SOUCHE DE LACTOBACILLUS EHAMNOSUS.

L'invention est relative à une nouvelle souche de Lactobacillus rhamnosus dotée de propriétés antimicrobiennes et immunomodulatrices . De très nombreuses études scientifiques ont rapporté les effets bénéfiques sur la santé de certains microorganismes présents dans des aliments fermentes, notamment des produits laitiers. Ces microorganismes sont communément dénommés «probiotiques». Selon la définition généralement admise à l'heure actuelle, les probiotiques sont : « des microorganismes vivants, qui lorsqu'ils sont consommés en quantités adéquates, ont un effet bénéfique sur la santé de l'hôte » (Rapport FAO/OMS sur l'évaluation des propriétés sanitaires et nutritionnelles des probiotiques dans les aliments, y compris le lait en poudre contenant des bactéries lactiques vivantes ; Cordoba, Argentine ; 1-4 octobre 2001) .

Il a été montré que la consommation de produits alimentaires contenant des bactéries probiotiques peut produire des effets favorables sur la santé, par l'intermédiaire notamment du rééquilibrage de la flore intestinale, de l'amélioration de la résistance aux infections, et de la modulation de la réponse immunitaire.

Les microorganismes probiotiques utilisés en alimentation humaine sont généralement des bactéries lactiques, appartenant principalement aux genres Lactobacillus et Bîfidobacterium.

Les effets bénéfiques sur la santé ne sont toutefois généralement pas communs à l'ensemble des bactéries d'un même genre, ni même d'une même espèce. Ils ne se rencontrent, le plus souvent, que chez certaines souches ; en outre, les effets observés peuvent varier qualitativement et/ou quantitativement d'une souche probiotique à l'autre, y compris à l'intérieur d'une même espèce.

Pour qu'un microorganisme puisse être considéré comme étant potentiellement utilisable comme probiotique, il doit satisfaire à au moins un, et idéalement plusieurs, des critères suivants -:

- présenter une activité inhibitrice vis-à-vis de microorganismes pathogènes pouvant être présents dans la flore intestinale, cette activité pouvant résulter soit de la capacité à adhérer aux cellules intestinales, excluant ou réduisant ainsi l'adhérence des pathogènes, soit de la capacité à produire des substances inhibant les pathogènes, soit de la combinaison de ces deux caractéristiques ;

- présenter des propriétés immunomodulatrices, et notamment immunostimulantes et/ou anti-inflammatoires. En outre, si ce microorganisme est destiné à être incorporé dans un produit laitier, il doit de préférence présenter une croissance satisfaisante sur lait.

Enfin, il doit conserver une bonne viabilité, au cours de la production et de la conservation de l'aliment dans lequel il est incorporé, ainsi qu'après l'ingestion de cet aliment par le consommateur, de manière à pouvoir atteindre l'intestin et à survivre dans le milieu intestinal.

Il est toutefois à noter que bien que la viabilité soit essentielle pour répondre à la définition actuelle de « probiotique », il a été montré que certains des effets bénéfiques associés à des souches probiotiques pouvaient être obtenus même en l'absence de bactéries vivantes, et étaient attribuables à certaines fractions bactériennes ou à des fractions actives de leurs surnageants de culture. Par exemple, la Demande PCT WO2004093898 décrit une préparation immunomodulatrice obtenue par fractionnement du surnageant de culture de la souche CNCM 1-2219.

Les Inventeurs sont maintenant parvenus à isoler une souche de Lactobacillus rhamnosus répondant aux critères indiqués ci-dessus.

La présente invention a pour objet cette souche, qui a été déposée selon le Traité de Budapest, auprès de la

CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris), le 9 novembre 2006, sous le numéro 1-3690.

Elle possède les caractéristiques suivantes:

Morphologie : Petits bacilles trapus parfois coccoides, isolés ou petites chaines.

- Fermentation des sucres suivants (résultats obtenus sur une galerie api 50 CH - Milieu MRS API à 37 ⁰ C pendant 48h) : Ribose, galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, L- sorbose, rhamnose, mannitol, sorbitol, Methyl-D glucoside, N- acétylglucosamine, arbutine, esculine, salicine, maltose, lactose, trehalose, melezitose, beta gentiobiose, D-turanose, D-tagatose, gluconate.

Elle possède d'autre part des propriétés antimicrobiennes, se traduisant par une forte capacité à inhiber la croissance en culture de microorganismes pathogènes.

Elle présente en outre des propriétés d' adhésion au mannose. Il est connu que des glycoconjugués riches en mannose présents à la surface des cellules épithéliales intestinales jouent un rôle dans l'attachement de bactéries pathogènes, telles que les Escherichia coli entérotoxiques, les salmonelles, Vibrlo cholerae ou Pseudomonas aeruginosa, et il a été rapporté que les propriétés d'adhésion au mannose de certaines bactéries probiotiques leur permettaient d'entrer en compétition avec ces pathogènes, et d'inhiber leur adhésion à la muqueuse intestinale, leur conférant ainsi des propriétés anti-infectieuses (MICHAIL et ABERNATHY, Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , 35, 350-355 2002 ; MANGELL et al., Dig Dis Sci., 47, 511-506, 2002). Ces propriétés avaient toutefois été observées principalement sur des bactéries de l'espèce Lactobacillus plantarum (notamment la souche L. plantarum 229v, décrite dans la Demande EP0817640 et la souche L. plantarum WCFSl), mais pas sur des bactéries de l'espèce Lactobacillus rhamnosus .

La souche CNCM 1-3690 possède également des propriétés immunomodulatrices, et notamment antiinflammatoires .

La présente invention englobe également pour objet des souches de Lactobacillus rhamnosus susceptibles d'être obtenues par mutagénèse ou par transformation génétique de la souche CNCM 1-3690. De préférence, ces souches conservent au moins les propriétés anti-microbiennes, ou les propriétés immunomodulatrices de la souche CNCM 1-3690. Il peut s'agir de souches dans lesquelles un ou plusieurs des gènes endogènes de

la souche CNCM 1-3690 a (ont) été muté (s), par exemple de manière à modifier certaines de ses propriétés métaboliques

(e.g. la capacité de cette souche à métaboliser des sucres, sa résistance au transit intestinal, sa résistance à l'acidité, sa post acidification ou sa production de métabolites) . Il peut s'agir également de souches résultant de la transformation génétique de la souche CNCM 1-3690 par un ou plusieurs gène (s) d'intérêt, permettant par exemple de conférer à ladite souche des caractéristiques physiologiques supplémentaires, ou d'exprimer des protéines d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, que l'on souhaite administrer par l'intermédiaire de ladite souche.

Ces souches peuvent être obtenues à partir de la souche CNCM 1-3690 par les techniques classiques de mutagénèse aléatoire ou dirigée et de transformation génétique de lactobacilles, telles que celles décrites par exemple par GURY et al. (Arch Microbiol., 182, 337-45, 2004) ou par VELEZ et al. (Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3604, 2007), ou par la technique dénommée « génome shuffling » (PATNAIK et al. Nat Biotechnol, 20, 707-12, 2002 ; WANG Y. et al., J Biotechnol., 129, 510-15, 2007) .

La présente invention a également pour objet des fractions cellulaires pouvant être obtenues à partir d'une souche de Lactobacillus rhamnosus conforme à l'invention. Il s'agit notamment de préparations d'ADN ou de préparations de parois bactériennes obtenues à partir de cultures de ladite souche. Il peut s'agir également de surnageants de culture ou de fractions de ces surnageants.

La présente invention a également pour objet des compositions comprenant une souche de Lactobacillus rhamnosus conforme à l'invention, ou une fraction cellulaire obtenue à partir de celle-ci.

Ces compositions peuvent être notamment des ferments lactiques, associant une souche de Lactobacillus rhamnosus conforme à l'invention avec une ou plusieurs autre (s) souche (s) de bactéries lactiques, probiotique (s) ou non.

II peut s'agir également de produits alimentaires, et notamment de produits laitiers, ou de produits pharmaceutiques ou cosmétiques comprenant une souche de

Lactobacillus rhamnosus conforme à l'invention, ou une fraction cellulaire obtenue à partir de celle-ci.

Lorsque ladite souche est présente sous forme de bactéries vivantes, celles-ci seront de préférence présentes à raison d'au moins 10 ⁵ ufc par gramme, avantageusement au moins 10 ⁶ ufc par gramme de produit, plus avantageusement au moins 10 ⁷ ufc par gramme et encore plus avantageusement au moins 10 ⁸ ufc par gramme.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à des exemples illustrant les propriétés anti-microbiennes, immunomodulatrices et anti-infectieuses de la souche CNCM I-

3690.

EXEMPLE 1 : COMPARAISON DES PROPRIETES DE LA SOUCHE CNCM I- 3690 AVEC CELLES DE SOUCHES PROBIOTIQUES CONNUES

Les propriétés de la souche CNCM 1-3690 ont été comparées avec celles de différentes souches de l'art antérieur, connues pour leurs propriétés probiotiques .

La liste de ces souches est donnée dans le Tableau I ci-dessous.

Tableau

Matériel et méthodes

1- Activité antimicrobienne

La recherche d'activités anti-microbiennes a été effectuée contre trois bactéries pathogènes cibles : Escherichia coli E1392-75-2A, Salmonella enteritidis NIZO B1241 et Listeria monocytogenes 4B. Les bactéries lactiques ont été mises en culture sur boîtes de Pétri dans différents milieux : LM17 (milieu Ml7 (TERZAGHI & SANDINE, Appl . Microbiol. 29, 807-813, 1975) additionné de 1% de lactose, milieu Elliker (ELLIKER et al., J. Dairy Sci., 39, 1611-1612, 1956) , et milieu TGV (Tryptone-Glucose-Meat Extract) .

Les boîtes sont incubées à 37 ⁰ C jusqu'à apparition de colonies bactériennes. Les cultures de Bifidobacterium ont été effectuées sous anaérobiose. Une couche d'agar contenant du milieu BHI (brain-heart infusion) et le pathogène est alors

coulée à la surface des boîtes. Les boîtes sont incubées de nouveau à 37 ⁰ C pendant 24h. Les diamètres des zones d' inhibition du pathogène sont ensuite mesurés autour de chaque colonie de bactéries lactiques. Le score 1 correspond à 5 un diamètre entre 1 et 3 mm. Le score 2 correspond à un diamètre entre 4 et 6 mm. Le score 3 correspond à un diamètre supérieur à 6 mm. Chaque expérience a été menée trois fois indépendamment pour chaque souche.

Les scores obtenus sur les pathogènes cibles dans .0 chaque expérience ont été additionnés, pour obtenir, pour chaque bactérie lactique, un score global d'activité antimicrobienne.

Les résultats sont donnés dans le Tableau II ci- après .

L5 Ces résultats montrent que parmi les souches testées, la souche CNCM 1-3690 est avec la souche ATCC55544 celle qui possède l'activité anti-microbienne la plus élevée.

Tableau II

2 - Immunomodulation

Les propriétés immunomodulatrices des différentes bactéries lactiques ont été évaluées par détection de la modulation induite par ces bactéries sur la réponse inflammatoire de cellules épithéliales de colon (HT-29) , en mesurant l'effet de ces bactéries sur l'activation du régulateur transcriptionnel NF-KB et la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire IL-8 par les cellules HT-29 en présence d'un mélange de TNFα, IL-lβ et IFNγ (Cytomix) simulant les conditions d'une agression inflammatoire.

Culture des bactéries lactiques

La croissance des bactéries lactiques s'effectue dans du milieu MRS (DE MAN et al., J. Appl . Bacteriol. 23, 130-135, I960), ou MRS complémenté avec L-cystéine (1% final), ou dans du milieu Elliker, selon l'espèce bactérienne testée. Les bactéries ont été inoculées et cultivées en une première pré-culture de 10 mL pendant 16h à 31°C, et re-cultivées le lendemain en une deuxième culture dans 100 mL pendant 16h à 37 ⁰ C, et récoltées en fin de phase stationnaire . Culture et préparation des cellules

Les cellules HT29 sont entretenues à 37 ⁰ C et 5% de CO ₂ dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) complémenté avec 4,5g/L de D-Glucose, L-Glutamine (ImM final), acides aminés (AA) non essentiels (1% final), Pénicilline/Streptomycine (1% final) , Sérum de veau fœtal (SVF) (10% final) .

Les cellules HT-29 sont ensemencées dans des plaques de 12 puits à raison de 2. 10 ⁵ cellules par puits dans 2ml de milieu, deux jours avant les expériences d'interaction avec les bactéries et de stimulation par le Cytomix.

Pour la mesure de l'activation du régulateur transcriptionnel NF-KB les cellules sont transfectées le lendemain de l'ensemencement, avec le plasmide rapporteur Ig- kB-Luciférase, comme décrit par TIEN et al. (J. Immunol., 176, 1228-37, 2006) . Préalablement à la transfection, les cellules sont lavées et le milieu est remplacé par le même milieu sans antibiotiques. La transfection est effectuée en déposant dans chaque puits 100 μL d'un mélange contenant 75 ng de plasmide

plg-kB-luciférase et 1 μL de Lipofectamine 2000 dans 99 μL de milieu OptiPro. Les plaques sont ensuite incubées pendant 24H à 37 ⁰ C et 5% de CO ₂ . Interaction avec les bactéries et stimulation par le Cytomix Les bactéries sont récupérées en fin de phase stationnaire, et lavées deux fois au PBS avant d'être mises en interaction avec les cellules.

Elles sont ensuite incubées pendant 2 heures avec les bactéries, avec une multiplicité d'infection de 100 bactéries par cellule. Après deux heures d'interaction avec les bactéries, les cellules sont incubées pendant β heures en présence des bactéries et du Cytomix, à raison de 50ng/mL de TNFα, 2,5ng/mL d' IL-lβ et 7,5ng/mL d' IFNγ dans le milieu d'incubation. Toutes les incubations sont effectuées à 37 ⁰ C, et 5% de CO ₂ .

Afin de déterminer le niveau basai d' activation de NF-κB et de sécrétion d' IL-8 en l'absence de bactéries lactiques, la même expérience a été réalisée en effectuant la stimulation par le Cytomix pendant 6 heures, après deux heures d'incubation des cellules en l'absence de bactéries.

A l'issue des 8 heures d'incubation, on récupère 1 mL de milieu pour doser l' IL8 sécrétée. Ce dosage est effectué par ELISA en utilisant le kit « Chimioluminescent ELISAs QuantiGlo Human IL-8 » (R&D Systems) . Pour mesurer l' activation de NF-κB, les cellules sont lysées dans 100 microlitres d'un tampon (Tris pH 7,9 25mM, MgCl ₂ 8 mM, Triton 1 %, Glycérol 15 %, additionné de ImM DTT. Pour mesurer l'activité luciférase, 10 microlitres de lysat cellulaire sont ajoutés à du tampon de lecture (Tris pH 7,9 25 mM, MgCl ₂ 8 mM, Triton 1%, Glycérol 15 %), additionné de ImM DTT, 10OmM ATP et 2 mM de Luciférine/K ₂ HPO ₄ - pH 7,58. La mesure est effectuée à l'aide d'un luminomètre (BECKMAN COULTER) .

Après ce temps total d'interaction de 8 heures, on mesure l' activation de NF-KB, et la sécrétion d'IL-8.

Les valeurs d' activation de NF-KB et de sécrétion d' IL-8 sont exprimées en pourcentages par rapport au niveau basai observé en l'absence de bactéries lactiques. Pour chaque

souche testée, un score moyen d' immunomodulation est calculé en additionnant le pourcentage d'activation de NF-KB et le pourcentage de sécrétion d'IL-8. Ces résultats sont rassemblés dans le tableau III suivant.

Tableau

Ces résultats montrent que la souche CNCM 1-3690 inhibe fortement la réponse inflammatoire des cellules épithéliales HT-29. Parmi les autres souches testées, seule la souche HN001 possède des propriétés anti-inflammatoires comparables.

3- Survie aux stress gastrique et intestinal

Un modèle in vitro reflétant les conditions de stress gastrique et intestinal a été utilisé.

Des cultures de bactéries lactiques sont réalisées dans du lait supplémenté avec de l'extrait de levure. Les

cultures sont incubées pendant 24 à 48h, selon les espèces (jusqu'à la phase stationnaire de culture).

Stress intestinal : Un jus intestinal artificiel composé de sels biliaires de porc (à 3.3 g/1) et de tampon carbonate NaHCO3 (à 16,5 g/1) est réalisé. Le pH est ajusté à 6,3. 1 ml de ce jus intestinal est ajouté à 100 μl de culture bactérienne. Les cultures sont ensuite incubées 5 heures. Ensuite, les populations bactériennes avant et après le stress sont évaluées sur boîtes. Stress gastrique : Un jus gastrique artificiel est réalisé. Il est composé d'acide lactique (9 g/1), de pepsine

(3,5 g/1) et de NaCl (2.2 g/1). Le pH est ajusté à 3,1. 1 ml de ce jus artificiel est ajouté à 100 μl de culture bactérienne. Les cultures sont incubées pendant différent temps : 10 min, 30 min et 60 min. Les populations bactériennes sont évaluées sur boîtes.

Les valeurs sont exprimées de la manière suivante : Stress gastrique = moyenne [log (ufclOmin/ufcO) et log (ufcO/ufcO) ] *10 + moyenne [log (ufc30min/ufc0) et log (ufclOmin/ufcO) ] *20 + moyenne [log (ufc60min/ufcO) et log (ufc30min/ufc0) ] *30.

Stress intestinal = log (ufc5h/ufcOh) . ufcXmin étant la concentration en bactéries exprimée en Unités Formant Colonies (UFC) après X minutes d'incubation. Pour le stress gastrique, la survie est bonne quand la valeur est supérieure à -50, moyennement bonne quand la valeur est comprise entre -50 et -100 et mauvaise quand la valeur est inférieure à -100.

Pour le stress intestinal, la survie est bonne quand la valeur est supérieure à -0,5, moyennement bonne quand la valeur est comprise entre -0,5 et -1,5 et mauvaise quand la valeur est inférieure à -1,5.

Les résultats sont donnés dans le tableau IV suivant .

Tableau IV

Les résultats illustrés dans les Tableaux II, III et IV ci-dessus montrent que, parmi les différentes souches testées, la souche CNCM 1-3690 est la seule à présenter à la fois des propriétés anti-microbiennes et des propriétés antiinflammatoires importantes, accompagnées en outre de très bonnes propriétés de résistance aux stress gastrique et intestinal .

Pour illustrer la supériorité de cette souche, les différents scores obtenus par cette souche sur le plan antimicrobien ont été additionnés entre eux et une moyenne a été faite entre les résultats obtenus par cette souche sur le plan de 1' immunomodulation. La Figure 1 montre à quel point cette souche se différencie par rapport aux autres souches testées. EXEMPLE 2 : PROPRIETES D'ADHESION AU MANNOSE DE IA SOUCHE CNCM 1-3690

La capacité de la souche CNCM 1-3690 à adhérer spécifiquement au mannose a été déterminée grâce à un test

d'agglutination. Ce test est basé sur la présence de polysaccharides contenant du mannose à la surface des cellules de Saccharomyces cerevisiae. Lorsque des bactéries adhérant au mannose sont mises en contact avec S. cerevisiae, un phénomène d'agglutination, visible au microscope, intervient.

Ce modèle permet d' évaluer des propriétés antiinfectieuses potentielles d'une bactérie, résultant de sa capacité à entrer en compétition avec des pathogènes au niveau de l'adhésion à la muqueuse intestinale. Les souches L. plantarum 229v et L. plantarum

WCFSl, connues pour leur forte capacité d'adhésion au mannose, ont été utilisées à titre de contrôles positifs.

Les souches de Lactobacillus sont cultivées en milieu MRS, à une température de 37°C. La croissance des bactéries est arrêtée en phase stationnaire, et les bactéries sont ensuite lavées et ajustées en concentration. La culture de S. cerevisiae est effectuée en milieu « malt extract »

(Oxoid) .

Un volume de 5 μl de suspension bactérienne est ensuite mélangé avec du PBS ou methyl-α-D-mannopyranoside

(concentration finale : 25 mM) . Puis 100 μl d'une préparation à 1 % de cellules de S. cerevisiae est ajoutée. Le mélange est agité pendant 10 min à température ambiante, puis examiné au microscope, et des scores sont attribués en utilisant la notation suivante :

Score 0 = pas d'agglutination Score 1 = faible agglutination Score 3 = forte agglutination Score 5 = très forte agglutination. L'expérience est menée trois fois indépendamment pour chaque souche.

Les résultats sont donnés dans le tableau V ci- après.

Tableau V

On observe que le pourcentage de cellules de S. cerevisîae agglutinées par la souche CNCM 1-3690 est comparable au pourcentage de cellules de S. cerevisiae agglutinées par les souches L. plantarum 229v et L. plantarum

WCFSl.

EXEMPLE 3 : CROISSANCE SUR LAIT DE LA SOUCHE CNCM 1-3690

Les propriétés de croissance sur lait de la souche CNCM 1-3690 ont été testées en utilisant le protocole suivant :

Un milieu constitué de lait écrémé reconstitué par de l'eau additionnée de poudre de lait écrémé a été ensemencé avec la souche CNCM 1-3690, à des taux variant entre 5,5xlO ⁶ ufc/g et 3,3xlO ⁷ ufc/g. L'activité fernαentaire de la souche, reliée à sa croissance, est mesurée en suivant en continu le pH du milieu de croissance.

Les résultats sont illustrés par la Figure 2.

Ces résultats montrent que la souche CNCM 1-3690 est capable de croître efficacement sur du lait, et qu'elle peut donc être utilisée dans la fabrication de produits laitiers fermentes.