本发明涉及生物技术领域， 具体地， 涉及 microRNA标准化的内参基因及其 用途。 背景技术

微小核糖核酸 (microRNA, miRNA)是一类长度约为 22个核苷酸的非编码 RNA分子， 它们在基因调控网络中起重要作用。 在血清、 血浆、 唾液、 尿液、 乳液等体液中， miRNA高度稳定地存在于细胞外。 miRNA与多种疾病有关， 已 经在多种病变条件下检测到 miRNA， 尤其是循环 miRNA的异常表达， 该病变条 件包括癌症、 糖尿病、 心脏衰竭、 急性心肌梗死和组织损伤等。 在某些病理情 况下， 尤其在像癌症这样的疾病中， miRNA, 特别是循环 miRNA的表达谱可能 随生理和病理条件的变化而发生显著变化。 这些研究表明， miRNA作为分子诊 断和预后的非侵入性生物标志物有着广阔的发 展前景。

近年来已有若干种方法被用于定量测量临床样 本中的 miRNA, 如 Solexa测 序法、 qRT-PCR法和 microarray法， 上述方法的准确性在很大程度上取决于使用 的参照基因。 参照基因可以是一个基因或者基因的组合， 并且在多种实验条件 和不同样本集中都稳定表达。 在临床应用中， 需要将 miRNA作为生物标志物的 检测标准化， 使检测过程可在任何实验室重复。 然而， 在进行 miRNA的定量检 测时， 原材料量的变化、 样品的采集和储存方法不同、 RNA的提取和酶解效率 的不同， 都可能导致潜在的偏差和量化的误差； 小体积样本中的总 RNA的量很 低， 甚至低于分光光度法准确定量的极限。 上述问题都严重影响了 miRNA定量 分析的准确性和可靠性。

理想的 miRNA标准化的参照基因应该具备下述条件：

1) 在所有样本中和实验条件下都稳定地表达；

2) 表达量可以与考察对象进行比较；

3) 具有与考察对象相似的属性， 如 RNA稳定性、 大小等。

迄今为止， 标准化测量样本中 miRNA时， 对参照基因的选择都还停留于经 验， 还未确定出符合上述标准的参照基因。 近年来出现了用人工合成的非人类 (如线虫） miRNA作为 miRNA检测标准化的外源性对照， 但是， 外源性对照不 能纠正样本采集的差异， 所以并不是理想的选择。 同时， 一些内源性基因常被 用作组织 /细胞 miRNA检测的内参基因， 比如 5SrRNA、 18SrRNA和 U6等， 但是 由于这些基因不是 miRNA, 不能代表 miRNA的组分， 而且这些基因的提取、 反 转录和 PCR扩增的效率可能与 miRNA有所不同。 因此， 这些基因也不是最理想 的选择。

目前尚无研究对 miRNA标准化的最佳参照基因进行系统性的鉴定� ��评估， 因此， 本领域迫切需要开发能够作为 microRNA标准化的参照基因， 并建立检测 miRNA, 特别是循环 miRNA的有效标准化方案。 发明内容

本发明的目的是提供一种作为 microRNAs标准化的内参基因及其用途。

本发明的另一目的是提供一种筛选内参基因的 方法及其应用。 在本发明的第一方面， 提供了一种微小核糖核酸 (microRNA)或其对应的核 酸序列或互补序列的用途， 其中， 所述的 microRNA选自下组： let-7d、 let-7g、 let-7i， 或其组合， 它们用作 microRNAs标准化的内参基因。

在本发明的第二方面， 提供了一种用于 microRNA标准化的内参基因集， 所 述内参基因集包括选自下组 2种或 3种 microRNA所构成的组合： let-7d、 let-7g、 和 let-7i。

在另一优选例中， 所述的内参基因集由 let-7d、 let-7g、 和 let-7i三种 microRNA 构成， 或所述的内参基因集至少包含上述三种 microRNA。

在另一优选例中， 所述的内参基因集还包括选自下组的一种或多 种辅助内参 基因： U6、 RNU44、 RNU48、 miR-16、 miR-191、 mi -103, miR-23a、 GADPH、 β-actin, 或其组合。

在本发明的第三方面， 提供了一种 miRNA标准化定量的方法， 包括步骤：

(1) 测定样本中待测 miRNA的绝对浓度；

(2) 将步骤 (1)获得的待测 miRNA的绝对浓度与样本中内参基因的绝对浓度 进行比较， 获得待测 miRNA的相对浓度。

在另一优选例中， 步骤 (2)所述的内参基因选自下组： let-7d、 let-7g、 let-7i、 或其组合。

在另一优选例中， 所述内参基因集包括选自下组 3种 microRNA所构成的组 合： let-7d、 let-7g、 禾口 let-7i。

在另一优选例中， 在步骤 (2)中， 将待测 miRNAs的绝对浓度与样本中 let-7d、 let-7g和 let-7i的总浓度进行比较。

在另一优选例中， 所述的样本选自下组： 血液、 血浆、 血清、 体液、 细胞、 组织、 器官、 或其组合。 在另一优选例中， 所述的样本来自正常个体或疾病个体。

在另一优选例中， 所述的待测样品来自人或非人哺乳动物， 较佳地为人。 在另一优选例中， 所述的内参基因还包括选自下组的一种或多种 辅助内参基 因： U6、 RNU44、 RNU48、 miR- 16、 miR-191、 mi -103 , miR-23a、 GADPH、 β-actin, 或其组合。

在本发明的第四方面， 提供了一种可用于定量检测微小核糖核酸的生 物芯 片， 所述的芯片包括固相载体以及位于所述固相载 体上的检测点， 所述检测点 用于特异性地检测本发明第一方面所述的微小 核糖核酸 (microRNA)或其对应 的核酸序列或互补序列， 或用于检测本发明第二方面所述的内参基因集 。

在本发明的第五方面， 提供了一种用于检测微小核糖核酸 (microRNA)的试 剂盒， 所述试剂盒包含一容器以及位于所述容器内的 测定内参基因或内参基因 集的试剂或本发明的第四方面所述的芯片，

其中， 所述内参基因或内参基因集包括选自下组的 1种、 2种或 3种 microRNA: let-7d、 let-7g、 let-7i;

其中， 所述的试剂选自下组：

(a) 特异性扩增所述内参基因的引物或引物对；

(b) 特异性与所述内参基因的核酸分子进行杂交的 探针；

其中， 所述的芯片是核酸芯片， 所述芯片具有特异性检测所述内参基因的 核酸分子的检测点。

在另一样优选例中， 所述的内参基因集包括 let-7d、 let-7g和 let-7i。

在本发明的第六方面， 提供了一种筛选 microRNA标准化内参基因的方法， 包括步骤：

(1) 获得疾病和正常样本， 提取并定量样本中的 RNA;

(2) 对步骤（1)获得样本的 microRNA进行测序， 获得样本中 microRNA的序列 信息；

(3) 分析 microRNA的稳定性， 选择稳定性高于平均水平的 microRNA, 作为候 选基因。

在另一优选例中， 所述方法还包括步骤 (4): 对步骤 (3)获得的候选基因进行 验证。

在另一优选例中， 步骤 (4)所述的验证包括步骤：

(i) 用 qRT-PCR技术， 比较对照内参基因和步骤 (3)获得的候选基因的稳定 性；

(ii) 利用 geNorm和 NormFinder算法对对照内参基因和候选基因进行� �估。 在另一优选例中， 步骤 (4)之后还包括步骤 (5):鉴定候选基因在极端条件下的 稳定性和准确性。

在另一优选例中， 所述的极端条件选自下组： 存在核糖核酸酶、酸性条件、 碱性条件、 或其组合。

在另一优选例中， 步骤 (2)所述的测序包括步骤：

将获得的样本中的 microRNA, 与固相载体上固定的测序探针进行杂交， 进 行固相桥式 PCR扩增， 形成测序簇； 然后对所述测序簇用 "边合成-边测序"法进行 测序， 从而获得样本中 microRNA的序列。

在另一优选例中， 步骤 (3)所述的分析包括步骤： 使用 geNorm和 NormFinder 算法分析 microRNA的稳定性， 选择方差最小的基因， 作为候选基因。 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各 技术特征和在下文 (如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合 ， 从而构成新的或优选的技术方 案。 限于篇幅， 在此不再一一累述。 附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案， 而不用于限定由权利要求书所 界定的本发明范围。

图 1显示了在本发明的一个优选例中， 筛选用于 microRNAs检测的最优参 照基因的流程。

图 2显示了采用 Solexa测序筛选稳定参照基因的结果， 其中， 图 2A显示用

S olexa测序方法测定其 miRNA水平结果； 图 2B显示选定的 miRN As的平均表达 值 (Solexa 读数 ± 标准误差)结果； 图 2C显示， 用 geNorm从 25个基因中选择最 稳定的参照基因结果；图 2D显示用 geNorm确定准确标准化的参照基因的最优数 量结果； 图 2E显示用 geNorm筛选最稳定的参照基因或者基因组合结果 ； 图 2F 显示用 NormFinder确定最稳定的参照基因结果。

图 3显示了用实时荧光定量 PCR检测验证选定的候选参照基因的稳定性结 果， 其中， 图 3A为候选参照基因的表达水平结果； 图 3B显示用 geNorm确定准 确标准化的参照基因的最优数量结果； 图 3C显示用 NormFinder确定最稳定的参 照基因结果； 图 3D显示大量血清样本中最优参照基因的表达水� ��结果。

图 4显示了血清 let-7d/let-7g/let-7i在各种极端条件下的绝对浓度� ��稳定性的 特征； 其中， 图 4A显示实时荧光定量 PCR测量 let-7d/let-7g/let-7i (n=5)的动态范 围和灵敏度结果； 图 4B显示血清体积与 C _T 值 (n=5)的相关性结果； 图 4C显示延 时储藏后血清中 let-7d/let-7g/let-7i的稳定性 (n=5)结果； 图 4D显示血清中其他 NAs的不稳定性（n=5)结果； 图 4E显示核糖核酸酶降解后血清中 let-7d/let-7g/let-7i的稳定性 (n=5)结果； 图 4F显示核糖核酸酶降解后血清中其他 RNAs的不稳定性 (n=5)结果； 图 4G和图 4H分别显示在酸性或碱性条件下 let-7d/let-7g/let-7i的稳定性 (n=5)结果。

图 5显示了不同标准化方法对目标循环 miRNAs的影响结果。 具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究， 对健康人和多种疾病患者体内循环 miRNAs进行标准化， 首次发现在众多的微小核糖核酸中， let-7d， let-7g， let-7i 三个基因中的任意一个或其组合， 均可用作 miRNAs检测的内参基因， 并具有 极高的稳定性和准确度。 在此基础上完成了本发明。

具体地， 本发明人采用高通量 Solexa测序方法， 检测健康对照组和患者样 本的血清 miRNAs的表达水平， 并采用 geNorm和 NormFinder两种算法， 鉴定测 序数据， 得出最佳候选参照基因； 采用定量逆转录聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 进行验证性实验， 在大量对照组和患者样本中检测最佳候选参照 基因和常用的 参照基因 (U6、 RNU44、 RNU48等）， 在大量健康对照组和不同疾病患者样本中， 发现 let-7d、 let-7g、 let-7i或其组合均可以作为内参基因。 微小核糖核酸 (miRN A)和循环 miRN A

微小核糖核酸是一类长约 19至 23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子， 在进化上高度保守， 广泛存在于动植物细胞中。 微小核糖核酸在基因表达调控 领域中起着重要作用， 其序列、 结构、 丰度和表达方式的多样性， 使之成为信 使 RNA强有力的调控因子。 微小核糖核酸的发现丰富了人们对蛋白质合成 控制 的认识， 补充了在 RNA水平对分子进行更迅速更有效调节的新方式 ， 展现了细 胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统。

某些 miRNA即使在核糖核酸酶存在的情况下， 也在体液中以高浓度和充分 完整的形态循环， 这些 miRNA称为循环 miRNA。 循环 miRNA之所以高度稳定， 可能是因为： 1. 循环 miRNA由微泡包裹保护； 2. 循环 miRNA与蛋白（如 Argonaute2蛋白、 高密度脂蛋白和核磷蛋白 1)相结合。 本发明人经过广泛而深 入的研究， 在众多的内源 miRNA中， let-7d、 let-7g、 let-7i, 或其组合， 均可以 用作 miRNA检测的内参基因。

let-7d, let-7g， let-7i的核酸序列见表 1。 Let-7d AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 1

Let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 2

Let-7i UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU 3 参照基因组合相对于单个参照基因的优势

标准化通常采用单个参照基因， 如 GAPDH、 α-tubulin或 β-actin等等， 但是 这种参照基因的表达在不同条件下会发生显著 变化， 使用单个基因进行标准 化， 可能在对转录量的定量分析中导致显著错误。 本发明提供了一种采用多参 照基因进行标准化的方案， 计算出 let-7d、 let-7g和 let-7i的组合是用于标准化最 佳的基因组合， 三个 miRNAs组合比两个 miRNAs的组合或者单个 miRNA, 可使 标准化更可靠。 高通量测序

本领域技术人员通常可以采用三种第二代测序 平台进行高通量测序： 454 FLX(Roche公司)、 Solexa Genome Analyzer(Illumina公司)禾卩 Applied Biosystems 公司的 SOLID等。 这些平台共同的特点是极高的测序通量， 相对于传统测序的 96道毛细管测序， 高通量测序一次实验可以读取 40万到 400万条序列， 根据平 台的不同， 读取长度从 25bp到 450bp不等， 因此不同的测序平台在一次实验中， 可以读取 1 G到 14G不等的碱基数。

其中， Solexa 高通量测序包括 DNA簇形成和上机测序两个步骤： PCR扩增 产物的混合物与固相载体上固定的测序探针进 行杂交， 并进行固相桥式 PCR扩增， 形成测序簇； 对所述测序簇用 "边合成 -边测序法"进行测序。

DNA簇的形成是使用表面连有一层单链引物 (primer)的测序芯片 (flow cell) 单链状态的 DNA片段通过接头序列与芯片表面的引物通过碱 基互补配对的原 理被固定在芯片的表面， 通过扩增反应， 固定的单链 DNA变为双链 DNA， 双链 再次变性成为单链， 其一端锚定在测序芯片上， 另一端随机和附近的另一个引 物互补从而被锚定， 形成"桥"； 在测序芯片上同时有上千万个 DNA单分子发生 以上的反应； 形成的单链桥， 以周围的引物为扩增引物， 在扩增芯片的表面再 次扩增， 形成双链， 双链经变性成单链， 再次成为桥， 称为下一轮扩增的模板 继续扩增； 反复进行了 30轮扩增后， 每个单分子得到 1000倍扩增， 称为单克隆 的 DNA簇。

DNA簇在 Solexa测序仪上进行边合成边测序， 测序反应中， 四种碱基分别 标记不同的荧光，每个碱基末端被保护碱基封 闭，单次反应只能加入一个碱基， 经过扫描， 读取该次反应的颜色后， 该保护集团被除去， 下一个反应可以继续 进行， 如此反复， 即得到碱基的精确序列。 在 Solexa多重测序 (Multiplexed Sequencing)过程中会使用 Index(标签)来区分样品， 并在常规测序完成后， 针对 Index部分额外进行 7个循环的测序， 通过 Index的识别， 可以在 1条测序甬道中 区分 12种不同的样品。 筛选标准化内参基因的方法

为了提供循环 miRNAs标准化适合的参照基因， 本发明还提供了一种筛选 方案 （见图 1 ) ， 在一个优选例中， 筛选方案包括三个主要的步骤：

第一步： 采用 Solexa测序筛选样本集， 代表广泛的生理和病理条件， 采用 geNorm NormFinder统计算法，对基因的稳定性进行排序� �筛选最稳定的候选基 因， 在不同样本中用最小方差表示。 同时筛选文献， 确定常用的参照基因； 第二步： 结合上述两方面结果， 形成最佳候选参照基因集。 采用 qRT-PCR 检测所述最佳候选基因， 利用 geNorm和 NormFinder两种统计方法评估候选基因 的稳定性。 接着， 在更大的样本集中， 进一步验证鉴定出的最稳定候选基因， 即最佳参照基因；

第三步： 应用所述最佳参照基因， 检测其绝对浓度， 评估在各种极端条件 下所述最佳参照基因的稳定性，并利用所述最 佳参照基因，对检测目标 miRNAs 进行标准化。 检测方法

本发明还提供了一种 miRNAs标准化定量的方法， 包括步骤：

(1) 测定样本中待测 miRNAs的绝对浓度；

(2) 将步骤 (1)获得的待测 miRNAs的绝对浓度 与样本中内参基因的绝对浓 度进行比较， 获得待测 miRNAs的相对浓度。

在本发明的一个优选例中，步骤 (2)所述的内参基因选自下组： let-7d、 let-7g、 let-7i、或其组合，较佳地，将待测 miRNAs的绝对浓度与样本中 let-7d， let-7g和 let-7i 的浓度进行比较。

在另一优选例中， 所述的待测样品包括： 血清、 血浆、 血液、 尿液、 乳汁、 细胞、 组织、 器官、 或其组合。

在另一优选例中， 所述的待测样品来自正常个体和疾病个体。 待测样品来自 人或非人哺乳动物， 更佳地为人。

在本发明中， 检测微小核糖核酸的方法没有特别限制， 代表性来自包括 (但 并不限于）： RT-PCR方法、 real-time PCR方法、 Northern blotting法、 Solexa测序 法、 原位杂交（ISH) 、 恒温滚环扩增（RCA) 、 Solexa测序法或生物芯片方法。 芯片

本发明还提供了一种用于检测微小核糖核酸的 生物芯片， 所述的芯片包括 固相载体以及位于所述固相载体上的检测点， 所述检测点用于特异性地检测微 小核糖核酸 (let-7d、 let-7g、 let-7i, 或其组合)或其对应的核酸序列或互补序列， 或用于检测微小核糖核酸构成的内参基因集。

该芯片包括以下组分：

固相载体 (如基片或微球)以及有序固定在固相载体上的� ��核苷酸探针。

本发明的检测芯片可以含有一种或多种， 较佳地含有 5种， 更佳地 10 种， 最佳地 20种 miRNA的检测点。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用 材料， 例如但不限于尼龙膜， 经活性基团 （如醛基、 氨基等） 修饰的玻片或硅片， 未修饰的玻片、 塑料片等。 所述的寡核苷酸探针是生物素化或带荧光标记 的探针。

所述的 miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片� ��常规制造方法。 例如， 如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针 的 5'端含有氨基修饰的聚 dT 串， 可将寡核苷酸探针配制成溶液， 然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片 上， 排列成预定的序列或阵列， 放置过夜以固定， 就可得到本发明的 miRNA芯 片。 试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒， 该试剂盒包含测定内参基因或内参基因集的 试剂或芯片， 所述内参基因或内参基因集包括选自下组的 1种、 2种或 3种 micro NA: let-7d、 let-7g、 和 let-7i;

其中， 所述的试剂选自下组：

(a) 特异性扩增所述内参基因的引物或引物对；

(b) 特异性与所述内参基因的核酸分子进行杂交的 探针；

其中， 所述的芯片是核酸芯片， 所述芯片具有特异性检测所述内参基因的 核酸分子的检测点。 在另一样优选例中， 所述的内参基因集包括 let-7d， let-7g和 let-7i。 本发明的主要优点

(1) 筛选的内参基因使得 miRNAs标准化过程的准确度获得了极大地提高；

(2) 本发明的内参基因适用于各种实验条件； (3) 本发明的内参基因稳定性高， 且能够用于极端条件下。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的 条件。 通用方法

1. 从血清样本中提取 RNA

从每个捐助者身上收集静脉血液样本 (约 5 ml), 置于血清分离管中。 样本 处理应在 1小时内处理。 室温下以 800g离心 10分钟， 后在室温下以 10,000 g高速 离心 15分钟， 以彻底去除细胞碎片。 收集上清， 储存于 -80°C， 以备分析用。

混合若干个样本（每个 5mL)创建血清株， 用力搅拌， 然后用 TRIzol试剂 (Invitrogen公司， 卡尔斯巴德， 美国加利福尼亚州）从 50mL混合血清中提取总 实时荧光定量 PCR检测分析： 从 ΙΟΟμΙ^血清中用一步酚 /氯仿纯化法提取总 RNA。 具体地， 依次向 ΙΟΟμΙ^血清中加入 300μ 无 RNase的水、 200 苯酚、 200 氯仿。 剧烈搅拌混合物， 并在室温下培养 15 min。 分层后， 水层混合 1.5倍的 异丙醇和 0.1倍的 3mol/L醋酸钠 (pH 5.3)。 将混合液储存于 -20 °C， 1 h; 在 4°C下 以 16，000g离心分离得到 RNA沉淀。 用 75%的乙醇清洗一次 RNA沉淀， 并置于室 温下 lO min干燥。 最后用 20 无 RNase的水溶解 RNA沉淀， 并储存于 -80°C下， 以备下一步分析用。 2. Solexa测序分析循环 miRNAs

30个碱基对（bp)以下的小 RNA分子经过 PAGE纯化， 使一对 Solexa接头 (adaptor) 与其 5'端和 3'端相结合后， 使用接头引物扩增 17个循环后， 从 PAGE 凝胶中分离出大约 90bp的片段 (小 RNA+接头)。经纯化的 DNA直接用于产生测序 簇， 按照制造商的说明使用 Illumina Genome Analyzer分析器分析序列。 将测序 器生成图像文件处理为数字数据。

随后的程序包括： 汇总生成数据、 评估测序质量和深度、 计算小 RNA长度 分布及过滤污染的读数。 屏蔽结合序列后， 参照基于 Smith- Waterman算法的 miRBase数据库 16.0， 对齐清洁的读数。 只有与参照 miRNA基因有相同序列和 长度的候选基因， 才能记为 miRNA匹配型。 最后， 每个样本总的测序频率可以 调试到 100万的同等规模。

3. 采用实时荧光定量 PCR检测方法定量测定循环 miRNAs

采用 Taqman mi NA PCR试剂盒 (Biosystems公司， 美国加利福尼亚州福斯 特城)进行循环 miRNAs的定量测定。 具体地， 用 AMV反转录酶 (TaKaRa, 中国 大连)禾卩茎环 RT引物 (Applied Biosystems) , 将 5μ 的总 RNA反转录成 cDNA。 用 TaqMan miRNA探针 (Applied Biosystems 公司)禾卩 Biosystems7300 Sequence Detection System( Applied Biosystems), 进行实时 PCR。 所有反应， 包括无样本 的对照组都重复三次。 所有反应完成后， 采用固定的阈值设置确定 CT值。

4. 基因稳定性分析

采用 geNorm和 NormFinder软件计算候选参照基因表达的稳定性� � Solexa读 数直接用于计算稳定性， 用 2— ^AACT 方法将 C _T 值转化成相对数量。

geNorm软件通过基因的表达稳定值 (M 值)将测定基因进行排序，从而为标 准化确定两个最稳定的参照基因或者多个稳定 基因的组合。 M 值代表候选参照 基因与同一试验小组中其他参照基因相比的平 均比对差异。 M 值最低的基因被 认为最稳定。通过逐步排除 M 值最高的基因， 来确定每个候选基因稳定性的排 序，再重新计算剩余基因的稳定性，直到发现 最稳定的两个基因。此外， geNorm 程序需通过计算两个序列的标准化因子 （NF^nNF _n+1 ) 的比对差异 （V _n /V _n+1 ) 准确标准化， 来确定参照基因的最优数量。 大的差异值 (> 0.15)意味着， 计算更 可靠的标准化因子需要再加入一个参照基因。 如果差异值 v _n /v _n+1 低于建议的阈 值 0.15， 则不需再加入参照基因。

NormFinder是一种基于模型的方法， 通过组间（如肿瘤与正常)和组内的表 达差异来确定候选参照基因的表达稳定性。 该方法的主要目的是确定组间和组 内的差异， 并将这两种结果结合进每个被考察基因的稳定 值。 根据此算法， 稳 定性最低的基因将会排在最前。 在本研究中， 利用 NormFinder分析了两组对应 不同类型的样本 (疾病与对照)。 实施例 1 Solexa测序并统计分析， 筛选最稳定的参照基因

本实施例首先生成和筛选 Solexa测序的数据集， 在各种生理和病理条件下 确定稳定的循环 miRNAs。

共对 23个样本进行了分析， 符合下列条件的 miRNAs被认为是稳定的：

(1) 在所有样本中都表达；

(2) 相对于测量平均值高表达； (3) 通过测量标准偏差确定其表达水平稳定。

根据这些标准， 筛选出 25个 miRNAs作为候选参照基因， 结果见图 2。

如图 2A中所示， 将 Solexa读数转换成对数值， 基因按平均表达水平和标准 偏差排序； 在筛选出的所有 miRNAs中， 25个 miRNAs在数据集中具有较高的丰 度 (log ₂ -转化读数>10)和较低的标准偏差 (<1)。 选取的 25个 miRNAs的平均表达 值如图 2B所示。

采用两种不同的算法 (geNorm和 NormFinder)进一步评估候选参照基因的稳 定性。通过两两比较， 采用 geNorm算法计算一个基因的平均表达稳定值 (M值)， 根据样本集表达谱的相似性排列推定的参照基 因。 25个候选参照基因的平均表 达稳定值如曲线图 2C所示， 这条曲线是通过逐步回归排除不稳定的候选参 照基 因形成的， 其中， let-7g是这组中表达最稳定的基因， 其次是 let-7i和 let-7d。

geNorm算法分析还可以评估可靠而准确的标准化 所需的参照基因的稳定 数。 该算法采用名为 V的度量， 确定参照基因的最佳数值， 其中两个序列标准 化因素 (NF _n /NF _n+1 )成对变化 (V _n /V _n+1 )。 Cut-off值为 0.15视为临界值， V值低于 0.15 时则不需再添加参照基因。

结果表明， let-7d、 let-7g和 let-7i的组合足以准确地规范数据集中的目标基 因， 产生 V值为 0.13， 低于 0.15的临界值（图 2D)。 三个 miRNAs的组合 (let-7d+let-7g+let-7i)在统计学方面优于二个 miRNAs(let-7d+let-7g、 let-7d+let-7i 或 let-7g+let-7i)或者单个基因 let-7d、 let-7g或 let-7i (图 2E)。

此外， NormFinder算法采用固定的统计框架， 不仅评估候选参照基因的整 体表达变化， 而且还分析了组间（例如， 肿瘤与正常)差异。 NormFinder软件单 独评估基因表达的稳定性， 评估结果与 geNorm算法确定的结果基本相同。 NormFinder算法选择 let-7i作为标准化的最佳参照基因，其次是 let-7d和 let-7g (图 2F)。 实施例 2 筛选其他候选参照基因

本实施例对上一实施例选定的三个候选参照基 因与一些常用的参照基因 做进一步的评估分析， 常用参照基因包括， 大分子 RNA (GAPDH和 p-actin)、 小 核 RNA/核仁小分子 RNA (sn NA/sno NA) (U6、 RNU44和 RNU48)及管家 mi NA (mi -16, miR-191、 miR-103和 miR-23a)。 基于先前关于其在组织或细 胞中稳定表达的报道， 本发明人选取 GAPDH和 p-actin。 选取 U6、 RNU44、 RNU48、 miR-16、 miR-191、 miR-103和 miR-23a，是因其在测定组织 /细胞 miRNAs 时， 常用于参照基因。 另外， 对 U6和 miR-16给予特别关注， 因其已被用作循环 miRNAs标准化的参照基因。 实施例 3 验证候选参照基因的稳定性

本实施例用实时荧光定量 PCR检测法， 进一步评估 21例癌症患者和 35例健 康对照组的样本中候选参照基因的表达模式。

首先， 对血清中 let-7d、 let-7g和 let-7i进行了检测， 并以" let-7d/let-7g/let-7i" 代表 let-7d、 let-7g和 let-7i的组合。 以 miR-20a、 mi -2 miR-24和 miR-25作为 对照。

结果表明（图 3)， 参照基因的 C _T 值分布范围较广， 介于 20.9到 33.0之间； GAPDH表达最高 (平均 C _T ± SE = 20.9 ± 0.27) ; 而 miR-25表达最低 (平均 C _T ± SE = 33.0 ± 0.23)； β-actin表达变异系数最大 (SE = 0.35); 而 let-7d/let-7g/let-7i表达 变异系数最小 (SE= 0.15)， 所有参照基因的平均数及 C _T 值的范围如图 3A所示。

然后， 采用 geNorm和 NormFinder算法， 按照候选参照基因表达的稳定性将 其进行排序， 基于 geNorm算法， 稳定值最低的 let-7d/let-7g/let-7i具有最稳定的 表达水平， 从而被选作最佳的参照基因（图 3B)， 相比之下， miRNA实时荧光定 量实验常用的参照基因 miR- 191、 mi -103 , U6、 miR-16、 RNU48和 RNU44 , 排在 let-7d/let-7g/let-7i之后， 表明它们不能视为可靠的数据标准化的参照基 因。 M1 -2 miR-24和 miR-25排名最低， 表明， 它们在血清中的表达模式确实在疾 病条件的反射中显著变化。

NormFinder算法证实了从 geNorm得出的结果， 表明 let-7d/let-7g/let-7i是最 稳定的参照基因， 而 miR-24的稳定性最低（图 3C )。

最后， 在包含 1278例健康对照、 254例癌症患者、 201例炎症性疾病患者和 320例 2型糖尿病患者的大样本集中，对选定的最佳� �照基因，进行进一步验证。

结果如图 3D所示， 所选定的参照基因在疾病条件独立、 个体检测中， 表达 水平保持恒定。 实施例 4 血清中循环 let-7d/let-7g/let-7i绝对浓度的特征

本实施例用 qRT-PCR检测方法测量 let-7d/let-7g/let-7i的线性动态范围和敏 感度。

将合成的单链 let-7d/let-7g/let-7i连续稀释十个以上数量级， 并用 qRT-PCR 检测方法测定， 将所得到的 C _T 值对应输入的 let-7d/let-7g/let-7i的量， 绘制标准 曲线。

let-7d/let-7g/let-7i量减少导致平均 C _T 值相应增加， Pearson相关系数

R=0.992(图 4A)。 研究结果表明， qRT-PCR检测方法测量 let-7d/let-7g/let-7i至少 有十个数量级的变化范围，在 PCR反应中 let-7d/let-7g/let-7i能够被检测到的量可 少至 0.01 amol(相当于 6000个拷贝）。 此外， 采用 qRT-PCR检测方法研究了从多 种量的血清中提取的 RNA样本中 let-7d/let-7g/let-7i表达水平的特征。

结合所得到的 C _T 值对用于 RNA提取的血清量作图， qRT-PCR检测显示血 清量与 C _T 值之间存在良好的线性度 （R = 0.9865)(图 4B)。 多个样本的结果表明， 在少至 10 L的血清中可有效地检测并可靠地比较 let-7d/let-7g/let-7i， 通过参考 标准曲线， 计算出血清中 let-7d/let-7g/let-7i 的绝对浓度为 271.35 ± 21.48 fmoH 实施例 5 血清中 let-7d/let-7g/let-7i的稳定性

作为适用于临床试验的参照基因，血清中 let-7d/let-7g/let-7i必须在合适的时 间内保持稳定， 耐受恶劣条件， 从而适用于临床样本的常规处理。 因此， 在本 实施例中， 利用延期储存或在恶劣条件下处理后的血清， 评估循环 let-7d/let-7g/let-7i的稳定性， 恶劣条件包括核糖核酸酶 (RNase)降解， 极端 pH值 和循环冻融等。

首先， 考察血清中 let-7d/let-7g/let-7i存储在不同温度 (室温、 4°C、 -20°C或

-80°C)不同时间（1、 2、 3、 7、 14或 30天)的稳定性。 结果表明， 储存时间 (长期 与短期)或储存条件 (零度以下与高温)不同时， C _T 值无显著差异 (图 4C)。 与此相 比， 大分子量的 RNA (β-actin, GAPDH和 28s rRNA)禾卩 snRNA/snoRNA (U6、 RNU44、 RNU48、 snoRNA24、 snoRNA38b、 snoRNA43、 snoRNA66和 snoRNA74a) 在室温下存放 24小时内很快降解（图 4D)。 因此， 血清中固有的 RNase导致大分 子量的 RNA和 snRNA/snoRNA快速降解，但是对循环 let-7d/let-7g/let-7i的影响较 少。

其次， 向血清样本加入 RNase后， 循环 let-7d/let-7g/let-7i对 RNase的裂解表 现相当大的耐受力， 但是合成的 let-7d/let-7g/let-7i则快速被降解（图 4E)。 RNase 处理后血清中大分子量的 RNA和 snRNA/snoRNA的浓度也快速降低（图 4F)。

在次， 还考察了酸性条件 (pH=2.0)或碱性条件 (pH12.0)下血清 miRNAs的稳 定性， 检测冻融条件对血清 let-7d/let-7g/let-7i表达水平的影响。 结果表明， 在酸 性或碱性条件培养 4小时， 血清中 let-7d/let-7g/let-7i的表达水平不会大幅变化。 此外， 反复冻融血清样本 8个循环， 对血清中 let-7d/let-7g/let-7i表达水平影响不 大（图 41)。

综上所述， 延期储藏、 RNase处理、 酸性 /碱性条件和冻融对循环 let-7d/let-7g/let-7i无显著影响， 稳定性很高。 实施例 6 不同标准化方法对 miRNAs定量的显著影响 本实施例考察 miRNAs标准化采用稳定或不稳定参照基因的检测 结果。 已有研究明确证明循环 miR-25、 mi -214, miR-223和 miR-483-5p为癌症患 者血清中表达上调的致癌基因， 本实施例选择这四个基因作为目标基因。

采用实时荧光定量 PCR检测和 2_ ^AACT 方法， 测定癌症患者和健康对照组血 清中上述四种 miRNAs相对表达水平， 分别相对于血清体积、 U6、 miR- 191或者 let-7d、 let-7g和 let-7i的组合标准化， 只认为其平均倍数变化>2和 !^值<0.05的 miRNAs明显上调。

结果表明，标准化方法确实显著影响变化倍数 (图 5)，具体地，相对于 let-7d、 let-7g和 let-7i的组合（最稳定的参照基因）标准化， 癌症患者血清中 miR-25、 mi -214, miR-223和 miR-483-5p相对于正常对照显著上调。 相对于血清体积标 准化后， 变化倍数趋势与相对于 let-7d/let-7g/let-7i标准化后一致， 但仅 miR-223 在癌症患者血清中表达显著增加。 然而， 相对于 U6(最不稳定的参照基因)标准 化后， 癌症患者与对照组的血清中 miR-25、 mi -214, miR-223和 miR-483-5p表 达无显著差异。 当使用稳定参照 miRNAs标准化后显示， 与非恶性肿瘤对照样 本相比， 癌症样本中 miR-25、 mi -214, miR-223和 miR-483-5p表达上调， 相对 于 miR- 191标准化显示上述 miRNAs的表达无明显变化。

因此， 使用适合的标准化的基因会提高结果的灵敏度 和可重复性， 而选择 非最佳的参照基因可能导致结果不准确。 实施例 7 试剂盒

本实施例提供了一种试剂盒， 该试剂盒包含测定内参基因的试剂， 所述内 参基因包括： micro NA let-7d, microRNA let-7g、 和 microRNA let-7i， 其中， 所 述的试剂选自下组： （a) 特异性扩增所述内参基因的引物或引物对； （b) 特异性 与所述内参基因的核酸分子进行杂交的探针。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用 作为参考， 就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅 读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修 改， 这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。