本发明涉及一株能利用未脱毒甘蔗渣酸解糖液 发酵产丁醇的高耐受性拜氏梭菌及其应 用， 属于生物发酵技术领域。

背景技术

丁醇是无色液体， 有酒味， 与乙醇 /乙醚及其他多种有机溶剂混溶； 已广泛应用于增塑剂 等各种精细化学品的制造。 丁醇具有能量密度大、可与汽油任意比混合、 可直接用于内燃机、 运输方便等优点； 作为可再生的新型液体燃料受到越来越多的重 视。

随着化石能源的日益枯竭和价格飞涨， 利用可再生的木质纤维质原料 （如秸秆、 甘蔗渣 等）发酵生产丁醇， 成为研究的重点和热点之一。 Thaddeus Ezeji等 （Bioresource Technology. 2008, 99: 5915-5922) 利用拜氏梭菌突变株 BA101， 以 XAD-4 resin脱毒的玉米芯酸解和酶解 糖液为底物发酵， 总溶剂产量为 9.30 g/L _; 但突变株 BA101不能利用未脱毒的酸解糖液发酵 产丁醇。庞浩等（生物技术, 2011, 21(5) , 79-82)报道拜氏梭菌 13-2株对甘蔗渣水解液具有较 高的发酵效率， 在 0.5%硫酸用量条件下， 它的丁醇发酵量最高可达到 4.5g /L。 中国专利 ZL 201110020102.6报道： 通过粒子束诱变育种得到的拜氏梭菌 (C/oWr i<¾ beijerinckii) IB4对 酚类化合物具有较高的抗逆性，其能以未脱毒 的玉米芯酸解糖液作为碳源，在 2L发酵罐中总 溶剂产量和丁醇产量分别达到了 10.3g/L和 7.1 g/L; 同时， 以未脱毒的甘蔗渣酸解糖液作为 碳源，在 2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 10.6 _§ 和7.3 _§ 。然而， 郭亭等（J Ind Microbiol Biotechnol, 2012, 39(3), 401-407)研究发现， 当玉米芯和甘蔗渣酸解糖液中的酚 类化合物的浓度提升到 1.5 g/L以上时， beijerinckii) IB4基本不生长。

甘蔗渣是一种重要的可再生木质纤维原料， 利用蔗渣生产丁醇， 不仅节约资源， 还促进 制糖产业节能减排， 产业升级。 但是， 甘蔗渣等原料经稀酸处理后， 会产生有机酸、 糠醛、 酚类等抑制物， 这些抑制物的去除成本较高、 并对微生物生长有一定的抑制作用； Thaddeus Ezeji等 （ Biotechnology &Bioengineering. 2007, 97(6): 1460-1469) 研究发现有机酸、 糠醛等抑 制物不影响丁醇的发酵， 而酚类抑制物对丁醇发酵有明显的抑制效果。 基于此， 甘蔗渣酸解 糖液中的毒素抑制物 （尤其是酚类化合物） 严重抑制产丁醇梭菌的发酵性能； 而菌种改良是 提高菌株对抑制物的耐受性、 发酵经济性的关键手段之一。

发明内容 为了解决上述存在的问题， 本发明通过诱导突变和筛选的方法获取一株不 仅对甘蔗渣酸 解糖液具有高效利用率， 且对其中的毒素抑制物 （尤其是酚类化合物） 具有高度耐受性的突 变菌株。

本发明的目的在于提供一株新菌种： 拜氏梭菌 (C/ ytr M beijerinckii) M17。

本发明的另一个目的在于提供上述菌株在丁醇 生产中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

申请人将菌株保藏在位于武汉市武昌珞珈山武 汉大学的中国典型培养物保藏中心， 保藏 中心于 2013年 9月 14日收到申请人提供的菌株。保藏中心给予该� ��养物的保藏号为 CCTCC ΝΟι M 2013425, 提议的分类命名为 Clostridium beijerinckii ΜΙΊ， 已于 2013年 9月 23日鉴 定保藏的菌株是存活的。

一种生产丁醇的方法， 其特征在于： 包括以下步骤：

1 ) 平板培养： 将拜氏梭菌 (C/oWr 6¾ M17接种至平板培养基上， 进行厌氧 培养， 培养温度 33〜37 °C， 培养时间 12〜24 h， 使菌种活化；

2 ) 种子培养： 将平板培养活化的拜氏梭菌 (Ctotr i beijerinckii) M17接种到种子培养 基中， lOO mL的厌氧瓶装液量 40〜60mL， 充氮气 3〜5min， 培养温度 33〜37 V， 培养时间 12〜24h;

3 ) 发酵产丁醇： 将种子培养后的拜氏梭菌 (Ctotr i beijerinckii) M17菌液接种到发酵 培养基中， 接种量按 5〜15%的体积百分比， 充氮气 3〜5min， 发酵温度 33〜37°C， 发酵培养 时间为 70〜90 h， 即可发酵产出丁醇。

进一步的， 步聚 1 )所述的平板培养基包含如下质量百分比的组� �： 碳源 0.3%〜1%、 氮 源 0.5%〜1%、 无机盐 0.5%〜0.8%、 琼脂 1.5%〜2%、 其余为水； 其中， 碳源选自葡萄糖、 淀粉、 甘蔗渣酸解糖液、 玉米芯酸解糖液中至少一种； 氮源选自乙酸铵、 氯化铵、 蛋白胨、 酵母粉、 玉米浆中的至少一种； 无机盐选自钠盐、 钾盐、 镁盐、 磷酸盐、 亚铁盐中的至少一 种。

进一步的， 步聚 2 )所述的种子培养基包含如下质量百分比的组� �： 碳源 0.5%〜1%、 氮 源 0.5%〜1%、 无机盐 0.5%〜0.8%、 其余为水； 其中， 碳源选自淀粉、 葡萄糖中至少一种； 氮源选自乙酸铵、 氯化铵、 蛋白胨、 酵母粉、 玉米浆中至少一种； 无机盐选自钠盐、 钾盐、 镁盐、 磷酸盐、 亚铁盐中至少一种。

进一步的， 步聚 3 ) 所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分 ： 碳源 3%〜6%、 氮 源 0.1%〜0.3%、 无机盐 0.1%〜0.2%、 生长因子 0.05%〜0.1%、 其余为水； 其中， 碳源选自 葡萄糖、 木糖、 甘蔗渣酸解糖液、 玉米芯酸解糖液中至少一种； 氮源选自乙酸铵、 氯化铵、 酵母粉中至少一种； 无机盐选自钠盐、 钾盐、 镁盐、 钙盐、 磷酸盐、 亚铁盐中至少一种； 生 长因子选自对氨基苯甲酸、 维生素 B l、 生物素和玉米浆中至少一种。

本发明的有益效果是：

本发明菌株拜氏梭菌 Clostridium beijerinckii Ml 7对未脱毒木质纤维酸解糖液中的毒素物 质具有高度耐受性， 在酚浓度高达 2.0 g/L的发酵液中， 能非常好地发酵生产丁醇， 其总溶剂 产量和丁醇产量分别达到了 10.9 g/L和 7.9 g/L, 即使酚浓度高达 2.4 g/L, 本发明菌株仍具有 可观的产丁醇能力， 说明本发明菌株拜氏梭菌 M17对毒素物质耐受性强、溶剂产量和丁醇产 量高、 重复性好， 是一种适合利用甘蔗渣发酵产丁醇的优良菌种 。

本发明菌株拜氏梭菌 Clostridium beijerinckii M17对甘蔗渣酸解糖液具有高效的利用率， 且对其中的毒素抑制物（尤其是酚类化合物） 具有高度的耐受性， 这不仅有利于丁醇的生产， 还有利于资源的节约， 促进制糖产业的节能减排， 促进产业升级。

附图说明

图 1为拜氏梭菌的等离子体诱变存活率曲线。

具体^ ½方式

根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解， 实施例 所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利 要求书中所详细描述的本发明。

鎌例

一、等离子体诱变原始拜氏梭菌株

拜氏梭菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的 方法如下：

将拜氏梭菌 NCIMB 8052原始菌株活化培养， 培养温度 33〜37°C， 50ml 肖特厌氧瓶装 液量为 15〜20ml， 充氮气 3min， 培养时间 12〜18 h， 得到生长旺盛的菌液； 取新鲜培养的细 胞稀释至细胞浓度 OD _6(K) =0.1〜1.0， 滴加在灭菌冷却后的载片上， 用无菌空气吹干； 以氦气 为放电气体， 以 100W作为射频功率， 以 10SLM作为气体流量， 以 10〜240s作为辐照时间 对菌株进行等离子体诱变， 诱变后， 将载体上的菌膜洗脱下来， 计算存活率。 实验结果如附 图 1所示； 由图 1可知， 180s是最佳的诱变辐照时间。

二、 筛选诱变后的目的拜氏梭菌株

( 1 ) 培养基配方 （％为质量百分比）：

1. 甘蔗渣酸解糖液平板培养基： 酵母粉 0.3%， 蛋白胨 0.5%， 可溶性淀粉 1%， 乙酸铵 0.2%, 氯化钠 0.2%， 七水合硫酸镁 0.3%， 磷酸二氢钾 0.1%， 磷酸氢二钾 0.1%， 七水合硫酸 亚铁 0.01%， 琼脂 1.5%， 刃天青 0.02%， 甘蔗渣酸解糖液 25% (v/v)， 其余为水， pH 6。

2. 种子培养基：酵母粉 0.3%，蛋白胨 0.5%，可溶性淀粉 1%，乙酸铵 0.2%，氯化钠 0.2%， 七水合硫酸镁 0.3%， 磷酸二氢钾 0.1%， 磷酸氢二钾 0.1%， 七水合硫酸亚铁 0.01%， 其余为 水， pH 6。

3. 摇瓶发酵初筛培养基： 葡萄糖 3%， 乙酸铵 0.22%， 磷酸二氢钾 0.05%， 磷酸氢二钾 0.05%,氯化钠 0.001%，七水合硫酸镁 0.02%，七水合硫酸亚铁 0.001%，一水合硫酸锰 0.001%， 玉米浆 0.1%， 其余为水， pH 6.6。

5. 摇瓶发酵复筛培养基： 甘蔗渣酸解糖液 3%， 乙酸铵 0.22%， 磷酸二氢钾 0.05%， 磷酸 氢二钾 0.05%， 氯化钠 0.001%， 七水合硫酸镁 0.02%， 七水合硫酸亚铁 0.001%， 一水合硫酸 锰 0.001%， 玉米浆 0.1%， 其余为水， pH 6.6。

(2) 筛选步骤：

1、 甘蔗渣酸解糖液平板培养基培养

将诱变后的载片置于装有 l〜2ml生理盐水的具塞试管中， 剧烈震荡，将载片上的菌株洗 脱， 稀释成不同浓度涂布于甘蔗渣酸解糖液平板培 养基上， 33〜37°C厌氧培养 12〜36h， 挑 选出透明圈和菌落较大的菌落 50株， 分别编号 M1〜M50， 将其分别用种子培养基进行扩大 培养， 并保种。

2、 摇瓶发酵初筛

将初筛的扩大培养后的 50株菌落和原始菌株接种到摇瓶发酵初筛培养� ��中，接种量 10% (v/v), lOO mL肖特厌氧瓶装液量 50 mL， 发酵温度 35°C， 发酵时间 72 h后检测各菌株的总 溶剂产量和丁醇产量， 结果显示菌株 M17、 M39和 M48可发酵产出较高的丁醇产量， 如表 1 所示。

表 1 各菌株的总溶剂产量和丁醇产量

总溶剂产量 丁醇产量

菌号

(g L) (g L) 原始菌株 NCIMB 8052 10.8 7.4

M17 11.4

M39 11.1 7.4

M48 11.2

经过组合筛选获得的三株突变株在发酵过程中 总溶剂产量和丁醇产量均高于原始菌株的 产量， 其中 M17的总溶剂产量和丁醇产量也最高。

3、 摇瓶发酵复筛

将发酵初筛获得的总溶剂和丁醇产量最高的菌 株 M17和原始菌株接种到摇瓶发酵复筛培 养基中， 接种量 10% (v/v)， lOO mL肖特厌氧瓶装液量 50 mL， 发酵温度 35 °C， 发酵时间 72 h后检测两个菌株的总溶剂产量和丁醇产量，� �果显示菌株 M17可发酵产出较高的丁醇产量， 如表 2所示。

表 2 原始菌株和 M17的总溶剂产量和丁醇产量 总溶剂产量 丁醇产量

菌号

(g L) (g L) 原始菌株 NCIMB 8052 1 1

M17 9.7 6.5

从摇瓶发酵复筛结果可知， 原始菌株拜氏梭菌 NCIMB 8052 基本不生长； Clostridium beijerinckii M17的总溶剂产量和丁醇产量分别 9.4g/L和 6.5 g/L,可见 M17在发酵过程中总溶 剂产量和丁醇产量明显高于原始菌株的产量。 这与平板培养及发酵初筛的结果是一致的。

三、 目的拜氏梭菌株的传代稳定性

在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中， 检测突变株拜氏梭菌 M17的传代稳定性， 菌株 M17 传代发酵试验结果如表 3所示：

表 3 拜氏梭菌 M17的传代稳定性

拜氏梭菌 M17

传代次数 丁醇产量 总溶剂产量

(g L) (g L)

1 7.7 11.4

2 7.5 11.2

3 7.8 11.6

4 7.7 11.5

5 7.6 11.3

6 7.9 11.7

7 7.8 11.4

从实验结果可知， 经过 7次连续传代， 突变株 M17、 M39和 M48的总溶剂产量和丁醇 产量都较稳定， 具有较好的传代稳定性， 可作为进一步研究和开发的生产菌株。 四、 检测目的拜氏梭菌对未脱毒木质纤维酸解糖液 中毒素物质的耐受性

( 1 ) 培养基配方 （％为质量百分比）：

发酵培养基 1 : 乙酸铵 0.22%， 磷酸二氢钾 0.05%， 磷酸氢二钾 0.05%， 氯化钠 0.001%， 七水合硫酸镁 0.02%， 七水合硫酸亚铁 0.001%， 一水合硫酸锰 0.001%， 玉米浆 0.1%， 用未 脱毒的甘蔗渣的酸解糖液（总还原糖为 3 %)配制， 其余为水， pH 6.6， 培养基中可溶性总酚 含量为 1.5 g/L。

发酵培养基 2: 乙酸铵 0.22%， 磷酸二氢钾 0.05%， 磷酸氢二钾 0.05%， 氯化钠 0.001%， 七水合硫酸镁 0.02%， 七水合硫酸亚铁 0.001%， 一水合硫酸锰 0.001%， 玉米浆 0.1%， 用未 脱毒甘蔗渣的酸解糖液（总还原糖为 4 %)配制， 其余为水， pH 6.6， 培养基中可溶性总分含 量为 2.0 g/L。

发酵培养基 3 : 乙酸铵 0.22%， 磷酸二氢钾 0.05%， 磷酸氢二钾 0.05%， 氯化钠 0.001%， 七水合硫酸镁 0.02%， 七水合硫酸亚铁 0.001%， 一水合硫酸锰 0.001%， 玉米浆 0.1%， 用未 脱毒的玉米芯酸解糖液 （总还原糖为 4.7 %) 配置， 其余为水， pH 6.6， 培养基中可溶性总酚 含量为 2.4 g/L。

平板培养基： 酵母粉 0.3%， 蛋白胨 0.5%， 可溶性淀粉 1%， 乙酸铵 0.2%， 氯化钠 0.2%， 七水合硫酸镁 0.3%，磷酸二氢钾 0.1%，磷酸氢二钾 0.1%，七水合硫酸亚铁 0.01%，琼脂 1.5%，， 其余为水， pH 6。

种子培养基： 酵母粉 0.3%， 蛋白胨 0.5%， 可溶性淀粉 1%， 乙酸铵 0.2%， 氯化钠 0.2%， 七水合硫酸镁 0.3%， 磷酸二氢钾 0.1%， 磷酸氢二钾 0.1%， 七水合硫酸亚铁 0.01%， 其余为 水， pH 6。

(2) 实验过程、 结果和结论

1. 菌种的平板培养、 种子培养和发酵培养

平板培养： 将原始菌拜氏梭菌 NCIMB 8052、 拜氏梭菌 IB4 (CCTCC NO: M2010310)、 拜氏梭菌 M17分别接种至平板培养基上， 厌氧培养， 培养温度 35°C， 培养时间 12 h， 使菌种 活化。

种子培养：将上述平板培养活化后的三种菌种 分别接种到种子培养基中， 250 mL 肖特厌 氧瓶装液量 150 mL， 充氮气 3min， 培养温度 35°C， 培养时间 12 h， 获得种子培养液。

发酵培养： 将种子培养后的原始菌拜氏梭菌 NCIMB 8052、 拜氏梭菌 IB4 (CCTCC NO: M2010310)、拜氏梭菌 M17的菌液分别接种至装有 1 L发酵培养基 1、发酵培养基 2、发酵培 养基 3的 2L发酵罐中， 如表 4所示， 接种量为 10% (v/v) , 发酵温度 35 °C， 连续通入氮气， 流速为 0.3 L/min， 在同样的实验条件下发酵培养 72 h后， 分别检测各组发酵产物中的总溶剂 产量和丁醇产量。

表 4 各菌种在含不同酚浓度的发酵培养基中的总溶 剂产量和丁醇产量

2. 实验结果

检测结果如表 4所示， 从中可以看出， 当发酵培养基中的总酚含量为 1.5 g/L时， 原始菌 种拜氏梭菌 NCIMB 8052均基本不生长， 而拜氏梭菌 IB4 ( CCTCC NO: M2010310 ) 和拜氏 梭菌 M17均能良好的生长，且拜氏梭菌 IB4总溶剂产量和丁醇产量分别为 10.3g/L和 7.1 g/L, 拜氏梭菌 M17的产量分别为 10.5g/L和 7.2 g/L， 二者丁醇产量相差并不显著； 当发酵培养基 中的总酚含量为 2.0g/L和 2.4g/L时，拜氏梭菌 NCIMB 8052和拜氏梭菌 IB4均不能正常生长， 而拜氏梭菌 M17仍可以良好地生长， 且当总酚含量为 2.0g/L时， M17产丁醇的能力还有所 上升， 其总溶剂产量和丁醇产量分别为 10.9 g/L和 7.9 g/L， 当总酚含量高达 2.4g/L时， M17 产丁醇的能力受到一定的影响， 其总溶剂产量和丁醇产量分别降至 8.7 g/L和 5.9 g/L。

3. 实验结论

上述的检测结果说明本发明获得的拜氏梭菌 (C/O M beijerinckii) M17能直接利用未 脱毒甘蔗渣酸解糖液发酵产丁醇， 且其对毒性的耐受能力远高于目前的拜氏梭菌 (C/a trW _M beijerinckii) IB4 (最高耐受的总酚浓度约为 1.5g/L)， 即使在高达 2.4g/L的总酚浓度下， 仍具 有较好的产丁醇能力。