本发明涉及微生物技术领域， 特别涉及一株产胞外多糖的短乳杆菌

{Lactobacillus brevis )及其在食品中的应用。 背景技术

乳酸菌 iLactic acid bacteria, LAB )是一类能利用可发酵性糖产生大量 乳酸的细菌总称， 目前在自然界已发现的这类细菌在分类学上至 少有 23个 属。 在食品、 医药等领域应用较多的乳酸菌主要有乳杆菌属 、 链球菌属、 肠 球菌属、 乳球菌属、 片球菌属和明串珠菌属等。 乳酸菌是益生菌最主要的来 源， 许多乳酸菌是人体肠道固有的益生菌， 已具有改善人体肠道菌群， 调节 机体免疫力， 抑肿瘤， 降低血清胆固醇， 调节血压等重要的生理活性。

人类对乳酸菌在发酵乳制品和微生态制剂中的 应用已取得了显著的进 展。 目前研究的热点是如何通过新型微生物发酵剂 的开发而赋予发酵乳特定 的功能性质。 已知的乳酸菌发挥主要功能特性的作用机理， 除了定殖、 通过 主要代谢产物 （乳酸等） 改善肠道内环境等以外， 一些次生代谢产物如细菌 素、 胞外多糖等也发挥着非常重要的作用。 其中具有理论和实际应用价值的 乳酸菌胞外多糖 （LAB EPS ) 引起了国内外许多学者的研究兴趣。

乳酸菌胞外多糖是乳酸菌产生并分泌到细胞外 的一种多糖。与其他微生 物多糖相比， 乳酸菌 EPS具有自己的特点， 如良好的流变学特性， 能改善发 酵乳的风味、 质地和性质， 使产品增稠、 稳定、 乳化、 保湿及胶凝， 质地细 腻均匀， 口感润滑， 是一种安全的食品添加剂。 EPS还具有良好的生理功能， 如增强黏膜吸附作用、 抗肿瘤、 抗溃疡、 免疫调节、 降胆固醇、 降血压等。 因此， 开展产胞外多糖乳酸菌的研究， 对于改善乳制品生产加工、 开发具有 特定功能性质的乳酸菌发酵乳制品， 具有十分重要的研究意义和经济价值。 开发具有益生功能的 LAB EPS成为目前研究的热点。 发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有技术中 缺乏高产胞外多糖的乳 酸菌的不足， 提供一株较高产胞外多糖的短乳杆菌 (Lactokzd//^ brevis )o 本发明的技术方案如下：

本发明技术方案一： 一株产胞外多糖的短乳杆菌 (Lacto^d//^ brevis ) , 其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心， 保藏编号 CGMCC No.5223。

本发明的技术方案二： 一种短乳杆菌 CGMCC No.5223的工作发酵剂， 由包括以下步骤 （a) 或 （b ) 的方法制备而得：

( a)将短乳杆菌 CGMCC No.5223菌种接种于灭菌乳中培养至凝乳，连 续培养活化两代作为母发酵剂； 将母发酵剂按 3-5% (v/v) 接种于灭菌乳中 培养至凝乳， 即得工作发酵剂；

(b ) 将短乳杆菌 CGMCC No.5223菌种接种于液体培养基中连续活化 两代， 然后将活化培养物按 2-4% (v/v ) 接种于液体培养基中培养 16-18 h， 固液分离得到细胞沉淀， 将沉淀用无菌乳悬浮， 即得工作发酵剂。

步骤 （a) 中， 培养至凝乳的方法是常规方法， 较佳的在 37°C条件下培 养 14-16 ho

步骤（b ) 中， 在液体培养基中活化的方法是短乳杆菌的常规 活化方法， 较佳的在 37°C条件下培养 12-16 ho 所用的液体培养基是常规的短乳杆菌液 体培养基， 较佳的如 MRS液体培养基。 固液分离的方法是常规的菌体发酵 液的固液分离方法， 包括离心法、 过滤法等， 本发明优选离心法， 更优选在 4°C条件下 4000 r/min离心 15 min。

本发明所述的短乳杆菌 CGMCC No.5223的工作发酵剂中， 活菌数优选 10 ⁹ cfu/mL以上。 本发明技术方案三： 短乳杆菌 CGMCC No.5223在发酵食品中的用途。 其中， 所述的发酵食品是常规的发酵类食品， 优选乳酸菌奶饮料或者发 酵乳。

优选的， 所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备的： 原料乳灭菌后冷 却然后加入短乳杆菌 CGMCC No.5223 工作发酵剂混合均匀， 使短乳杆菌 CGMCC No.5223浓度达到 10 ⁶ cfu/mL以上， 即得到含有所述短乳杆菌的乳 酸菌奶饮料。

其中， 所述的灭菌方法是常规的原料乳灭菌方法， 较佳的如超高温瞬时 灭菌， 更佳的如在 95°C下加热杀菌 20 min或在 140°C下高温热杀菌 2 s。 待 灭菌乳冷却后再加入所述的短乳杆菌工作发酵 剂， 冷却温度常规， 较佳的冷 却到 40°C。

优选的， 所述的发酵乳是按照下述步骤制备的： 原料乳灭菌后冷却然后 加入 3-5% (V/V)短乳杆菌 CGMCC No.5223工作发酵剂和 3-5% (V/V)可 共生的发酵乳商品发酵剂， 混匀后发酵至滴定酸度以乳酸计 0.6-0.7， 即得到 含有所述短乳杆菌的发酵乳。

其中， 所述的灭菌方法是常规的原料如灭菌方法， 较佳的如超高温瞬时 灭菌， 更佳的如在 95°C下加热杀菌 20 min或在 140°C下高温热杀菌 2 s。 待 灭菌乳冷却后再加入所述的短乳杆菌工作发酵 剂， 冷却温度常规， 较佳的冷 却到 37°C。 发酵温度常规， 较佳的为 37°C。 可共生的发酵乳商品发酵剂是 常规的商品发酵剂， 如保加利亚乳杆菌。

本发明的技术方案四：从短乳杆菌 CGMCC No.5223中提取的胞外多糖。 其中， 所述的提取的方法是常规的微生物胞外多糖的 提取方法， 优选的 包括将短乳杆菌 CGMCC No.5223的发酵液煮沸后离心以除去菌体和凝结� � 白， 上清液用三氯乙酸法沉淀除去蛋白， 然后用醇沉淀， 沉淀溶解于水后再 用水透析。

其中， 所述的短乳杆菌的发酵液是常规的短乳杆菌发 酵液， 较佳的是将 所述的短乳杆菌以 5% (V/V)的接种量接种于含 l%(w/v)葡萄糖的 12% (w/w) 脱脂乳中发酵培养而得的发酵液。 较佳的是在 30°C条件下培养 30 h而得发酵 液。

其中， 优选的离心条件是 20 min， 10000 g， 4。C。 三氯乙酸法是除蛋白 的常规方法，较佳的添加三氯乙酸至终浓度 4% (wA ,静置过夜， 4。C， 10000 g， 离心 20 min除去沉淀蛋白。醇沉淀法也是常规的方法， 较佳的采用乙醇， 加乙醇至终浓度 75% (v/v)， 4。C静置 24h， 离心（20 min, 10000 g， 4。C) 取 沉淀。

本发明的技术方案五： 所述的从短乳杆菌 CGMCC No.5223中提取的胞 外多糖在增强免疫药物、 保健品或食品中的用途。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外， 均市售可得。

相比于现有技术， 本发明的有益效果如下： 本发明提供了一株短乳杆菌

CGMCC No.5223 , 其胞外多糖产量较高， 所产的胞外多糖能够刺激 B淋巴 细胞增殖， 增强免疫， 在提高免疫力的药品、 保健品、 食品的应用方面具有 广阔的前景。 保藏信息

本发明提供的短乳杆菌（Lactokzd//^ Γ£?νώ)菌株 BDLB0001，已于 2011 年 9月 6日保藏于中国微生物菌种保藏理委员会普通� �生物中心，保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号。 邮编： 100101， 其保藏编号为 CGMCC No.5223。 附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图 1示本发明所述短乳杆菌 CGMCC No. 5223 的菌落形态。

图 2示本发明所述短乳杆菌 CGMCC No. 5223的细胞形态 （χ 1000)。 图 3示本发明所述短乳杆菌 CGMCC No. 5223的生长曲线。

图 4示本发明所述短乳杆菌 CGMCC No. 5223的最适生长温度。

图 5示本发明所述短乳杆菌 CGMCC No. 5223的最适 pH。 具体实施方式

本发明从乳酸菌生境中采集样品， 筛选产胞外多糖的乳酸菌野生菌株， 研究其多糖的生物活性， 开发新的益生菌。

本发明提供一株短乳杆菌 (Lactokzd//^ brevis )菌株 BDLB0001。

本发明从自然发酵的泡菜中筛选出一株乳酸菌 BDLB0001 , 利用形态特 征、 培养性状和生理生化特征等微生物学特性及其 遗传特性 16s rDNA对该 乳酸菌 BDLB0001鉴定为短乳杆菌 (Lactobacillus brevis ) , 该菌株已于 2011 年 9 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏理委员会普通微 生物中心 （简称 CGMCC ) , 其保藏编号为 CGMCC No.5223。

本发明短乳杆菌 CGMCC No.5223的形态学特征：

菌落特征： 菌株在 MRS平板上划线分离， 37°C厌氧培养 48 h， 菌株生 长良好，其菌落形态如图 1所示。菌落大小 0.2-2 mm, 菌落圆形，边缘整齐， 正面微凸起， 颜色乳白中带点微黄色， 不透明， 表面湿润光滑， 挑取能拉丝。

菌体特征： 菌体呈短杆状 （图 2)， 两端圆形， 成对或单个排列， 着色均 匀， 菌体大小一般为 0.9μηι>< 1.8μηι， 不产芽孢， 革兰氏染色阳性。

本发明短乳杆菌 CGMCC No.5223的培养特征：

短乳杆菌 BDLB0001的最低生长温度为 15 °C， 最高生长温度为 40°C， 在 30-40 °C生长温度最佳； 最高和最低初始生长 pH为 8.0和 4.0， 最适生长 初始 pH为 6.0; 菌株 BDLB0001的延迟期相对较短， 2h进入对数生长期， 10 h达到稳定期； 菌株在胆盐浓度 0.1%-0.4%范围内生长良好， 具有良好的 胆盐耐受性； BDLB 0001在≤7°/(^& 1浓度下生长良好， 能够耐受 9%NaCl。 本发明的短乳杆菌 BDLBOOOl 来源于传统发酵食品， 属公认安全 (Generally Recognized As Safe, GRAS ) 菌种， 可用于乳酸菌食品中。

因此， 本发明还涉及所述的短乳杆菌 BDLBOOOl在发酵食品中的用途。 所述含有短乳杆菌 BDLBOOOl的发酵食品是乳酸菌奶饮料和发酵乳。

本发明还提供所述短乳杆菌 BDLBOOOl工作发酵剂。

本发明工作发酵剂较佳的是采用下述制备方法 制备的： 将短乳杆菌 BDLBOOOl菌种接种于 12% (w/v) 的脱脂乳中， 在 37°C条件下培养 14-16 h 至凝乳，连续培养活化两代，作为母发酵剂使 用；将母发酵剂按 3-5% (v/v) 接种于上述的灭菌乳中， 培养 14-16 h 至凝乳， 此时凝乳中活菌数约在 10 ⁹ cfu/mL, 得到所述的工作发酵剂； 或者将短乳杆菌 BDLBOOOl 菌种接种 于 MRS液体培养基中， 在 37°C条件下培养 12-16 h进行活化， 连续活化两 代， 然后将活化培养物按 2-4% (v/v)接种于 MRS培养基中， 培养 16-18 h， 在 4°C条件下 4000 r/min离心 15 min， 去除上清液， 得到细胞沉淀， 将沉淀 用一定量的无菌脱脂乳悬浮， 得到所述的工作发酵剂。

本发明中优选的所述的乳酸菌奶饮料是按照下 述步骤制备得到的： 原料 乳在 95°C下加热杀菌 20 min或在 140°C下高温热杀菌 2s，然后冷却到 40 °C， 再加入所述的短乳杆菌 BDLBOOOl工作发酵剂， 使其浓度达到 10 ⁶ cfu/mL以 上， 在 4°C冷藏保存即得到含有短乳杆菌 BDLBOOOl的乳酸菌奶饮料。

本发明中优选的所述的发酵乳是按照下述步骤 制备得到的： 原料乳在 95°〇下加热杀菌20 1^11或在140°(^下高温热杀菌2 8， 然后冷却到 37°C， 再 按照 3-5% (V/V)加入所述短乳杆菌 BDLBOOOl , 再加入 3-5% (V/V)可共 生的制备发酵乳商品发酵剂，混匀后在 37°C下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计 0.6-0.7， 然后冷却至 40°C， 再进行冷藏保存得到含有短乳杆菌 BDLBOOOl 的发酵乳。 下面用实施例来进一步说明本发明， 但本发明并不受其限制。 下列实施 例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建 议的条件。 实施例中所述的 "室温"是指进行试验的操作间的温度， 一般为

25°C。

实施例 1 短乳杆菌 BDLB 0001的采集、 分离

( 1 )、 样品采集

从自然发酵的泡菜、 传统发酵乳制品 （酸奶、 酸马奶酒等）、 生牛乳、 生面团、 发酵香肠、 腊肠、 开菲尔粒 （藏灵菇）、 青贮饲料、 婴儿粪便等中 取样。 将收集的样品放入冰盒内冷藏， 保持在较低温度下带回实验室并放置 于 4°C冰箱内， 尽快将乳酸菌进行分离。

(2)、 样品预处理

取固体样品 20 g (液体样品 20 mL) 放入装有 180 mL 0.1%无菌蛋白胨 水（蛋白胨 lg， 蒸馏水 1000 g) 的 250 mL三角瓶（含玻璃珠） 中， 振荡后 静置 20 min， 备用。

(3 )、 产糖菌株的初步分离

使用 0.1%无菌蛋白胨水以体积计按照 1:10对上述样品进行连续稀释， 在每个稀释度取 O.lmL稀释样品， 分别涂布 MRS琼脂平板、 M17琼脂平板 和 SM琼脂平板， Modified MRS琼脂平板和 ESM平板， 在 37 °C厌氧条件下 恒温培养 24-48h， 用无菌牙签挑取粘稠且有明显拉丝的单菌落。 然后在相应 的琼脂平板上划线分纯， 得到纯的单菌落， 进行革兰氏染色， 接触酶实验。 纯化菌株保藏在相应的分离培养基中， 添加 20%的甘油作为保护剂， -20°C 冻存。

其中使用的培养基配方如下：

SM培养基 （g/L): 120 g 脱脂乳粉， 10 g 葡萄糖， 880 g水。 ESM培养基（g/L) : 90 g 脱脂乳粉， 3.5 g酵母抽提物， 3.5 g 蛋白胨， 20 g 葡萄糖。 （Van den Berg, D. J. C, A. Smits, B. Pot, A. M. Ledeboer, K. Kersters, J. M. A. Verbakel, and C. T. Verrips. 1993. Isolation, screening and identification of lactic acid bacteria from traditional food process and culture collections. Food Biotechnol. 7: 189-205. )

MRS培养基 （乳杆菌选择性培养基， 德国 Merck公司）

M17培养基 （乳球菌培养基 BD Difco公司）

Modified MRS培养基： MRS培养基中葡萄糖的含量改为 50 g/L， 其他 组分不变。

不同样品在 MRS琼脂培养基、 M17琼脂培养基、 Modified MRS琼脂平 板、 ESM琼脂培养基和 SM琼脂培养基上共分离出 700株菌。这些菌株在分 离平板上表现出粘丝状、 粘稠状和粘液状。

(4) 菌株产胞外多糖

将从平板上得到的分离株接种到 MRS 液体培养基中培养 18 h， 再按 1% (V/V) 的接种量接种到含 50 g/L葡萄糖的 MRS液体培养基中， 在 30°C发酵 24 ho 量取 20 mL培养液， 沸水浴 10 min， 冷却到室温， 上清液加 80%质量分 数的三氯乙酸至终浓度 4% (m/v) , 4°C静置过夜， 10000 g离心 20 min， 轻倾 上清液于截留分子量 14000的透析袋中， 去离子水透析 72 h， 每 8 h换水一次， 定容。采用硫酸-苯酚法（Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Pebers PA, Smith F. (1956). Colorimetric method of determination of sugars and related substances. Analytical chemistry. 28(3):350-356. ) 测定胞外多糖的含量。 这些实验结果列 于表 1中。 从表 1中可以看出， 菌株 22-22产的粗多糖的产量相对较高， 选取 这株菌， 命名为 BDLB0001。

表 1. 产胞外多糖乳酸菌的初步分离 （30°C， 24 h培养）

——言 ^n^LL— 4-21 60.98

5-28 81.6

9-9 131.96

17-5 109.03

17-15 135.79

17-16 126.79

18-9 125.48

19-16 117.61

19-19 115.87

26-9 81.53

26-8 158.91

22-22 161.88

27-2 93.12

33-4 107.79

33-10 100.23 实施例 2 短乳杆菌 BDLB 0001的鉴定

( 1 ) 生理生化试验

菌株 BDLB0001为革兰氏阳性、过氧化酶阴性、不运动� ��杆菌，在 15 V 和 40 °C能够生长， 不水解淀粉， 不液化明胶， 不产生硫化氢， 发酵葡萄糖 产酸不产气， 联苯胺试验阴性、 吲哚试验阴性、 甲基红试验阳性。

(2 ) 利用糖发酵试验鉴定菌株

挑取少许菌株 BDLB0001培养物划线 MRS固体平板 37°C厌氧培养 24-48 ho 从平板上挑取单菌落， 接入 API 50 CHL液体培养基 （生物梅里埃中国有 限公司， API 50 CHL Medium) 中制成菌悬液， 接入 API 50 CHL鉴定试剂条 (生物梅里埃中国有限公司）， 37°C厌氧培养 24-48 h， 记录菌株对 49种碳水 化合物的发酵结果， 将其输入梅里埃公司的鉴定软件 API LAB PLUS , 这些 反应结果如表 2所示。 经数据库查询， 本发明的 BDLB0001与短乳杆菌 Lactobacillus rev^具有 99.8%的同源性， 因此， 将本发明的短乳杆菌 BDLB0001菌株初步鉴定为短乳杆菌。 表 2. 菌株 BDLBOOOl碳源利用情况 碳水化合物 反应结果 碳水化合物 反应结果 甘油 - 水杨苷 - 赤藻糖醇 - D-纤维二糖 -

D-阿拉伯糖 - D-麦芽糖 +

L-阿拉伯糖 + D-乳糖 -

D-核糖 + D-蜜二糖 -

D-木糖 + D-蔗糖 -

L-木糖 - D-海藻糖 -

D-侧金盏花醇 - 菊粉 - 甲基 -β-D-吡喃木糖 - D-松三糖 - 苷

D-半乳糖 -+ D-棉子糖 -

D-葡萄糖 + 淀粉 -

D-果糖 -+ 糖原 -

D-甘露糖 - 木糖醇 -

L-山梨糖 - D-龙胆二糖 -

L-鼠李糖 - D-土伦糖 - 卫茅醇 - D-来苏糖 - 肌醇 - D-塔格糖 - 甘露醇 - D-岩藻糖 - 山梨醇 - 岩藻糖 - 甲基 -α-D-B比喃甘露 - D-阿拉伯醇 - 糖苷

甲基 -α-D-B比喃葡萄 - L-阿拉伯醇 - 糖苷

N-乙酰葡萄糖胺 + 葡萄糖酸钾 + 苦杏仁苷 - 2-酮基葡萄糖酸钾 -

ARBULIN - 5-酮基葡萄糖酸钾 + 七叶灵柠檬酸铁 + - 注: "+"为反应阳性， "-"为反应阴性， "-+"为不能确定是否利用该碳源

(3 ) 菌株 BDLBOOOl的 16s rDNA序列分析 菌株 BDLB0001基因组 DNA提取方法： 挑取纯化的 BDLB0001单菌落接 种到 1 mL MRS液体培养基中， 37°C培养 14 h后将菌液离心（5000 g， lO min) 收集菌体。 采用基因组 DNA抽提试剂盒 （TIAN GEN公司） 提取。 PCR扩增 采用两种合成的通用引物 （16s 27F: GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG； 16s 1492R : CGGCTACCTTGTTACGACTT )， PCR产物采用切胶回收试剂盒

(BioFlux)回收，纯化后送 Invitrogen生物技术公司测序。所得菌株 BDLB0001 的 16s rDNA核苷酸序列为 1442bp (序列表中的 SEQ ID ΝΟ:1 )， 送 GenBank

(GenBank accetion number: J 86880 ) 做 Blast分析。 菌株 BDLB0001同源 性最高菌株的是 L νώ ATCC 14687 ( GenBank accetion number： EF120367), 同源性为 99%。

根据 Goodfellow和 O'Donnell所说的 DNA的 G+C(mol%)≤ 10%~12%及 16S rRNA的序列同源性≥95%的种可归为一个属， 并且 Embley和 Stackebrangdt认 为当 16s rRNA的序列同源性≥97%时可以认为是一个种。 由此可以推断： 菌 株 BDLB0001与 L Γ£?νώ ATCC 14687属于同一个种。菌株 BDLB0001鉴定为短 乳杆菌。

依据形态特征、 生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性 16s rDNA 对乳酸菌 BDLB0001鉴定为短乳杆菌（Lactobacillus brevis)，该菌株已于 2011 年 9 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏理委员会普通微 生物中心 （简称 CGMCC), 其保藏编号为 CGMCC No.5223。

实施例 3 BDLB0001菌株的生长特性

( 1 ) BDLB0001菌株生长曲线的绘制

将活化好的短乳杆菌 BDLB0001按 1% (V/V) 接种量接入 MRS液体培养 基中， 37°C恒温培养 24 h， 每隔 2 h在 600 nm测定培养液的活菌数和 pH值。培 养液 pH值用 pH计测定， 活菌数采用平板计数法， 以活菌数对数值和 pH值对 时间作图得到菌株 BDLB0001在 MRS液体培养基中的生长曲线，其结果（图 3 ) 表明： 短乳杆菌 BDLB0001在 MRS液体培养基中生长迅速， 在 2 h左右进入对 数期， 10 h左右进入稳定期。 随着培养时间的延长， 菌株生长产酸， pH不断 降低， 进入稳定期后， pH下降趋势渐缓。 24 h培养结束时， 培养液的 pH值为 4.63， 培养液中活菌浓度可以达到 10 ⁸ CFU/mL。

(2) BDLB0001菌株最适生长温度测定

将活化好的短乳杆菌 BDLB0001按 1%(V/V)接种量分别接于 lO mL MRS 液体培养基中， 分别置于 15°C、 37°C、 40°C、 45°C和 65°C条件下恒温培养 8 h， 以未接种的 MRS液体培养基作对照， 于 620 nm测定不同温度下培养的培 养液的 OD值， 依据 OD值的大小确定最适生长温度。 结果表明： （图 4) 短 乳杆菌 BDLB0001的生长温度范围较广， 从 15°C到 40°C都生长， 在 30°C-40°C 生长良好， 最适生长温度为 35°C。

(3 ) BDLB0001菌株最适生长 pH测定

将短乳杆菌 BDLB0001接种到不同初始 pH值 （3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0和 10.0)的 MRS液体培养基中， 在 37°C下培养 16 h， 以未接种的同 pH 值 MRS液体培养基作对照， 于 620 nm处测定培养液的 OD值， 依据 OD值的大 小确定最适生长 pH值。 结果表明（图 5 ):菌株 BDLB0001在初始 pH值 4.0-7.0 的 MRS液体培养基中菌体生长良好， 最适生长 pH测定为 6.0。

(4) 短乳杆菌 BDLB 0001对胆汁的耐受性试验

将活化的短乳杆菌 BDLB 0001按 1% (V/V) 的接种量接种于含不同浓度 (质量分数为 0.0%, 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%和 0.4%) 牛磺胆酸钠 （TCA) 的 MRS液体培养基中， 37°C恒温培养， 于 24 h测 定 OD ₆₂ 。， 依据 OD值的大小确定菌株对胆汁的耐受能力。 人体小肠中胆盐含 量在 0.03%-0.3%之间波动， 能够在正常生理胆盐浓度中生长和代谢的菌株 才 可能在肠道转运过程中存活。 如表 3所示， 随着胆盐浓度的增大， OD值在下 降，菌株表现出不适应性。菌短乳杆菌 BDLB 0001表现出良好的胆盐耐受性， 胆盐浓度在 0.1%-0.4%范围内菌株生长良好。 说明菌株在人体小肠中可正常 存活并生长繁殖， 有开发为益生菌的潜力。 表 3. 短乳杆菌 BDLB 0001在不同胆盐浓度培养基中的生长情况

牛磺胆酸钠 （TCA) 质量分数 （％)

0 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4

OD ₆₂₀ 2.4825 2.4549 2.4159 1.3704 0.5868 0.5156 0.492

(5 ) 短乳杆菌 BDLB 0001对 NaCl的耐受性试验

将活化的短乳杆菌 BDLB 0001按 1% (V/V) 的接种量接种于含不同浓 度 （质量分数为 0%， 2%, 4%， 6%, 7%, 8%, 9%， 10%和 11%) NaCl的

MRS液体培养基中， 37°C恒温培养， 以溴钾酚紫为指示剂， 观察菌株 NaCl 的耐受性。 结果列于表 4中。 短乳杆菌 BDLB 0001在含≤7%NaCl浓度的培 养基中生长良好， 在 9%NaCl浓度下生长缓慢， 10%NaCl以上不生长， 说明

BDLB 0001具有良好的 NaCl耐受性。

表 4. 短乳杆菌 BDLB 0001对 NaCl的耐受性

NaCl浓度 （％) 生长情况

0 ++

2 ++

4 ++

6 ++

7 ++

8 +

9 +

10 -

11 -

·+为生长良好， +为生长， -为不生长 实施例 4 短乳杆菌 BDLB0001产胞外多糖的提取

( 1 ) 菌种活化： 将短乳杆菌 BDLB0001菌种接种于 MRS液体培养基中， 在 37°C条件下培养 12-16 h进行活化， 连续活化两代。

(2 ) 种子培养： 短乳杆菌 BDLB0001经活化后， 接种于含 1%葡萄糖的 12% (w/v)脱脂乳在 115°C灭菌 15min的脱脂乳中，在 37°C条件下培养 14-16 h 至凝乳， 连续培养活化两代， 用作母发酵剂。

(3) 发酵培养： 将短乳杆菌 BDLB0001以 5% (v/v) 的接种量接种于含 1%葡萄糖的 12% (w/v) 脱脂乳中， 在 30°C条件下培养 30h。

(4) EPS的提取纯化： 将上述制备的发酵液首先经过沸水浴 10 min， 以 失活可降解多糖的酶， 然后离心 （20 min， 10000 g， 4°C) 除去菌体和凝结 蛋白，上清液浓缩至原体积的 1/2，添加 80% (w/v)三氯乙酸至终浓度 4% (w/v), 静置过夜， 离心（20min， 10000 g， 4°C)除去沉淀蛋白， 浓缩液加 95% (v/v) 乙醇至终浓度 75% (v/v)， 4。C静置 24h， 离心（20min， 10000 g， 4。C)， 取沉 淀去离子水溶解， 离心 （20 min， 10000 g， 4°C) 去沉淀， 上清液去离子水 透析 72h， 每 8 h换水一次， 冷冻干燥得粗多糖样品。 实施例 5 多糖的体外免疫活性研究

EPS细胞毒性实验及对 T/B淋巴细胞的增殖反应

无菌操作取出 BALB/C小鼠脾脏， 制成脾细胞悬液。用淋巴细胞分离液 (上海华美生物工程公司） 分离淋巴细胞， PBS 缓冲液 （每升含 0.144 g KH ₂ P0 ₄ , 9.0 gNaCl, 0.795 gNa ₂ HP0 ₄ 7H ₂ 0, pH7.4)洗涤 2次，用 RPMI1640 培养液（BiosharpAmresco公司）调整细胞浓度至 lxl0 ⁶ /mL的脾淋巴细胞悬 液。 96孔培养板每孔加入 150 μ 脾淋巴细胞悬液和 50 μ 不同浓度 （10 g/mL、 100 g/mL、 1000 g/mL) 的多糖样品， 用有丝分裂原刀豆蛋白 A (ConA, 5 g/mL， Sigma)诱导 T淋巴细胞增殖， 脂多糖（LPS, lO g/mL) 诱导 B淋巴细胞增殖， 设阴性对照组（只含脾淋巴细胞悬液）和阳性 对照组 (添加有丝分裂原）， 细胞毒性检验时不添加有丝分裂原。 每实验组设 3孔 重复， 置 37°C， 5%C0 ₂ 饱和湿度条件下培养 72h。

(1)细胞毒性检验：采用 MTT法（许德义， 贾宏彬. 大鼠杏仁核 5-HT3 受体参与免疫调制 [J].生理学报， 2001, 53(5): 349-354)， 培养结束前 4 h， 每 孔加入 20μΙ^ΜΤΤ (5 g/L, Sigma), 继续培养 4 h。 培养结束后加二亚基砜 DMSO150 L。 酶联免疫检测仪于 570nm测定 A ₅₇ 。值。 其中： MTT溶液的 配制： 用 D-hank's液溶解 MTT, 搅拌使之完全溶解， 定容， 使 MTT浓度为 5mg/rtLL。

MTT法以实验周期短、 操作简便、 灵敏度高、 重复性好而得到迅速发 展和广泛应用， 在细胞生物学、 辐射生物学和免疫学等研究领域具有重要地 位。 MTT 比色法的原理在于活细胞线粒体中的琥珀酸脱 氢酶能使黄色的 MTT还原为难溶性的蓝紫色结品物并沉积在细胞 中 （死细胞无此功能）， 经 二甲亚砜 （DMSO) 溶解后， 利用酶联免疫检测仪在一定波长下测定的吸光 度与活细胞线粒体的代谢能力呈正相关，进而 反映细胞的增殖活性。经 MTT 比色法测定可知，添加不同浓度的粗多糖体外 培养的小鼠脾淋巴细胞培养液 与对照组相比， OD值之间没有显著差异， 结果见表 5。 这说明粗多糖未显 示细胞毒性。

表 5. 粗多糖的细胞毒性检测

浓度 g/mL OD值 P值 细胞毒性

对照 - 0.124±0.001

10 0.137±0.005 0.0329 无

粗多糖 100 0.127±0.037 0.0034 无

1000 0.202±0.009 0.2614 无

(2) 细胞增殖检验： 采用 ³ H-TdR掺入法 （郭曲练， 张阳德， 邹望远等. 鞘内泵入吗啡对大鼠细胞免疫功的影响 [J]. 中华麻醉学杂志， 2005, 25(2): 118-121 )， 培养结束 8 h， 每孔内加入 20μΙ^， ³ H-TdR (370kBq/mL)。 培养结 束后将各管细胞收集在 49型玻璃纤维滤纸上，将纸烘干并置于 PPO-POPOP (Sigma) 闪烁液内过夜， 用液闪仪测出各管的 CPM值。 其中：

³ H-TdR工作液： 原液为 37MBq/mL， 放射性比强度为 0.925TBq/mmol， 临用前用 RPMI 1640培养液稀释至所需浓度（370kBq/mL)， ³ H-TdR—般临 用时稀释。

闪烁液： POPOP (0.1-0.3g) 中加入少量二甲苯在 37°C水浴上溶解后， 再加 PPO (5.0 g)， 然后补足二甲苯至 1L。 配好的闪烁液需要闭光保存。 ConA溶液的配制：精确称取 10 mg ConA,用 RPMI 1640培养液充分溶 解， 定容至 lOO mL, 浓度为 10(^g /mL。

LPS溶液的配制： 精确称取 10 mg LPS, 用 RPMI 1640培养液充分溶解， 定容至 100 mL， 浓度为 10(^g/mL。

³ H-TdR方法与 MTT法相比灵敏度高、 稳定性好、 经济实惠。 ³ H-TdR 方法基于细胞增殖周期中 DNA， RNA合成增加， ³ H-TdR能被作为原料摄入 细胞， 测定细胞内 ³ H-TdR放射量， 反映了细胞增殖情况。

脾脏淋巴细胞中包括 T淋巴细胞和 B淋巴细胞， 两者含量基本相近。 ConA作为 T淋巴细胞有丝分裂原， 仅促进 T淋巴细胞的增殖， 对 B淋巴细 胞不起作用， 相反 LPS仅能诱导 B淋巴细胞增殖。 粗多糖对 LPS激活的 B 淋巴细胞增殖具有明显的促进作用 （PO.01 ) (表 6)， 并且具有明显的剂依 赖关系。粗多糖对经 ConA激活的体外小鼠 T淋巴细胞增殖并没有促进作用

表 6. 粗多糖对 T/B淋巴细胞增值反应的影响 浓度 T淋巴细胞 B淋巴细胞

增强百分比 增强百分比 g/mL CMP值 CMP值

(%) (%) 阴性对照 - 332±35 - 277±59 - 阳性对照 - 24911±822 - 11984±1287 -

10 25400±1097 2 13911±932 16 粗多糖 100 30003±838 20 20848±1302 74

1000 33131±3648 33 25066±2608 109

体外淋巴细胞培养实验显示，短乳杆菌 BDLB0001产的胞外多糖无细胞 毒性。体外免疫活性实验可知， 短乳杆菌 BDLB0001产的胞外多糖能显著增 强 B淋巴细胞的增殖反应， 显示较强的免疫增强活性。 应用实施例 1 短乳杆菌 BDLB0001工作发酵剂 将短乳杆菌 BDLB0001菌种接种于 12% (w/w)在 115°C灭菌 15 min的 脱脂乳中， 在 37°C条件下培养 14-16 h至凝乳， 连续培养活化两代， 作为母 发酵剂使用；将母发酵剂按 3-5% (v/v)接种于上述的灭菌乳中，培养 14-16 h至凝乳， 此时凝乳中活菌数约在 10 ⁹ cfu/mL， 得到所述的工作发酵剂 （1 )。

将短乳杆菌 BDLB0001菌种接种于 MRS液体培养基中，在 37°C条件下 培养 12-16 h进行活化， 连续活化两代， 然后将活化培养物按 2-4% (v/v)接 种于 MRS液体培养基中，培养 16-18 h，在 4°C条件下 4000 r/min离心 15 min, 去除上清液， 得到细胞沉淀， 将沉淀用一定量的无菌脱脂乳悬浮， 得到所述 的工作发酵剂 （2)。 应用实施例 2 含有短乳杆菌 BDLB0001的乳酸菌饮料

原料乳在 95°C下加热杀菌 20 min或在 140 °C下高温热杀菌 2 s， 然后冷 却到 40°C，再加入应用实施例 1所得的短乳杆菌 BDLB0001工作发酵剂【工 作发酵剂 （1 ) 或者 （ ₂ )】， 使其浓度达到 10 ⁶ cfu/mL以上， 在 4°C冷藏保存 即得到含有短乳杆菌 BDLB0001的乳酸菌奶饮料。 应用实施例 3 含有短乳杆菌 BDLB0001的发酵酸乳

将原料乳鲜奶在 95°C加热灭菌 20 min后，再冷却至 37°C，以 3-5% (v/v) 的量加入应用实施例 1所得的短乳杆菌 BDLB0001工作发酵剂【工作发酵剂 ( 1 )或者（2)】， 以及加入可共生的制备发酵酸乳的商业发酵剂 保加利亚乳 杆菌， 该混合菌在 37°C发酵至滴定酸度为 0.6 (以乳酸计）， 冷藏至 4°C并冷 藏保存即得到含有短乳杆菌 BDLB0001的发酵酸乳。 应理解， 在阅读了本发明的上述内容之后， 本领域技术人员可以对本发 明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于 本申请所附权利要求书所限定 的范围。