまり� ��前記発色剤からメチレンブルーを遊離させ� ��遊離したメチレンブルーを検出する工程を� ��むあらゆる測定方法(例えば、定性方法また は定量方法等)に適用できる。このため、本� �明は、例えば、酸化還元反応によりメチレ� �ブルーを生成させ、メチレンブルーの有無� �たはその量の増減を測定することによって� �的成分を定性または定量する方法等に、適� �することが好ましい。また、前記発色試薬� �添加順序も特に制限されず、例えば、前記(A )工程の前後のいずれであってもよい。

 前記反応系におけるメチレンブルーは、� ��述のように、吸光度測定によって行うこと� ��できる。一般的に、メチレンブルーの極大� ��収波長は、例えば、約660~670nm(例えば、約666 nm)であり、検出波長は、例えば、600~680nmの範 囲である。なお、本発明の安定化剤として、 前記(2)の色素物質を使用し、前記反応系にお いて前記発色剤と前記色素物質とが共存する 場合、例えば、メチレンブルーのスペクトル を長波長側にシフトできる。このため、前記 (2)の色素物質を使用する際には、例えば、670 nm以上、680nm以上、690nm以上での測定も可能で ある。具体的な波長範囲としては、例えば、 610~730nmであり、好ましくは650~715nmであり、よ り好ましくは660~700nmである。

 本発明における目的成分は、例えば、発� ��剤を利用した測定が可能であれば、その種� ��は何ら制限されない。前記目的成分として� ��、例えば、前記目的成分から酸化還元反応� ��より酸化物質を生成できるもの等があげら� ��る。また、前記目的成分自体が酸化物質で� ��る場合は、前述のように、前記目的成分か� ��酸化物質をさらに生成させてもよいし、例� ��ば、前記(A)工程を省略し、前記(B)工程にお� ��て、酸化物質である目的成分そのものを発� ��剤と反応させてもよい。前記目的成分の具� ��例としては、例えば、糖化ヘモグロビン(Hb) 、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化 ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸 、コレステロール、クレアチニン、サルコシ ン、グリセロール等があげられる。

 以下、実施例により本発明をさらに具体� ��に説明するが、本発明はこれらに限定され� ��ものではない。