本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种能 够产生多种抗肿瘤化合物的新 的链霉菌 Streptomyces sp. ) SCSIO 03032 , 以及该菌生产的抗肿瘤化合物 Spiro-Indimycin A-D及其制备方法和应用。 背景技术：

近年来，发现新型海洋放线菌资源， 并从中筛选新型的活性次生代谢产物成 为国际上海洋微生物研究的重要方向。 从海洋放线菌中寻找结构新颖、 高效、低 毒的代谢产物逐渐成为药物寻找的新源泉。 发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种新的链霉菌 treptomyces sp. ) SCSIO 03032, 该菌于 2011年 7月 18 日保藏于中国典型培养物保藏中心 （CCTCC), 地址： 中国武汉市武汉大学， 其保藏编号为 CCTCC NO: M 2011258ο

本发明的新的链霉菌 treptomyces sp. ) SCSIO 03032 是从印度洋（E 87°59.7 '， N 9°59.3')水深 3412米的海底沉积物中分离获得的。

1、 形态学特征和生理生化分析

链霉菌 i Streptomyces ^. SCSIO 03032属于革兰氏阳性， 好氧放线菌， 基 丝微黄分枝， 气丝灰白色分支并分化成卷曲的孢子链； 孢子椭球状 （图 2)， 长 0.4-0.7μηι, 表面光滑。在 PDA培养基上长势较弱， 在 ISP5上生长有可溶性色素 产生。 接触酶、 脲酶、 牛奶凝固和胴化反应阳性， 明胶液化、 黑色素产生和氧化 酶反应阴性。 能水解淀粉、 纤维素、 吐温 20， 40， 80； H ₂ S 产生和硝酸盐还原 反应阴性； 可以利用 D-阿拉伯糖， D-纤维二糖， 果糖， 肌醇， 丙酮酸钠， D-棉 子糖， L-鼠李糖， D-甘露醇， D-葡萄糖， D-山梨糖和木糖醇， 为唯一碳源和能源 生长。而不能利用 D-半乳糖， D-乳糖， D-甘露糖， D-核糖， D-海藻糖和 D-木糖； 对甲氧嘧啶和林可霉素敏感。 pH、 盐浓度和温度的耐受范围分别为 pH 6.0-9.0， 0-9% 和 15-40 °C。 细胞壁含有 L-DAP。 优势醌为 MK-9(H6)和 MK-11； 主要脂 肪酸为 i-C _15:0 (8%), i-C _16:0 (24%), i-C _16:1 G (14%), ai-C _17:0 (15%)和 ai-C _17:1 A(12 G+C摩尔含量为 71.6 (±0.5) %。

2、 分子生物学鉴定

常规 PCR扩增菌株 SCSIO 03032的 16S rDNA并测序， 其序列如 SEQ ID NO. l所示， 而后提交到 GenBank中， 对 16S rDNA核苷酸序列进行 BLAST分 析， 结果显示， 该菌株与& /^ )^^ GW41-1564 ^T 的相似度为 97%， 重新构建该属系统发育树显示菌株 SCSIO 03032聚在该类群，说明该菌株 SCSIO 03032为链霉菌属。 如图 1所示， 通过邻接法清晰地揭示了该菌株与一组链霉菌 属物种的系统进化关系， 表明该菌属于链霉菌属的一种。

根据以上形态学、 生理学、 化学等分析， 其与已知最接近的菌株与 ₁ ¾/¾/^ >^^ ^^'^ 0^¥41-1564 ¹ 有较大的差异， 且基因组杂交显示其杂交值为 23% , 远低于种内差异标准的 70% ( Stackebrandt, E. & Ebers, J. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards. Microbiol Today.(2006).33, 152-155.)；因此，综合分析多项分类数据，鉴定 此菌株为链霉菌属（ reptom^ ) 的一个新种， 命名为： 链霉菌 ( Streptomyces spJ SCSIO 03032, 该菌于 2011年 7月 18日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC ) , 地址： 中国武汉市武汉大 学， 其保藏编号为 CCTCC NO:

本发明的链霉菌 Streptomyces spj SCSIO 03032能够产生 4种具有新颖结 构的抗肿瘤化合物 Spiro-Indimycin A-D。

因此本发明的第二个目的是提供化合物 Spiro-Indimycin A-D, 其结构式如式 ( I ) 所示：

SPiro-indimycin A R^N, R ₂ =H, R ₃ =COOCH ₃ , X coupled with Z

Spiro-indimycin B R-|=NCH ₃ , R ₂ =H ₂ , R ₃ =H, X coupled with Y

Spiro-indimycin C R-|=NH, R ₂ =H ₂ , R ₃ =H, X coupled with Y

Spiro-indimycin D RfNCI^, R ₂ =H ₂ , R ₃ =COOCH ₃ , X coupled with Y 式 （ I )。

本发明人通过实验发现，化合物 Spiro-Indimycin A-D对人癌细胞包括乳腺癌 MCF-7, 人胰腺癌 1990， 人肝癌 HepG2， 人宫颈癌 Hale, 人黑色素瘤 B16， 人 肺癌 H460和人急性淋巴细胞白血病 T淋巴细胞 CCRF-CEM有选择性细胞毒活 性， 其中 Spiro-Indimycin B对人黑色素瘤 B 16细胞、人肺癌 H460细胞和人急性 淋巴细胞白血病 T淋巴细胞 CCRF-CEM的 IC ₅₀ 分别是 11 μΜ 、36.6 μΜ 禾口 4.5 μΜ， 而对其它受试细胞株无明显生长抑制活性； Spiro-Indimycin C对人肝癌细 胞 HepG2和人肺癌 H460细胞的 IC _5Q 分别是 14.1 μΜ和 35.4 μΜ， 而对其它受试 细胞株无明显生长抑制活性； Spiro-Indimycin D对人肝癌细胞 HepG2、人黑色素 瘤 B16细胞和人肺癌 H460细胞的 IC ₅ Q 分别是 44.4μΜ、 40.4 μΜ 禾 Β 36.3 μΜ， 而对其它受试细胞株无明显生长抑制活性， Spiro-Indimycin Α对人急性淋巴细胞 白血病 T淋巴细胞 CCRF-CEM的 IC ₅ 。为 44.4μΜ，而对其它受试细胞株无明显 生长抑制活性 （表 3 )。

本发明的第三个目的是提供化合物 Spiro-Indimycin A-D在制备抗肿瘤药物 中的应用。

优选，所述的化合物 Spiro-Indimycin A在制备治疗人急性淋巴细胞白血病药 物中的应用。

优选， 所述的化合物 Spiro-Indimycin B在制备治疗人黑色素瘤、人肺癌或人 急性淋巴细胞白血病药物中的应用。

优选，所述的化合物 Spiro-Indimycin C在制备治疗人肝癌或人肺癌药物中的 应用。

优选，所述的化合物 Spiro-Indimycin D在制备治疗人黑色素瘤、人肝癌或人 肺癌药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供链霉菌 Streptomyces spj SCSIO 03032在用于 制备化合物 Spiro-Indimycin A、 B、 C或 D的应用。

本发明的第五个目的是提供 Spiro-Indimycin A、 B、 C或 D的制备方法， 其 特征在于，所述的化合物 Spiro-Indimycin A、 B、 C或 D是从链霉菌 Streptomyces sp. ) SCSIO 03032的发酵培养物中制备分离得到的。

优选， 是通过以下方法从链霉菌 Streptomyces ^ ) SCSIO 03032的发酵培 养物中制备得到化合物 Spiro-Indimycin A、 B、 C或 D， 具体步骤如下：

a) 制备链霉菌 i Streptomyces ^ SCSIO 03032的发酵培养物， 将该发酵培 养物的发酵液和菌丝体分离开， 发酵液经大孔树脂吸附， 后用丙酮洗脱 大孔树脂， 洗脱液回收丙酮后剩余的水混合液用乙酸乙酯 萃取， 乙酸乙 酯层经蒸馏浓縮后得到浸膏 A; 菌丝体先用丙酮浸提， 浸取液回收丙酮 后剩余的水混合液再用乙酸乙酯萃取， 乙酸乙酯层经蒸馏浓縮后得到浸 膏 B;

b) 将浸膏 A和浸膏 B合并的粗提物经硅胶柱层析， 用氯仿 /甲醇作为洗脱 剂， 从体积比 100: 0〜0： 100进行梯度洗脱， 收集氯仿 /甲醇体积比 95 :5 梯度洗脱下来的馏分 Fr. l ,后经 ODS反相中压液相色谱，用水 /甲醇作为 洗脱剂，从体积比 100: 0〜0： 100进行梯度洗脱，收集水 /甲醇体积比 30: 70梯度洗脱下来的馏分 Fr. l-1， 再过 LH-20凝胶柱， 以氯仿 /甲醇体积比 1 : 1 作为流动相洗脱， 用薄层层析追踪分离， 收集薄层板上用氯仿 /丙酮 体积比为 9: 1作为展开剂时 Rf值为 0.8的馏分，即为 Spiro-Indimycin B , Rf值为 0.6的馏分， 即为 Spiro-Indimycin A; 收集薄层板上用石油醚 /乙 酸乙酯体积比为 40:60 作为展开剂时 Rf 值为 0.8 的馏分， 即为 Spiro-Indimycin C;收集薄层板上用石油醚 /乙酸乙酯体积比为 50:50作为 展开剂时 Rf值为 0.8的馏分， 即为 Spiro-Indimycin D。

所述的 a) 步骤的制备链霉菌 Streptomyces sp. ) SCSIO 03032的发酵培养 物优选通过以下方法制备： 将活化的链霉菌 ( Streptomyces sp. ) SCSIO 03032接 入种子培养基， 28 °C， 200 rpm, 培养 48 h得种子液， 将种子液以 10%的接种量 接入到发酵培养基中， 28 °C， 200 rpm, 振荡培养 120 h， 而制得发酵培养物， 所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每 升培养基中含有： 淀粉 10 g， 酵 母粉 5g， 蛋白胨 4g， CaC0 ₃ 2 g， 粗海盐 30 g， 余量为水， pH 7.2。

本发明提供了一种新的链霉菌 Streptomyces sp. ) SCSIO 03032, 该菌可以 生产结构新颖的具有抗肿瘤活性的化合物 Spiro-Indimycin A、 B、 C和 D， 化合 物 Spiro-Indimycin A、 B、 C和 D除具有罕见的螺环结构外， 还对肿瘤细胞有选 择性的、高效的活性，是开发成为高效、低毒 的抗肿瘤化合物理想的候选化合物。

本发明的链霉菌 Streptomyces sp. ) SCSIO 03032于 2011年 7月 18日保藏 于中国典型培养物保藏中心 （CCTCC ) , 地址： 中国武汉市武汉大学， 其保藏编 号为 CCTCC NO: M 2011258。 附图说明：

图 1是链霉菌 i Streptomyces sp. ) SCSIO 03032基于 16S rDNA序列的邻接法重 建的与之亲缘关系最近的种之间关系的系统发 育树；

图 2是链霉菌 ( Streptomyces sp. ) SCSIO 03032的扫描电镜显微形态； 图 3是上清液的提取物 -浸膏 A和菌丝体的提取物 -浸膏 B的高效液相色谱图； 高效液相色谱（HPLC )条件：色谱柱为 phenomex 150x4.6mm (SphereClone SAX), 流动相包括流动 A相和流动 B相，流动相 A相： 10% (体积分数）的乙腈 +0.08% (体积分数） 的三氟乙酸， 溶剂为水， 流动 B相： 90% (体积分数） 的乙腈， 溶 剂为水； 进样程序： 0-20min, 流动相比例为 A相 /B相 (体积比）: 95 :5-0: 100， 20-2 lmin, 流动相比例为 A相 /B相 (体积比）: 0: 100， 21-22min, 流动相比例为 A相 /B相 (体积比）: 0: 100-95 :5， 22-30min, 流动相比例为 A相 /B相 (体积比）: 95 :5， 检测波长 254 nm， 流速 1 ml/min， 其中 1代表化合物 1， 2代表化合物 2， 3代表化合物 3和 4代表化合物 4。

图 4 是化合物 1的 X-ray结构图；

图 5 是化合物 2的 X-ray结构图。 具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。

实施例 1:

一、 链霉菌 Streptomyces sp' SCSIO 03032的分离和鉴定

本发明的链霉菌 i Streptomyces ^. SCSIO 03032是从印度洋： （E 87°59.7'， N 9°59.3')水深 3412米的海底沉积物中分离获得的。 分离培养基为现有技术中优 化的 ISP2培养基， 每升含有酵母提取粉 2.0 g， 麦芽提取粉 2.0 g， 葡萄糖 1.0 g， 琼脂 20.0 g， 蒸馏水 500 ml， 天然海水 500ml， pH 7.2。分离培养条件为： 28 °C， 14天。由此从海底沉积物分离纯化得到一菌株 SCSIO 03032(链霉菌 Streptomyces sp. SCSIO 03032 ) 。 1、 形态学特征和生理生化分析

该菌属于革兰氏阳性， 好氧放线菌， 基丝微黄分枝， 气丝灰白色分支并分化 成卷曲的孢子链； 孢子椭球状 （图 2 ) ， 长 0.4-0.7μηι， 表面光滑。 在 PDA培养 基上长势较弱， 在 ISP5上生长有可溶性色素产生。 接触酶、 脲酶、 牛奶凝固和 胴化反应阳性， 明胶液化、黑色素产生和氧化酶反应阴性。能 水解淀粉、纤维素、 吐温 20， 40， 80； H ₂ S 产生和硝酸盐还原反应阴性； 可以利用 D-阿拉伯糖， D- 纤维二糖， 果糖， 肌醇， 丙酮酸钠， D-棉子糖， L-鼠李糖， D-甘露醇， D-葡萄糖， D-山梨糖和木糖醇， 为唯一碳源和能源生长。 而不能利用 D-半乳糖， D-乳糖， D-甘露糖， D-核糖， D-海藻糖和 D-木糖； 对甲氧嘧啶和林可霉素敏感。 pH、 盐 浓度和温度的耐受范围分别为 pH 6.0-9.0, 0-9% 和 15-40 °C。细胞壁含有 L-DAP。 优势醌为 MK-9(H6)和 MK-1 1； 主要脂肪酸为 i-C _15:0 (8%), i-C _16:0 (24%), i-C _{16: 1} G (14%), ai-Ci7:o (15%)和 ai-C _17:1 A(12%)。 G+C摩尔含量为 71.6 (±0.5) %。

2、 分子生物学鉴定

链霉菌 Streptomyces ^ ) SCSIO 03032鉴定中涉及的基因组 DNA的提取， 16S rDNA 的 PCR扩增， 序列比对和系统进化树的构建以及生理学、 化学和形 态学鉴定等，均参考文献 [Tian, X. P., Zhi, X. Y.， Qiu, Υ. Q.， Zhang, Y. Q.， Tang, S. K.， Xu, L. H.， Zhang, S.， Li, W. J. Sciscionella marina gen. no v., sp. no v., a marine actinomycete isolated from a sediment in the northern South China Sea. Int J Syst Evol Microbiol, 2009, 59(Pt 2): 222-228]。

按照参考文献中的方法提取菌株 SCSIO 03032 的基因组 DNA， PCR扩增该 菌株的 16SrDNA并测序， 获得 1430个碱基， 其序列如 SEQ ID N0.1所示， 而 后提交到 GenBank中， 对 16S rDNA核苷酸序列进行 BLAST分析， 结果显示， 该菌株与 reptomyces specialis GW41-1564 ^T 的相似度为 97%， 重新构建该属系 统发育树显示菌株 SCSIO 03032聚在该类群， 说明该菌株 SCSIO 03032为链霉 菌属。如图 1所示，通过邻接法清晰地揭示了该菌株 SCSIO 03032与一组链霉菌 属物种的系统进化关系，表明该菌属于链霉菌 属的一种， 通过基因组杂交方法结 果显示菌株 SCSIO 03032与最相似菌种 Streptomyces specialis GW41-1564 ^T 的杂 交值为 23%， 该杂交值远低于种内差异标准的 70% ( Stackebrandt, E. & Ebers, J. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards. Microbiol Today. (2006). , 152-155.)； 同时在形态学、 生理学、 细胞化学等方面与已知最相似菌株均有较 大的差异，因此，综合分析多项分类数据，鉴 定此菌株为链霉菌属 Streptomyce^ 的一个新种， 命名为： 链霉菌 (StreptomycesspJ SCSIO 03032, 该菌于 2011年 7月 18日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC), 地址： 中国武汉市武汉大 学， 其保藏编号为 CCTCCNO: M 2011258ο

二、 活性代谢产物 Spiro-IndimycinA-D的分离和制备

1、 培养基 （种子培养和发酵培养基）： 每升含有淀粉 10 g， 酵母粉 5g， 蛋 白胨 4g， CaC0 ₃ 2g， 海盐 30g， 余量为水， pH7.2。 121°C， 灭菌 30 min;

2、 发酵

2.1、 种子培养： 将培养皿上活化的链霉菌 (Streptomyces sp.) SCSIO 03032 的单菌落分别接入 18瓶， 每瓶含有 50 mL培养基的 250 mL的锥形培养瓶中， 28。C， 200 rmin" ¹ , 培养 48 h， 制得种子液 900mL。

2.2、 发酵培养： 将种子液以 10%的接种量 （体积百分比） 接入到 9 L发酵 培养基 （置于 250 mL的锥形培养瓶， 每瓶含有 50ml培养基， 共 180瓶） 中， 28 °C， 200 rmin ¹ , 振荡培养 120 h， 得到 9 L发酵培养物。

3、 萃取： 发酵培养物先进行离心分离 （3500 min- ¹ , 8min), 得到 9L体积 的上清液 （发酵液） 和菌丝体。 发酵液经大孔树脂 XAD16固相萃取， 后用丙酮 洗脱大孔树脂 3次，洗脱液回收丙酮后剩余的水混合液用乙� �乙酯萃取 3次， 乙 酸乙酯层经蒸馏浓縮后得到上清液提取物 -浸膏 A (4.1 g); 菌丝体用 2L丙酮在 室温下浸提 3次， 每次 3小时， 合并提取液， 减压回收丙酮后剩余水混合液用 6L乙酸乙酯萃取， 乙酸乙酯层减压蒸馏得菌丝体提取物一浸膏 B (0.9 g)。

4、 活性化合物的提取分离和鉴定

4.1化合物 Spiro-IndimycinA-D的提取分离和鉴定： 分别取少量浸膏 A和浸 膏 B的样品溶于 100 μΐ 甲醇中， 离心取上清 10 μ1， 经 HPLC进样检测， 表明， 浸膏 Α中含有化合物 1 (1)和 2 (2)， 浸膏 B中含有化合物 3 (3)和 4 (4) (图 3)， 将浸膏 A和浸膏 B合并。 将该合并的粗提物经硅胶柱 （300-400目） 层析， 用氯仿 /甲醇作为洗脱剂， 从体积比 100:0〜0:100进行梯度洗脱， 收集氯仿 /甲醇 体积比 95:5梯度洗脱下来的馏分 Fr.l(3.03g)， 蒸干， 经 ODS反相中压液相色谱 (YMC*GEL ODS-A球型填料， 120A孔径， 50um粒径， 240x4.0 cml.D.), 流 速为 25 ml/min, 用水 /甲醇作为洗脱剂， 从体积比 100:0〜0:100进行梯度洗脱， 收集水 /甲醇体积比 30: 70梯度洗脱下来的馏分 Fr.l-l(1.57 g)， 再过 LH-20凝胶 柱 （2.5*100 cm), 以氯仿 /甲醇体积比 1:1作为流动相洗脱， 流速为 lml/min， 每 100ml收集合并为一份， 顺序得到 Fr.l-1-Α— G 7份样品， 其中 Fr.l-1-C (331 mg), Fr.l-1-D (626 mg), Fr.l-l-E (27 mg)。 Fr.l-l-C用氯仿 /丙酮体积比为 9: 1 作为展开剂， 经过薄层制备， 刮取 Rf值为 0.8的条带， 乙酸乙酯洗脱得到化合 物 2 (18.0 mg) (Spiro-lndimycin B); 刮取 Rf值为 0.6的条带， 乙酸乙酯洗脱得 到化合物 1(5.0 mg) (Spiro-lndimycin A); Fr.l-1-D用石油醚 /乙酸乙酯体积比为 40:60作为展开剂， 经过薄层制备， 刮取 Rf值为 0.8的条带， 乙酸乙酯洗脱得到 化合物 3 (22.0 mg) (Spiro-lndimycin C); Fr.l-1-Ε用石油醚 /乙酸乙酯体积比为 50:50作为展开剂， 经过薄层制备， 刮取 Rf值为 0.8的条带， 乙酸乙酯洗脱得到 化合物 4(6.6 mg) ( Spiro-lndimycin D )。

通过结构分析， 对本发明的从链霉菌 (Streptomyces sp.) SCSIO 03032的发 酵培养物中制备得到的 4个化合物 1-4一化合物 Spiro-lndimycin A-D (式 （Π)) 对其进行鉴定， 其鉴定结果如下：

Spiro-lndimycin A Spiro-lndimycin B Spiro-lndimycin C Spiro-IndimycinD 式 （II)

化合物 1: 白色晶体， 其核磁数据归属如表 1所示， [c¾° +46.49 (c 0.15, MeOH ); UV (MeOH) λ _ωαχ (log ε) 272 nm (4.05); 227 nm (4.40); IR (KBr) _max 3443, 1725, 1229 cm— ¹ ; 1H NMR (500 MHz, CD ₃ OD) 见表 1， ¹³ C NMR (125 MHz, CD ₃ OD) 见表 2。 高分辨质谱 HRESIMS m¾ C ₂₄ H ₁₅ C1 ₂ N ₃ 0 ₃ (实测值 [M-H]- 478.0353, 计算值为 478.0361)， 不饱和度为 18。 化合物 1的氢谱显示有 2个甲 氧基 [δΗ 3.53 (3H，s)， 4.00 (3H，s)]， 7个芳香质子， 2个活泼氢 [δΗ 11.47 (1H， s)， 12.20 (1H， brs)]。 ¹³ C NMR和 DEPT NMR显示有 2个 羰基碳 [SC 159.6 (s), 160.3 (s)]，13个季碳， 7个次甲基碳， 2个甲基碳。 化合物 1的氢谱 C谱与已知化合物 Lynamicin D相比 [Mc Arthur, K. A.; Mitchell, S. S.; Tsueng, G.; Rheingold, A.;

White, D. J.; Grodberg, J.; Lam, K. S.; Potts, B. C. Lynamicins A-E, chlorinated bisindole pyrrole antibiotics from a novel marine actinomycete， J Nat Prod, 2008， 71 , 1732-7.]， 发现二者极其相似， 不同之处在于： 化合物 1 在分子式中少 2 个 氢，同时多一个不饱和度；化合物 1的碳谱中多 1个 sp ³ 杂化季碳，同时 Lynamicin D中少一个 sp ² 杂化的季碳； 化合物 1中的 C-2'的化学位移明显偏向低场 （S _c 169.2)。 根据以上的证据推测， 化合物 1的 C-3'和 C-5"相连接成环， 同时原 C-2' 与 C-3'间存在的共轭发生转移， 变为 C-2'与 Ν-Γ间的共轭。 以上推测通过化合物 1的 X-ray (图 4 )进一步证明。 且分子中存在的氯原子， 使得 X-ray可以清晰地 将化合物 1的绝对构型确定为 构型。 化合物 1的结构如式 （Π)所示， 命 名为 Spiro-Indimycin A

化合物 2: 白色晶体。 [a] ^2Q _D +169.2 ( c 0.67, MeOH ); UV (MeOH) ^ _ax (log ε) 252 nm (4.77); 209 nm (4.66); IR (KBr) ^ _ax 3418, 1695， 1284 cm- 负离子高分辨 质谱在 436.0602 处给出 [M-H]- 峰， （；计算值为 436.0620 结合碳谱、氢谱得出 该化合物的分子式为 C ₂₃ H ₁₆ C1 ₂ N ₃ 0 ₂ ，包含有 16个不饱和度。化合物的 1D NMR

( 1H NMR (500 MHz, CD ₃ OD) 见表 1， ¹³ C NMR (125 MHz, CD ₃ OD) 见表 2。 ) 提示氢谱中存在以下信号： 1个氮甲基 [δ _Η 2.88 (1H, s) ]， 1个氧甲基 [δ _Η 3.36 (3Η, s) ]，7个次甲基质子，1个亚甲基质子 [5 _Ha 3.63 (1H, d, /=8.5 Hz) 和 δ _¾ 4.06 (1H, d, /=8.5 Hz)] 和 2个可交换的质子； 碳谱中存在以下信号： 1个羰基碳， 13个季 碳 （包括 12个 sp2杂化的季碳及 1个 sp3杂化的季碳）， 7个次甲基碳， 1个亚 甲基碳， 1个氧甲基碳及 1个氮甲基碳。 比较化合物 2与已知化合物 Lynamicins A [McArthur, K. A.; Mitchell, S. S.; Tsueng, G.; Rheingold, A.; White, D. J.; Grodberg, J.; Lam, K. S.; Potts, B. C. Lynamicins A-E, chlorinated bisindole pyrrole antibiotics from a novel marine actinomycete, J Nat Prod, 2008， 71， 1732-7.] 的氢谱碳谱数据，发现二者相似，提示化合物 2 与化合物 Lynamicins A结构类 似， 也属于双吲哚类生物碱。 化合物 2 的氢谱中存在着两个 ABX 偶合体系 (H-57H-7VH-8'; Η-5ΎΗ-7 Η-8"), 与 Lynamicins A相似， 表明在化合物 2中存在 着两个 1， 2， 4-三取代苯环， 分别将其归属为 la和 lb (式 （ΙΠ))。 进一步， la 片段通过以下的 HMBC相关建立：从 H-5' 到 C-67C-77C-9';从 H-7'到 C-57C-9'; 从 H-8' to C-6VC-4 (以上相关同时表明氯在 C-6'位取代） 及从 H-2' 至 lj C-37C-47C-9'。 H-10'位的氮甲基质子 [δΗ 2.88 (s)] 到 C-2' [5C 64.3 (t)]禾 B C-9' [5C 151.9 (s)] 的 HMBC 相关把这个氮甲基定位到 la片段的 N-l'。 lb片段通过 下列 HMBC得到：从 H-5" 到 C-3'7C-7'7C-6'7C-9"，从 H-7" 到 C-5'7C-6'7， 和 从 H-8" 到 C-3"/C-5"/C-4"/C-6"/C-9" lc 片段由下列 HMBC 相关： H-2 到 C-3/C-4/C-5及 H-2/NH-1的 COSY相关得到。除此，从 H-2到 C-3" 的弱的 HMBC 相关提示甲氧酰基在 C-5位取代。与已知化合物 Lynamicins A不同的是，化合物 2形成一个罕见的 5/5螺环， 关键的 HMBC相关： H-2' [δΗ 3.63 (d)] 到 C-3 [5C 140.1 (s)]， H-2' [δΗ 4.06 (d)] 到 C-2" [5C 154.5 (s)] 及 H-2 [δΗ 6.91 (d)] 到 C-3" [5C 112.1 (s)] 支持螺环结构的形成。以上对化合物 2的结构推测被 X-ray (图 5 ) 进一步证明， 且分子中存在的氯原子， 使得 X-ray可以清晰地将化合物 2 C-3'的 绝对构型确定为 R 构型。化合物 2的结构如式（Π)所示，命名为 Spiro-Indimycin B。

式 απ)

化合物 3 : 白色固体， 其核磁数据归属如表 1所示。 [0¾° +174.1 ( c 0.31, MeOH ); UV (MeOH) ^ (log ε) 251 nm (4.44); 210 nm (4.63); IR (KBr) l _max 3417, 1701, 1285 cm— ¹ ; 1H NMR (500 MHz, CD ₃ OD) 见表 1， ¹³ C NMR (125 MHz, CD ₃ OD) 见表 2。 HRESIMS m ¾ [M-H]- 422.0499 (calcd for C ₂₂ H ₁₄ C1 ₂ N ₃ 0 ₂ 422.0463)， 其分 子式与化合物 2相差一个甲基， 仔细分析 H-谱， C-谱， HSQC 及 HMBC 谱， 得出化合物 3是化合物 2缺失 Γ-Ν甲基的同系物， 其结构如式（Π)所示， 命名 为 Spiro-Indimycin C。 化合物 4: 白色固体， 其核磁数据归属如表 1所示。 [0¾° +100.5 ( c 0.40， MeOH ); UV (MeOH) ^ _ax (ε) 266 nm (4.23); 243 nm (26373); 208 nm (4.48); IR (KBr) ^ 3307, 1718, 1268 cm— ¹ ; 1H NMR (500 MHz, CD ₃ OD) 见表 1， ¹³ C NMR (125 MHz, CD ₃ OD) 见表 2。 HRESIMS m/z [M-H]- 494.0661, (calcd for C ₂₅ H ₁₈ C1 ₂ N ₃ 0 ₄ , 494.0674) 将化合物 4 的氢谱和碳谱与化合物 2相比， 发现比化 合物 2多一个甲酯基团，还发现 2中的 C-2位的 sp ² 杂化的次甲基碳 [δΗ 6.91 (d， J = 3.0 Hz, H-2); 5C 110.3 (d，C-2)]被 sp ² 杂化的季碳 [SC 111.5 (s，C-2)]所取代， 这说 明化合物 4是化合物 2的 2位甲酯取代结构类似物， 其结构如式 （Π) 所示， 命 名为 Spiro-Indimycin D。

表 1 : ： 化合物 1-4的 iH-NMR核磁数据归属（数据于 500MHz 3 Ufl定， 括号中为偶合常数 (Hz) )

No. l ^a 2 ^b 3 ^b 4 ^b

NH 12.20(s) 8.88 (brs) 8.78 (s) 8.52 (s)

2 6.92 (d, 3.0) 6.91 (d, 2.5)

7 3.36 (s) 3.61 (s) 3.66 (s) 4.09 (s)

9 3.92 (s) 3.67 (s)

而

2' 8.04 (s) 3.64 (d, 8.5); 4.07 (d, 8.5) 3.76 (d, 9.0); 4.45 (d, 9.0) 3.61 (d, 8.5); 4.07 (d, 8.5)

5' 6.97 (d, 6.54 (d, 2.0) 6.57 (d, 2.0) 6.53 (s)

2.0)

7' 7.41(dd, 7.07 (dd, 2.0, 8.5) 7.04 (dd, 2.0, 8.5) 7.09 (d, 8.0)

2.0, 8.0)

8' 7.62 (d, 6.57 (d, 8.5) 6.76 (d, 8.5) 6.61 (d, 8.0)

8.0)

10' 2.88 (s) 2.89 (s)

NH 11.47 8.45 (br s) 8.55 (s)

(s)

2" 8.08 (d,

2.0)

5" 7.62 (d, 1.5) 7.63 (d, 2.0) 8.12 (s)

7" 7.35 (d, 7.06 (dd, 1.5, 9.0) 7.09 (dd, 2.0, 8.8) 7.13 (dd, 2.0, 8.5)

8.5)

8" 6.98 (d, 7.15 (d, 9.0) 7.19 (d, 8.8) 7.17 (d, 8.5)

8.5)

样品溶于 DMSO检测； ^b 样品溶于 CDC1 ₃ 检测

表 2·· 化合物 1-4的 ¹³ C-NMR核磁数据归属 （数据于 125MHz测定）

No. l ^a 2 ^b 3 ^b 4 ^b

2 116.1 s* 110.3 d 110.1 d 114.0 s* 3 122.2 s 127.2 s 127.0 s 119.8 s

4 116.2 s 140.1 s 141.0 s 139.5 s

5 123.6 s* 116.7 s 116.7 s 111.5 s*

6 159.6 s 160.5 s 160.4 s 159.7 s

7 51.3 q 51.1 q 51.4 q 51.7 q

8 160.3 s 160.8 s

9 51.5 q 52.0 q

2' 169.2 d 64.3 t 56.3 t 63.8 t

3' 61.2 s 51.8 s 53.3 s 51.5 s

4' 147.2 s 134.2 s 133.6 s 133.2 s

5' 122.6 d 123.1 d 123.4 d 122.9 d

6' 130.5 s 123.5 s 124.7 s 123.6 s

7' 127.9 d 128.2 d 128.3 d 128.5 d

8' 121.4 d 108.9 d 111.6 d 109.3 d

9' 157.5 s 151.9 s 149.7 s 151.9 s

10' 36.6 q 36.6 q

2" 123.5 d 154.5 s 154.5 s 156.8 s

3" 105.5 s 112.1 s 112.3 s 132.3 s

4" 133.4 s 121.8 s 121.8 s 122.5 s

5" 120.7 s 118.9 d 118.9 d 120.6 d

6" 120.7 s 125.9 s 126.0 s 126.4 s

7" 112.5 d 121.5 d 121.6 d 122.3 d

8" 125.7 d 113.1 d 113.1 d 112.9 d

9" 127.2 s 137.8 s 137.8 s 138.2 s

样品溶于 DMSO检测； ^b 样品溶于 CDC1 ₃ 检测

实施例 3 : Spiro-Indimycin A-D的细胞毒活性测定

Spiro-Indimycin A-D针对七种肿瘤细胞株： 人乳腺癌 MCF-7细胞， 人胰腺 癌 1990， 人肝癌细胞 HepG2， 人宫颈癌 Hale, 人黑色素瘤 B16细胞， 人肺癌 H460细胞和人急性淋巴细胞白血病 T淋巴细胞 CCRF-CEM进行了活性测定， 实验方法参考文献 [Wu， Z. C; Li, D. L.; Chen, Y. C; Zhang, W. M.， A new isofliranonaphthalenone and benzopyrans from the endophytic fungus Nodulisporium sp. A4 from Aquilaria sinensis. Helv. Chim. Acta 2010, 93, (5), 920-924.] , 以 Staurosporine作为对照。

其结果如表 3所示，结果表明 Spiro-Indimycin A-D有选择性细胞毒活性，其 中 Spiro-Indimycin B对人黑色素瘤 B16细胞、人肺癌 H460细胞和人急性淋巴细 胞白血病 T淋巴细胞 CCRF-CEM的 IC ₅₀ 分别是 11 μΜ 、 36.6 μΜ禾卩 4.5μΜ， 而对其它受试细胞株无明显生长抑制活性； Spiro-Indimycin C 对人肝癌细胞 HepG2和人肺癌 H460细胞的 IC _5Q 分别是 14.1 μΜ和 35.4μΜ， 而对其它受试细 胞株无明显生长抑制活性； Spiro-Indimycin D对人肝癌细胞 HepG2， 人黑色素瘤 B16细胞和人肺癌 H460细胞的 IC ₅₀ 分别是 44.4μΜ、 40.4 μΜ 禾卩 36.3 μΜ， 而 对其它受试细胞株无明显生长抑制活性； Spiro-Indimycin Α对人急性淋巴细胞白 血病 T淋巴细胞 CCRF-CEM的 IC _5Q 为 44.4μΜ，对其它受试细胞株无明显生长 抑制活性；与阳性对照 Staurosporine相比， Spiro-Indimycin A-D对所测的七种细 胞的表现为选择性的抑制作用， 且其活性较强， 通过生物工程或化学修饰可望开 发成为抗肿瘤新药。

表 3： Spiro-Indimycin A-D的细胞毒性 if M定 样品 IC ₅₀ ( M)

MCF-7 1990 HepG2 Hale B16 H460 CCRF-CEM

Spiro -Indimycin - - - - - - 44.4μΜ

A

Spiro -Indimycin - - - - 11.4 36.6 4.5

B

Spiro -Indimycin - - 14.1 - - 35.4 - C

Spiro-Indimycin - 44.4 40.4 36.3

D

Staurosporine 17.1 32.1 17.1 17.1 4.29 17.1 10.7 注： - IC5 ₀ >100 g/ml

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