| REIVINDICACIONES 1. Cultivo iniciador para la fabricación de queso formado por tres cepas de bacterias lácticas autóctonas del queso artesanal de Tenerife: Lactococcus lactis ssp. lactis TF 53 (CECT 7513); Lactobacillus plantarum TF 191 (CECT 7514); y Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroid.es TF 756 (CECT 7515) 2. Cultivo iniciador para la fabricación de queso formado por tres cepas de bacterias lácticas autóctonas del queso artesanal de Tenerife: Lactococcus lactis ssp. lactis TF 53 (CECT 7513); Lactobacillus plantarum TF 191 (CECT 7514); y Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides TF 756 (CECT 7515) añadidas a la leche a las concentraciones iniciales siguientes: 1 a 7 x 106 ufc/ml Lactococcus lactis ssp. lactis TF 53 (CECT 7513) ; 1 a 8 x 104 ufc/ml Lactobacillus plantarum TF 191 (CECT 7514); 1 a 8 x 104 ufc/ml Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides TF 756 (CECT 7515). 3. Procedimiento para la obtención del cultivo iniciador autóctono para su aplicación industrial caracterizado por dos etapas: la obtención del cultivo en fermentador y la obtención de liofilizados de las bacterias correspondientes donde: - Las condiciones de cultivo en fermentador de cada una de las tres cepas de bacterias lácticas para su producción a gran escala son las siguientes: Inoculo: cultivo en MRS 24h a 300C y se adiciona del 1-5% concentración final en el fermentador. Condiciones de fermentación: medio de cultivo: MRS; pH: 5,5-6,0; temperatura: 25-32°C; agitación: 100 r.p.m.; aireación: no; tiempo de incubación: 18-22h. - La obtención del liofilizado se caracteriza por recoger por centrifugación las bacterias una vez cultivadas, se lavan, y se resuspenden. Las suspensiones celulares así obtenidas se mantienen a temperatura ambiente, se pasan a balones de liofilización y se congelan al menos durante dos horas antes de proceder a su liofilización. 4. Procedimiento para la aplicación industrial del cultivo iniciador autóctono caracterizado según reivindicación 2 donde: - El Lactococcus lactis ssp. lactis TF53 (CECT 7513) : Se adiciona el liofilizado a RSM o leche pasteurizada a concentración inicial del orden 1 x 106 ufc/ml. Tras un intervalo en el entorno de las 24 horas de incubación a unos 3O0C se toma el volumen necesario de este precultivo para lograr en la leche pasteurizada una concentración inicial según reivindicación 2. - El Lactobacillus plantarum TF 191(CECT 7514): Se reactiva el liofilizado en RSM o leche pasteurizada preferentemente 30 minutos a 300C y se adiciona a la leche pasteurizada utilizada para fabricar los quesos para lograr una concentración inicial según reivindicación 2. - El Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteriodes TF 756 (CECT 7515): Se reactiva el liofilizado en RSM o leche pasteurizada preferentemente 30 minutos a 3O0C y se adiciona a la leche pasteurizada para lograr una concentración inicial según reivindicación 2. 5. Queso elaborado a partir de un cultivo iniciador formado por tres cepas de bacterias lácticas autóctonas del queso artesanal de Tenerife caracterizado según reivindicación 1. 6. Queso elaborado a partir de un cultivo iniciador formado por tres cepas de bacterias lácticas autóctonas del queso artesanal de Tenerife caracterizado según reivindicación 2. |
Sector de Ia técnica
Sector lácteo. Cultivo iniciador para la fabricación de quesos
Introducción
Los cultivos iniciadores son preparaciones de microorganismos vivos que se aplican a los alimentos para hacer uso de su metabolismo. En la industria quesera, la adición de cultivos iniciadores a la leche pasteurizada permite fabricar quesos seguros desde el punto de vista sanitario, correctamente acidificados y con textura, aroma y sabor determinados por los microorganismos que los conforman. En general, los microorganismos que forman parte de los cultivos iniciadores deben de cumplir unos requerimientos de aptitud tecnológica en lo que se refiere a su seguridad, efectividad y aspectos económicos.
El queso es un alimento fermentado cuya fabricación está muy extendida, dando lugar a más de 4.000 variedades diferentes en todo el mundo con características en aroma, sabor y textura propias. Estas variedades vienen determinadas por el tipo de leche y cuajo utilizados, por la preparación de la cuajada y por la presencia de microorganismos (principalmente bacterias lácticas) responsables del desarrollo, durante la maduración, de las características que las definen.
Los quesos pueden elaborarse a nivel artesanal, normalmente en granjas, a partir de la leche recién ordeñada y donde ocurre una fermentación espontánea llevada a cabo por las bacterias lácticas procedentes de la contaminación de la leche y/o utensilios utilizados en la fabricación del queso. En la industria quesera, donde se utiliza una fermentación controlada, la leche procedente de diversos ganaderos se pasteuriza, destruyendo la mayoría de los microorganismos, y haciendo necesaria la adición de cultivos iniciadores para que lleven a cabo la maduración. Estos cultivos iniciadores comerciales están formados principalmente por cepas de bacterias lácticas vivas con aptitud tecnológica demostrada que se compran a diferentes casas comerciales y que normalmente se suministran liofílizados y listos para su uso.
Al estar elaborado con leche cruda los quesos artesanales presentan dos inconvenientes principales: el primero es el riesgo higiénico-sanitario que supone su consumo, ya que la leche cruda puede contener microorganismos patógenos y alterantes que provocan pérdidas económicas y, lo que es más grave, enfermedades en los consumidores. Además, el proceso de fabricación no está estandarizado y durante la maduración ocurre una fermentación espontánea por lo que el producto no siempre se obtiene de igual forma, es decir, no se tiene un control de la calidad. En los quesos industriales el proceso de fabricación está estandarizado y la fermentación está controlada y es, por tanto, reproducible. Además, al pasteurizar la leche se destruyen los microorganismos patógenos y alterantes. El principal inconveniente de los quesos industriales pasteurizados es la sustitución de la microbiota natural de la leche por bacterias comerciales, lo que hace que pierdan el carácter peculiar de aroma, textura, color, etc., distintivo típico de los quesos artesanales. Así podría darse el caso de partiendo del mismo tipo de leche (por ejemplo de cabra), el mismo cuajo (en las industrias éste también está estandarizado y se compra a casas comerciales) y el mismo cultivo iniciador comercial; podemos acabar produciendo el mismo tipo de queso en lugares muy diferentes. Una alternativa que evitaría esta pérdida del carácter distintivo de los quesos industriales es el uso de cultivos iniciadores autóctonos, formados por cepas de bacterias lácticas aisladas de quesos artesanales con aptitud tecnológica para fabricar quesos. Los quesos así obtenidos estarían estandarizados y tendrían condiciones higiénico-sanitarias adecuadas, al tiempo que conservarían la biodiversidad propia de los quesos artesanales.
En este sentido se enmarca nuestra invención, en el desarrollo de un cultivo iniciador formado por cepas seleccionadas de bacterias lácticas autóctonas del queso artesanal de Tenerife para poder ser utilizado en las industrias queseras como sustituto de los cultivos iniciadores comerciales actualmente empleados. Estado de la técnica
Son conocidos diversos trabajos en los que se describe la introducción de un cultivo iniciador para la fabricación de quesos. Por ejemplo, en el documento RU2192137 se emplea un cultivo iniciador formado por: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris y Lactobacillus plantarían.
Así mismo, en el documento ES2072827 se describe la utilización en la industria quesera de una cepa de Lactococcus lactis ssp. lactis aislada de queso majorero. También en el documento ES2157155 se describe una cepa de Lactobacillus casei aislado del queso manchego y su uso.
Sin embargo, no se ha encontrado una descripción de un cultivo iniciador constituido por tres cepas de bacterias lácticas aisladas del queso artesanal de Tenerife
(un lactococo, un lactobacilo y un leuconostoc). Estas cepas cumplen los requisitos de seguridad, efectividad tecnológica y facilidad de manejo, obtención y aplicación deseables en un cultivo iniciador.
Descripción de la invención
Se tiene un cultivo iniciador para la fabricación de queso formado por tres cepas de bacterias lácticas autóctonas del queso artesanal de Tenerife: Lactococcus lactis ssp. lactis TF 53 (CECT 7513); Lactobacillus plantarum TF 191 (CECT 7514); y Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides TF 756 (CECT 7515).
Se trata de tres microorganismos seleccionados a partir de cepas de bacterias lácticas aisladas de quesos artesanales de Tenerife. La selección de las citadas cepas se realizó en base a las siguientes características tecnológicas:
-Seguridad: tener el estatus de GRAS (Generally Recognized as Safe for Human Consumption) y no presentar actividad tóxica por producción de aminas biógenas (metabolitos tóxicos obtenidas por descarboxilación microbiana de aminoácidos) -Efectividad Tecnológica: a) capacidad acidificante por degradación de la lactosa que contribuye al sabor, textura y tiene efecto antimicrobiano. b) capacidad generadora de aroma y textura por degradación de las proteínas
(proteolisis) y de las grasas (lipolisis); y por producción de diacetilo. c) Capacidad de supervivencia y actividad en quesos.
-Aspectos Económicos: facilidad de manejo, conservación y aplicación.
Con la incorporación de estas tres cepas de bacterias lácticas se podrán obtener de forma estandarizada quesos industriales con garantías higiénico-sanitarias, al estar elaborados con leche pasteurizada, al tiempo que mantienen las características sensoriales propias de quesos artesanales, al estar madurados por bacterias lácticas autóctonas del queso de Tenerife. Los quesos así obtenidos presentan una textura ligeramente más cremosa que los quesos artesanales de Tenerife y un sabor ligeramente ácido-amargo agradable a la cata.
La elaboración de queso se consigue con la adición de estos microorganismos a la leche pasteurizada en forma de cultivo iniciador a las concentraciones iniciales siguientes: 1 a 7 x 10 6 ufc/ml Lactococcus lactis ssp. lactis TF 53 (CECT 7513) ; 1 a 8 x 10 4 ufc/ml Lactohacillus plantarum TF 191 (CECT 7514); 1 a 8 x 10 4 ufc/ml Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides TF 756 (CECT 7515). Con estas proporciones se consiguen quesos seguros desde el punto de vista sanitario, correctamente acidificados y con textura, olor y sabor característicos. Los criterios tenidos en cuenta para la selección de las cepas que forman el cultivo iniciador autóctono se detallan a continuación:
-Lactococcus lactis ssp. lactis TF53 (CECT 7513): Categoría GRAS. No productora de tirosina-, histidina-, ornitina-, Usina- y triptófano-descarboxilasa. Altamente acidificante y proteolítica. Porcentaje de supervivencia del 86,6% cuando crece en presencia de un 3% de cloruro sódico (concentración máxima de sal habitual en quesos).
-Lactobacillus plantarum TF 191 (CECT 7514): Categoría GRAS. No productora de tirosina-, histidina-, ornitina-, Usina- y triptófano-descarboxilasa. Altamente peptidolítica y productora de diacetilo a partir de la leche y del citrato. Porcentaje de supervivencia del 86,2% cuando crece en presencia de un 3% de cloruro sódico.
-Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteriodes TF 756 (CECT 7515): Categoría GRAS. No productora de tirosina-, histidina-, ornitina-, Usina- y triptófano- descarboxilasa. Moderadamente peptidolítica y altamente estearásica. Con un porcentaje de supervivencia del 78,6% cuando crece en presencia de un 3% de cloruro sódico.
El procedimiento de obtención del cultivo iniciador autóctono a gran escala consta de dos etapas: primera, la obtención del cultivo en fermentador (obtención del biomasa viable) y segunda, la obtención de liofilizados de las bacterias correspondientes.
Dichas etapas pueden describirse de la siguiente forma:
1. Obtención del cultivo en fermentador. Las condiciones de cultivo en fermentador de cada una de las tres cepas de bacterias lácticas para su producción a gran escala se muestran en la Tabla 1
Parámetros Cepa de bacteria láctica
Lactococcus lactis Lactobacillus plantarum Leuconostoc mesenteroides TF 191 ssp. mesenteroides TF756 ssp.lactis TF53
(CECT 7514) (CECT 7515) (CECT 7513)
Inoculo
Obtención Cultivo en MRS 24h 30 0 C Cultivo en MRS 24h 30 0 C Cultivo en MRS 24h 30 0 C Adición 1-5% 1-5% 1-5%
Medio de MRS MRS MRS cultivo
PH 5,5-6,0 5,5-6,0 5,5-6,0
Temperatura 25-32 0 C 25-32°C 25-32°C
Agitación 100 100 100 (r.p.m)
Aireación No No No
Tiempo de 18-22 18-22 18-22 incubación
(h)
Tabla 1
2. Obtención de liofilizados. Una vez cultivadas, las bacterias se recogen por centrifugación (10.000 r.p.m, 5 min a 4°C), se lavan tres veces con tampón fosfato 20 mM pH 6,5 y se resuspenden en leche desnatada reconstituida estéril al 10% (RSM) conteniendo glutamato rnonosódico (12,5 g/1) como crioprotector. Las suspensiones celulares así obtenidas se mantienen una hora a temperatura ambiente, se pasan a balones de liofílización y se congelan a -80 0 C al menos durante dos horas antes de proceder a su liofílización. La concentración inicial de liofílizado está entre 10 10 -10 n ufc/g y se mantiene activo durante meses a 4 0 C y en oscuridad.
Por otro lado, una vez obtenido el liofilizado, su forma de aplicación en la industria quesera depende de cada cepa. Se detalla a continuación la aplicación en la industria:
-Lactococcus lactis ssp. lactis TF53 (CECT 7513) : se adiciona el liofílizado a
RSM o leche pasteurizada a concentración inicial del orden 1 x 10 6 ufc/ml. Tras 24 horas de incubación a 30 0 C se obtiene una concentración del orden de 1 x 10 9 ufc/ml. A partir de este precultivo se toma el volumen necesario para lograr una concentración inicial de 1 a 7 x 10 6 ufc/ml en la leche pasteurizada con la que se fabrican los quesos.
-Lactobacillus plantarum TF 191 (CECT 7514): Se reactiva el liofilizado en RSM o leche pasteurizada 30 minutos a 30 0 C y se adiciona a la leche pasteurizada utilizada para fabricar los quesos a una concentración inicial de 1 a 8 x 10 4 ufc/ml.
-Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides TF 756 (CECT 7515). Se reactiva el liofílizado en RSM o leche pasteurizada 30 minutos a 3O 0 C y se adiciona a la leche pasteurizada utilizada para fabricar los quesos a una concentración inicial de 1 a 8 x lO 4 ufc/ml.
Modos de realización de la invención
Aplicando los procedimientos descritos anteriormente se obtienen unos 12 gr de liofílizado para cada cepas de bacteria láctica del cultivo iniciador autóctono a partir de su cultivo en 1.100 mi de medio MRS en fermentador. La concentración de bacterias viables (expresadas en ufc/g) presentes en los liofílizados recién obtenidos y justo antes de la fabricación de quesos (se fabricaron el 2/12/08) se recogen en la Tabla 2.
Cepa de bacteria láctica Fecha de Concentración Concentración
Jiofílización del liofϊlizado del liofilizado a recién obtenido 29/11/08
(ufc/g) (ufc/g)
Lactococcus lactis ssp. lactis 10/10/08 6,2 x lO 10 4 x lO 10
TF53 (CECT 7513)
Lactobadllus plantarum 24/5/08 1,5 x lO 11 5,4 xlO 10
TF191 (CECT 7514)
Leuconostoc mesenteroides 2/6/08 1,6 x 10" 5,0 xl0 10 ssp. mesenteroides TF756
(CECT 7515)
Tabla 2
Con estas bacterias liofilizadas se elaboró una tanda de fabricación de quesos que incluyó estudio de los lotes (Lote I y Lote II). Para la fabricación de cada lote se utilizaron 20 litros de leche de cabra pasteurizada y se obtuvieron 4 quesos de aproximadamente 1 kg cada uno. En la Tabla 3 se muestra la composición y el modo de adición de los cultivos iniciadores utilizados en esta tanda de fabricación. En ambos casos se utilizaron las mismas tres bacterias pero modificando su concentración inicial en leche de modo que en el Lote II se redujo la concentración del lactococo TF53 (CECT 7513), se aumentó ligeramente la del lactobacilo TF191 (CECT 7514) y se aumentó la del leuconostoc TF756 (CECT 7515) con respecto al Lote I. Con estos cambios se pretendía obtener quesos ligeramente menos ácidos y más aromáticos en el Lote II con respecto al I. En cuanto al modo de aplicación, el lactococo TF53 (CECT 7513) se adicionó a partir de un cultivo madre, mientras que el lactobacilo TF191 (CECT 7514) y el leuconostoc TF756 (CECT 7515) se adicionaron directamente a partir del liofilizado. Lote Composición Concentración Adición inicial en leche
(ufc/ml)
I Lc. lactis ssp.lactis TF53 (CECT 7,OxIO 6 140 mi de cultivo
7513) madre
Lb. plantarum TF191 (CECT 7514) 7,5 xlO 4 0,027 g del liofilizado
Ln. mesenteroides ssp. 3,OxIO 4 0,012 g del mesenteroides TF756 (CECT 7515) liofilizado
II Lc. lactis ssp.lactis TF53 (CECT 1,OxIO 6 20 mi de cultivo
7513) madre
Lb. plantarum TF191 (CECT 7514) 8,OxIO 4 0,030 g del liofilizado
Ln. mesenteroides 8,OxIO 4 0,032 g del ssp. mesenteroides TF756 (CECT liofilizado
7515)
Tabla 3
El cultivo madre se obtuvo a partir del liofilizado del TF53 (CECT 7513) por inoculación en RSM a concentración teórica inicial de 1 x 10 6 ufc/ml. Tras incubación 24h a 3O 0 C se añadió a la leche pasteurizada el volumen señalado en la Tabla 3. La concentración teórica del cultivo madre estaba en torno a 1x10 9 ufc/ml y la real, determinada mediante recuento, fue de 1,3 xlO 9 ufc/ml. Para el lactobacilo TFl 91 (CECT 7514) y leuconostoc TF756 (CECT 7515) se pesó la cantidad de liofilizado necesario para conseguir las concentraciones iniciales en leche pasteurizada que se recogen en la Tabla 3; se reactivaron en 5 mi de RSM durante 30 min a 30 0 C y finalmente se añadieron a la leche.
Una vez fabricados los quesos se maduraron en cámara de maduración a 1O 0 C y 80% de humedad relativa. A distintos tiempos (2, 20, 40 y 60 días) se tomó un queso, se transportó al laboratorio y se realizaron análisis microbiológicos, bromatológicos y sensoriales.
El análisis sensorial lo realizó un panel de cata formado por un grupo aleatorio de individuos, todos habituados a catar quesos canarios. Las características que se puntuaron fueron, la apariencia externa, textura, aroma, sabor y aceptación general. Para cada parámetro se utilizó una escala de puntuación del 1 al 7 donde 1 fue: muy pobre y 7: excelente.
En la Tabla 4 se muestra la evaluación sensorial de los lotes I y II a los 20, 40 y 60 días de maduración. Los valores de desviación estándar encontrados reflejan las considerables variaciones en gustos y preferencias del panel de catadores.
Tabla 4
En general los dos lotes fueron bien aceptados por los catadores con puntuaciones totales superiores a 24 puntos en todos los tiempos de maduración. Ambos lotes mostraron una cremosidad mayor que la habitual del queso de Tenerife, que fue evaluada positivamente por el panel de cata. El lote mejor valorado de esta tanda de fabricación fue el I logrando las puntuaciones más favorables en todos los parámetros evaluados durante todo el periodo de maduración, a excepción de la apariencia externa a los 20 días. De acuerdo con la opinión de los catadores se consideró que el tiempo óptimo de maduración de los quesos era de 60 días, momento en que el queso I destacó por su cremosidad, sabor menos ácido y más picante y salado que el II.
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