【명세서】

【발명의 명칭】

과당으로부터 알로오스를 생산하는 균주 및 이를 이용한 알로오스 생산방

【기술분야】

본 발명은 과당으로부터 알로오스를 생산하는 재조합 균주， 상기 균주를 포함하는 과당 -함유 원료부터 알로오스를 생산하는 알로오스 생산용 조성물， 및 이를 이용한 알로오스의 제조방법에 관한 것이다.

【배경기술】

알로오스 (D-allose)는 포도당 (D-glucose)과 3번 탄소의 -OH 기 방향만 다른 에피머 (epimer)로서, 사이코스 (psicose)의 이성질체로 알려진 희소당 단당류이다. 알 로오스는 혈전 형성, 장기이식수술 환자의 자가 면역 반웅 및 암세포의 증식을 억 제하는 기능을 가지고 있다. 또한, 간과 뇌의 허혈 후 신경세포의 사멸을 연장시 키는 효과도 있으며 백혈병 환자의 치료약으로도 연구가 진행되고 있다.

상기와 같은 특징으로 인해, 알로오스는 의약 분야에서 차세대 핵심 소재 로서 높은 이용가치가 있으나, 자연계에 극히 드물게 존재하기 ^' 때문에 산업적으로 적용하기 위해서는 효율적인 생산 공정을 개발하는 것이 필요하다. 종래에 알로오 스는 주로 화학적 합성 방법에 의해서만 생산되었으나, 부가적인 당류의 생성 및 이로 인한 복잡한 정제 과정과 공정상에서 화학적 폐기물이 발생한다는 문제가 있다.

이에, 최근에는 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 알로오스를 대량 생산 하는 방법이 제안되었다. 일본 카가와 대학의 이즈모리 그룹에서 처음으로 슈도모 나스 슈체리 (Pseudomonas stutzeri) 유래의 람노스 이성화 효소 (L-rhamnose isomemse)를 사용하여 사이코스에서 알로오스를 생산하여 보고하였으나 (Journal of Fermentation and Bioengineering, 85(5); 539-541, 1998), 상기 효소는 알로오스 생성시 부산물로 다량의 알트로스 (D-altrose)도 함께 생성시키는 단점이 있었다.

따라서 알트로스와 같은 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온 도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타내며, 높은 수율로 알로오스를 생산할 수 있는 효소의 개발이 요구되고 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 사이코스 에피머화 효소 (psicose epimerase)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 백터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 알로오스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 이들의 흔합물을 과당 -함유 원료와 반응시키는 단계를 포함하는 과당 -함유 원료로 부터 알로오스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 23 또는 25의 아미노산 서열을 포함 하는 과당으로부터 알로오스 생산용 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 과당, 사이코스 및 알로오스를 포함하는 흔합당 조성물을 제공하는 것이다.

【과제의 해결 수단】

본 발명은 과당으로부터 알로오스를 생산하는 재조합 균주, 상기 균주를 포함하는 과당 -함유 원료부터 알로오스를 생산하는 알로오스 생산용 조성물, 및 이를 이용한 알로오스의 제조방법에 관한 것이다.

기존의 알로오스를 화학적 합성 방법에 의해 생산하는 경우, 부가적인 당 류의 생성 및 이로 인한 복잡한 정제 과정과 공정상에서 화학적 폐기물이 발생하 고， 미생물을 이용한 방법은 알로오스 생성시 부산물로 다량의 알트로스 (D-altrose) 도 함께 생성시키는 단점이 있는바, 알트로스와 같은부산물을 생.성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타내며, 높은 수율로 과당으로부터 알로오스를 생산할 수 있는 알로오스의 제조방법을 제공하 고자 한다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다. 이에 본 발명의 하나의 양태는, 사이코스 에피머화 효소 (psicose epimerase) 를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴 클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 백터를 제공한다.

상기 사이코스 에피머화 효소는 클로스트리디움 신댄스 (C/( t i¾w« scidens), 엔시퍼 아드해렌스 (Era^r a^flere ) 또는 트로포네마 프리미샤 (7 epo"ewa /)n ^' m/t/a) 에서 유래된 것일 수 있다.

상기 클로스트리디움 신댄스 (C7cwt ^' i¾w« « /ife _ra )에서 유래한 사이코스 에피 머화 효소 (이하, CDPE)는, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백 질이다. 예컨대, 상기 CDPE는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부 터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 CDPE를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호 화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어， 서열번호 5의 염기서열 및 /또는 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 CDPE는 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 법 (SDS-PAGE)으로 측정된 단량체의 분자량이 30 내지 37 kDa, 예컨대 30 내지 35 kDa인 것일 수 있다. 상기 CDPE의 최적 온도는 40 내지 65, 구체적으로 50 내지 65일 수 있다. 상기 최적 온도는, 예컨대， pH 7.0, lmM Co ²⁺ 존재하에서 5분간 반웅 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 단백질의 최적 pH는 pH 6 내지 9, pH 7 내지 9， pH 7 내지 8.5, 또는 pH 7 내지 8일 수 있다. 상기 최적 pH는 예컨대， 60, lmM Co ²⁺ 존재하에서 5분간 반웅 진행의 결과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 엔시퍼 아드해렌스 (E ^r ai/ aere/w)에서 유래한 사이코스 에피머화 효소는 (이하 , EDPE) 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질이 다. 예를 들어, 상기 EDPE는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다.

상기 EDPE를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 핵산서열, 예를 들어, 서열번호 7의 염기 서열을 포함할 수 있다

상기 트로포네마 프리미샤 ( Q emapn ^' m to)에서 유래한 사이코스 에피머 화 효소는 (이하 , TDPE) 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질 이다. 예를 들어, 상기 TDPE는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부 터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다.

상기 TDPE를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 서열번 호 8의 염기서열 및 /또는 서열번호 9의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 사이코스 에피머화 효소는 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 유지 되는 한, 서열번호 1， 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 중 일부가 치환, 삽 입 및 /또는 결실된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번 호 1 , 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상， 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 클로 스트리디움 ^ ^스 Chstridiun scidem), 엔시퍼 아드해렌스 (E¾«/er ί /zaerera) 또는 트로포네마 프리미샤 (7>e o«ema/?n> Y/a)에서 얻어진 사이코스 에피머화 효소의 암 호화 뉴클레오타이드 서열이거나, 대장균 또는 코리네박테리움속 균주에서 발현에 최적화할 수 있도록 변형된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

예를 들면, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서 열은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이 드 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오 타이드 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

구체적으로, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 5 내지 서열번호 9로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 9로 이루어 지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레 오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 알로오스 이성질화 효소는 尸 e e/7/ «e//fl Wfl ra EX-Hl에서 유래된 것 일 수 있으며， 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 알로오스 이성질화 효소일 수 있다.

상기 알로오스 이성질화 효소는 사이코스를 알로오스로 이성질화 활성이 유지되는 한, 서열번호 4의 아미노산 중 일부가 치환， 삽입 및 /또는 결실된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열 과 70% 이상, 80% 이상， 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아 미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 P ^^½ e//a man ¾z EX-Hl에서 얻어진 알로오스 이성질화 효소의 암호화 뉴클레 오타이드 서열이거나, 대장균 또는 코리네박테리움속 균주에서 발현에 최적화할 수 있도록 변형된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

예를 들어, 상기 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서 열은, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이 드 서열일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 뉴클레오타이 드일 수 있다. 또는 상기 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동 일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기의 실질적인 동일성은 각각의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 뉴 클레오타이드 서열을 최대한 대웅되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임 의의 다른 뉴클레오타이드 서열이 각각의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재 조합 기술 등을 이용하여 상기 뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 그 이상의 염 기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일 한 활성을 갖는 효소 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조할 수 있 음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율 (%)로 계산하여 수행 될 수 있다.

본 발명에 따른 구체적인 효소의 아미노산 서열을 표 1에， 이를 암호화하 는 뉴클레오타이드 서열을 하기 표 2 내지 3에 예시적으로 기재한다.

【표 11

서열목록 (5·->3') 9

[Z Έ]

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6S0M0/9T0ZaM/X3d 6εεΐΐΐ/.ΐοζ OAV 서열 o ᄋ 서열목록 (5'->3')

번호

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ACGTTTCTGACTCTCAGCTGTTCGACCTGCGTGACTACGCGAAA

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GTGAAAACCTGTCTTCTTCTGACAACCGTGTTGTTAAAAACGCG

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ACATCCGTCTGCTGGGTGGTGGTCTGTACTCTTACTGGCCGGTT

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GCGGGTGACAAACTGGGTCACTTCCACATCGGTGAACAGAACC

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TCACGCGCTGCGTGACATCCGTTACAACGGTACCGTTGTTATGG

AACCGTTCGTTATGCCGGGTGGTACCATCGGTCAGGACATCAA

AGTTTGGCGTAACCTGCTGCCGGAAACCTCTGAAACCATCCTG

GACCGTGACGCGAAAGGTGCGCTGGAATTCGTTAAACACGTTT

TCGGTTCTACCTCTGTTCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCAC

TGA

10 RPI ATGAAAATCTCTATCGGTTCTGACCACGCGGGTTTCGAACTGAA

AGAAATCATCAAAGACCACCTGCAGAAAAAAGGTTACGAAGTT

GTTGACAAAGGTACCTACTCTAAAGAATCTGTTGACTACCCGCT

GTTCGGTGAAGCGGTTGGTCGTTCTGTTTCTGAAGGTGAAACCG

ACCGTGGTATCGTTATCTGCGGTACCGGTATCGGTATCTCTATC

TCTGCGAACAAAATCAAAGGTGTTCGTGCGGCGCTGTGCACCA

ACGAATACATGGCGCGTATGTCTCGTAAACACAACGACGCGAA

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TGTCTATCGTTGACACCTTCCTGTCTACCGACTTCGAAGGTGGT

CGTCACGAACGTCGTGTTCACCTGATCCAGAACATCGAAAAAA

TCAACCTGtAA 상기 사이코스 에피머화 효소 및 알로오스 이성질화 효소는 링커 템타이 드로 연결된 하나의 융합 단백질인 것일 수 있다.

상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한， 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 링커 펩타이드는 1 내지 6개의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 링커 펩타이드가 상기 아미노산 개수 마만이거나 초과이면 두 단백질 을 연결할 때 서로의 단백질의 구조에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 상기 TI

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SEGETDRGIVICGTGIGISISANKIKGVilAALCTNEYMA MSRKHNDANVL

ALGSRVLGIDLALSIVDTFLSTDFEGGRHERRVHLIQNIEKINL 상기 재조합 백터는 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 클로닝을 위한 백 터 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있다 (Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:41 1 -421). 상기 재조합 백터는 유전자 재조합에 이용되어온 백터라면 모두 사용이 무방하며, 예컨대， 플라스미드 발현백터, 바이러스 발현백터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이 들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 백터 등으로 이루어진 군에서 선택 된 것일 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어， 상기 재조합 백터는 pACYC, RSF, pET, pKK223-3, pTrc99a, pKD, pXMJ19, pCES208 백터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것으로부터 제작된 것일 수 있으며, 바람직하게는 pACYC 또는 RSF 일 수 있다.

상기 재조합 백터란 작동 가능하도록 연결된 목적 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 목적 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및 전사 종결인자 등으로 이루어지는 하나 이상의 전사 조절 요소와 작 동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다.

상기 전사 종결인자는 rrnB, rrnBᅳ Tl , rrnB—T2, T7 terminator 등 일수 있으며, 바람직하게는 pET2 la vector로부터 PCR된 T7 전사 종결인자일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 백터로 형질전환된 재조합 균주에 관한 것이다.

. 본 발명에 따른 구체적인 재조합 백터의 개열지도를 도 1 내지 도 4에 예 시적으로 기재하였다.

상기 재조합 백터로 숙주 세포를 형질 전환시키는 방법은 당업계에 공지 된 모든 형질전환 방법 특별한 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예컨대， 세 균 원형질체의 융합， 전기 천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러 스 백터를 사용한 감염 등 선택된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환된 재조합 균주는 높은 안정성을 가지며, 도입된 사이코스 에피머화 효소 및 알로오스 이성질화 효소를 과발현할 수 있으며 , 따라 서 장기간 안정적으로 높은 알로오스 전환능을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 형 질전환된 재조합 균주는 알로오스 제조에 유용하게 적용될 수 있으며 , 알로오스 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양은 적당한 배지에서 당업계에서 알려진 다양한 배양 방법으로 수행될 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가 식 배양이 포함된다. 상기 유가식 배양에는 주입 배치 및 반복 주입 배치 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따라사용될 수 있는 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소 공 급원， 질소 공급원， 무기염, 비타민 및 (또는) 미량 원소를 포함한다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당류이다. 질소 공급원은 일반적으 로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공 급원의 예로는 암모니아 기체 또는 암모늄염, 예컨대 황산암모늄， 염화암모늄， 인 산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 니트레이트, 우레아, 아미노산, 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액， 대두 분말, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등이 있다. 질소 공급 ¾은 단독으로 또는 흔합물로 사용할 수 있다.

배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물은 칼슘, 마그네슴, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염 또는 황산염을 포함한 다. 인 공급원으로서, 인산， 인산 2수소 칼륨 또는 인산수소 2칼륨， 또는 대웅하는 나트륨 -함유 염을 사용할 수 있다. 용액 중 금속 이온을 유지시키기 위해 배지에 킬레이팅제를 첨가할 수 있다. 배지의 모든 성분은 가열 (1.5 bar 및 121에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균시킨다. 이 성분들은 함께, 또는 필요에 따라.개별적 으로 멸균시킬 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 시작 시에 존재할 수 있거나, 임의로는 연속 또는 회분식으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 균주의 ^체 및 /또는 재조합 균주 의 배양물을 포함하는 알로오스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 과당 -함유 원료로부터 알로오스를 제조하는 것일 수 있다. 또한， 상기 배양물은 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로， 상 기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 무세포 (cell-free) 형태일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 알로오스의 제조에 사용되는 재조합 균주는 상기 균주의 균체 및 /또는 상기 균주의 배양물을 의미하는 것으로 사용된다.

상기 알로오스 생산용 조성물에 있어서, 상기 알로오스는 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물의 형태인 것일 수 있으며, 예를 들어， 과당, 사 이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량 ⁰ / ₀ 기준으로， 과당 60 내지 63 중량 ⁰ /。, 사이코스 24 내지 26 중량 % 및 알로오스 12 내지 15 중량 ⁰ /。를 포함하는 흔합당 조성물의 형태인 것일 수 있다.

상기 조성물은 과당으로부터 12% 이상, 예를 들어, 12 내지 15%, 12내지 14%또는 12 내지 13%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것일 수 있다. 과당으로 부터 사이코스를 생산한 후, 사이코스로부터 알로오스를 생산하는 2단계의 공정을 통하는 경우에는 약 9% 정도의 전환율로 알로오스가 생산되며, 하나의 공정을 통 해 생산하지 못하기 때문에 시간이 오래 걸리고 생산 비용이 증가하는 문제점이 생긴다. 그러나 상기 조성물을 이용하여 알로오스를 생산하는 경우에는, 1단계의 공정을 통해 알로오스를 생산할 수 있어 시간이 단축되며 생산 비용을 절감할 수 있으며, 특히 2단계의 공정을 통해 생산하는 경우보다 30% 이상 향상된 수율로 알로오스를 생산할 수 있다.

상기 조성물은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이 온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온, 및 칼슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 포함하지 않는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 균주의 균체 및 /또는 상기 재조합 균주의 배양물을 포함하는 알로오스 생산용 조성물을 과당 -함유 원료와 접촉하여 알로오스를 생산하는 방법을 제공한다ᅳ

상기 알로오스 생산 방법은 상기 재조합 균주를 과당 -함유 원료와 반웅시 키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 재조합 균주를 과당과 반웅시키는 단 계는， 상기 재조합 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 재조합 균주를 과당과 반웅시키는 단계는, 상기 재조합 균주 (균체 및 /또는 균주의 배양물)를 과당과 접촉시키는 단계, 예를 들어, 상기 재조합 균주를 과당과 흔합하는 단계 또는 상기 재조합균주가 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 재 조합 균주를 과당과 반웅시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하고, 사이코스를 알 로오스로 전환하여 과당으로부터 알로오스를 생산할 수 있다.

상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 상기 알로오스는 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물의 형태인 것일 수 있으며, 예를 들어, 과당， 사이 코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량 ⁰ / ₀ 기준으로, 과당 60 내지 63 중 량 %, 사이코스 24 내지 26 중량 ⁰ / ₀ 및 알로오스 12 내지 15 중량 ⁰ / ₀ 를 포함하는 흔 합당 조성물의 형태인 것일 수 있다.

또한, 상기 방법은 과당으로부터 12% 이상, 예를 들어， 12 내지 15%, 12 내 지 14%또는 12 내지 13%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것일 수 있다.

또한, 상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하 여， 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반웅물 기준으로 10 내지 80%(w/v), 20 내지 30%(w/v), 40 내지 80%(w/v), 10 내지 75%(w/v), 20 내지 75%(w/v), 30 내지 75%(w/v), 예컨대 , 40 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮 으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로， 과 당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완층용액 또는 물 (예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 알로오스 생산방법에 있어서， 상기 반응은 pH 6 내지 9， 예를 들어, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8 또는 pH 8 내지 9의 조건하에서 수행될 수 있다. 또한， 상기 반웅은 30 이상, 예컨대 40 이상의 온도 조건하에서 수행될 수 있다. 은도가 80 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반웅은 30 내지 80， 예를 들어, 35 내지 80, 40 내지 80, 35 내지 75, 40 내지 75, 35 내지 70 또 는 40 내지 70의 조건하에서 수행될 수 있다.

또한, 상기 생산방법에 있어서, 상기 반웅 시간이 길수록 알로오스 전환률 이 높아진다. 예를 들어, 상기 반웅 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반웅시간이 48 시간을 넘어가면 알로오스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로， 반 응시간은 48시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반웅 시간은 1 내지 48시 간, 2 내지 48시간, 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시 간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지

36시간, 3 내지 24시간, 3 내지 12시간， 또는 3 내지 6시간 정도로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조건은 과당에서 알로오스로의 전환 효율이 최 대화되는 조건으로서 선정된 것이다.

또한, 상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 사용되는 재조합 균주의 균체 농도는 전체 반웅물 기준으로 5 mg(dcw _: 건조세포중량 )/ml 이상， 예컨대 , 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70

mg(dcw)/ml, 40 내지 60 mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55 mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 알로오스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 알로오스 전환 반웅의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 싱 -기 범위로 하는 것이 좋다.

또한, 상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 상기 방법은 구리 이온, 망간 이 온, 칼슴 이온, 마그네슘 이온, 아연 이은, 니켈 이온, 코발트 이온， 철 이온， 알루 미늄 이온, 및 칼슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 첨 가하지 않는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 사이코스 에피머화 효소 (psicose epimemse) 및 알 로오스 이성질화 효소가 링커 펩타이드로 연결된 융합 단백질을 포함하는 과당으 一로부터—알로오스ᅳ생산용 효소를 제공한다.

상기 효소는 과당으로부터 12% 이상, 예를 들어， 12 내지 15%, 12 내지 14% 또는 12 내지 13%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것을 특징으로 하는 것이다. 또한, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군 에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 알로오스 이성 질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열올 포함하는 것일 수 있다.

상기 링커 펩타이드는 1 내지 6개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 상기 링커 펩타이드가 상기 아미노산 개수 미만이거나 초과이면 두 단백질을 연 결할 때 서로의 단백질의 구조에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 상기 개수 가 적당하다.

상기 하나의 융합된 단백질은 서열번호 23 또는 25의 아미노산 서열을 포 함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 생물학적 방법으로 생산되며, 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량 ⁰ /。 기준으로, 과당 60 내지 63 중량 ⁰ / ₀ ， 사이코스 24 내지 26 중량 % 및 알로오스 12 내지 15 중량 ⁰ / ₀ 를 포함하는 흔합당 조성물을 제공한다. [발명의 효과】

본 발명은 과당으로부터 알로오스를 생산하는 재조합 균주， 상기 재조합 균주를 포함하는 과당 -함유 원료부터 알로오스를 생산하는 알로오스 생산용 조성 물， 및 이를 이용한 알로오스의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 균주 및 /또는 이를 이용한 알로오스의 제조방법을 이용하여, 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타 내며, 높은 수율로 알로오스를 생산할 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 pACYCDuet-1 백터에 CDPE 또는 TDPE와 RPI 유전자를 도입한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 pACYCDuet-1 백터에 EDPE와 RPI 유 전자를 도입한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 RSFDuet-Ι 백터에 CDPE 또는 TDPE 와 RPI 유전자를 도입한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 RSFDuet-1 백터에 EDPE와 RPI 유전 자를 도입한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— CDPE_RPI 균주의 온도에 따른 세포 반웅 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF TDPE— RPI 균주의 온도에 따른 세포 반웅 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— EDPE_RPI 균주의 은도에 따른 세포 반응 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSFᅳ CDPE_RPI 균주의 pH에 따른 세 포 반웅 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— TDPE_RPI 균주의 pH에 따른 세 포 반웅 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다ᅳ

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— EDPE_RPI 균주의 pH에 따른 세포 반웅 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 1 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_CDPE_RPI 균주에서의 효소의 금속 이온 요구성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— TDPEᅳ RPI 균주에서의 효소의 금속 이온 요구성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_EDPE— RPI 균주에서의 효소의 금속 이온 요구성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— CDPE— RPI 균주의 세포 반웅 열 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— TDPE_RPI 균주의 세포 반웅 열 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

. 도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_EDPE— RPI 균주의 세포 반웅 열 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 15% 과당으로부터 알로오스 생산 결 과를 나타낸 그래프이다.

도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 50% 과당으로부터 알로오스 생산 결 과를 나타낸 그래프이다.

도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 pACYCDuet-1 백터에 CDPE 또는 TDPE와 RPI 유전자가 융합된 유전자를 도입한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.

도 20은 본 발명와 일 실시예에 따른 융합 효소의 발현을 SDS-PAGE를 통 해서 확인한 사진이다.

도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 효소의 알로오스 전환율을 측 정한 결과를 나타낸 그래프이다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실 시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 듀엣 플라스미드의 제조 및 형질전환 유전자 재조합을 통해， 사이코스에서 알로오스를 생산하는 RPI 효소와 함 께 하나의 균주에서, 과당에서 사이코스를 생산하는 효소 CDPEJEDPE, 또는 TDPE 각각을 발현시키기 위한 플라스미드를 제작하였다.

구체적으로, RPr암호화 서열을 도입한 백터를 제조하고자, RPI 단백질인 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 1 1)를 Ndel과 XhoI(NEB)올 사용하여 발현백터인 pACYC(NOVAGEN) 또는

RSF(NOVAGEN)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 백터를 제조하였다. 그 다음, 사이코스 에피머라제 암호화 서열을 도입한 백터를 제조하고자, 먼저 사이코스 에피머라제 암호화 서열를 제조하였다.

구체적으로, 크로스트리디움 신댄스 (C/(w/r/i¾ww ^/"i /«)로부터 유래된 서 열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (Gene bank:

EDS0641 1.1), 엔시퍼 아드해렌스 (Eraz/er a /zaem )로부터 유래된 서열번호 2의 아 미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 트로포네마 프리미샤 (Jreponema pr/ a)에서 유래한 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이 드로서 (Gene bank: WP_010256447)， 발현 균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 원 래의 암호화 폴리뉴클레오타이드의 염기서열 (각각 서열번호 5, 7 및 8) 및 이에 변 형이 가해진 폴리뉴클레오타이드 (각각 서열번호 6 및 9)를 바이오니아 (Bioneer.Co, Korea)에 의뢰하여 합성하였다.

그 다음， 제한효소 Ndel과 XhoI(NEB)을 사용하여， 상기 합성된 각각의 사 이코스 에피머라제 암호화 폴리뉴클레오타이드를 RPI 유전자가 삽입된 발현백터 인 pACYC(NOVAGEN) 또는 RSF(NOVAGEN)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 RPI가 포함된 제조된 재조합 백터에 TDPE, CDPE, EDPE를 각각 삽입하여 한 백터 에 두 개의 유전자 (RPI 효소 유전자 및 사이코스 에피머라제 효소 유전자)가 삽 입 되도록 하였다. 상기 제한 효소는 하기 표 6에 나타내었다.

【표 6】

서열번 Primer Name Sequence (5'→ 3') 제한 효소 호

1 1 CDPE_F_BamHI(Duet) CGATCGGATCCGATGAAACACGGTAT BamHI

CTACTAC

12 CDPE_R_HindIII(Duet) GCGACCAAGCTTTTATTTCCATTCCA Hindlll

GCATG

13 EDPE— F BamHI(Duet) CGATCGGATCCGATGCAGGGTTTTGG BamHI CGTC

14 EDPE_R_NotI(Duet) GCGACCGCGGCCGCTTAGATCAATCC Notl

GTATTGCCG

15 TDPE F— BamHI(Duet) CGATCGGATCCGATGCAGTACGGTAT BamHI

CTAC

16 TDPE_R_HindIII(Duet) GCGACCAAGCTTTTACAGAACAGAG Hindlll

GTAGAACC

17 RPI_F_NdeI(Duet) GCGTTGCATATGAAAATCTCTATCGG Ndel

TTCTG

18 RPI_R_XhoI(Duet) GGCAGGCTCGAGTTACAGGTTGATTT Xhol

TTTCGATG

19 CDPE_F_NcoI(Duet) CGCAAGCCATGGGCATGAAACACGG Ncol

TATCTACTAC

20 EDPE_F_NcoI(Duet) CGCAAGCCATGGGCATGCAGGGTTTT Ncol

GGCGTC

21 TDPE_F_NcoI(Duet) CGCAAGCCATGGGCATGCAGTACGGT Ncol

ATCTAC 그 다음, heat shock방법 (Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 상기 제작한 각각의 재조합 백터로 형질 전환하여 재조합 대장균 균주를 제조하였다.

상기 제조된 재조합 대장균 균주를 5ml LB-ampicilline 배지 (Difco)에 접종한 ,후 600nm에서의 흡광도 (OD)가 1.5에 도달할 때까지 37 ^° C , 200rpm에서 진탕 배양하 고， 이를 다시 500ml LB-ampicilline 배지에 접종한 후 37 ^' C의 진탕 배양기에서 종 배양하였다. 그 다음, 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 ImM의

IPTG(isopropyl-l-thio-p-D-galactopyranoside)를 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도 하였다. 상기 과발현 유도 시점부터 배양조건을 16 ^° C 및 150rpm으로 전환하여 16 시간 동안 유지하였다. 실시예 2. 알로오스 생산 균주의 반응조건 확립

2-1. 온도에 따른 세포 반웅 활성 분석

알로오스 생산 최적 온도를 확인하기 위하여 , 10%(v/v) 과당 lml, 50mM PIPES buffer (pH 7.0) 용액에, 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도를

5mg/ml_DCW 범위에서, 60 ^° C 하에서 2시간 동안 반웅시키고, 기질 반웅 정지를 위 해 5분간 가열하여 반웅을 종료 (정지)시키고 난 후에， 최대 활성을 나타내는 온도 를 측정하였다. 그 다음， 두 시간 동안의 과당으로부터의 알로오스 전환율을 측정 하여, 최적 온도에서의 알로오스 전환율올 100%로 했을 때 각각의 온도에서의 알 로오스 전환율의 상대적인 값으로 나타내었다 (도면의 Y축 값인 RA(%)). 그 결과 를 하기 표 7 및 도 5 내지 7에 나타내었다.

[계산식]

전환율 (%) = (생산량 I 넣어준 기질 양) * 100

넣어준 기질양 = 잔여 과당 + 사이코스 잔여량 + 알로오스 생산량

【표 7】

상기 표 7 및 도 5 내지 7에 나타난 바와 같이, RSF— TDPE_RPI는 55 ^° C에서 (도 5)최적의 활성을 나타냄을， RSF_CDPE_RPI (도 6)와 RSF_EDPE_RPI (도 7)는 50 ^° C 에서 최적의 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

2-2. pH에 따른 세포 반웅 활성 분석

pH에 따른 세포 반웅 활성을 분석하기 위하여 , 실시예 1에서 분리된 균주 의 균체농도 5mg/ml_DCW 및 과당농도 10%(v/v)의 완충용액 50 mM sodium citrate(pH 4 내지 5), 50 mM sodium phosphate(pH 6 내지 8)， 50 mM glycine NaOH (pH 9 내지 10)을 각각 사용하여 각 pH 조건에서 50 ^° C에서 2시간 반웅시키고 기질 반웅 정지를 위해 5분간 가열하여 반웅을 종료 (정지)시켜, 최대 활성을 나타내는 pH를 측정하였다. 그 다음, 두 시간 동안의 과당으로부터의 알로오스 전환율을 측정하 여, 최적 pH에서의 알로오스 전환율을 100%로 했을 때 각각의 pH에서의 알로오 스 전환율의 상대적인 값으로 나타내었다 (도면의 Y축 값인 RA(%)). 그 결과를 하기 표 8 및 도 8 내지 10에 나타내었다.

[계산식]

전환율 (%) = (생산량 I 넣어준 기질 양) * 100 넣어준 기질양 잔여량 + 알로오스 생산량

【표 8】

상기 표 8 및 도 8 내지 10에 나타난 바와 같이, RSF— TDPE_RPI는 pH7.0에 서최적의 활성을 나타내었으며 (도 8), RSF_CDPE— RPI (도 9)와 RSF_EDPE— RPI (도 10)는 pH8.0에서 최적의 활성을 나타내었다.

2-3. 효소의 금속 이온 요구성 분석

금속이온 요구성을 확인하기 위하여 , 10%(v/v) 과당을 기질로 사용하고, 상 기 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도 5mg/ml— DCW, 및 50 ^° C에서, 50mM PIPES 완충용액 (pH7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행)에 녹인 ImM 금속 이온 (CuCl ₂ , MnCl ₂ , FeS0 ₄ , ZnS0 ₄ , NiS0 ₄ , 또는 CoCl ₂ ) 용액을 각각 사용하여 2시간 동안 반웅시키고， 기질 반웅 정지를 위해 5분간 가열하여 반웅을 종료 (정지)시키 고 난 후에， 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 알로오스 생산량을 측정하였다. 대조군 (Non)으로는 금속이온을 처리하지 않은 것을 사용하 였다. ¹

그 결과를 하기 표 9 및 도 1 1 내지 13에 나타내었다.

【표 9】

상기 표 9 및 도 11 내지 13에 나타난 바와 같이, CDPE_RPI의 경우, Fe 이 온에 의해 약간 활성이 증가하였지만 (도 11), 세 효소 모두 크게 금속 이온에 의 존하는 결과를 나타내지 않음을 확인하였다 (도 11 내지 13).

즉, 기존의 CDPE, TDPE, EDPE를 단독으로 발현했을 경우에는 금속이 없으 면 활성, 전환율， 열 안전성 등이 현저히 저하되나， 두 효소를 동시에 하나의 백터 에서 발현했을 때는, 기존의 각각의 효소와 달리 금속 이온이 없이도 전환반응이 일어남을 확인하였다.

2-4. 세포 반웅의 열 안정성 분석

세포 반웅의 열 안정성을 확인하기 위해, 40 내지 50°C에서 24시간 동안 효소에 열을 가한 후, 열 층격이 가해진 균주를 반웅에 사용하였다.

구체적으로, 10%(v/v) 과당을 기질로 사용하고, 상기 열 층격이 가해진 균 주의 균체 농도 5mg/ml_DCW, 및 50에서, 50mM PIPES 완층용액 (pH7.0 또는 8.0， 각 효소의 최적 pH에서 수행)을 각각 사용하여 2시간 동안 반웅시키고, 기질 반 웅 정지를 위해 5분간 가열하여 반응을 종료 (정지)시켰다. 하기의 계산식을 통해 알로오스 전환율을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 10(40°C) 및 표 11 (50°C)에 나 타내었으며, 도 14 내지 16에 전환율을 로그 값으로 변환시켜 나타내었다.

[계산식]

전환율 (%) = (생산량 I 넣어준 기질 양) * 100

넣어준 기질양 = 잔여 과당 + 사이코스 잔여량 + 알로오스 생산량 【표 10】

40 ^° C 전환율 (%)

시간 (h) RSF CDPE RPI RSF TDPE— RPI RSF EDPE RPI

(his tag X) (his tag X) (his tag X)

0 5.4 5.4 5.7

2 5.8 6.4 6.0

[표 1 1】

상기 표 10 내지 1 1 및 도 14 내지 16에 나타난 바와 같이, 40 ^° C에서는 20 시간 이상 어느 정도 열에 효소가 견디는 양상을보였지만, ^' 각 은도에서의 반감기 (Half-life)를 비교해 볼 때， 50 ^° C에서는 3시간 정도 ¾ 층격이 가해졌올 때 활성이 반으로 줄어 들었음을 확인하였다.

실시예 3. 알로오스 생산

3-1. 15% (v/v) 과당으로부터 알로오스 생산 반웅

과당으로부터 알로오스 생산을 확인하기 위하여, 기질로 15%(v/v) 과당 1 ml 와 50mM PIPES buffer (pH 7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행) 용액에， 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도를 5mg/ml_DCW 범위에서 , 50 ^° C온도에서 0 내지 20시간 동안 반웅시키면서, 시간별 샘플링을 하여 하기의 계산식을 통해 알 로오스 전환율을 측정하였다. 그 결과를 표 12 및 도 17에 나타내었다.

[계산식]

전환율 (%) = (생산량 I 넣어준 기질 양) * 100

넣어준 기질양 = 잔여 과당 +사이코스 잔여량 + 알로오스 생산량 【표 12】 RSF TDPE PI (Histag x) 12.0 25.3

RSF_EDPE_RPI (Histag x) 12.6 25.3

RSF_CDPE_RPI (Histag 0) 13.0 24.8

RSF_TDPE_RPI (Histag 0) 1 1.5 25.3

RSF— EDPE RPI (Histag 0) 12.9 24.9

ACYC_GDPE_RP1 (Histag x) 1 1.8 25.9

ACYC— TDPE_RPI (Histag x) 12.8 25.7

ACYC— TDPE RPI (Histag x) 13.6 25.9

ACYC_CDPE_RPI (Histag O) 13.4 24.7

ACYC_TDPE_RPI (Histag 0) 13.1 25.9

ACYC_EDPE_RPI (Histag 0) 12.8 26.0 상기 표 12에서 확인할 수 있듯이 , 12개의 효소 반웅 전환 분석 결과, 효소 마다 약간의 차이는 있지만 평균적으로 과당으로부터 약 13% 정도의 전환율로 알로오스를 생산함을 확인할 수 있었다.

3-2. 50% (v/v) 과당으로부터 알로오스 생산 반응

과당으로부터 알로오스 생산을 확인하기 위하여, 기질로 50%(v/v) 과당 lml 와 50mM PIPES buffer (pH 7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행) 용액에, 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도를 5mg/ml一 DCW 범위에서, 50 하에서 0 내 지 20시간 동안 반웅시키면서, 시간별 샘플링을 하여 알로오스 전환율을 측정하였 다. 그 결과를 표 13 및 도 18에 나타내었다.

【표 13】

상기 표 13에서 확인할 수 있듯이， 12개의 효소 반웅 전환 분석 결과, 효소 마다 약간의 차이는 있지만 평균적으로 과당으로부터 약 13% 정도의 전환율로 알로오스를 생산함을 확인할 수 있었다. 실시예 4. 융합 효소 플라스미드의 제조 및 형질전환

엔시퍼 아드해렌스 (Erai/er acZ/werera)로부터 유래된 사이코스 에피머화 효소 의 암호화 유전자를, 대장균에 최적화하여 변형한 형태의 폴리뉴클리오티드 (서열 번호 6)로 합성하고 EDPE라 명명하였다. 대장균에 최적화된 폴리뉴클리오티드， Persephone!!a marina EX-lil ^ gDNA에서 확보한 PRI의 암호화 유전자 (서열번호 10)을 PCR을 통해 각각의 주형으로 확보하였고, 이를 오버랩 PCR 법으로 하나의 주형으로 연결하였다 (서열번호 22). ^'

상기 하나의 주형으로 연결된 폴리뉴클레오타이드를 제한효소 Ndel과 Xh 을 사용하여 발현백터인 pET21 a의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 백터를 제조하였다ᅳ 상기 제조된 재조합 백터의 개열지도를 도 19에 ^' 개시하였다. 그 다음, heat shock방법 (Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대 장균 BL21 (DE3)(invitrogen)를 상기 제작한 재조합 백터로 형질전환 하여 재조합 균주를 제조하였다.

상기 제조된 재조합 균주를 5ml LB-ampicilline 배지 (Difco)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도 (OD)가 1.5에 도달할 때까지 37 °C , 200rpm에서 진탕 배양하고， 이를 다시 500ml LB-ampicilline 배지에 접종한 후 37 °C의 진탕 배양기에서 종 배 양하였다. 이 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 ImM의 IPTG(isopropyl-l - thio-p-D-galactopyranoside) - 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. 상기 과 발현 유도 시점부터 배양조건을 16 °C 및 150rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지 하였다. 이후 8000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체만올 회수하고, 0.85% (w/v) NaCl로 2회 세척한 다음 알로오스 생산 및 효소 정제에 사용하였다. 실시예 5. 융합 효소를 이용한 알로오스 생산 반웅 (효소 반웅)

5-1: 융합 효소의 정제 ^" 상기 실시예 4에서 회수된 균체를 lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.0 300mM NaCl)에 흔탁시킨 후 음파진동기 (Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4 °C 에서 20분 동안 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 13,000rpm으로 4 ^° C에서 20분 동안 원 심분리하여 상등액을 회수하여 미리 lysis buffer로 평형 시킨 Ni-NTA컬럼 (Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 적용시킨 다음 50mM Tris-HCl 300mM NaCl, pH 7.0에 20mM imidazd과 250mM imidaz 이 함유된 완층용액을 순차적으로 홀려주었다. 용출된 목적 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액 (50mM Tris-HCl, pH7.0)으로 전환하여 다음 실험에 사용하였다. 상기 방법으로 부분 정제된 효소를 얻을 수 있었고, SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기가 약 47 kDa임을 확인하였다 (도 20).

5-2: 과당으로 부터 알로오스 생산

과당으로부터 알로오스 생산을 확인하기 위하여， 기질로 50%(v/v) 과당 1 ml와 50mM PIPES buffer (pH 7.0 또는 8.0， 각 효소의 최적 pH에서 수행) 용액에, 실시예 6에서 정제된 효소의 농도를 LOmg/ml 범위에서, 50 ^° C에서 24시간동안 반 응시키면서, 시간별 샘플링을 하여 알로오스 전환율을 측정하였다. 그 결과를 표 14 및 도 21에 나타내었다.

【표 14】

상기 표 14 및 도 20에서 확인할 수 있듯이, 두 효소 반옹 분석 결과, 24시 간 동안 EDPE_RPI— FUSION은 약 13.4%, CDPE_RPI_FUSION은 약 13.1%의 전환율 로 알로오스를 생산하는 것을 확인하였다. 즉, 융합 효소의 경우 발현율은 감소하 였지만, 두 효소를 각각 발현시켜 반웅할 때와 전환율에 있어서는 유사한 평형 값 인 13%에 도달함을 확인하였다.