La présente invention a pour objet : - une composition injectable stérile sous forme d'hydrogel contenant de l'acide hyaluronique réticulé, ou l'un de ses sels, et de l'articaïne, ou l'un de ses sels,

un procédé de préparation de ladite composition injectable stérile

l'utilisation de ladite composition injectable stérile dans les domaines de l'esthétique et de la médecine L'acide hyaluronique est un polysaccharide formé par la répétition d'une unité disaccharidique composée d'acide D-glucuronique et de N-acétylglucosamine. Sa structure est linéaire et sans spécificité d'espèce. L'acide hyaluronique est largement distribué dans les organismes vivants humains et animaux, dans lesquels il joue de nombreuses fonctions biologiques comme par exemple le contrôle du taux d'hydratation ou le maintien de la viscoélasticité de fluides ou de tissus. On le retrouve notamment en concentration élevée dans le liquide synovial, le corps ' vitreux de l'oeil et dans le derme. Un être humain de 70 kg possède environ 15 g d'acide hyaluronique dont la moitié est contenue dans la peau et cette quantité diminue avec le vieillissement.

Les hydrogels d'acide hyaluronique sont connus et utilisés dans de larges domaines de l'esthétique et de la médecine depuis de nombreuses années. Ces gels sont, notamment, couramment injectés : dans les yeux, au cours de chirurgies ophtalmologiques, afin de maintenir l'espace intra- i oculaire et protéger les tissus de l'œil

dans les articulations, en cas d'arthrose, pour supplémenter le liquide synovial déficient et restaurer temporairement les propriétés chondroprotectrices dudit liquide biologique dans ou sous la peau, afin de combler des rides ou d'augmenter le volume de certaines, zones du visage ou du corps

L'acide hyaluronique possède une demi-vie faible dans les organismes vivants (moins de 1 semaine). Dans de nombreuses applications en esthétique et en médecine, il est injecté chez les patients sous sa forme native, c'est-à-dire qu'il n'est pas réticulé et/ou modifié chimiquement.

Pour d'autres applications, il est administré chez les patients sous une forme stabilisée par réticulation. La réticulation permet de considérablement augmenter la durée de vie (encore appelée rémanence) de l'acide hyaluronique in vivo, mais elle permet également de modifier ses propriétés mécaniques et rhéologiques en le rendant notamment plus élastique, ce qui permet alors d'accroître sa capacité à créer du volume une fois injecté dans les tissus souhaités. Ainsi, _t grâce à cette modification par réticulation, un hydrogel à base d'acide hyaluronique réticulé a par exemple la capacité de combler des rides sur une période de plusieurs mois. Les injections d'acide hyaluronique réticulé s'accompagnent généralement d'une sensation de douleur chez le patient traité au cours de l'administration du produit par le praticien. En effet, le fait d'injecter un hydrogel avec une viscosité importante dans les tissus (derme, tissus sous- cutanés, ...) ou dans les fluides corporels (liquide synovial, humeur aqueuse, ...) induit la plupart du temps une douleur d'un niveau allant de faible à moyen au cours de la procédure d'injection et dans les minutes qui suivent cette procédure. Afin de limiter cette douleur, et en particulier dans ' le cadre des actes à visée esthétique, la plupart des produits injectables à base d'acide hyaluronique réticulé (JUVEDERM ^® , RESTYLANE ^® , BELOTE RO ^® , ...) pour comblement des rides possèdent aujourd'hui de la lidocaïne (un anesthésiant local), et plus précisément du chlorhydrate de lidocaïne à la concentration de 0.3% (3 mg/ml). Comme démontré dans différentes études · cliniques au cours des 10 dernières années, l'adjonction de lidocaïne dans les gels à base d'acide hyaluronique réticulé a permis de considérablement améliorer le confort des patients traités (réduction de la douleur) par rapport à des produits ne contenant pas de lidocaïne, ce qui en fait incontestablement aujourd'hui la solution référence sur le marché des produits de comblement · en esthétique. Compte tenu du rôle clé que joue l'acide hyaluronique réticulé dans les domaines de l'esthétique et de la médecine (plusieurs millions d'injections effectuées chaque année à travers le monde), l'homme de l'art cherche constamment à améliorer la sécurité et la performance des produits ' injectables à base d'acide hyaluronique réticulé.

La présente invention vise précisément à proposer un hydrogel injectable stérile à base d'acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, et d'un anesthésiant local, l'articaïne, afin d'améliorer la sécurité et la performance par rapport aux produits injectables actuels à base d'acide - hyaluronique réticulé contenant de la lidocaïne, pour des utilisations dans les domaines de l'esthétique et de la médecine.

Ainsi, dans ce contexte, la présente invention divulgue une solution permettant d'améliorer significativement le niveau de sécurité des produits injectables à base d'acide hyaluronique réticulé en proposant une composition faisant intervenir, dans les conditions spécifiques de l'invention, de l'articaïne, au lieu de la lidocaïne, un anesthésiant local possédant un profil toxicologique significativement plus intéressant que celui de la lidocaïne (anesthésiant plus ] rapidement métabolisé par l'organisme en comparaison de la lidocaïne, pas de métabolite à forte toxicité comme dans le cas de la lidocaïne, ...), mais permettant également d'offrir une composition avec une meilleure performance clinique (temps nécessaire pour bénéficier du début de l'effet anesthésiant plus court, puissance et temps d'action de l'anesthésiant supérieurs à celui < de la lidocaïne, ...). Ces avantages majeurs, ainsi que bien d'autres mis en avant et démontrés dans cette description, font de cette nouvelle composition injectable stérile une solution de choix pour permettre des injections d'acide hyaluronique réticulé avec anesthésiant possédant une meilleure performance mais également un meilleur niveau de sécurité pour les millions de * patients traités chaque année avec ce type de produits.

Ainsi, la présente invention concerne, selon un premier de ses aspects, une nouvelle composition aqueuse injectable stérile sous forme d'hydrogel, contenant au moins de l'acide hyaluronique réticulé, ou l'un de ses sels, et un anesthésiant local, l'articaïne, ou l'un de ses sels. Selon l'invention, la composition contient de l'acide hyaluronique ou l'un de ses sels, et en particulier ses sels acceptables d'un point de vue physiologique comme les sels de sodium, calcium, zinc, potassium, avantageusement le sel de sodium. L'acide hyaluronique peut être d'origine animale ou obtenu par fermentation bactérienne. Il peut avoir une masse moléculaire de quelques daltons à plusieurs millions de daltons, avantageusement d'environ 0.01 à 5 millions de daltons, encore avantageusement d'environ 0.1 à 3.5 millions de daltons.

Selon un aspect de l'invention, la composition peut être à base d'un dérivé de l'acide hyaluronique, c'est-à-dire à base d'une molécule obtenue en modifiant par voie chimique, ou par toute autre voie, la molécule d'acide hyaluronique.

Selon l'invention, la concentration totale en acide hyaluronique, ou l'un de ses sels, est comprise entre 0.001 et 70 mg/ml, entre 0.01 et 50 mg/ml, entre 1 et 40 mg/ml, entre 5 et 35 mg/ml, entre 8 et 33 mg/ml, entre 9 et 30 mg/ml, entre 10 et 29 mg/ml, entre 11 et 28 mg/ml, entre 12 et 27 mg/ml, entre 13 et 26.5 mg/ml, avantageusement entre 14 et 26 mg/ml. Selon l'invention, l'acide hyaluronique contenu dans la composition est réticulé, totalement ou partiellement, préférentiellement selon les techniques de réticulation décrites dans l'art antérieur. Le ou les agents réticulants qui interviennent dans la réticulation peuvent être identiques ou différents. Ce sont généralement des réticulants bi- ou poly-fonctionnels de différents types et ils peuvent par exemple être sélectionnés parmi la divinylsulfone, les époxy bi- ou poly-fonctionnels, les carbodiimides et le formaldéhyde. On choisit de préférence les agents de la famille des époxy bi- ou poly-fonctionnels et notamment le 1,4-butanedioldiglycidyléther (BDDE), le diépoxy-octane ou le l,2-bis-(2,3-époxypropyl)-2,3-éthylène. On préfère tout ' particulièrement utiliser le BDDE. Les températures de réticulation sont généralement comprises entre environ 15°C et 60°C et les durées de réticulation sont généralement de plusieurs heures, avantageusement de plus de lh jusqu'à environ 24h.

Il est important de noter que le réticulant utilisé pour le pontage des chaînes d'acide hyaluronique est une molécule possédant en général un niveau de toxicité non négligeable. Le réticulant résiduel après réticulation (= celui n'ayant pas réagit avec le HA) doit être éliminé au maximum au cours de la purification de l'hydrogel (généralement par dialyse dans une solution physiologique) de manière à avoir une composition injectable possédant le meilleur niveau de sécurité possible ⁱ pour le patient. Dans le cas du BDDE cité précédemment, il a été montré dans le cadre des études réalisées par les inventeurs que la teneur en BDDE résiduelle dans le produit fini, après stérilisation, doit être inférieure ou égale à 10 ppm, préférentiellement inférieure ou égale à 5 ppm, encore préférentiellement inférieure ou égale à 2 ppm, pour limiter au maximum la ^; dégradation de l'articaïne au cours du process de préparation de la composition injectable stérile. Ainsi, dans le cas d'un produit injectable stérile à base d'acide hyaluronique réticulé au BDDE selon l'invention, la concentration résiduelle en BDDE doit être inférieure ou égale à 10 ppm, préférentiellement inférieure ou égale à 5 ppm, encore préférentiellement inférieure ou égale à 2 ' ppm, pour obtenir une composition avec un niveau de sécurité maximal.

Selon l'invention, l'acide hyaluronique est totalement ou partiellement réticulé. Ainsi, la composition selon l'invention comprend avantageusement plus de 80% en masse d'acide hyaluronique sous la forme réticulée et moins de 20% en masse d'acide hyaluronique sous la ¹ forme non réticulée. De manière préférentielle, la fraction massique d'acide hyaluronique sous la forme non réticulée est inférieure ou égale à 15% de la masse totale d'acide hyaluronique dans le produit fini.

Selon l'invention, la composition a pour ingrédient majoritaire l'eau, d'où le qualificatif de composition aqueuse ou d'hydrogel pour la nouvelle composition selon l'invention. La masse en eau dans la composition selon l'invention est supérieure à 51% de la masse totale, avantageusement supérieure à 60% de la masse totale, avantageusement supérieure à 70% de la masse totale, avantageusement supérieure à 75% de la masse totale, avantageusement supérieure à 80% de la masse totale, avantageusement supérieure à 85% de la masse totale. Une solution tampon est avantageusement utilisée notamment pour mieux contrôler le pH et l'osmolarité de la formulation tout au long de sa durée de péremption. On peut par exemple citer l'utilisation d'un tampon à base de chlorure de sodium et d'ions phosphates.

Selon l'invention, la composition injectable stérile possède avantageusement une osmolarité physiologique, c'est-à-dire une osmolarité comprise entre 200 et 400 mOsm/kg. II est important de préciser que les études des inventeurs ont mis en évidence que le pH de l'hydrogel selon l'invention est un élément très important de la composition. En effet, il a été montré que, pour un pH inférieur à 6.0, une dégradation importante des propriétés biophysiques ' de l'hydrogel (cas de l'élasticité du gel avec le module élastique G') est observée lors de l'étape de stérilisation du produit. D'autre part, il a également été montré que, pour un pH supérieur à 7.9, des particules blanches sont observées dans le produit fini alors qu'aucune de ces particules (identifiées comme étant de l'articaïne) n'est observée pour un pH inférieur ou égal à 7.9. Ainsi, ' dans le cas de la présente invention, un pH supérieur ou égal à 6.0 et inférieur ou égal à 7.9 est requis afin d'avoir un produit avec le meilleur niveau de sécurité et de performance. Avantageusement, le pH de la composition injectable stérile selon l'invention est supérieur ou égal à 6.2 et inférieur ou égal à 7.8. '

Selon l'invention, la composition contient l'anesthésiant local articaïne, ou l'un de ses sels, quelque soit la forme énantiomérique. De manière avantageuse, le chlorhydrate d'articaïne est la forme utilisée, notamment du fait de sa bonne solubilité dans l'eau et donc dans la composition aqueuse selon l'invention. Selon l'invention, la concentration en articaïne est homogène au sein de l'hydrogel et elle est comprise entre 0.1 et 50 mg/ml (soit entre 0.01% et 5% en masse), préférentiellement entre 1 et 50 mg/ml (soit entre 0.1% et 5% en masse), encore préférentiellement entre 2 et 45 mg/ml (soit ^; entre 0.2% et 4.5% en masse). Dans le cas d'injections pour des applications en esthétique, elle est avantageusement fixée à 3 mg/ml (soit 0.3% en masse), c'est-à-dire à une concentration égale à la concentration en anesthésiant fixée pour les produits injectables à base d'acide hyaluronique réticulé contenant de la lidocaïne. Dans le cas d'applications en médecine, par exemple dans le cas de chirurgie dentaire, elle peut avantageusement être fixée à 4% (soit 40 mg/ml). Les études des inventeurs ont également permis de mettre en évidence que, tout comme dans le cas de la lidocaïne dans un hydrogel d'acide hyaluronique réticulé, l'articaïne est à l'état libre dans la composition injectable stérile selon l'invention (c'est-à-dire que la molécule d'articaïne est non liée de manière covalente à l'acide hyaluronique) et que cet anesthésiant local est en mesure- d'être libéré rapidement de l'hydrogel (= cinétique de libération équivalente à celle de la lidocaïne, ce qui est surprenant car la plus forte liposolubilité de l'articaïne par rapport à la lidocaïne devrait induire une libération plus lente de la molécule) pour agir au plus vite au niveau des tissus environnants sur le site d'implantation, après injection chez le patient traité.

Selon l'invention, la composition est stérile. Elle est stérilisée selon les techniques décrites dans l'art antérieur. Elle est avantageusement stérilisée à la chaleur, préférentiellement à la chaleur humide (également appelée autoclavage à la vapeur).

De manière préférée, la stérilisation à la chaleur humide est effectuée à une température supérieure à 100 ^e C, avantageusement supérieure à 110°C, avantageusement supérieure à 120°C. De manière générale, la durée de stérilisation peut aller de quelques secondes à plusieurs minutes. On peut citer par exemple les cycles de stérilisation à la chaleur humide suivants : 121°C ' pendant 20 minutes ou 125°C pendant 7 minutes ou 127°C pendant 4 minutes ou encore 130°C pendant 3 minutes.

Il est important de noter que la stérilisation à la chaleur est avantageusement sélectionnée car elle octroie notamment un très haut niveau de stérilité à la composition choisie, ce qui permet alors de viser un haut niveau de sécurité pour le patient traité.

Les études des inventeurs ont permis de mettre en évidence que la molécule d'articaïne est stable, c'est-à-dire non dégradée thermiquement, au cours du process de stérilisation à la chaleur ' de la composition selon l'invention dès lors que :

- la concentration en réticulant résiduelle est faible dans le produit. Dans le cas du BDDE, il a été prouvé dans ces études que la concentration résiduelle en BDDE après stérilisation doit être inférieure ou égale à 10 ppm pour limiter de manière forte la dégradation de l'articaïne dans la · composition injectable stérile selon l'invention.

- le pH de la composition doit être supérieur ou égal à 6.0. En effet, comme décrit précédemment, un pH inférieur à 6.0 induit une dégradation importante des propriétés biophysiques de l'hydrogel d'acide hyaluronique réticulé et de plus, un pH inférieur à cette même valeur catalyse une ' dégradation de l'articaïne au cours du process de stérilisation de la composition ; catalyse indésirable qui se poursuit au cours du stockage pendant la durée de péremption du produit et donc qui génère un produit n'étant pas stable au cours du temps.

Sans vouloir se lier à une explication, le pH joue très probablement un rôle majeur dans les interactions moléculaires entre l'acide hyaluronique et l'articaïne au sein de la composition dans les conditions spécifiques de l'invention, notamment en impactant le réseau dense de liaisons hydrogènes qui existent entre ces 2 molécules et qui assurent leur stabilité au cours du process de préparation de la composition injectable stérile selon l'invention mais également au cours de la , durée de péremption de la composition.

Dans ce cadre, il est à noter que les études des inventeurs ont permis de montrer que la composition injectable stérile, dans les conditions de l'invention, est stable au cours du stockage de la composition à température ambiante. Ainsi, la stabilité des paramètres clés de la ' composition injectable stérile selon l'invention montre que la composition est tout à fait compatible avec une durée de péremption de 18 à 36 mois, comme c'est actuellement le cas pour des produits à base d'acide hyaluronique réticulé contenant l'anesthésiant lidocaïne. Selon l'invention, la composition est injectable. Elle est préférentiellement conditionnée dans une seringue ou dans un vial, afin de pouvoir être facilement administrée à travers une aiguille ou une canule.

Selon l'invention, la composition stérile injectable à base d'acide hyaluronique réticulé est préférentiellement sous la forme d'un hydrogel dit monophasique plutôt que sous la forme d'un hydrogel dit biphasique.

Selon l'invention, la composition stérile injectable à base d'acide hyaluronique réticulé possède une élasticité G' à 0.7 Hz avantageusement comprise entre 10 Pa et 900 Pa, préférentiellement ^' entre 20 Pa et 700 Pa, préférentiellement entre 30 Pa et 500 Pa, encore préférentiellement entre 50 Pa et 400 Pa. Selon un aspect de l'invention, la composition selon l'invention contient une ou plusieurs substances actives d'origine naturelle ou synthétique à action pharmacologique ou non, comme par exemple les anti-inflammatoires, les antiseptiques, les antibactériens, les antifongiques, les anticancéreux, les protéines, les hormones, les acides gras, les lipides biologiquement acceptables, seuls ou en combinaison. Ces substances actives sont soit dispersées dans l'hydrogel, : soit greffées à un ou plusieurs des polymères de l'hydrogel, soit contenues/encapsulées dans des liposomes/niosomes dispersés dans l'hydrogel, soit contenues/encapsulées dans un autre matériau lui-même dispersé au sein de l'hydrogel.

Selon un aspect de l'invention, la composition selon l'invention contient un ou plusieurs composés d'origine biologique comme des cellules, des plaquettes enrichies, des gènes, des fragments d'ADN ou des facteurs de croissance. Ces composés sont préférentiellement dispersés dans l'hydrogel, mais ils peuvent également être greffés à un ou plusieurs des polymères de l'hydrogel ou contenus/encapsulés dans des liposomes/niosomes dispersés dans l'hydrogel ou ; contenus/encapsulés dans un autre matériau lui-même dispersé au sein de l'hydrogel.

Selon un aspect de l'invention, la composition selon l'invention contient des polymères qui sont dispersés au sein de la matrice réticulée de l'hydrogel. On peut citer par exemple les polymères de la famille des polysaccharides, les polyesters, les polyanhydrides, les polyphosphazenes, les ' poly-e-caprolactones, les acides polylactiques et leurs dérivés, les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, la N-vinyl pyrrolidone et les polymères acryliques et dérivés biologiquement acceptables. Selon un aspect de l'invention, la composition selon l'invention contient des substances minérales qui sont dispersées au sein de la matrice réticulée de l'hydrogel. On peut citer par exemple l'hydroxyapatite ou les phosphates tricalciques comme le β tricalcium phosphate.

Selon un aspect de l'invention, la composition selon l'invention est mélangée avec une ou

ι plusieurs autres substances, préférentiellement stériles, susceptibles d'apporter un bénéfice à l'organisme, juste avant son administration chez le patient. Le mélange est alors effectué par l'utilisateur final, c'est-à-dire par un praticien ou par du personnel habilité, selon une méthode appropriée utilisant un ou plusieurs dispositifs de mélange permettant de réaliser un mélange . satisfaisant et de conserver la stérilité. On peut par exemple citer le mélange par l'utilisateur final de l'hydrogel selon l'invention et d'un ou plusieurs composés comme des acides gras, des lipides, des substances actives, des biologiques ou des substances minérales : en réalisant des allers-retours entre deux contenants (l'un rempli de l'hydrogel selon l'invention et l'autre rempli du composé à disperser dans l'hydrogel), ces contenants pouvant être par exemple des seringues

en extrudant simultanément le contenu de deux contenants (l'un rempli de l'hydrogel selon l'invention et l'autre rempli du composé à disperser dans l'hydrogel) pour réunir ^; les différents composés et/ou les mélanger dans un autre contenant avant administration chez le patient La nouvelle composition injectable stérile divulguée dans la présente invention a pour objectif d'améliorer significativement la sécurité et la performance/efficacité clinique des produits injectables à base d'acide hyaluronique réticulé avec anesthésiant local en procurant notamment les bénéfices suivants autour de l'effet anesthésiant recherché : ' l'articaïne possède une capacité à anesthésier plus rapide et une puissance plus élevée que la lidocaïne. Cela s'explique par le pKa plus faible de l'articaïne (pKa = 7.8) par rapport à la lidocaïne (pKa = 7.9), mais également par une plus forte liposolubilité de l'articaïne (49.5%) par rapport à la lidocaïne (2.9%) (s'expliquant en particulier par la présence d'un groupement thiophène sur la molécule d'articaïne et la capacité de faire davantage de liaisons hydrogènes intermoléculaires). Ce point constitue un avantage considérable pour améliorer le confort patient au cours de la procédure de traitement. En effet, sur une , procédure d'injection d'un acide hyaluronique réticulé d'une durée d'environ 10 à 20 minutes en général, il est clé pour le patient comme pour son praticien de pouvoir bénéficier de l'effet anesthésiant au plus tôt au cours de l'injection, ceci afin que l'acte se passe dans les meilleures conditions possibles

l'articaïne possède un plus faible niveau de cytotoxicité que la lidocaïne (clé pour une meilleure sécurité tant au niveau local qu'au niveau général) comme cela est par exemple décrit dans la publication de Malet et al., The comparative cytotoxic effects of différent local anesthetics on a human neuroblastoma cell line, Anesth analg, 120(3):589-96, 2015 ^■ l'articaïne est plus rapidement métabolisé (= temps d'élimination plus court) par l'organisme probablement du fait de la présence d'une liaison ester au niveau de la molécule. Cette propriété est majeure vis-à-vis du profil de sécurité du produit car elle permet de réduire le risque de toxicité systémique de l'articaïne chez le patient traité l'articaïne ne possède pas de métabolites toxiques et cette caractéristique constitue un avantage considérable par rapport à la lidocaïne. En effet, la lidocaïne possède un métabolite (qui est d'ailleurs également une impureté de synthèse de la matière première lidocaïne se retrouvant par conséquent naturellement dans le produit fini à base d'acide ^■ hyaluronique réticulé contenant l'anesthésiant), la 2,6-diméthylaniline (DMA), possédant une toxicité importante vis-à-vis de l'organisme (molécule carcinogène).

Le fait de ne pas posséder un métabolite toxique comme la DMA mais également le fait d'avoir un temps d'élimination plus court dans l'organisme représentent des bénéfices ^; absolument considérables vis-à-vis de la sécurité au profit de l'articaïne par rapport à la lidocaïne. Ces éléments expliquent en très grande partie la raison pour laquelle l'articaïne est couramment injectée à 4% pour réaliser des anesthésies locales nécessitant une forte diminution de la douleur (cas des chirurgies dentaires) alors que la lidocaïne n'est généralement pas recommandée et utilisée à une concentration supérieure à 2% pour les mêmes applications cliniques.

Ces bénéfices peuvent par exemple permettre :

- soit de réduire la quantité d'anesthésiant articaïne nécessaire par rapport à la lidocaïne pour avoir le même effet anesthésiant (et ainsi réduire les potentiels effets secondaires de l'anesthésiant comme par exemple moins de rougeurs en post injection) ' ^' - soit d'augmenter l'efficacité clinique de l'anesthésie par l'articaïne en comparaison de la lidocaïne si la même concentration/dose en anesthésiant est utilisée pour les 2 principes actifs

l'articaïne est également considérée comme étant une molécule possédant une durée ¹ d'action plus longue par rapport à la lidocaïne comme le montre le plus fort taux de liaisons protéiques de l'articaïne (95%) par rapport à la lidocaïne (65%). Cet avantage est pertinent par rapport aux indications visées en esthétique et en médecine afin que l'effet sur la diminution de la douleur se poursuive sur une durée plus longue en post injection ' par rapport à la solution actuellement en vigueur avec les produits à base d'acide hyaluronique utilisant de la lidocaïne

D'autre part, les études effectuées par les inventeurs ont permis de montrer les différents éléments surprenants suivant au regard de la composition injectable stérile selon l'invention :

- au cours de la stérilisation à la chaleur par autoclave de l'articaïne, la molécule est plus stable dans la composition à base d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention que dans une solution physiologique. Cet avantage est clé car il est impératif d'avoir la meilleure stabilité possible pour ' un principe actif comme l'articaïne, que ce soit pour des raisons de sécurité produit, mais également pour des raisons relatives aux exigences réglementaires des produits contenant ce type de substance pharmaceutique. Sans vouloir se lier à une explication, on peut supposer que l'acide hyaluronique joue un rôle de stabilisant pour l'articaïne en créant avec le principe actif un ' réseau dense de liaisons hydrogènes, ce qui participe notamment à stabiliser la liaison ester de la molécule (= la liaison la plus fragile de la molécule articaïne dans l'environnement aqueux de la composition selon l'invention)

- comme discuté auparavant, le pH de la composition selon l'invention joue un rôle majeur aussi bien sur la stabilité (et la solubilité) de l'articaïne que sur la stabilité de l'acide hyaluronique réticulé, que ce soit lors du process de préparation (et plus particulièrement lors du process de stérilisation) que lors du stockage de la composition à température ambiante

- le réticulant utilisé pour ponter les chaînes d'acide hyaluronique doit être à l'état d'infimes traces dans le produit fini stérile (moins de 10 ppm dans le cas du BDDE - sans vouloir se lier à une explication, on suppose que les fonctions époxydes du BDDE résiduel dans le gel réagissent avec les fonctions réactives de l'articaïne induisant ainsi une instabilité du principe actif), ce qui implique de le retirer selon les méthodes connues par l'homme de l'art (en particulier par dialyse) ^■ avant stérilisation, afin de ne pas catalyser une dégradation de l'articaïne au cours du process de stérilisation à la chaleur mais également au cours du stockage à température ambiante de la composition selon l'invention

- l'ajout d'articaïne dans un gel d'acide hyaluronique réticulé a une influence négligeable sur sa rhéologie avant stérilisation mais une différence significative devient observable après stérilisation de l'hydrogel à la chaleur. D'autre part, contrairement à ce que pourrait attendre l'homme de l'art sur la base de ce qui est décrit dans l'art antérieur avec la lidocaïne et plus généralement avec les anesthésiants locaux de la classe des amino-amides, l'articaïne ne permet ' pas d'obtenir un hydrogel stérilisé à la chaleur qui possède une plus forte élasticité (par rapport à un gel référence ne contenant pas d'anesthésiant) comme c'est le cas avec la lidocaïne, mais au contraire, une plus faible élasticité. Cette propriété spécifique obtenue avec un gel selon l'invention contenant de l'articaïne fournit les avantages importants suivants : - la durée de stérilisation à la chaleur pour obtenir les propriétés rhéologiques souhaitées est plus courte, ce qui est un point très positif dans le cadre de la production industrielle de ce type de composition (cycle de stérilisation plus court = meilleure productivité et coût de fabrication inférieur)

- la durée de stérilisation à la chaleur est plus courte ce qui permet de générer moins de petites masses moléculaires d'acide hyaluronique (l'acide hyaluronique étant sensible à la chaleur, celle-ci impliquant des coupures de chaînes proportionnelles à la durée - d'exposition à la température) connues pour être pro-inflammatoires et donc susceptibles de créer des effets indésirables chez le patient traité

- la durée de stérilisation à la chaleur est plus courte ce qui permet de moins altérer l'acide hyaluronique non réticulé (plus fragile que l'acide hyaluronique réticulé) contenu dans la composition et jouant un rôle de lubrifiant vis-à-vis de l'acide hyaluronique réticulé, ce qui permet alors d'obtenir des produits plus faciles à extruder à travers une aiguille fine et donc plus faciles à utiliser par le praticien

- cette différence de comportement de la composition selon l'invention lors d'une stérilisation à la chaleur (= temps de stérilisation plus court) permet néanmoins d'obtenir des propriétés rhéologiques/mécaniques (cas des modules viscoélastiques G' et G") et de cohésivité tout à fait similaires à celles d'une composition à base d'acide hyaluronique réticulé contenant de la lidocaïne dès lors que la durée de stérilisation est adaptée de ; manière appropriée (= durée de stérilisation plus courte qu'avec un produit à base d'acide hyaluronique réticulé contenant de la lidocaïne avec une durée de stérilisation exacte dépendant des propriétés biophysiques spécifiques visées). Ces propriétés sont décrites comme étant clés dans la littérature pour la sécurité et la performance clinique d'un ; produit injectable à base d'acide hyaluronique réticulé (par exemple, Sundaram et al., Plast Reconst Surg, 2013,132:5S-21S). Ce point est particulièrement intéressant car il offre la possibilité de fournir aux praticiens des produits injectables avec articaïne possédant des propriétés similaires à celles déjà connues actuellement avec les produits contenant ' de la lidocaïne, et donc ayant vocation à traiter les mêmes indications, tout en visant une meilleure sécurité et performance clinique.

- la composition injectable stérile selon l'invention est stable (process et stockage) et tout à fait compatible avec une durée de péremption de 18 à 36 mois à température ambiante et ceci, en l'absence d'un stabilisant comme un polyol dans la formulation (solution décrite dans l'art antérieur pour améliorer la stabilité d'une composition à base d'acide hyaluronique)

- la cinétique de libération de l'articaïne pour la composition selon l'invention est équivalente ^' (aussi rapide) à celle d'un produit à base d'acide hyaluronique réticulé avec lidocaïne et ceci malgré la plus forte liposolubilité de l'articaïne par rapport à la lidocaïne D'autre part, il est intéressant de mettre en évidence la synergie suivante relative à la composition injectable stérile selon l'invention : dans les conditions de l'invention, l'acide hyaluronique réticulé stabilise l'articaïne au cours du process de préparation de la composition mais également lors de son stockage (comme décrit précédemment). L'acide hyaluronique réticulé, de par sa forte viscosité, permet également de maintenir l'articaïne au niveau du site ₍ d'injection afin que l'effet anesthésiant soit focalisé/localisé au niveau de ce site (ceci afin d'avoir une anesthésie la plus ciblée et la plus efficace possible). La molécule d'articaïne, elle, de par sa capacité antioxydante, est ainsi en mesure de « protéger » l'acide hyaluronique réticulé au niveau de la zone traitée dans les premières heures suivant l'injection (c'est-à-dire pendant la période pour laquelle l'émission de radicaux libres par l'organisme est la plus forte), en captant des radicaux libres (qui ne sont donc plus en mesure de dégrader l'acide hyaluronique en coupant ses chaînes) et en limitant l'inflammation des tissus environnants (inflammation qui génère ' notamment des radicaux libres), ceci afin de permettre à l'acide hyaluronique d'être moins altéré dès le début de l'implantation et donc d'avoir une plus longue rémanence dans les tissus.

La présente invention concerne, selon un deuxième de ses aspects, un procédé de préparation de la nouvelle composition injectable stérile décrite précédemment.

Le procédé de préparation de la composition selon l'invention se caractérise par les étapes successives suivantes : a) préparation d'un hydrogel à base d'acide hyaluronique réticulé, ou l'un de ses sels b) ajout de l'articaïne dans l'hydrogel avec opération de mélange

c) stérilisation

L'étape (a) débute généralement par la mise en solution de l'acide hyaluronique puis par sa réticulation, à l'aide d'un réticulant, et elle se termine généralement par la purification de l'hydrogel obtenu.

On entend par étape de réticulation de l'acide hyaluronique, l'étape permettant de ponter les chaînes d'acide hyaluronique les unes aux autres par des liaisons covalentes. De manière ' générale, l'étape de réticulation de l'acide hyaluronique commence lorsque le réticulant est mis en contact avec l'acide hyaluronique et se termine lorsque l'homme de l'art considère que la cinétique de réaction de pontage des chaînes d'acide hyaluronique par le réticulant a atteint un niveau négligeable.

La purification de l'hydrogel, elle, permet de retirer les molécules indésirables du gel préparé et en particulier les résidus de réticulant, suite à la réticulation. Cette purification est effectuée selon les techniques bien connues par l'homme de l'art comme par exemple par bains de dialyse, par lavage par flux d'eau continu ou par précipitation.

La préparation d'un hydrogel à base d'acide hyaluronique réticulé est effectuée avantageusement selon les méthodes décrites dans l'art antérieur. On pourra par exemple citer les demandes WO 97/04012, WO 2004/092222, WO 2005/085329 et WO 2009/071697 pour la fabrication d'un ' hydrogel à base d'acide hyaluronique réticulé. L'étape (b) consiste à ajouter l'articaïne (ou l'un de ses sels, et en particulier le chlorhydrate d'articaïne) dans l'hydrogel à base d'acide hyaluronique réticulé préalablement préparé.

Cet ajout peut être effectué selon par exemple l'une des 2 solutions suivantes : l'articaïne est ajoutée sous forme de poudre dans le gel puis un mélange est effectué (pendant et/ou après l'ajout) afin que la molécule soit homogène dans le gel

l'articaïne est ajoutée dans le gel sous forme d'une solution aqueuse contenant le principe actif puis un mélange est effectué (pendant et/ou après l'ajout) afin que la ^; molécule soit homogène dans le gel

Il est important de noter que, dans le cadre de cet ajout d'articaïne, une base (NaOH, KOH, ...) peut être ajoutée dans le gel afin d'obtenir le pH souhaité, en sachant que le pH de la composition injectable stérile selon l'invention ne doit pas excéder 7.9. Cet ajout d'une base se fait ' avantageusement sous la forme d'une solution aqueuse et il se fait préférentiellement en même temps que l'ajout de l'articaïne et/ou après l'ajout de l'articaïne dans l'hydrogel.

Cet ajout d'articaïne s'accompagne d'une opération de mélange ayant vocation à homogénéiser le principe actif (et la base) au sein de l'hydrogel. Le mélange peut se faire pendant l'ajout et/ou après l'ajout.

L'opération de mélange est effectuée par les techniques bien connues par l'homme de l'art comme par exemple par mélange mécanique au sein d'une cuve de mélange.

Le mélange peut être effectué à une température supérieure à la température ambiante et/ou sous pression et/ou sous ultra-sons afin d'optimiser l'homogénéisation de la composition.

L'étape (c) consiste à stériliser la composition par les techniques bien connues par l'homme de ' l'art; la stérilisation étant avantageusement réalisée à la chaleur humide par autoclavage.

Un procédé avantageux selon l'invention pour la fabrication d'une composition aqueuse stérile injectable selon l'invention comprend au moins les étapes suivantes : - préparation d'une solution aqueuse d'acide hyaluronique

réticulation de l'acide hyaluronique

purification de l'hydrogel, par exemple par dialyse dans une solution physiologique ajout de l'articaïne dans l'hydrogel avec opération de mélange

conditionnement en seringues

- stérilisation La présente invention concerne, selon un troisième de ses aspects, l'utilisation chez l'homme ou chez l'animal de la nouvelle composition aqueuse stérile injectable décrite précédemment, pour des applications esthétiques ou thérapeutiques.

La composition aqueuse stérile injectable selon l'invention est notamment utilisée pour : - combler des volumes

générer des espaces au sein de certains tissus, favorisant ainsi leur fonctionnement optimal

remplacer des liquides physiologiques ou des tissus déficients

stimuler ou favoriser la régénération des tissus

- hydrater et protéger des tissus

délivrer des substances susceptibles d'apporter un bénéfice à l'organisme et notamment des substances actives et/ou des biologiques

A titre d'exemple, on peut citer les utilisations de l'hydrogel dans les cas suivants : la formulation d'une composition injectable en intradermique, dans les muqueuses ou en sous-cutané pour l'amélioration de la qualité de la peau ou le comblement des ^' rides ou la restauration des volumes du visage (pommettes, menton, lèvres, nez, ...) ou du corps

la formulation d'une composition injectable à usage dentaire par exemple pour combler des poches parodontales et/ou pour stimuler la régénération des tissus ' autour de la dent

la formulation d'une composition injectable en intra-oculaire, notamment pour des applications au cours de la chirurgie de la cataracte, du glaucome, de la presbytie ou du vitré ¹ la formulation d'une composition injectable en intra-articulaire pour des applications en orthopédie ou en rhumatologie, notamment dans le cadre de la viscosupplémentation du liquide synovial déficient pour le traitement de l'arthrose mais également de la reconstruction osseuse ou de la régénération du cartilage la formulation d'une composition injectable en urologie pour des applications dans le traitement de l'incontinence urinaire ou fécale

- la formulation d'une composition injectable utilisée en médecine ou chirurgie générale dans le cadre du traitement de la fibrose ou pour améliorer la cicatrisation des plaies la formulation d'une composition pharmaceutique injectable permettant la libération contrôlée de substances actives et/ou de biologiques pour différentes applications médicales

La présente invention concerne, selon un quatrième de ses aspects, une méthode de traitement chez l'humain ou chez l'animal, par injection de la composition injectable stérile décrite précédemment pour : combler des volumes

générer des espaces au sein de certains tissus, favorisant ainsi leur fonctionnement optimal

- remplacer des liquides physiologiques ou des tissus déficients

stimuler ou favoriser la régénération des tissus

hydrater et protéger des tissus

délivrer des substances susceptibles d'apporter un bénéfice à l'organisme et notamment des substances actives et/ou des biologiques A titre d'exemple, on peut considérer la méthode de traitement consistant à améliorer la qualité de la peau et/ou à combler des rides ou des creux et/ou à restaurer des volumes (pommettes, menton, lèvres, nez, ...) au niveau du visage et/ou au niveau du corps (cicatrices, seins, fesses, parties génitales,...) chez l'humain par injection (avantageusement avec une aiguille et/ou une canule) en intradermique et/ou dans les muqueuses et/ou dans les tissus sous-cutanés, de la composition injectable stérile décrite précédemment.

EXEMPLES

L'invention va maintenant être illustrée, de manière non limitative, par les exemples suivants.

Le hyaluronate de sodium, le chlorhydrate de lidocaïne, le chlorhydrate d'articaïne et l'ensemble dés autres composés utilisés dans les exemples suivants possèdent un haut niveau de pureté.

La solution de tampon phosphate utilisée possède la composition suivante : 8.5 g de NaCI, 0.041 g , de NaH ₂ P0 ₄ dihydrate, 0.292 g de Na ₂ HP0 ₄ dihydrate dans 1 litre d'eau pour préparation injectable.

La concentration en articaïne dans les gels est mesurée par HPLC-UV et la concentration en BDDE résiduel dans les gels est mesurée par HPLC- S. Les propriétés rhéologiques (mesure du module élastique G') des gels sont mesurées à 25"C à l'aide d'un rhéomètre à contrainte imposée (TA AR2000) et d'une géométrie cône/plan 4 cm-2° avec un entrefer de 1000 micromètres.

Exemple 1 : Préparation des gels GEL1A et GEL1B selon l'invention et du gel GEL1C (comparatif)

On pèse 1.27 g d'une poudre de hyaluronate de sodium (NaHA), de masse moléculaire environ égale à 1.5 Da, avec un taux d'humidité de 8.2%, auxquels on ajoute 12.9 g d'une solution aqueuse de NaOH à 0.25 N. L'hydratation de la poudre dure lh30, avec une homogénéisation manuelle régulière à la spatule. 0.39 g d'une solution de 1,4-butanedioldiglycidyléther (BODE) dilué au i/5 ^ème dans la soude 0.25 N sont ajoutés au milieu réactionnel, suivi d'une homogénéisation mécanique de 15 minutes avant immersion dans un bain thermostaté à 50°C pendant 2h30. On ajoute une solution de tampon phosphate contenant du HCI dans le réticulat ; obtenu afin d'obtenir un pH=7.3 et une concentration en acide hyaluronique égale à 25 mg/ml. On laisse le gel gonfler pendant 24h à température ambiante dans cette solution et, à la fin de ce temps, on l'homogénéise manuellement à la spatule pendant 10 minutes avant de le purifier par dialyse pendant 24h en utilisant une membrane à base de cellulose (seuil de rétention = 10000 - Da) dans une solution de tampon phosphate. On mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit REF1 le gel ainsi obtenu. La concentration en acide hyaluronique de REF1 est de 16.8 mg/ml. Dans 60.0 g de gel REF1, on ajoute 2.5 g d'une poudre de chlorhydrate d'articaïne et on mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit REF1A, le gel avec articaïne ainsi obtenu.

Dans une fraction du gel RE FIA, on ajoute une solution de soude NaOH à 0.2 N jusqu'à obtenir un pH de 7.4. On mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit GEL1AA, le gel ainsi obtenu.

Dans une fraction du gel GEL1AA, on ajoute à nouveau une solution de NaOH à 0.2 N jusqu'à obtenir un pH de 7.9. On mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit GEL1BB, le gel ainsi obtenu.

Dans une fraction du gel GEL1BB, on ajoute à nouveau une solution de NaOH à 0.2 N jusqu'à obtenir un pH de 8.2. On mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit GEL1CC, le gel ainsi obtenu. Les gels GEL1AA, GEL1BB et GEL1CC sont conditionnés en seringues plastiques de 1 ml puis stérilisés à l'autoclave à 121°C pendant 20 minutes. Soit GELIA et GELIB (= gels selon l'invention) et GELIC, les gels stérilisés issus respectivement de GEL1AA, GEL1BB et GEL1CC.

Les pH des gels GELIA, GELIB et GELIC après stérilisation sont respectivement égaux à 7.3, 7.9 et 8.1.

Exemple 2 : Observation au microscope des gels GELIA et GELIB selon l'invention et du gel GELIC (comparatif)

Une observation au microscope optique (grossissement X35) de GELIA, GELIB et GELIC (préparés à l'exemple 1) montre que les 2 compositions injectables stériles GELIA et GELIB selon l'invention ne possèdent pas de particules blanches dans l'hydrogel à base d'acide hyaluronique réticulé (qui est transparent) alors que la composition GELIC, qui est en dehors du périmètre de l'invention car possédant un pH supérieur ou égal à 7.9, possède des particules blanches identifiées comme · étant des particules d'articaïne.

Exemple 3 : Stabilité de l'articaïne dans les gels GELIA et GEL1D selon l'invention, dans un gel GEL1E (comparatif) et dans une solution physiologique sans acide hyaluronique (comparatif)

Dans une fraction du gel REF1A préparé dans l'exemple 1, on ajoute une solution de HCI à 0.2 N jusqu'à obtenir un pH de 6.2. On mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit GEL1DD, le gel ainsi obtenu.

Dans une fraction du gel GEL1DD, on ajoute à nouveau une solution de HCI à 0.2 N jusqu'à obtenir un pH de 5.3. On mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit GEL1EE, le gel ainsi obtenu.

On prépare également une solution de tampon phosphate avec 40 mg/ml de chlorhydrate d'articaïne avec un pH de 6.2 avant stérilisation (soit TP-AA la solution préparée) et un pH de 5.3 (soit TP-BB la solution préparée).

Les gels GEL1DD, GEL1EE et les solutions TP-AA, TP-BB sont conditionnés en seringues plastiques de 1 ml puis stérilisés à l'autoclave à 121°C pendant 20 minutes. Soit GEL1D (= gel selon l'invention) et GELIE, les gels stérilisés issus de GELIDD et GELIEE, et TP-A et TP-B, les solutions stérilisées issues de TP-AA et TP-BB.

Les pH des gels GEL1D et GELIE après stérilisation sont respectivement égaux à 6.0 et 4.9.

Les pH des solutions TP-A et TP-B après stérilisation sont respectivement égaux à 6.1 et 4.9. Les concentrations en articaïne avant ou après stérilisation des produits suivants (préparés à l'exemple 1 et dans cet exemple) sont mesurées par HPLC-UV :

Les dosages ci-dessus démontrent que l'articaïne est stable dans la composition injectable selon l'invention au cours du process de stérilisation.

Ces dosages montrent également que : - le pH joue un rôle important dans la stabilité de l'articaïne au cours de la stérilisation. Un pH inférieur à 6.0 (en dehors du périmètre de la présente invention) implique une dégradation de l'articaïne comme le prouve la concentration plus faible en articaïne (après stérilisation par rapport à la valeur avant stérilisation) mais également l'augmentation des aires relatives aux pics des produits de dégradation de l'articaïne. - l'acide hyaluronique réticulé, dans les conditions de l'invention, joue un rôle protecteur vis-à-vis de la dégradation thermique de l'articaïne en comparaison d'une solution de tampon phosphate ne contenant pas d'acide hyaluronique

Il est également important de noter que le gel GELIE, à pH égal à 4.9, a une consistance extrêmement fluide par rapport à l'ensemble des autres compositions stériles ou non stériles testées. En plus de catalyser une dégradation du principe actif articaïne, un pH inférieur à 6.0 d'une formulation à base d'acide hyaluronique réticulé et d'articaïne semble catalyser une dégradation du réseau d'acide hyaluronique réticulé ce qui génère une perte des propriétés viscoélastiques de la composition.

Exemple 4 : Préparation des gels GEL2A et GEL2C selon l'invention et des gels GEL2B et REF2B1 (comparatif)

On pèse 9.97 g d'une poudre de hyaluronate de sodium (NaHA), de masse moléculaire environ égale à 1.7 MDa, avec un taux d'humidité de 4.9%, auxquels on ajoute 89.0 g d'une solution aqueuse de NaOH à 0.25 N. L'hydratation de la poudre dure lh30, avec une homogénéisation manuelle régulière à la spatule. 4.12 g d'une solution de 1,4-butanedioldiglycidyléther (BDDE) dilué au l/5 ^ème dans la soude 0.25 N sont ajoutés au milieu réactionnel, suivi d'une homogénéisation mécanique de 15 minutes avant immersion dans un bain thermostaté à 50°C pendant 2h30. On ajoute une solution de tampon phosphate contenant du HCI dans le réticulat ' obtenu afin d'obtenir un pH=7.3 et une concentration en acide hyaluronique égale à 30 mg/ml. On laisse le gel gonfler pendant 24h à température ambiante dans cette solution et, à la fin de ce temps, on l'homogénéise manuellement à la spatule pendant 10 minutes avant de le purifier par dialyse soit dans les conditions A (pour une fraction du gel à purifier) soit dans les conditions B (pour l'autre fraction du gel à purifier) suivantes :

- conditions A : soit pendant 24h en utilisant une membrane à base de cellulose (seuil de rétention = 10000 Da) dans une solution de tampon phosphate

- conditions B : soit pendant 48h en utilisant une membrane à base de cellulose (seuil de rétention = 10000 Da) dans une solution de tampon phosphate

Soit REF2A et REF2B, les gels purifiés par dialyse respectivement pendant 24h et 48h, tous deux ramenés à une concentration en acide hyaluronique de 24.5 mg/ml, puis mélangés à la spatule pendant 10 minutes chacun.

Dans une fraction du gel REF2A, on ajoute une solution de chlorhydrate d'articaïne dans du tampon phosphate pour obtenir une concentration en articaïne de 3 mg/ml dans le gel et on mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. On ajoute ensuite une solution de soude NaOH à 0.2 N jusqu'à obtenir un pH de 7.4. On mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit GEL2AA, le gel ainsi obtenu. Dans une fraction du gel GEL2AA, un dopage au BDDE est réalisé dans le gel : 50 ppm de BDDE sont ajoutés au gel et un mélange manuel à la spatule de 10 minutes est effectué. Soit GEL2AA- DOP, le gel ainsi obtenu.

Dans une fraction du gel REF2B, on ajoute une solution à 3 mg/ml de chlorhydrate de lidocaïne dans du tampon phosphate pour obtenir une concentration en lidocaïne de 3 mg/ml dans le gel et on mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. On ajoute ensuite une solution de soude NaOH à 0.2 N jusqu'à obtenir un pH de 7.4. On mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit GEL2BB, le gel ainsi obtenu.

Dans une fraction du gel REF2B, on ajoute une solution à 3 mg/ml de chlorhydrate d'articaïne dans du tampon phosphate pour obtenir une concentration en articaïne de 3 mg/ml dans le gel et on mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. On ajoute ensuite une solution de soude NaOH à 0.2 N jusqu'à obtenir un pH de 7.4. On mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit GEL2CC, le gel ainsi obtenu.

Les volumes de solution de soude introduits étant équivalents pour les 3 formulations, on en déduit que GEL2AA, GEL2BB et GEL2CC ont des concentrations en acide hyaluronique identiques.

Dans une fraction du gel REF2B, on ajoute un volume (équivalent à celui de la soude pour les gels GEL2AA, GEL2BB et GEL2CC) d'une solution de tampon phosphate et on mélange manuellement le gel à la spatule pendant 10 minutes. Soit REF2B1B, le gel ainsi obtenu.

Les gels GEL2AA, GEL2AA-DOP, GEL2BB, GEL2CC et REF2B1B sont conditionnés en seringues plastiques de 1 ml puis stérilisés à l'autoclave à 125°C pendant 9 minutes. Soit GEL2A et GEL2C (= gels selon l'invention) et GEL2A-DOP, GEL2B, REF2B1 les gels stérilisés issus respectivement de GEL2AA, GEL2CC, GEL2AA-DOP, GEL2BB et REF2B1B.

Les pH des gels GEL2A, GEL2B et GEL2C après stérilisation sont respectivement égaux à 7.3, 7.3 et 7.4.

Exemple 5 : Influence de la concentration résiduelle en BDDE sur la stabilité de l'articaïne dans la composition injectable stérile selon l'invention

La concentration résiduelle en BDDE est mesurée par HPLC-MS pour les gels GEL2A, GEL2C et' GEL2A-DOP. Elle est de 9.4 ppm pour le gel GEL2A, de 1.2 ppm pour le gel GEL2C et de 56.7 ppm pour le gel GEL2A-DOP. Les concentrations en articaïne après stérilisation des produits suivants (préparés à l'exemple 4) sont mesurées par HPLC-UV :

Les dosages ci-dessus démontrent que l'articaïne est stable dans la composition injectable selon l'invention au cours du process de stérilisation. Ces dosages montrent également que la concentration en BDDE résiduelle dans la composition injectable stérile joue un rôle important dans la stabilité de l'articaïne au cours de la stérilisation (mais également au cours du stockage, même si ce fait n'est pas illustré dans le présent exemple). Une concentration résiduelle en BDDE supérieure à 10 ppm catalyse une dégradation de - l'articaïne comme le prouve la concentration plus faible en articaïne (après stérilisation par rapport à la valeur avant stérilisation pour le gel dopé au BDDE) mais également l'augmentation des aires relatives aux pics des produits de dégradation de l'articaïne.

Exemple 6 : Influence de l'articaïne versus lidocaïne sur les propriétés rhéologiques dans la composition injectable stérile selon l'invention

Les modules élastiques G' à 0.7 Hz avant et après stérilisation des produits suivants (préparés à l'exemple 4) sont mesurés par rhéologie :

Les mesures d'élasticité G' ci-dessus montrent que :

- les 3 produits testés possèdent une rhéologie équivalente avant stérilisation - par contre, après stérilisation, contrairement à un produit avec lidocaïne, la composition selon l'invention avec articaïne possède une élasticité inférieure à la composition correspondante sans anesthésiant

La stérilisation à la chaleur joue donc un rôle majeur dans la structure du produit obtenu avec la composition injectable stérile selon l'invention.

Comme décrit précédemment, cette plus faible élasticité obtenue dans le cas de la composition selon l'invention est surprenante car elle va à l'opposé du comportement (décrit dans l'art antérieur et confirmé dans le présent exemple) de produits à base d'acide hyaluronique réticulé ^■ avec lidocaïne. Ce comportement spécifique permet de viser des durées de stérilisation plus courtes avec la composition injectable stérile selon l'invention, ce qui présente de multiples intérêts comme :

- une meilleure productivité et un coût de fabrication inférieur, intéressants dans le cas d'une production industrielle

- un apport de chaleur requis pour obtenir les propriétés rhéologiques souhaitées inférieur, ce qui est grandement bénéfique à la stabilité de l'articaïne, à l'apparition de petites masses moléculaires d'acide hyaluronique considérées comme pro- ' inflammatoires, ou encore à la facilité d'extrusion de la composition à travers une aiguille ou une canule.

Il est intéressant de noter qu'un essai complémentaire a été effectué en stérilisant la composition GEL2CC à 125°C pendant 7 minutes au lieu de 9 minutes (comme dans l'exemple 4). Avec cet essai complémentaire, on constate qu'on obtient une composition injectable stérile selon l'invention possédant une élasticité G' à 0.7 Hz égale à 181 Pa, c'est-à-dire équivalente à celle de la composition GEL2B à base d'acide hyaluronique réticulé et de lidocaïne de l'art antérieur. Cet essai montre ainsi que malgré la différence de comportement (= dégradation du gel différente lors de la stérilisation à la chaleur) de la composition injectable selon l'invention, il est possible de retrouver des propriétés rhéologiques équivalentes à celle d'une composition référence de l'art antérieur, c'est-à-dire d'une composition à base d'acide hyaluronique réticulé et de lidocaïne.>

Exemple 7 : Evaluation de la stabilité au cours du stockage à température ambiante de la composition injectable stérile selon l'invention La stabilité au cours du stockage à température ambiante du gel GEL2C avec articaïne selon l'invention (préparé à l'exemple 4) est comparée à celle du gel GEL2B avec lidocaïne.

On constate qu'après 9 mois à température ambiante, les gels GEL2B avec lidocaïne et GEL2C avec articaïne selon l'invention ont une perte équivalente d'élasticité. Cette faible perte d'élasticité met en avant la stabilité de la composition injectable selon l'invention et la possibilité de viser des durées de péremption comprises entre 18 mois et 36 mois (comme c'est actuellement le cas avec les produits à base d'acide hyaluronique réticulé contenant de la lidocaïne présents sur le marché).

Exemple 8 : Etat libre de l'articaïne dans la composition injectable selon l'invention

Une étude de libération du principe actif articaïne a été effectuée avec la composition injectable GEL2C selon l'invention.

La méthodologie suivie pour réaliser cette étude de cinétique de relargage in vitro est celle de la publication de Mondon et al., Influence of the Macro- and/or Microstructure of Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels on the Release of Two Mode! Drugs. J Glycobiol 5: 119., 2016.

Les dosages de l'articaïne ont été réalisés par HPLC-UV.

Les résultats obtenus dans cette étude montrent que le profil de libération de l'articaïne est tout à fait comparable à celui obtenu et publié pour la lidocaïne (dans un gel à base de HA réticulé) dans ' l'article de Mondon et al. On constate effectivement une forte libération de l'articaïne dans les premières minutes suivant le début de l'étude de relargage et l'intégralité de l'articaïne est libéré du gel selon l'invention après quelques heures, tout comme c'est le cas avec la lidocaïne dans un gel de l'art antérieur.

Ainsi, malgré la plus forte liposolubilité de l'articaïne par rapport à la lidocaïne, l'articaïne dans la composition injectable selon l'invention est libérée très rapidement (aussi rapidement que la lidocaïne), et cette caractéristique est tout à fait compatible avec une capacité à anesthésier rapidement le patient au niveau de la zone traitée au cours de l'injection et en post injection immédiat.