Einsatzmöglichkeiten ergeben sich beispielsweise in der Medizin und der Pharmazie, in der Bio-und Materialwissenschaft, bei der Umweftkontrolle und dem Nachweis von in Natur oder Technik vorkommenden organischen und anorganischen Mikroproben, sind jedoch nicht auf die genannten Bereiche beschränkt.

Polymethine sind als NIR-Marker seit langem bekannt und zeichnen sich durch intensive, leicht in den NIR-Bereich verschiebbare Absorptionsmaxima aus (Fabian, J. ; Nakazumi, H. ; Matsuoka, M. : Chem. Rev. 1992,92,1197). Bei geeignetem Substituentenmuster und n-Elektronensystem fluoreszieren sie mit ausreichender Quantenausbeute auch im roten und nahem infraroten (NIR)-Bereich.

Entsprechend finden diese Verbindungen breite Anwendung in verschiedenen Bereichen der Technik, als Sensibilisatoren in AgX-Materialien, als Laserfarbstoffe, als Quantenzähler, als Indikator-Farbstoffe in der Sensorik, als Licht-Absorber in beschreibbaren CD's und nicht zuletzt als Biomarker ("Near-Infrared Dyes for High Technology Applications", herausgegeben von Daehne, S. ; Resch-Genger, U. ; Wolfbeis, O.-S., Kluwer, Academic Publishers-Dordrecht/Boston/London- 1998).

Die Anzahl der als Biomarker verwendeten Polymethine ist begrenzt. Breite kommerzielle Anwendung haben in diesem Sinne bisher nur das sich vom Astraphloxin (DE 410 487) abgeleitete Trimethin Cy3, bzw. das vinyloge Pentamethin Cy5 und das doppelt vinyloge Heptamethin Cy7 mit Absorptionsmaxima bei ca. 550 nm, ca. 650 nm und ca. 750 nm gefunden (US- PS 5 627 027). Darüber hinaus werden das polysulfonierte, vom kommerziellen Heptamethin"Indocyaningreen"bzw."Cardio Green"abgeleitete Trimethin Cy3.5 und Pentamethin Cy5.5 angeboten (US-PS 5 569 766). In der Polymethinkette aliphatisch verbrückte Heptamethine wurden von Patonay entwickelt (US-PS 5 800 995). Charakteristisch für alle kommerziellen Biomarker sind die sich vom Inden bzw. Heteroinden (Fischer-Base) ableitenden terminalen Heteroaromaten. Werden methylsubstituierte Cycloimonium-Salze dieses Typs als terminale Polymethin-Bausteine verwendet, so ist es notwendig, mindestens fünf

aufeinander folgende sp2-hybridisierte Kohlenstoffatome (Pentamethine) zwischen den Heterocyclen anzuordnen, um Absorptionsmaxima an der Grenze zum NIR-Bereich zu erzeugen.

Ein wesentlicher Nachteil der als Biomarker technisch genutzten NIR-Polymethine besteht darin, dass mit Verlängerung der Polymethinkette im steigenden Maße nucleophile bzw. elektrophile Angriffsmöglichkeiten auf die Kette gegeben sind, in deren Folge es zur Zerstörung des s-Systems kommt. Weitere Nachteile dieser Marker-Farbstoffe bestehen in einer ungenügenden Photo-oder Lagerstabilität, in aufwendigen Synthese-und Reinigungsschritten, in geringen Absorptionskoeffizienten bzw. einer unbefriedigenden Fluoreszenzquantenausbeute sowie in unerwünschten Änderungen der optischen Eigenschaften in Gegenwart von Proteinen oder Nucleinsäureoligomeren bzw. nach Bindung an diese. Beispielsweise wurde eine Verminderung der Fluoreszenzquantenausbeute von Cy5 beim kovalenten Binden an verschiedene Albumine beschrieben (Oswald, B. ; Patsenker, L. ; Duschl, J. ; Szmacinski, H. ; Wolfbeis, O. S. ; Terpetschnig, E. ; Bioconjugate Chem. 1999,10,925-931).

Die Verwendung von Pyrylium-und Benzopyrylium-Heterocyclen bzw. den entsprechenden mesomeren Chromenen als terminale Endgruppen in Markerfarbstoffen in biologisch relevanten Systemen ist bisher nicht bekannt. Dies ist auf die extreme Hydrolyseempfindlichkeit dieser z-Mangelaromaten, vor allem in wässrig-basischem Milieu, zurückzuführen (H. Lietz, G. Haucke, P. Czerney, B.

John, J. Prakt. Chem., 1996,338,725-730).

Telfer et al. (US-Patent 5 262 549) beschreiben symmetrische Trimethine auf der Basis von 2-alkyl-substituierten Benzopyryliumsalzen für die Verwendung als NIR- Absorber in polymeren Medien, wobei die Aggregationsneigung in diesen Medien reduziert ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, NIR-Marker-Farbstoffe auf Polymethin- Basis mit hoher Photo-und Lagerstabilität sowie hoher Fluoreszenzausbeute zu schaffen, die auf möglichst einfache Weise durch Laserstrahlung im langwelligen sichtbaren oder im nahen IR-Spektralbereich, insbesondere mit Licht des Helium/Neon-oder Diodenlasers, zur Fluoreszenz angeregt werden können.

Die vorliegende Erfindung beschreibt Marker-Farbstoffe auf der Basis von unsymmetrischen Polymethinen, die eine substituierte-(BenzRb] pyran-4- yliden) alk-1-enyl)-Einheit der allgemeinen Struktur I

enthalten mit Z als substituierten Benzooxazol-, Benzothiazol-, 2,3,3- Trimethylindolenin-, 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo-3H-indolenin-, 2-und 4-Picolin-, Lepidin-, Chinaldin-sowie 9-Methylacridinderivaten der aligemeinen Formeln Ha oder IIb oder IIc

wobei -X für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N- alkyl oder C (alkyl) 2 steht, -n für die Zahlenwerte 1,2 oder 3 steht, R'-R'4 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl-oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy-oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei ortho-ständige Reste, z. B. RIO und R", zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können,

-mindestens einer der Substituenten R'-R'4 einen solubilisierenden bzw. ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie Cyclodextrin, Zucker, SOg', pO32-, COO-, oder NR3+ darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt, wobei dieser Substituent auch über eine Spacergruppe am Markerfarbstoff angebunden sein kann, -mindestens einer der Substituenten R'-R'4 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht, wobei dieser Substituent auch über eine Spacergruppe am Markerfarbstoff angebunden sein kann, und -R'einen Substituenten darstellt, der in a-Position zum Pyran-Ring ein quartäres C-Atom aufweist. Beispiele für einen solchen Substituenten sind t-Butyl (-C (CH3) 3) und Adamantyl (-C, Hl5/ Tricyclo [3.3.1.1] decy)).

In den Unteransprüchen 2-20 sind spezielle Ausführungsformen und Anwendungen zu den Marker-Farbstoffen aufgeführt.

Diese substituierten Indol-, Heteroindol-, Pyridin-, Chinolin-oder Acridinderivate der allgemeinen Formel I können als Farbstoffe zur optischen Markierung von organischen oder anorganischen Mikropartikeln, z. B. von Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, Zuckern, biologischen Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen polymeren Trägermaterialien verwendet werden.

Die Markierung der Partikel kann dabei durch die Ausbildung von ionischen Wechselwirkungen zwischen den Markern der aligemeinen Formel I und den zu markierenden Materialien erfolgen.

Die gegenüber Nucleophilen aktivierten funktionellen Gruppen dieser Marker vermögen kovalent an eine OH-, NH2-oder SH-Funktion zu koppeln. Somit entsteht ein System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von organischen und anorganischen Materialien, wie den besagten Proteinen, Nukleinsäuren, DNA, Zuckern, biologische Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen Polymeren.

Diese Kopplungsreaktion kann in wässriger oder überwiegend wässriger Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dabei entsteht ein Konjugat mit fluoreszenten Eigenschaften.

Durch die Darstellung von nichtsymmetrischen Polymethinen, die einerseits als terminale Funktion einen leicht derivatisierbaren Heterocyclus vom Typ der Pyridin-, Chinolin-, Indol-, Heteroindol-bzw. Acridinderivate sowie andererseits einen neuartigen 6-Ringheterocyclus aufweisen, werden insbesondere nachfolgende Vorteile erreicht : Bereits Trimethine absorbieren im Spektralbereich > 650 nm und zeigen eine gegenüber den bisher bekannten Polymethinen mit Absorptionsmaxima > 650 nm (Penta-und Hepta-methine) eine wesentlich verbesserte photochemische und thermische Stabilität.

Durch"molecular engineering"ist es möglich, Lage und Intensität der Absorptions-und Emissionsmaxima beliebig zu steuern und den Emissionswellenlängen unterschiedlicher Anregungslaser, vor allem NIR- Laserdioden, anzupassen.

Die Marker-Farbstoffe sind durch relativ einfache und in zwei Stufen durchzuführende Synthese herstellbar, mit welcher eine Vielzahl unterschiedlich funktionalisierter Farbstoffe, beispielsweise hinsichtlich der Gesamtladung des Farbstoffes und der Anzahl, Spezifität und Reaktivität der zur Immobilisierung genutzten aktivierten Gruppen, anwendungsspezifisch zur Verfügung gestellt werden kann.

Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formel I als auch davon abgeleitete Systeme (Konjugate) können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care-Messungen), Erforschung des Genoms und in Miniaturisierungstechnologien eingesetzt werden. Typische Anwendungen erfolgen in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz- Korrelations-Spektroskopie (FCS), im Ultra-High-Troughput-Screening (UHTS), bei der multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (Gen- und Proteinchips).

Dabei ist ein Mikroarray eine rasterartige Anordnung von auf mindestens einer Oberfläche immobilisierten Molekülen, die zum Studium von Rezeptor-Liganden- Wechselwirkungen verwendet werden können. Eine rasterartige Anordnung bedeutet mehr als zwei voneinander verschiedene Moleküle, welche sich innerhalb einer Fläche befinden und dort in unterschiedlichen, vorher definierten Regionen mit bekannter Position immobilisiert sind.

Ein Rezeptor ist ein Molekül, das eine Affinität zu einem gegebenen Liganden besitzt. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Moleküle sein.

Rezeptoren können in reiner Form oder gebunden an andere Spezies eingesetzt werden. Rezeptoren können kovalent oder nichtkovalent entweder direkt oder durch bestimmte Kopplungsvermittler an einen Bindungspartner angeknüpft werden.

Beispiele für Rezeptoren, die durch diese Erfindung detektiert werden können, schließen Agonisten und Antagonisten für Zell-Membran-Rezeptoren, Toxine und andere Giftstoffe, virale Epitope, Hormone wie Opiate und Steroide, Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, als Kofaktoren agierende Wirkstoffe, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Zellen, Zellfragmente, Gewebefragmente, Proteine und Antikörper ein, sind aber nicht auf die angeführten Stoffe beschränkt.

Ein Ligand ist ein Molekül, das von einem bestimmten Rezeptor erkannt wird.

Beispiele für Liganden, die durch diese Erfindung detektiert werden können, schließen Agonisten und Antagonisten für Zell-Membran-Rezeptoren, Toxine und andere Giftstoffe, virale Epitope, Hormone wie Opiate und Steroide, Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, als Kofaktoren agierende Wirkstoffe, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Proteine und Antikörper ein, sind aber nicht auf die angeführten Stoffe beschränkt.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen und Zeichnungen näher erläutert werden.

In den dazugehörigen Zeichnungen zeigt Fig. 1 Strukturformel von Benzopyrylium-Salz 2a Fig. 2 Synthese und Strukturformel von Benzopyrylium-Salz 2b Fig. 3 Synthese und Strukturformel von Trimethin OB11 (DY-630) Fig. 4 Fluoreszenzspektren von OB15 (DY-635) in wäßriger Lösung und gebunden an Rinderserum-Albumin (BSA) Fig. 5 Fluoreszenzanregungsspektren von OB15 (DY-635) in wäßriger Lösung und gebunden an Rinderserum-Albumin (BSA)

Ausführungsbeispiele : 1. Vorschrift zur Darstellung von 11-(2, 2-Dimethylethyl)-9-methyl- 1 H, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H-pyrano [2,3-f] pyrido [3,2,1-ij] chinolin-12-ium tetrafluoroborat 2b (BS 28), vgl. Fig. 2 : Zu einer gekühiten Lösung von 7.3 g (0.0245 mol) 11- (2, 2-Dimethylethyl)- 1H, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H-pyrano [2, 3-f] pyrido [3,2,1-ij] chinolin-9-on in 50 ml Ethylenglycoldimethylether werden tropfenweise 50 ml einer 1.0 molaren Lösung von Methylmagnesiumbromid in Dibutylether gegeben. Die Mischung wurde für 30 Minuten auf 40°C erwärmt. Nach Kühlung auf 0°C wurde 70 ml gesättigte NH4CI-Lösung und verdünnte Salzsäure zur Hydrolyse zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit 4 x 10 ml Diethylether extrahiert. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und der ölige Rückstand in 20 ml Eisessig gelöst. Zugabe von 3 ml HBF4 (48-50 %) und Verdünnen mit Diethylether führte zu einem Niederschlag, der abfiltriert und aus Eisessig umkristallisiert wird.

3.35 g (35 %) Ausbeute, 175-80°C Schmelzpunkt.-'H NMR (400 MHz, CDCI3 + CF3CO2D) : 1.43 (s, 9H), 1.90 (m, 2H), 2. 06 (m, 2H), 2. 67 (m, 2H), 2.92 (m, 2H), 3.35 (m, 2H), 3.57 (m, 2H), 3.95 (s, 3H), 6.90 (s, 1 H), 7.58 (s, 1 H) :-C20H26BF4NO (383.24) : ber. C 62.68, H 6.84, N 3.65, gef. C 63.06, H 6.72, N 3.48.

2. Allgemeine Vorschrift zur Darstellung der unsymmetrischen Trimethine OB 11, OB 14, OB 15 und OB 20 : 0.01 mol vom entsprechenden 4-Methyl-benzopyrylium-tetrafluoroborat der Formel 2a (BS4) oder 2b (BS28) (vgl. Fig. 1 und 2) und 0.01 mol methylenaktiver N-Heterocyclus wurden in 20 ml Acetanhydrid gelost, mit 2,0 g Triethoxymethan und 5 ml Pyridin versetzt und ca. 10 min erhitzt. Nach dem Abkühlen der Lösung auf RT wurde das Farbstoffrohprodukt mit ca. 30 ml Diethylether ausgefällt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und säulenchromatographisch gereinigt.

3.1- (5-Carboxypentyl)-3, 3-dimethyl-2- [3- (7-N, N-diethylamino-2- (1,1- dimethylethyl)-4H-benzopyran-4-yliden)-1-propenyl]-3H-indoli um-5-sulfonat OB 11 (DY-630) : 0.01 mol 2a und 0.01 mol 1- (5-Carboxypentyl)-2, 3,3-trimethyl-3H-indolium-5- sulfonat wurden entsprechend der allgemeinen Vorschrift 1 umgesetzt, vgl. Fig. 3.

Säulenchromatographie : SiO2, Eluent Ethanol. 3.2 g (50 %) Ausbeute, 280-82°C Schmelzpunkt.-'H NMR (400 MHz, DMSO-d6) : 1.10-1.86 (m, 27H), 2.16 (m, 2H), 3.54 (m, 4H), 4.13 (m, 2H), 6.58 (d, 1 H), 6.74 (s, 1 H), 6.97 (s, 1H), 7.06 (d, 1 H), 7.14 (d, 1 H), 7.36 (d, 1H), 7.68 (d, 1 H), 7.78 (s, 1 H), 8.08 (d, 1 H), 8.32 (t, 1H)-13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) : 12.30,21.51,24,32,25.66,26.56,27.55, 34.07,36.37,43.72,44.22,48.87,96.36,99.40,104.11,109.85,110. 28, 112.48,113.27,119.66,126.09,140.23,141.81,145.59,147.09,162. 14, 172.33,174.64-MS (FAB in dmba) : 657 (M+Na+), 635 (M+H+), 391,359,258, 257-C36H46N206S (634.83) : ber. C 68.11, H 7.30, N 4.41, gef. C 68.25, H 7.33, N 4. 39.

4.1- (3-Hydroxypropyl)-4- [3- (7-N, N-diethylamino-2- (1, 1-dimethylethyl)-4H- benzopyran-4-yliden)-1-propenyl]-chinolinium-tetrafluorobora tOB 14 : 0.01 mol 2a und 0.01 mol 1- (3-Hydroxypropyl)-4-methylchinolinium-iodid wurden entsprechend der allgemeinen Vorschrift 1 umgesetzt.

Säulenchromatographie : SiO2, Eluent Toluol/Ethanol 1/1. 2.4 g (42 %) Ausbeute, 162-64°C Schmelzpunkt.-'H NMR (400 MHz, CDCI3) : 1.17 (t, 6H), 1.32 (s, 9H), 2.14 (m, 2H), 2.25 (s, 1 H), 3.39 (q, 4H), 3.71 (m, 2H), 4.89 (m, 2H), 6.31 (d, 1 H), 6.56 (s, 1 H), 6.62 (m, 2H), 7.01 (d, 1 H), 7.60 (t, 1 H), 7.67 (d, 1H), 7.77 (d, 1H), 7.84 (t, 1 H), 7.93 (d, 1 H), 8.12 (t, 1 H), 8.31 (d, 1 H), 9.27 (d, 1H).-13C NMR (100 MHz, CDC13) : 12.52,28.08,32.01,36.20,44.61,52.53,57.52,97.05,97.94, 109.58,109.94,110.91,111.77,113.61,117.72,124.79,125.38,125. 50, 127.13,133.64,137.96,140.92,142.20,144.96,150.87,151.74,155. 40, 167.12-MS (FAB in dmba) : 483 (M+)-C32H39BF4N202 (570.48) : ber. C 67.37, H 6.89, N 4.91, gef. C 67.30, H 6.92, N 4.89.

5.1- (5-Carboxypentyl)-3, 3-dimethyl-2- [3- (11- (2, 2-dimethylethyl)- 1 H, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H-pyrano [2,3-f] pyrido [3,2,1-ij] chinolin-9-yliden)-1- propenyl]-3H-indolium-5-sulfonat OB 15 (DY-635) : 0.01 mol 2b und 0.01 mol 1- (5-Carboxypentyl)-2, 3,3-trimethyl-3H-indolium-5- sulfonat wurden entsprechend der allgemeinen Vorschrift 1 umgesetzt.

Säulenchromatographie : SiO2, Eluent Ethanol. 2.9 g (44 %) Ausbeute, >300°C Schmeizpunkt. 1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) : 1.10-1.56 (m, 19H), 1.91 (m, 4H), 2.08 (m, 4H), 2.83 (m, 4H), 3.38 (m, 4H), 4.03 (m, 2H), 6.45 (d, 1 H), 6.97 (s, 1 H), 7.13 (d, 1 H), 7.26 (d, 1 H), 7.62 (d, 1 H), 7.73 (s, 1H), 7.78 (s, 1 H), 8.23 (t, 1H)-13C NMR (62 MHz, DMSO-d6) : 19.40,20.43,24.86,25.98,26.61,27.16, 27. 76,27.85,28.94,35.17,36.71,43.40,48.45,49.04,49.63,99.24,102 .90, 105.09,109.69,110.03,112.96,119.71,121.85,123.50,139.89,142. 18, 144.84,145.76,148.56,148.86,151.59,170.08,171.37-MS (ESI) : 681 (M+Na+), 659 (M+H+), 352-C38H46N206S (658.12) : ber. C 69.27, H 7.34, N 4.25, gef. C 69.20, H 7.37, N 4.29.

6.1- (5-Carboxypentyl)-4- [3- (7-N, N-diethylamino-2- (1, 1-dimethylethyl)-4H- benzo-pyran-4-yliden)-1-propenyl]-chinolinium-6-sulfonat OB 20 : 0.01 mol 2a und 0.01 mol 1- (5-Carboxypentyl)-4-methyl-chinolinium-6-sulfonat wurden entsprechend der allgemeinen Vorschrift 1 umgesetzt.

Säulenchromatographie : SiO2, Eluent Ethanol. 2.1 g (35 %) Ausbeute, >300°C Schmelzpunkt.-C35H42N206S (618. 76) : ber. C 67.93, H 6.84, N 4.53, gef. C 67.73, H 6.93, N 4.29.

7. Darstellung des NHS-Esters von OB 11 (DY-630) mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)/N, N'-Dicyclo-hexylcarbodiimid (DCC) 15 mg OB 11 (DY-630), 14 mg DCC und 4 mg NHS wurden in 1 mi trockenem DMF gelöst. Dann gab man 10 pI Triethylamin zu. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand mit Ether gewaschen. Diese Reaktion verlief quantitativ.

8. Darstellung des NHS-Esters von OB 15 (DY-635) mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)/N, N'-Dicyclo-hexylcarbodiimid (DCC) Es wurde analog zum Beispiel Nr. 7 verfahren. Auch diese Reaktion verlief quantitativ.

9. Anregungs-und Emissionsspektren von 1- (5-Carboxypentyl)-3, 3-dimethyl-2- [3- (11- (2, 2-dimethylethyl)-1 H, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H-pyrano [2,3-f] pyrido [3,2,1- ij] chinolin-9-yliden)-1-propenyl]-3H-indolium-5-su If onat OB 15 (DY-635) Die Abbildungen in Fig. 4 zeigen die Emissions-und in Fig. 5 die Anregungsspektren von 1- (5-Carboxypentyl)-3, 3-dimethyl-2- [3- (11- (2, 2- dimethylethyl)-1 H, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H-pyrano [2,3-f] pyrido [3,2,1-ij] chinolin-9- yliden)-1-propenyl]-3H-indolium-5-sulfonat in Wasser und nichtkovalent gebunden an Rinder-Serum-Albumin (BSA), wobei jeweils das intensivere Spektrum das BSA konjugat kennzeichnet. Beide Farbstofflösungen waren bei diesen Messungen gleich konzentriert.

10. Allgemeine Vorschrift zur Markierung von Proteinen Die Proteinmarkierungen wurden in einem 50 mM Bicarbonatpuffer (pH 9,0) ausgeführt. Es wurde eine Stammlösung mit 0.5 mg Reaktivfarbstoff (z. B. OB 11- NHS-ester, M=732 g mol-1) in 100 pI DMF hergestellt. Das Protein, z. B. Avidin (M=66000 g mol-1) wurde portionsweise zu je 1 mg in 200 ml Bicarbonatpuffer gelöst, worauf verschiedene Volumina der ggf. verdünnten Farbstoff- Stammlösung zu den einzelnen Protein-Aliquots hinzugegeben wurden. Dann wurden die Reaktionsgemische 1-2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der freie Farbstoff wurde von den markierten Proteinen durch Gelchromatographie (Sephadex G25 medium, Eluent PBS pH 7.2 22mM) abgetrennt.