SUBSTANZKOMBINATION MIT ISOCHINOLINALKALOIDEN UND KOKZIDIOSTATIKUM ODER

KOKZIDIOSEIMPFMITTEL

Beschreibung Technisches Gebiet

Die Erfindung bezieht sich auf eine Substanzkombination zur Behandlung von Kokzidiose bei Nutztieren.

2017015356/ MR/TB/TB Stand der Technik

Als Kokzidiose bezeichnet man Erkrankungen durch Einzeller, die sogenannten Kokzidien (Klasse: Sporozoen). Kokzidiose gehört zu den Protozoeninfektionen. Die Kokzidien befallen vor allem den Darm, bei einigen Tieren auch Leber und Niere. Kokzidiosen spielen bei ver schiedenen Haustieren eine große Rolle, insbesondere, aber nicht nur, als Jungtiererkran kung. Wirtschaftlich bedeutsam sind insbesondere die Kokzidiose des Rindes, des Schafes und des Geflügels, einschließlich der Hühnervögel. Die Krankheit tritt aber auch bei Kanin chen, Hasen, Hunden, Katzen, Ziegen und Fischen auf. Kokzidiose wird unter anderem von verschiedenen Eimeria-Arten hervorgerufen. Eimerieninfektionen sind besonders schädlich für die Geflügelindustrie und kosten z.B. die Vereinigten Staaten jährlich mehr als 1,5 Milli arden Dollar an Verlusten.

Kokzidiose wird heute durch Antibiotika, insbesondere ionophore Antibiotika, und duch eine Reihe nicht-ionophorer Kokzidiostatika behandelt. Teilweise werden die Tiere auch gegen Kokzidiose geimpft.

Allerdings treten oftmals nach wenigen Erreger-Generationen und/oder bereits nach kurz zeitiger Verwendung eines einzelnen Wirkstoffs Resistenzen auf, die die Wirksamkeit des eingesetzten Kokzidiostatikums erheblich reduzieren bis hin zur völligen Unwirksamkeit.

Um dieses Problem zu umgehen, werden die Kokzidiostatika oft im Rotationsprinzip verab reicht, um Erregern mit Resistenzen gegen einen bestimmten Wirkstoff nach Möglichkeit durch frühzeitigen Wechsel auf ein anderes Präparat beizukommen. Insbesondere bei Hähnchenmastbetrieben mit hoher Besatzdichte und mehreren Herdenzyklen pro Jahr in einer einzigen Anlage ist das schnelle Auftreten von Resistenzen ein großes Problem.

Verschärfend kommt hinzu, dass das Spektrum verfügbarer Antibiotika kleiner wird, teils, weil Resistenzen gegen bestimmte Antibiotika ubiquitär geworden sind, teils, weil gesetzli che Bestimmungen die Verwendung von Antibiotika wegen Rückstandbedenken oder Kreuzresistenzen zu Humanmedizinischen Antibiotika einschränken. Insbesondere der Ein satz ionophorer Antibiotika wird in vielen Ländern zunehmend stark vom Gesetzgeber ein geschränkt, um das Auftreten multiresistenter Erreger zu verhindern. Nutztierhalter sehen sich zunehmend mit dem Problem konfrontiert, mit einem kleiner werdenden Spektrum verfügbarer Antibiotika dennoch ihren Tierbestand wirksam und oh ne erhebliche Mehrkosten vor Kokzidiose zu schützen.

Technisches Problem und grundlegende Lösungen

Der Erfindung liegt demgemäß die Aufgabe zugrunde, Alternativen zu den oben beschrie benen Verfahren zum Schutz von Nutztieren oder Hobbytieren vor Kokzidiose zur Verfü gung zu stellen.

Die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgaben werden jeweils mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche gelöst. Ausführungsformen der Erfindung sind in den ab hängigen Ansprüchen angegeben. Die im Folgenden aufgeführten Ausführungsformen sind frei miteinander kombinierbar, sofern sie sich nicht gegenseitig ausschließen.

In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine Substanzkombination zur Verwendung zur Be handlung von Kokzidiose bei Nutztieren oder Hobbytieren. Die Substanzkombination ent hält Isochinolinalkaloide und enthält zudem ein Kokzidiostatikum oder ein Kokzidioseimpf mittel.

Der Begriff „Behandlung" ist hier breit zu verstehen, also im Sinne einer vorbeugenden Be handlung (Verabreichung bevor Krankheitssymptome beobachtet wurden) und/oder einer Behandlung nachdem bereits Symptome von Kokzidiose beobachtet wurden („Akutbehand lung", Behandlung einer akuten Kokzidiose). Bei der Verwendung zur Behandlung von Kok zidiose kann es sich insbesondere um eine Anwendung bei der Behandlung von Kokzidiose handeln.

Ausführungsformen der Erfindung können den Vorteil haben, dass durch die Kombination eines Kokzidiostatikums oder Kokzidioseimpfmittels mit Isochinolinalkaloiden die Wirksam keit des Kokzidiostatikums oder Kokzidioseimpfmittels deutlich erhöht werden kann. Dies bedeutet, dass bereits geringere Konzentrationen des Kokzidiostatikums ausreichen kön nen, um der Kokzidiose wirksam vorzubeugen oder diese nach Ausbruch zu bekämpfen. Beispielsweise wurde beobachtet, dass Ausführungsformen mit einer Kombination aus Iso- chinolinalkaloiden und einem Kokzidiostatikum oder einem Kokzidioseimpfmittel einen positiven synergistischen Effekt im Hinblick auf die Reduktion von kokzidiosebedingten Krankheitssymptomen wie auch der kokzidiosebedingten Mortalität haben.

Ausführungsformen können weiterhin den Vorteil haben, dass der Ausbreitung von resis tenten Erregerstämmen entgegengewirkt wird, und dem Ausbruch von Kokzidiose in gro ßen Tierbeständen wirksamer vorgebeugt wird. Resistenzbildung beruht auf einzelnen, zu fälligen Veränderungen des Erbguts, sogenannten Mutationen, die den Stoffwechsel eines Erregers so verändern, dass der Erreger weniger empfindlich auf auf ein spezielles Antibio tikum reagiert. Da es sich bei der Mutationsentstehung um ein zufälliges Ereignis handelt, das durch den Selektionsdruck des Einsatzes eines speziellen gegen die Kokzidien wirksa men Wirkstoffs in seiner Ausbreitung gefördert wurde, erhöht sich das Risiko, dass eine Mutation auftritt, die zu einer verringerten oder ausbleibenden Empfindlichkeit der Kokzi dien gegen den Wirkstoff führt, mit der Anzahl der an Kokzidiose erkrankten Tiere eines Tierbestands und mit der Gesamtzahl an Kokzidioseerregern. Ein möglichst früh einsetzen der und wirksamer Schutz gegen eine Verbreitung des Erregers in einem Tierbestand, der durch die kombinierte Verabreichung von Kokzidiostatika/Impfstoffen und Isochinolinalka loiden bewirkt wird, reduziert daher das statistische Risiko und damit die Geschwindigkeit der Resistenzerzeugung.

Ausführungsformen können weiterhin den Vorteil haben, dass dadurch Kosten reduziert werden können: Isochinolinalkaloide können vergleichsweise günstig aus Pflanzenextrakten gewonnen werden, wohingegen viele Antibiotika chemisch oder biotechnologisch unter Laborbedingungen erzeugt werden müssen und daher in der Regel deutlich teurer sind. Dadurch, dass Isochinolinalkaloide die Wirksamkeit von Kokzdiostatika erhöhen, reduzieren sie den Verbrauch an Kokzidiostika, denn es kann für den gleichen Schutzeffekt weniger von dem teuren Antibiotkum eingesetzt werden und/oder es kann beim Einsatz einer gegebe nen Menge Antibiotikum eine bessere Schutzwirkung erzielt werden, sodass das Risko des Befalls weiterer Tiere und der damit einhergehende Antibiotikaeinsatz vermieden werden kann. Nach Ausführungsformen beinhaltet die Substanzmsichung isochinolinhaltiges Pflanzenma terial. Das für Ausführungsformen beschriebene Pflanzenmaterial kann z.B. ein pflanzlicher Extrakt sein. Ein pflanzlicher Extrakt kann beispielsweise wie nachfolgend beschrieben her gestellt werden: getrocknetes und pulverisiertes isochinolinhaltiges Pflanzenmaterial (z.B. pulverisierte Blätter oder Wurzeln) wird einer zweifachen hydroalkoholischen Extraktion (70% Ethanol) unterzogen. Das Lösungsmittel wird mittels Vakuumdestillation bei ca. 55- 60°C entfernt. Dabei wird ein konzentrierter Extrakt gewonnen. Dieser Extrakt wird mit Maltodextrin versetzt, der resultierende flüssige Extrakt bei ca. 80-90°C vakuumgetrocknet und anschließend gemahlen.

Nach Ausführungsformen der Erfindung dient die Substanzkombination insbesondere zur Behandlung von kokzidieninduzierten Darmentzündungen bei Nutztieren oder Hobbytieren und/oder zur Behandlung von kokzidieninduzierten Durchfällen bei Nutztieren oder Hobby tieren.

Nach Ausführungsformen der Erfindung ist die Behandlung eine Vorbeugung, also eine Be handlung, bevor die Kokzidiose erkennbar ausgebrochen ist. Eine vorbeugende Behandlung kann eine Impfung sein.

Nach anderen Ausführungsformen der Erfindung ist die Behandlung eine Akutbehandlung, also eine Behandlung einer bereits ausgebrochenen Kokzidiose.

Bei der Substanzkombination kann es sich z.B. um ein Medikament, eine Tiernahrung, ein Tränkwasser, oder ein Tiernahrungsergänzungsmittel handeln.

Die Verwendung von Tiernahrungsergänzungsmitteln, die z.B. als flüssiges oder festes Kon zentrat realisiert sein können, kann vorteilhaft sein, da die Alkaloide und das Kokzidiostati- kum bzw. der Impfstoff darin homogen durchmischt vorliegen können. Der größte Volu menanteil des Tiernahrungsergänzungsmittels kann aber aus anderen Substanzen, z.B. Wasser, Milch, Pflanzenmaterialien, Sojamehl, Mais oder Maismehl oder Getreide, beste hen. Wird ein solches Tiernahrungsergänzungsmittel mit Tränkwasser oder der eigentlichen Tiernahrung vermischt, kann dies die homogene Verteilug der bereits in geringen Mengen physiologisch wirksamen Substanzen im Vergleich einer direkten Zugabe von Alkaloiden, Kokzidiostatika oder Impfstoffen erleichtern.

Durchfall ist eine häufige Folge von Kokzidiose und führt aufgrund der schlechteren Resorp tion von Nähr- und Mineralstoffen zu einer Wachstumsverzögerung bei Nutztieren oder Hobbytieren, einem allgemein verschlechterten Gesundheitszustand und in vielen Fällen auch zum Tod. Wenn erste Symptome erkennbar werden, ist es oftmals schon zu spät, um eine Ausbreitung der Kokzidiose im Tierbestand zu verhindern oder erfordert hohe Dosen eines Kokzidiostatikums.

Bezüglich einer Kombination aus Isochinolinalkaloiden und Kokzidostatika oder Kokzidiose impfmittel hat der Anmelder beobachtet, dass diese Kombination kokzidieninduzierte Darmentzündungen und/oder Durchfall wirksamer bekämpft bzw. diesen vorbeugt als der Einsatz von Kokzidostatika oder Kokzidioseimpfmitteln alleine. Zusätzlich wird in vielen Fäl len eine bessere Verdauung des Futters, eine bessere Futterausnutzung, eine höhere Ei weißausnutzung, und verbesserte Masttagzunahme bei gegebenem Einsatz von Futter be wirkt. Auch konnte eine ganz allgemein verbesserte Immunabwehr beobachtet werden, da der Darm für einen Großteil der Immunreaktion eines Körpers verantwortlich ist.

Nach Ausführungsformen der Erfindung wird die Substanzkombination über die gesamte Mast hinweg (täglich oder regelmäßig im Abstand von einigen wenigen Tagen) verabreicht. Vorzugsweise wird die Verabreichung mindestens fünf Tage vor Ende der Mast beendet.

Nach Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei dem Kokzidiostatikum um ein ionophores Antibiotikum.

Unter einem „Ionophor" wird hier ein Molekül verstanden, das Ionen durch eine Membran transportiert. Einige Bakterien bilden lonophore, also Moleküle, die die Permeabilität von Membranen für Ionen erhöhen. Oft haben solche Moleküle eine antibiotische Wirkung, da sie lonenkonzentrationsgefälle abbauen. Ein Ionophor mit antibiotischer Wirkung wird auch als ionophores Antibiotikum bezeichnet. Manche lonophore werden von Bakterien als po renbildendes Toxin verwendet. Beispielsweise sing sog. „Carrier-Ionophore" und „kanalbil dende lonophore" bekannt. Nach Ausführungsformen der Erfindung ist das ionophore Antibiotikum Salinomycin, Mo- nensin oder Narasin.

Dies ist vorteilhaft, da die besagten Antbiotika in vielen Ländern zugelassen sind, sodass viele Nutztierhalter mit der Handhabung und Dosierung dieser Antibiotika bereits vertraut sind.

Nach anderen Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei dem Kokzidiostatikum um ein nicht-ionophores Antibiotikum. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Kokzidiostati kum um ein nicht-ionophores Antibiotikum mit fehlender oder nur schwacher antibakteriel ler Wirkung, insbesonde um reine Antiprotozoika.

Nicht-ionophore Antibiotika, insbesondere nicht-ionophore Antibiotika, die nicht oder nur geringfügig anitbakteriell wirken, können den Vorteil haben, dass sie deutlich sicherer im Einsatz sind und eine viel geringere Toxizität für das Tier haben als z B. das Narasin oder das Salinomycin (beide ionophor). So ist der Faktor von Einsatzdoiserung zu toxischer Dosierung beim z B. Diclazuril eins zu 100 während die toxische Dosis beim Salinomycin bereits beim nur 5-fachen der Einsatzsdosierung liegt.

Allerdings haben nicht-ionophore Kokzisiostatika den Nachteil einer raschen und häufig spontan auftretenden Resistenzbildung bis hin zu rascher vollkommener Resistenz der Kok zidiose-Erreger und damit völligem Wirkungsverlust, die bei ionophoren Kokzidiostatika nicht in dieser Form auftritt.

Nicht-ionophore Kokzidiostika wie Diclazuril oder Nicarbazin werden gemäß Ausführungs formen der Erfindung in der Kokzidiosevorbeuge bevorzugt wervendet, da sie sind kaum toxisch für die Tiere sind, sodass Inhomogenitäten bei der Verteilung des Kokzidiostatikums im Futter oder Tränkwasser weniger schädlich sind. Nicht-ionophoere Kokzidiostatika sind zudem nicht antibakteriell wirksam sondern nur kokzidienwirksam und selektieren keine resistenten Bakterien (Kokzidien sind keine Bakterien), sie sind umweltfreundlicher, nach haltiger und auch im Hinblick auf die Gefahr multiresistenter Erreger für die menschliche Gesundheit weniger problematisch. Insbesondere wurde bei den nicht-ionophoren Kokzidi- ostatika, insbesondere Nicarbazin, ein besonders hoher synergistischer Effekt in Kombinati on mit Isochinolinalkaloiden beobachtet.

Nach Ausführungsformen der Erfindung ist das nicht-ionophore Antibiotikum Nicarbazin, Amprolium, Diclazuril, Toltrazuril oder Halofuginon. Nach bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das nicht-ionophore Antibiotikum Nicarbazin.

Die Kombination von Isochinolinalkaloiden mit Nicarbazin hat sich als ganz besonders er folgreich bei der Bekämpfung von Kokzidiose erwiesen. Es konnte gezeigt werden (siehe Figur 17), dass diese Kombination eine 10 bis 100 mal niedrigere Oozystenzahl pro gr Kot bewirkte, als sie in Tiergruppen zu beobahten war, die mit anderen antikozidialen Interven tionen behandelt wurden wie z.B. Nicarbazin alleine. Durch die besonders effektive Verrin gerung der Zahl der Kokzidiose-Erreger und Oozysten durch die Kombination von Nicarba zin mit Isochinolinalkaloiden kann auch der Bildung von resistenten Kokzidiose-Erregern vorgebeugt werden: je stärker die frühe Reduktion der Anzahl von Kokzidiose-Erregern, desto geringer die Anzahl von Zellen, in welchen eine Mutation auftreten kann, welche die Kokzidien resistent macht gegen den besagten Kombinationswirkstoff.

Beispielsweise wird derzeit das Medikament Maxiban, eine Kombination aus Nicarbazin mit dem ionophoren Antibiotikum Narasin, als Kombipräparat gegen Kokzidiose eingesetzt, wobei allerdings Narasin den Nachteil hat, dess es wegen gesetzgeberischen Restriktionen aufgrund seines antibakteriellen Charakters in immer weniger Ländern zum Einsatz kommt. Daher, und auch um dem Kundenwunsch nach medizinisch unbedenklichen Behand lungsoptionen zu folgen, suchen Geflügelmäster nach Alternativen. Ein Ersatz des Antibioti kums Narasin (ionophor) durch die Isoquinolinalkaloide in solchen Kombipräparaten gemäß Ausführungsformen der Erfindung kann die besagten Nachteile von ionophoren Antibiotika überwinden, da Isochinolinalkaloide für die Tiere ebenfalls nicht toxisch sind und nicht dazu neigen, die Entstehung von resistenten Bakterien zu induzieren.

Nach Ausführungsformen der Erfindung hat das nicht-ionophore Antibiotikum keine oder nur eine schwache antibakterielle Wirkung. Dies kann den Vorteil haben, dass die Bildung von resistenten Bakterienstämmen, die aufgrund des genetischen Austauschs mit pathoge- nen Bakterienstämmen, die den Menschen befallen können, vermieden wird. Beispielswei se sind die nicht-ionophoren Antibiotika Nicarbazin, Amprolium, Diclazuril, Toltrazuril und Halofuginon nicht oder nur schwach antibakteriell. Sie wirken im Wesentlichen antiprotozo- isch.

Nach anderen Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei dem Kokzidiostatikum um ein nicht-ionophores Antibiotikum und die Tiernahrung, das Tränkwasser und/oder das Tiernahrungsergänzungsmittel ist frei von ionophoren Antibiotika.

Nach Ausführungsformen der Erfindung enthält die Substanzkombination das Nicarbazin in einer Konzentration von 20 mg bis 500 mg, vorzugsweise von 50 mg bis 200 mg pro kg Tier nahrung.

Nach anderen Ausführungsformen der Erfindung ist die Substanzkombination eine Tiernah rung, welche das Nicarbazin in einer Konzentration von 20 mg bis 500 mg, vorzugsweise von 50 mg bis 200 mg pro kg Tiernahrung enthält.

Nach anderen Ausführungsformen der Erfindung ist die Substanzkombination ein Tränk wasser, welches das Nicarbazin in einer Konzentration von 20 mg bis 500 mg, vorzugsweise von 50 mg bis 200 mg pro Liter Tränkwasser enthält.

Nach anderen Ausführungsformen der Erfindung ist die Substanzkombination ein Medika ment oder ein Tiernahrungsergänzungsmittel, welches das Nicarbazin in einer Konzentrati on enthält, die eine bestimmungsmäßige Beimischung des Medikaments oder des Tiernah rungsergänzungsmittels zu einerTiernahrung eine Tiernahrung mit einer Nicarbazinkon- zentration von 20 mg bis 500 mg, vorzugsweise von 50 mg bis 200 mg pro kg Tiernahrung ergibt.

Nach anderen Ausführungsformen der Erfindung ist die Substanzkombination ein Medika ment oder ein Tiernahrungsergänzungsmittel, welches das Nicarbazin in einer Konzentrati on enthält, die eine bestimmungsmäßige Beimischung des Medikaments oder des Tiernah rungsergänzungsmittels zu Tränkwasser ein Tränkwasser mit einer Nicarbazinkonzentration von 20 mg bis 500 mg, vorzugsweise von 50 mg bis 200 mg, pro Liter Tränkwasser ergibt. Nach Ausführungsformen wird die Substanzkombination mit den Isochinolinalkaloiden und dem Nicarbazin zur vorbeugenden und/oder akuten Behandlung von Zäkum- und Dünn darmkokzidiose bei Hühnern verwendet. Die oben genannten Konzentrationsbereiche kön nen vorteilhaft sein, da diese sicherstellen, dass ein Nutztier im Rahmen der üblicherweise aufgenommenen Mengen an Futtermitteln oder Tränkwasser eine physiologisch wirksame Menge des Nicarbazins aufnimmt, wobei die aufgenommene Konzentration nicht so hoch ist, dass hierdurch unerwünschte und inakzeptable Nebenwirkungen auftreten.

Die Verwendung von Nicarbazin kann vorteilhaft sein, da Nicarbazin gegen mehrere Arten von Eimeria aktiv ist. Im Gegensatz zu anderen Kokzidiostatika, induziert Nicarbazin nur selten Resistenzerscheinungen in den häufigsten Kokzidioseerregern, wie z.B. in Eimeria tenella.

Die Verwendung einer Kombination von ionophoren oder nicht-ionophoren Antibiotika mit Isochinolinalkaloiden kann vorteilhaft sein, da das Wirkungsspektrum dieser Kokzidostatika erhöht und die Stärke und Geschwindigkeit der Resistenzbildung verringert wird.

Nach anderen Ausführungsformen der Erfindung beinhaltet die Substanzkombination ein Kokzidioseimpfmittel anstelle eines Kokzidiostatikums. Bei dem Kokzidioseimpfmittel han delt es sich z.B. um einen Lebendimpfstoff, der sporulierte Oozysten von einer Eimeria-Art oder von mehreren Eimeria-Arten beinhaltet. Die Verwendung von Lebendimpfstoff kann vorteilhaft sein, da dieser Impfstoff wirksam für Immunität gegen Kokzidiose sorgt. Aller dings werden die Tiere bei Verwendung eines Lebendimpfstoffs zunächst zwangsläufig durch eine subklinische Kokzidiose-Infektion geschwächt, durch die das Immunsystem lernt, den Erreger zu bekämpfen. Die subklinischen Kokzidiose-Verläufe die mit der Impfung ein her gehen, führen in der praktischen Geflügelhaltung häufig zu Einbußen der Wachstums leistung und können die Tiere empfänglicher für andere Krankheitserreger machen.

Die Substanzkombination mit dem Kokzidioseimpfmittel mildert die negativen Nebenwir kungen der Impfstoffe, insbesondere der Lebendimpfstoffe, ab und sorgt für eien zuverläs sige Bildung von Immunität bei gleichzeitig geringeren Wachstumseibußen im vergleich zum alleinigen Einsatz der Vakzine. Die bakterienbezogene Resistenzproblematik bei ionophoren Kokzidostatika sowie die kok zidienbezogene Resistenzproblematik bei nicht-ionophoren Kokzidostatika hat die Tierhal ter oftmals dazu gezwungen, mehrere Anitbiotika im Wechsel einzusetzen, bis die Tiere das Schlachtalter erreicht haben. Oftmals war der Zeitraum zwischen dem ersten Auftreten von Krankheitssymptomen und der massiven Verbreitung innerhalb eines Tierbestands so kurz, dass eine Ausbreitung der Kokzidiose nicht mehr oder nur unter hohem Antibiotikaeinsatz verhindert werden konnte. Die Verwendung von Impfmitteln dagegen kann den Vorteil haben, dass der Tierhalter den Anstieg einer ggf. nur subklinisch manifestierten Kokzidiose nicht mehr ganz so engmaschig kontrollieren muss, da die Tiere ja geimpft sind. Als beson ders wirksam haben sich Impfungen mit Lebendimpfstoff erwiesen. Die Zeit von der Imp fung bis zur vollständigen Immunität beträgt bei Masthähnchen z.B. oftmals 21 bis 28 Tage, je nach den Impfstoff- und Haltungsbedingungen. Dieser lange Zeitraum ist von erhebli chem Nachteil und schränkt die Verwendbarkeit der Impfung zur Kokzisiosevorbeuge ein, da gerade im Zeitraum vom 14. bis 21. Lebenstag der höchste Infektionsdruck der Kokzidien stattfinmdet, dem Zeitraum, in dem die Impfung noch nicht ihre volle Wirksamkeit entfaltet hat. Isochinolin Alkaloide können helfen, diesen kritischen Zeitraum der Infektion durch Kokzidien wirkungsvoll zu überbrücken. Ein wesentlicher Vorteil kann auch darin liegen, dass bei einer Impfung keine Resistenzbildung des Erregers auftritt. Eine Impfung ist eine nachhaltige Maßnahme, um sowohl klinische als auch subklinische Kokzidiosen zu vermei den. Eine Impfung kann ein Fortschreiten der Kokzidiose auf einem subklinischen Niveau wirksam verhindern, was beim Einsatz von Kokzidiostatika nicht immer gelingt, da eine sub klinische Ausprägung und Ausbreitung der Krankheit schwer zu erkennen ist. Dies kann für die Tierhalter zu erheblichen wirtschaftlichen Nachteilen führen: Durch subklinische Kok zidiose hervorgerufene niedriggradige Darmläsionen können spät im Herdenzyklus auftre- ten und sich nachteilig auf die Gewichtszunahme, die Tage bis zur Vermarktung, die Futter verwertung und den Fleischertrag auswirken.

Entsprechende Impfprodukte sind auf dem Markt erhältlich, z.B. FORTEGRA ^® vom Herstel ler MSD Animal Health (in den Vereinigten Staaten und Kanada als Coccivac ^® B52 von Merck Animal Health bekannt). FORTEGRA ^® enthält die Kokzidiose-Stämme, die üblicherweise in Masthähnchenställen Vorkommen, einschließlich Stämmen von E. acervulina, E. mivati, E. maxima und E. tenella.

Nach Ausführungsformen der Erfindung enthält die Substanzkombination Pflanzenmaterial der Gattung Sanguinaria (insbesondere Sanguinaria canadensis), und/oder Pflanzenmaterial der Gattung Argemone (insbesondere Argemone mexicana), und/oder Pflanzenmaterial der Gattung Chelidonium (insbesondere Chelidonium majus), und/oder Pflanzenmaterial der Gattung Macleaya (insbesondere Macleaya cordata), oder eines Extraktes eines oder meh rerer dieser Pflanzenmaterialien, wobei die Isochinolinalkaloide Bestandteil des Pflanzen materials sind.

Nach Ausführungsformen der Erfindung sind die Isochinolinalkaloide Benzophenanthiridin- Alkaloide in physiologisch wirksamer Menge. Die Isochinolinalkaloide können insbesondere das Sanguinarin, das Chelerythrin oder eine Mischung dieser beiden Isochinolinalkaloide sein.

Gemäß einem Beispiel beinhalten die Isochinolinalkaloide eines Sanguinaria Canadensis Extrakts: 35 bis 55 Gew.-% Sanguinarin, 20 bis 30 Gew.-% Chelerythrin, und eine Mischung weiterer Isochinolinalkaloide, wie z.B. Chelirubin. In einem anderen Beispiel wurde ein San guinaria Canadensis Extrakt verwendet, bei welchem Sanguinarin und Chelerythrin jeweils einen Anteil von über 40% der Isochinolinalkaloide des Extrakts ausmachten. In manchen Ausführungsformen können auch annähernd 100% der Isochinolinalkaloidie des Extrakts aus Sanguinarin und/oder Chelerythrin bestehen. Bei dem Extrakt kann es sich z.B. um ei nen alkohloischen Extrakt handeln.

In anderen Ausführungsformen werden die Isochinolinalkaloide der Substanzkombination als einzelne chemische Substanz, die durch chemische oder biotechnologische Synthese oder durch substanzspezifische Extraktion aus Pflanzenmaterial gewonnen wurde, indivi duell zugesetzt.

Die Alkaloide können in der Substanzkombination z.B. frei Vorkommen, oder als physiolo gisch akzeptable Salze, z.B. als Sanguinarinchlorid. Nach Ausführungsformen enthält die Substanzkombination das Kokzidioseimpfmittel, ins besondere einen Lebendimpfstoff, insbesondere infektiöse Eimeria Oozysten. Die Sub stanzkombination wird dazu verwendet, alternativ oder zusätzlich zu der Behandlung von Kokzidiose auch eine impfmittelbedingten Erhöhung der Darmpermeabilität der Tiere zu behandeln, das heißt, einer Erhöhung der Darmpermeabilität der Tiere vorzubeugen oder diese zu verhindern oder abzuschwächen.

Der Anmelder hat beobachtet, dass eine Kokzidien-Impfung oftmals einhergeht mit einer Erhöhung der Darmpermeabilität, was zudem das Infektionsrisiko in Bezug auf andere Erre ger erhöht. Dieser unerwünschten Nebenwirkung der Kokzidioseimpfung kann jedoch dadurch begegnet werden, dass neben dem Impfmittel auch Isochinolinalkaloide verab reicht werden. Die Verabreichung von Impfmittel und Isochinolinalkaloiden kann auf ge trenntem Wege erfolgen. Beispielsweise ist es möglich, den Impfstoff in Form von Augen tropfen bereitzustellen und das Isochinolinalkaloid als Futterzusatzstoff.

Nach Ausführungsformen der Erfindung enthält die Substanzkombination die Isochinolinal kaloide in einer Konzentration von 0,1 mg bis 10 mg, vorzugsweise von 0,5 mg bis 5 mg pro kg Substanzkombination.

Nach Ausführungsformen der Erfindung ist die Substanzkombination eine Tiernahrung oder ein Tränkwasser. Die Substanzkombination enthält die Isochinolinalkaloide in einer Kon zentration von 0,1 mg bis 10 mg, vorzugsweise von 0,5 mg bis 5 mg pro kg Substanzkombi nation.

Nach einer weiteren Ausführungsform ist die Substanzkombination ein Tiernahrungsergän zungsmittel oder Medikament, welches die Isochinolinalkaloide in einer Konzentration ent hält, die bei bestimmungsmäßiger Beimischung der Substanzkombination in eine Tiernah rung eine Tiernahrung mit einer Isochinolinalkaloidkonzentration von 0,1 mg bis 10 mg, vorzugsweise von 0,5 mg bis 5 mg pro kg Tiernahrung ergibt.

Nach einer weiteren Ausführungsform ist die Substanzkombination ein Tiernahrungsergän zungsmittel oder Medikament, welches die Isochinolinalkaloide in einer Konzentration ent hält, die bei bestimmungsmäßiger Beimischung der Substanzkombination in ein Tränkwas- ser ein Tränkwasser mit einer Isochinolinalkaloidkonzentration von 0,1 mg bis 10 mg, vor zugsweise von 0,5 mg bis 5 mg pro Liter Tränkwasser ergibt.

Nach Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei den Nutztieren um Rinder, Kü he, Schweine, Pferde, Geflügel, Schafe, Ziegen, Kaninchen, oder Fische, und insbesondere um Geflügel, und/oder bei den Hobbytieren um Hunde oder Katzen.

Nach Ausführungsformen der Erfindung liegt die pro Tag verabreichte Menge an Isochinoli nalkaloiden zwischen 0,02 und 3,0 mg pro kg Lebendgewicht der Nutztiere oder Hobbytie re, bevorzugt zwischen 0,02 und 1,0 mg pro kg Lebendgewicht der Nutztiere oder Hobby tiere.

Nach Ausführungsformen der Erfindung ist das verwendete Kokzidiostatikum Nicarbazin.

Die pro Tag verabreichte Menge an Nicarbazin liegt bei mindestens 2 mg Nicarbazin pro kg Lebendgewicht der Nutztiere oder Hobbytiere, bevorzugt zwischen 2 und 50 mg Nicarbazin pro kg Lebendgewicht.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur vorbeugenden und/oder akuten Behandlung von Kokzidiose bei Nutztieren oder Hobbytieren. Das Verfahren ist da durch gekennzeichnet, dass es ein Füttern der Substanzkombination nach Ausführungsfor men der Erfindung an Nutztiere umfasst.

Die oben genannten Konzentrationsbereiche können vorteilhaft sein, da diese sicherstellen, dass ein Nutztier im Rahmen der üblicherweise aufgenommenen Mengen an Futtermitteln oder Tränkwasser eine physiologisch wirksame Menge der Isochinolinalkaloide aufnimmt, wobei die aufgenommene Konzentration nicht so hoch ist, dass hierdurch unerwünschte und inakzeptable Nebenwirkungen auftreten.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung einer Substanzkombina tion nach einer der hier beschriebenen Ausführungsformen zur Herstellung eines Medika ments, Tierfutters, Tränkwassers oder Nahrungsergänzungsmittels zur vorbeugenden und/oder akuten Behandlung von Kokzidiose bei Nutztieren oder Hobbytieren. In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine Substanzkombination zur Verwendung zur Be handlung von Kokzidiose bei Nutztieren oder Hobbytieren unter Reduktion unerwünschter Nebenwirkungen, insbesondere erhöhter Darmdurchlässigkeit bei Kokzidioseimpfmitteln und/oder entzündlichen Prozessen bei Kokzidiostatika oder Kokzidioseimpfmitteln. Die Substanzkombination enthält Isochinolinalkaloide und enthält zudem ein Kokzidiostatikum oder ein Kokzidioseimpfmittel. Gemäß Ausführungsformen hat die Substanzkombination die Eigenschaften, die bereits bezüglich der Eigenschaften der Substanzkombination zur Verwendung zur Behandlung von Kokzidiose bei Nutztieren oder Hobbytieren hier be schrieben sind.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung einer Substanzkombina tion nach einer der hier beschriebenen Ausführungsformen zur Herstellung eines Medika ments, Tierfutters, Tränkwassers oder Nahrungsergänzungsmittels zur Behandlung von Kokzidiose bei Nutztieren oder Hobbytieren unter Reduktion unerwünschter Nebenwirkun gen, insbesondere erhöhter Darmdurchlässigkeit bei Kokzidioseimpfmitteln und entzündli chen Prozessen bei Kokzidiostatika oder Kokzidioseimpfmitteln.

Nach Ausführungsformen sind die Isochinolinalkaloide Benzophenanthridinalkaloide, vor zugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sanguinarin und/oder Chelerythrin und/oder deren Salzen.

Dies kann vorteilhaft sein, da alkaloidhaltige Pflanzenextrakte kostengünstig herstellbar sind und keine Antibiotikaresistenzen verursachen.

Isochinolinalkaloide sind biologisch abbaubar und können als Naturprodukt (Pflanzenex trakt) in vergleichsweise großen Mengen gewonnen werden. Dies entspricht auch den Wünschen des Konsumenten nach einem naturbelassenen Lebensmittel und einer nachhal tigen, umweltfreundlichen und im Hinblick auf die Entwicklung multiresistenter Erreger unbedenklichen Lebensmittelproduktion.

Somit kann in manchen Fällen auf den Einsatz von ionophoren Antibiotika, die in manchen Ländern verboten sind, verzichtet werden, oder der Einsatz von solchen Antibiotika kann reduziert werden. Ein Medikament oderTiernahrungsergänzungsmittel nach einem der hier beschriebenen Ausführungsformen kann zur Erzeugung der Tiernahrung bzw. des Tränkwassers nach ei nem der hierin beschriebenen Ausführungsformen verwendet werden. Das Tiernahrungs ergänzungsmittel kann beispielsweise eine (Tiernahrungs)vormischung oder ein Konzentrat sein, das sowohl Isochinolinalkaloide als auch ein Kokzidiostatikum oder ein Kokzidiose impfmittel enthält. Beispielsweise können Dosierempfehlungen auf der Verpackung des Tiernahrungsergänzungsmittels so lauten, dass bei empfehlungsgemäßer Dosierung eine Tiernahrung bzw. ein Tränkwasser nach den hier beschriebenen Ausführungsformen beim Endabnehmer erzeugt wird.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Nutztie ren oder Hobbytieren gegen Kokzidiose, wobei das Verfahren die Bereitstellung (Verfütte- rung) einer Substanzkombination nach einer der hier beschriebenen Ausführungsformen an Nutztiere oder Hobbytiere beinhaltet. Die Bereitstellung kann z.B. in einem Befüllen eines Futtertrogs oder eines Futterautomaten mit entsprechender Tiernahrung oder dem Befül len einer Tränkanlage oder eines Wassertrogs mit einem entsprechenden Tränkwasser oder sonstiger Formen der Bereitstellung der erfindungsgemäßen Substanzkombination an Nutz tiere oder Hobbytiere bestehen. Die Substanzkombination kann fest oder flüssig sein. So wird hier z.B. auch die sogenannte „Kälbermilch" als Tiernahrung verstanden, welche die genannte Kombination von einem oder mehreren Isochinolinalkaloiden einerseits und ei nem Kokzidiostatikum oder einem Kokzidioseimpfmittel andererseits beinhaltet. Die Zu sammensetzung und Darreichungsform kann in Abhängigkeit von der Tierart (z.B. Geflügel, Rinder, Schweine, Schafe, Ziegen, Kaninchen, Hund, Katze etc.), dem Alter der Tiere und dem Verfütterungsort (Stall, Freiland, etc.) variieren.

Optional kann die Substanzkombination weitere Zusatzstoffe wie Vitamine, Spurenelemen te, Aminosäuren, Kräuter, Geschmacksstoffe etc. beinhalten. Das Isochinolinalkaloid kann der Substanzkombination in Form eines Pflanzenextrakts zugegeben werden, welcher z.B. Alkaloide wie Sanguinarin und/oder Chelerythrin enthält.

Nach Ausführungsformen der Erfindung ist die Substanzkombination als Substanzmischung, insbesondere als homogen gemischte flüssige oder feste Substanzmischung, ausgebildet. Beispielsweise kann die Substanzkombination ein Medikament, eine Tiernahrung, ein Tier nahrungsergänzungsmittel, oder ein Tränkwasser sein, welches bereits sowohl die Isochino linalkaloide als auch das Kokzidiostatikum oder das Kokzidioseimpfmittel beinhaltet.

Nach anderen Ausführungsformen ist die Substanzkombination als Behandlungsset ausge bildet. Das Behandlungsset beinhaltet mindestens zwei Komponenten, wobei eine der Komponenten die Isochinolinalkaloide und die andere Komponente das Kokzidiostatikum oder das Kokzidioseimpfmittel enthält. Eine Komponente kann z.B. als Flasche, Glasampul le, Tube oder sonstiges portables Behältnis ausgebildet sein, sodass sich die einzelnen Komponenten unabhängig voneinander bewegen und handhaben lassen. Beispielsweise kann ein Behandlungsset aus zwei Behältnissen bestehen, wobei das eine Behältnis Tier nahrungszusatzstoffe einschließlich der Isochinolinalkaloide beinhaltet und das andere Be hältnis eine kleine Glasampulle oder kleines Glasbehältnis mit einem Kokzidioseimpfstoff. Dies kann z.B. die Lagerung vereinfachen, da einzelne Komponenten, insbesondere die Komponente mit einem Kokzidioseimpfmittel, gekühlt oder besonders geschützt aufbewart werden können, was für die Lagerung der Isochinolinalkaloid-Komponente in der Regel nicht erforderlich ist.

Unter „Nutztieren" wird hier jegliche Tierart verstanden, die von Menschen aus kommerzi ellen Gesichtspunkten gehalten, gemästet und/oder vermehrt wird, insbesondere von land lebenden Säugetieren (insb. Schwein, Rind, Ziege und Schaf) und Geflügel, aber auch Fi sche.

Unter „Hobbytieren" werden hier Haustiere verstanden sowie Tiere, die für sonstige Zwe cke von Menschen gehalten werden, z.B. zum Zwecke der Unterhaltung, des Sports oder für edukative Zwecke (z.B. Zoostiere und Aquariumfische). Zu den Hobbytieren gehören z.B. Hund und Katze oder Kaninchen, Meerschweinchen etc., die z.B. im Haushalt gehalten wer den und die alle ebenfalls an Kokzidien erkranken können.

Unter einer „Kokzidiose" wird hier eine Erkrankungen durch Einzeller, die sogenannten Kokzidien (Klasse: Sporozoen), verstanden. Sie gehören zu den Protozoeninfektionen. Die Kokzidien befallen vor allem den Darm, bei einigen Tieren auch Leber und Niere. Die Kok- zidiose der Hühnervögel ist eine häufige parasitäre Erkrankung der Hühnervögel. Sie wird durch bestimmte Einzeller (Protozoen), den sogenannten Kokzidien verursacht, die der Gat tung Eimeria angehören. Die Kokzidiosen der Hühnervögel sind vornehmlich Darmkokzidio sen.

Unter einer „Behandlung" von Tieren wird hier eine Verabreichung zumindest einer physio logisch gegen eine bestimmte Krankheit wirksamen Substanz an Tiere verstanden, nach dem, während, oder bevor diese Krankheit erkennbar in einem oder mehreren dieser Tiere ausgebrochen ist.

Unter einer „Vorbeugung" bzw. „vorbeugender Behandlung" wird hier eine Verabreichung von zumindest einer physiologisch gegen eine bestimmte Krankheit wirksamen Substanz an Tiere verstanden, bevor diese Krankheit erkennbar in einem oder mehreren dieser Tiere ausgebrochen ist. Eine vorbeugende Behandlung kann in einer Impfung oder in der vorbeu genden Verabreichung von akut wirkenden Substanzen, z.B. Kokzidiostatika, bestehen (die zwar keinen Impfeffekt haben, aber zumindest gegen latent schon vorhandene Erreger, die noch keine sichtbaren Symptome bewirkt haben, wirken können).

Unter einer „Akutbehandlung" wird hier eine Verabreichung von zumindest einer physiolo gisch gegen eine bestimmte Krankheit wirksamen Substanz (z.B. Kokzidiostatika) an Tiere verstanden, nachdem diese Krankheit erkennbar in einem oder mehreren dieser Tiere aus gebrochen ist.

Unter einem „Kokzidioseimpfmittel" wird hier ein Impfmittel (auch „Vakzin") verstanden, das ein Tier vor der übertragbaren Krankheit Kokzidiose oder zumindest einigen Kokzidiose formen schützt. Ein Kokzidioseimpfmittel bewirkt eine Aktivierung des Immunsystems ge gen spezifische Stoffe, die mit einer Infektion durch einen oder mehrere Kokzidioseerreger einhergehen. Impfungen wurden als vorbeugende Maßnahme gegen Infektionskrankheiten entwickelt. Eine Impfung befähigt das körpereigene Immunsystem auf eine Infektion mit dem Erreger so rasch und wirksam zu reagieren, dass daraus keine oder nur eine abge schwächte Infektionskrankheit resultiert. Ein Impfmittel kann z.B. ein Lebendimpfstoff oder ein Totimpfstoff (z.B. Toxoidimpfstoffe) sein. Unter einem „Kokzidiostatikum" wird hier ein Wirkstoff verstanden, der vorbeugend oder akut gegen den Befall von Tieren mit Kokzidien-Arten einsetzbar ist. Kokzidiostatika sind oftmals Antiprotozoenmittel, z.B. Amprolium, Arprinocid, Artemether, Clazuril, Clopidol, Decoquinat, Diclazuril, Dinitolmid, Ethopabate, Maduracmicin, Semduramicin, Halofuginon, Lasalocid, Monensin, Narasin, Nicarbazin, Oryzalin, Ponazuril, Robenidin, Roxarson, Salino- mycin, Spiramycin, Sulfadiazin, Sulfadimethoxin, Toltrazuril. Gemäß Ausführungsformen besteht das Kokzidiostitikum aus einem oder mehreren der vorgenannten Kokzidiostatika.

Unter einem „Antibiotikum" wird hier eine teilsynthetische, vollsynthetische oder natürlich (z.B. durch Fermentation) gebildete Substanz, oder ein Substanzgemisch verstanden, wel ches schon in geringer Konzentration das Wachstum von Mikroorganismen hemmt oder diese abtötet. Bei den Mikroorganismen kann es sich um Bakterien, Protozoen, Pilze, oder Viren handeln. Insbesondere kann das Antibiotikum als Antiprotozoikum ausgebildet sein, z.B. als Kokzidiostatikum. Unter der Bezeichnung Antibiotikaresistenz werden Eigenschaften von Mikroorganismen wie Bakterien oder Pilze zusammengefasst, welche ihnen ermögli chen, die Wirkung von antibiotisch aktiven Substanzen abzuschwächen oder ganz zu neut ralisieren.

Kurzbeschreibung der Figuren

Einige Ergebnisse empirischer Tests bezüglich der Wirksamkeit einer Kombination aus Iso chinolinalkaloiden einerseits und unterschiedlichen Klassen von Kokzidiostatika oder eines Kokzidioseimpfmittels andererseits und sind in den nachfolgenden Figuren veranschaulicht. Darin zeigen:

Figur 1 ein Foto von 80 Masthähnchen unter ähnlichen Haltungsbedingungen wie die in dem Test untersuchten Tiergruppen,

Figur 2 ein Foto einer Impfung eines Kükens unter Versuchsbedingungen,

Figur 3 eine Tabelle mit Komponenten der verwendeten Futtermischungen während der Testlaufzeit, Figur 4 eine Tabelle mit Eimeria Läsionsscores der getesteten Masthähnchengruppen im Alter von 14 Tagen,

Figur 5 eine Tabelle mit Eimeria Läsionsscores der getesteten Masthähnchengruppen im Alter von 28 Tagen, Figur 6 eine Tabelle mit Eimeria Läsionsscores der getesteten Masthähnchengruppen im Alter von 42 Tagen,

Figur 7 eine Tabelle mit Sterblichkeiten der getesteten Masthähnchengruppen, Figur 8 eine Tabelle mit kumulierten Sterblichkeiten der getesteten Masthähnchen gruppen, Figur 9 eine Tabelle mit Gewichtszunahmen verschiedener getesteter Masthähnchen gruppen,

Figur 10 eine Tabelle mit kumulierten Gewichtszunahmen der getesteten Masthähn chengruppen,

Figur 11 eine Tabelle mit Futterverwertungsraten der getesteten Masthähnchengrup- pen,

Figur 12 eine Tabelle mit kumulierten Futterverwertungsraten der getesteten Mast hähnchengruppen,

Figur 13 eine Tabelle mit Futteraufnahmemengen der getesteten Masthähnchengrup- pen, Figur 14 eine Tabelle mit kumulierten Futteraufnahmemengen der getesteten Mast hähnchengruppen,

Figur 15 die beobachteten Läsionsscores in Masthänchen in einer weiteren Wirksam keitsstudie,

Figur 16 die beobachtete Oocystenzahl in Ausscheidungen der Tiere der weiteren Stu die,

Figur 17 die beobachtete Oocystenmasse in Ausscheidungen der Tiere der weiteren Studie,

Figur 18 zeigt den schützenden Einfluss von Isochinolinalkaloiden auf die Barrierewir kung der Darmwand bei der Verabreichung eines Kokzidiose-Impfmittels, Figur 19 zeigt die Reduktion von kokzidienmittelbedingten Entzündungen durch Zugabe von Isochinolinalkaloiden, und

Figur 20 zeigt Daten eines weiteren Experiments, welche die Kompensation der Impf nebenwirkung auf die Darmpermeabilität durch Isochinolinalkaloide belegt.

Ausführliche Beschreibung

Im Folgenden wird die Wirksamkeit von Substanzkombinationen gemäß verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung gegen Kokzidiose bei Masthähnchen anhand experimen teller Daten veranschaulicht.

Figur 1 zeigt ein Foto von 80 Masthähnchen unter ähnlichen Haltungsbedingungen wie die in dem Test untersuchten Tiergruppen. Der Test hatte zum Ziel, den Effekt einer Kombina tion aus Isochinolinalkaloiden (Sanguinarin und Chelerythrin) mit bekannten Kokzidiostatika oder Kokzidioseimpfmitteln auf Kokzidien und die von diesen beeinträchtigte Darmgesund heit von Masthähnchen zu ermitteln. Es sollte gezeigt werden, ob der kombinierte Einsatz bekannter Anti-Kokzidiosemittel mit Isochinolinalkaloiden die Kontrolle von Kokzidieninfek tionen verbessern kann.

Um dies herauszufinden, wurden die Masthähnchen Kokzidien-Oocysten ausgesetzt. Unter sucht wurden mehrere kommerziell genutzte antikozidiale Behandlungsoptionen, beste hend aus einem nicht-ionophoren Kokzidiostatikum (Nicarbazin), einem ionophoren anti mikrobiellen Kokzidiostatikum (Salinomycin) und einer Impfung. Da Kokzidiostatika häufig Resistenzen induzieren, und da auch die Impfung einige kritische Schwächen hat, die die Gesundheit der Tiere beeinflussen können, sollte untersucht werden, ob die Nachteile der Monotherapien bzw. der Impfung als alleinige Maßnahme durch die Kombination mit den Isochinolin-Alkaloiden überwunden werden können.

DerTest wurde am 7. Februar 2019 auf Basis von 1.782 einem Tag alten männlichen „Cobb 500" Masthähnchen begonnen. Die Küken wurden nach dem Zufallsprinzip in 11 Tiergrup pen aufgeteilt. Die Tiere der Tiergruppe wurden 10 unterschiedlichen Behandlungen unter zogen. Insgesamt wurden 99 Versuchsabteile mit jeweils 18 Tieren verwendet, was einer Dichte von BO kg/m2 (6.14 Ibs/ft2) am Ende der Studie entsprach. Die 99 Versuchsabteile sind in einer kommerziellen Versuchsabteilanlage von 14 x 130 m untergebracht. Jedes Ver suchsabteil ist 1,7 x 1,7 m groß.

Im Zuge der Studie wurde eine experimentelle Infektion der Masthähnchen mit einer kommerziell erhältlichen Mischung von Lebendstämmen pathogener Kokzidiose Eimeria Erregern durchgeführt. Hierfür wurden jedem Küken am Tag 10 seines Lebens oral sporu- lierte Oozysten mehrerer Kokzidienarten verabreicht, nämlich je 35.000 Eimeria (E.) acervu- lina, je 10.000 E. maxima und 10.000 E. tenella.

Es wurde ein altes Einstreumaterial verwendet, um darüber hinaus eine natürlichere Infek tion mit in der Umwelt natürlicherweise vorkommenden Kokzidien zu bewirken. Als Ein streu wurden Kiefernhobelspäne verwendet, auf welchen bereits drei Generationen Mast hähnchen gehalten wurden. Jeder der Tiergruppen wurde Wasser und Futter ad libitum (zur freien Verfügung) bereitgestellt. Die Masthähnchen wurden in Abhängigkeit von ihrem Alter mit vier unterschiedlichen Varianten eines Mais-Soja-Futters gefüttert, die ausnahms los pflanzlich waren und deren Zusammensetzung aus der Tabelle 1 in Figur 3 hervorgeht.

Während der gesamten Studie wurden dem Tierfutter der Tiergruppen, die eine Kombina tionstherapie aus Isochinolinalkaloiden und einem Kokzidiostatikum oder einem Kokzidio seimpfstoff erhielten, die entsprechende Substanzkombination hinzugefügt. Das Wasser wurde nicht behandelt. Die dem Futter der Tiergruppen zugesetzten Isochinolinalkaloide bestanden aus einer Isochinolinalkaloidmischung, die zu ca. 50% aus Sanguinarin und zu ca. 50% aus Chelerythrin bestand.

Die Tiergruppen wurden wie folgt behandelt:

1. Kontrollgruppe (nicht aktiv infiziert, kein Futtermittelzusatz oder Impfstoff)

2. infizierte Kontrollgruppe (mit Kokzidien infiziert, kein Futtermittelzusatz oder Impf stoff)

3. infiziert wie Gruppe 2, behandelt mit nicht-ionophorem Antibiotikum (Nicarbazin - Nicarmix 100 ppm, Phibro) 4. infiziert wie Gruppe 2, behandelt mit ionophorem Antibiotikum (Salinomycin (Sacox 66 ppm, Huvepharma)

5. infiziert wie Gruppe 2, behandelt mit Impfstoff (Fortegra, MSD, wie Coccivac B52)

6. infiziert wie Gruppe 2, behandelt mit nicht-ionophorem Antibiotikum + 1 mg Isochi nolinalkaloidmischung/kg Futter

7. infiziert wie Gruppe 2, behandelt mit nicht-ionophorem Antibiotikum + 2 mg Isochi nolinalkaloidmischung/kg Futter

8. infiziert wie Gruppe 2, behandelt mit ionophorem Antibiotikum + 1 mg Isochinoli nalkaloidmischung/kg Futter

9. infiziert wie Gruppe 2, behandelt mit ionophorem Antibiotikum + 2 mg Isochinoli nalkaloidmischung/kg Futter

10. infiziert wie Gruppe 2, behandelt mit Impfstoff + 1 mg Isochinolinalkaloidmi schung/kg Futter

11. infiziert wie Gruppe 2, behandelt mit Impfstoff + 2 mg Isochinolinalkaloidmi schung/kg Futter

Die Isochinolinalkaloide (50% Sanguinarin, 50% Chelerythrin) basieren auf einer ethanoli- schen Extraktion einer Mohnpflanze. Die Basisquelle der Alkaloide sind botanischer Natur und stammen entweder aus der Mohngattung Sanguinaria canadensis oder Macleaya Cordata. Das geerntete Material wird durch einen Säureaufschluss des die Alkaloide enthal tenden Fasermaterials vorbehandelt, indem eine flüssige pflanzenzellwand-aufbrechende Säure, vorzugsweise Salzsäure und Cellulase-Enzyme, zugegeben wird, um die faserige Zell struktur, die die Alkaloide enthält, aufzubrechen. Nach dem säure-enzymatischen Auf schluss des Pflanzenmaterials wird die Säure mit einem Neutralisationsmittel, vorzugsweise Natriumhydroxid oder einer Calciumhydroxid-Brühe, neutralisiert. Die Alkaloide werden dann aus dem pflanzlichen Fasermaterial gelöst und können aus der aufbereiteten pflanzli chen Biomasse durch Zugabe eines Lösungsmittels, vorzugsweise Ethanol, extrahiert wer- den. Der Alkaloid-Ethanol-Extrakt ist eine rot gefärbte, flüssige Lösung. In einem weiteren Schritt folgt eine Kristallisation durch Zugabe von Salzsäure oder Schwefelsäure. Das Etha nol wird durch einen Trocknungsprozess in einem Ofen oder einer anderen Sprühtrock nungstechnologie entfernt und das Endprodukt wird durch Mikronisierung zum Produkt hergestellt.

Das nicht-ionophore Antibiotikum der Gruppe 6 und 7 ist identisch zu dem der Gruppe S. Das ionophore Antibiotikum der Gruppe 8 und 9 ist identisch zu dem der Gruppe 4. Die Iso chinolinalkaloide wurden den Tiergruppen 6-11, das nicht-ionophore Antibiotikum den Tiergruppen 3, 6 und 7, und das ionophore Antibiotikum den Tiergruppen 4, 8 und 9 jeweils über das Futter verabreicht. Die Impfung bei den Tiergruppen 5, 10 und 11 erfolgte über das Auge, wie in Figur 2 dargestellt. Das Impfmittel war also nicht dem Futter beigemischt, dies kann aber eine alternativ mögliche Verabreichungsform darstellen.

Alle Daten wurden mittels einer Einweg-ANOVA mit SAS nach Prüfung auf Homoskedastizi- tät analysiert. Daten, die keine Normalverteilung aufwiesen, wurden transformiert (loglO). Ausreißer (außerhalb des +-2,5 SD-Bereichs) wurden aus der Datenbank entfernt. Die Er gebnisse der Kokzidiose-Score-Läsionen wurden mit der Statistiksoftware Statistix 9 ausge wertet und mit dem Shapiro-Wilk-Normalitätstest analysiert. Die parametrischen Daten wurden mit der Varianzanalyse (ANOVA) und dem Tukey-Test für die Mittelwerte mit einer signifikanten Differenz (P<0,05) unterlegt. Nichtparametrische Daten wurden dem Kruskal- Wallis-Test unterzogen (P<0,05).

Als Nullhypothese gilt die Annahme, dass kein Zusammenhang zwischen dem gemessenen Parameter und der Behandlungsvariante relativ zur Behandlung einer Vergleichsgruppe besteht und eventuelle Abweicher folglich „zufällig" sind. Der P-Wert (nach R. A. Fisher) gibt dabei jeweils die Wahrscheinlichkeit dafür an, dass - unter der Bedingung, dass die Nullhypothese in Wirklichkeit gilt - der beobachtete Wert der Prüfgröße erhalten wird. Der p-Wert kann als das kleinste Signifikanzniveau interpretiert werden, bei dem die Nullhypo these gerade noch verworfen werden kann. Ist der p-Wert „klein" (kleiner als ein vorgege benes Signifikanzniveau; allgemein < 0,05), so lässt sich die Nullhypothese ablehnen. In die sem Fall kann man davon ausgehen, dass die Alternativhypothese gilt und damit ein be- stimmter Zusammenhang besteht (z. B. eine bestimmte Behandlung wirksam ist). Wenn die Nullhypothese zugunsten der Alternativhypothese verworfen wird, wird das Resultat als „statistisch signifikant" bezeichnet.

Die nachfolgenden Versuchsdaten zeigen, dass eine Kombinationstherapie aus Isochinoli nalkaloiden und Kokzidostatika bzw. Kokzidioseimpfstoffen eine stärkere antikokzidale Wir kung hat als eine Monotherapie mit den entsprechenden Kokzidostatika bzw. Impfmitteln. Ersichtlich ist dies insbesondere anhand von kokzidien-induzierten Läsionsscores, Eimeria (Coccidia) Oozystenzählung und die Mortalität der betroffenen Tiere (Figuren 4-8). Die nachfolgenden Messwerte stellen die wichtigsten Parameter der Kokzidioseprävention bzw. -behandlung dar. Ein gutes Präventionsprogramm führt auch zu einer besseren Le bensleistung der Vögel als Folge der geringeren Infektionsrate der verschiedenen Darm kompartimente mit den Eimeria-Arten. Zu diesen indirekten positiven Effekten der besse ren Darmgesundheit gehört auch eine bessere Futterverwertungsrate, was für den Land wirt von größtem kommerziellen Interesse ist (Figuren 9-14).

Figur 3 zeigt eine Tabelle mit Komponenten der vier verwendeten Futtermischungen wäh rend der Testlaufzeit. Das Futter „Start" wurde an den Tagen 1-14 verabreicht, das Futter „Wachstum" an den Tagen 15-28, das Futter „Wachstumsende" an den Tagen 29-44, und das Futter „Entnahme" an den Tagen 45-53.

Figuren 4, 5 und 6 zeigen jeweils eine Tabelle mit Eimeria Läsionsscores der getesteten Masthähnchengruppen im Alter von 14, 28 und 42 Tagen.

Eimerien sind eine Gattung von Sporozoen, die verschiedene Arten umfasst, die die Krank heit Kokzidiose bei Tieren wie Rindern, Geflügel und kleineren Wiederkäuern, einschließlich Schafen und Ziegen, verursachen können. Die Arten dieser Gattung infizieren eine Vielzahl von Wirten, darunter Geflügel, Rinder, Schafe, Ziegen, aber auch Fische, Fledermäuse, Schildkröten, Robben, Nagetiere, Lamas und Alpakas. Die häufigsten Eimeria-Arten, die Kokzidiose bei Rindern verursachen, sind E. bovis, E. zuernii und E. auburnensis. Bei einem jungen, anfälligen Kalb können schätzungsweise nur 50.000 infektiöse Oozysten eine schwere Krankheit verursachen. Eimerieninfektionen sind besonders schädlich für die Ge- flügelindustrie und kosten die Vereinigten Staaten jährlich mehr als 1,5 Milliarden Dollar an Verlusten. Die wirtschaftlich wichtigsten Arten bei Hühnern sind E. tenella, E. acervulina und E. maxima.

Die Darmgesundheit wurde durch makroskopische Untersuchung von 1 zufällig sezierten Vogel pro Versuchsabteil untersucht. Die Darmtrakte wurden individuell untersucht und auf das Auftreten von Läsionen, die auf Kokzidiose und / oder nekrotisierende Enteritis hindeu ten, untersucht und bewertet.

Die Tabelle der Figur 4 zeigt, dass die Infektion der zweiten Kontrollgruppe („Gruppe 2") mit Kokzidien erfolgreich durchgeführt wurde: die jeweiligen Eimeria-Läsionsscores in dieser Gruppe 2 waren im Vergleich zu den Gruppen mit antikozidialer Intervention signifikant höher. Die Gruppen mit der kombinierten Anwendung des Antikozidienmedikaments oder Impfstoffs und der Isochinolinalkaloide hatten ähnliche oder zahlenmäßig bessere Läsions- scores als die Gruppen, in denen das Medikament als Monotherapie, also ohne die Isochi nolinalkaloide, angewendet wurde.

Die Tabelle der Figur 5 zeigt die Läsionsscores am 28. Lebenstag der Masthähnchen. In die sem Alter wirt allgemein die höchste Kokzidien-Infektionsrate und Ausprägung beobachtet. Die Tabelle zeigt, dass die Infektion mit Kokzidien erfolgreich durchgeführt wurde (Gruppe 2) und die jeweiligen Eimeria-Läsionen-Scores in dieser Gruppe signifikant höher waren als in den Gruppen mit antikozidialer Intervention. Die Gruppen mit der kombinierten Anwen dung des Antikozidienmedikaments oder Impfstoffs und der Isochinolin-Alkaloide hatten ähnliche oder zahlenmäßig bessere Läsionsscores als die Gruppen, in denen das Medika ment ohne die Isochinolinalkaloide angewendet wurde.

Die Tabelle der Figur 6 zeigt die Läsionsscores am 42. Lebenstag der Masthähnchen. Auch für diesen Zeitpunkt wurde beobachtet, dass Tiergruppen mit der kombinierten Anwen dung des Antikozidienmedikaments oder Impfstoffs und der Isochinolin-Alkaloide ähnliche oder zahlenmäßig bessere Läsionsscores hatten als die Gruppen, in denen das Medikament ohne die Isochinolinalkaloide angewendet wurde. Die Tabelle der Figur 7 zeigt die Mortalität der Masthähnchen dieses Tests. Die Mortalität wurde während des gesamten Versuchszeitraums täglich aufgezeichnet. Die Mortatlität ist sowohl ein wichtiger medizinischer als auch ein ökonomischer Parameter einer Kokzidiose- Infektion. Die Sterblichkeitsrate der Gruppe 2 beweist, dass die Infektion der Gruppen 2-11 mit Kokzidien erfolgreich durchgeführt wurde. Zudem waren auch die Läsionsscores in Gruppe 2 signifikant höher als in anderen Grupppen.

Die Tiergruppen mit einer „Kombitherapie" (Isochinolinalkaloid + Kokzidiostatikum oder Impfstoff) hatten in der wirtschaftlich kritischsten Phase von Tag 29 bis 44 eine ähnliche oder signifikant niedrigere Mortalität als die Gruppen, in denen das Medikament ohne die Isochinolin-Alkaloide angewendet wurde. Ein enormer ökonomischer Nutzen wurde durch die Kombination des chemischen Medikaments Nicarbazin mit den Isoquinolin-Alkaloiden in der Mortalität während der letzten Tage nachgewiesen, als die Vögel bereits ihr gesam tes Futter verbraucht hatten und somit bereits eine hohe Investition getätigt worden war. Die Kombination reduzierte die Mortalität auf 0%, während alle anderen Gruppen eine leicht niedrige oder moderate Mortalität auch unter einem Kokzidiosepräventionspro gramm hatten. Das Nicarbazin allein war signifikant weniger wirksam als die Kombination von Nicarbazin mit den Isochinolinalkaloiden.

Die Tabelle der Figur 8 zeigt die kumulative Mortalität der Masthähnchen des Versuchs. Figur 8 lässt erkennen, dass die Infektion mit Kokzidien erfolgreich durchgeführt wurde (Gruppe 2) und die entsprechenden Eimeria-Läsionen in dieser Gruppe signifikant höher waren als in den Gruppen mit antikokzidialer Intervention. Die Gruppen mit der kombinier ten Anwendung des Antikozidienmedikaments oder Impfstoffs und der Isochinolinalkaloide hatten eine ähnliche oder signifikant niedrigere Mortalität als die Gruppen, in denen das Medikament ohne die Isochinolin-Alkaloide angewendet wurde. Die deutlich niedrigste Mortalität aller Gruppen ergab sich bei der Kombination von Nicarbazin mit den Isochinoli nalkaloiden.

Die Ergebnisse der Läsionsscore-Analyse des Darmgewebes der Vögel in den verschiedenen Mastphasen beweisen eindeutig, dass die Infektion stattgefunden hat und erfolgreich in die Vögel eingebracht wurde, die Differenz der Läsionsscore zwischen Gruppe 2 und den ande ren zeigt diesen Effekt.

Alle Interventionen zeigen eine verbesserte Darmgesundheit, ersichtlich durch geringere Läsionsscore-Zahlen und sind somit ein Beweis für das Konzept.

Weitere molekularbiologische Untersuchungen bezüglich der Blutplasmakonzentrationen von FITC-Dextran-, TNF-alpha und IL-10 (siehe auch Figuren 18-20) haben die erhöhte Wirk samkeit eines Kombipräparates mit Isochinolinalkaloiden bestätigt.

FITC-Dextran- und TNF-alpha Konzentrationen der getesteten Masthähnchengruppen sind Biomarker, die Auskunft über die Stärke des Kokzidienbefalls und der hierdurch induzierten körperlichen Reaktionen geben.

FITC-Dextran ist ein Marker für die Permeabilität des Darms, die bei Kokzidiose erhöht sein kann. Einmal oral verabreicht, durchquert dieser fluoreszierende Marker den Magen-Darm- Trakt und durchquert passiv das Darmepithel. Die mit einem Fluorimeter leicht zu bestim mende Konzentration von 4-kDa FITC-Dextran im Blutplasma stellt ein Maß für die parazel luläre Permeabilität des Darmepithels dar.

Tumornekrosefaktor (kurz: TNF) ist ein multifunktionaler Signalstoff (Zytokin) des Immun systems, welcher bei lokalen und systemischen Entzündungen beteiligt ist. Er kann als Krankheitsindikator bezüglich Kokzidiose herangezogen werden. lnterleukin-10 (oder kurz: ILIO) gehört innerhalb der Zytokine zu den Interleukinen. Es hat zahlreiche Funktionen in der Regulation des Immunsystems. Es ist eines der wichtigsten antientzündlichen Zytokine und wichtig zur Entwicklung der Immuntoleranz lnterleukin-10 ist ein wesentlicher Immunmodulator im Intestinaltrakt. Ein Mangel geht mit einer Veran lagung zu chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wie Morbus Crohn oder Colitis ulce rosa einher. Ein erhöhter IL-10 Wert ist ein Krankheitsindikator bezüglich Kokzidiose.

Zur Messung der FITC-Dextran Werte erhielten die Masthähnchen oral am Tag 28 (8. März) eine Dosis von 4,16 mg FITC-d (MW 3.000-5.000, FD4, Sigma Aldrich Ca., Saint Louis, MO) pro Vogel. Es wurde Blut 2,5 Stunden danach entnommen. Die Blutproben wurden für 3 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt, um die Gerinnung zu ermöglichen, und dann zur Separation des Seerums zentrifugiert (500 x g für 15 min). Das Serum wurde verdünnt (1: 1 PBS) und bei einer Wellenlänge von 528 nm gemessen. Die Konzentration von FITC-d pro mL Serum wurde dann auf der Basis eines Standards berechnet (Baxter et al., 2017).

Ebenfalls am Tag 28 (8. März) wurden vier weitere Masthähnchen nach dem Zufallsprinzip aus jeder Tiergruppe ausgewählt und Blutproben aus den Flügelvenen in heparinisierten Röhren entnommen. Die Blutproben wurden auf Eis gelagert, bei 2.500 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und das Plasma bis dahin bei -80 °C gelagert. Es wurden die Plasmakonzent rationen fürTNF-alpha und IL-10 alpha gemessen. Es stellte sich heraus, dass eine Kom bitherapie bzw. Kombiimpfung unter Verwendung von Isochinolinalkaloiden die Plasma werte sowohl von TNF-alpha also auch von IL-10 gegenüber der Monotherapie bzw. alleini gen Impung senkt, teilweise sogar deutlich senkt. Dies lässt auf eine verbesserte Wirksam keit einer Kombinationsimpfung mit Isochinolinalkaloid schließen im Verlgeich zur reinen Impfung ohne Isochinolinalkaloide.

Die Ergebnisse der in Figuren 1-14 veranschaulichten Studie zeigen, dass ein Kokzidioseprä ventionskonzept, bei dem ein Impfstoff oder ein Kokzidiostatikum in Kombination mit Iso chinolinalkaloiden verabreicht wird, einen verbesserten Schutz vor bzw. eine verbesserte Bekämpfung einer bestehenden Kokzidiose bewirkt im Vergleich zu einer Verabreichung als Monotherapie ohne Isochinolinalkaloide. Darüberhinaus konnte z.B. für das nicht- ionophore Antibiotikum Nicarbazin gezeigt werden, dass zumindest in Kombination mit Isochinolinalkaloiden auch ein nicht-ionophores Antibiotikum ein wirksames Instrument für großflächige Geflügelmastbetriebe ist, um diese wirtschaftlich bedeutendste Krankheit zu verhindern.

Die derzeit in 85 % aller Betriebe weltweit angewandte Praxis ist der Einsatz von ionopho- ren Antibiotika als Kokzidiostatikum (Monensin, Narasin, Maduramycin, Salinomycin, Lasa- locid etc.) oder Kombinationen von antimikrobiellen Medikamenten mit nicht-ionophoren Antibiotika wie die Mischung Maxiban (Narasin & Nicarbazin). Der Einsatz von Antibiotika, insbesondere von ionophoren Antibiotka, hat aber den großen Nachteil, dass befürchtet wird, dass sie die Verbreitung von Resistenzmutationen bei Bakterien fördern. Aufgrund des Drucks der Verbraucher, die Verwendung von resistenzinduzierenden antimikrobiellen Mitteln in landwirtschaftlichen Betrieben zu reduzieren, liegt es im Interesse der Landwirte, neue Interventionssysteme gegen Kokzidiose zu entwickeln, die ebenso gut wie die bekann ten ionophoren Antibiotika wirken, ohne die besagten Nachteile zu haben.

Ausführungsformen der Erfindung erlauben es, Kokzidiose mit Substanzen zu bekämpfen (Impfstoffe, nicht-ionophore Antibiotika), die nicht wie die heute als Kokzidiostatika ver wendeten ionophoren Antibiotika Resistenzen bei Bakterien induzieren. Ausführungsfor men der Erfindung können einen wirksamen Kokzidioseschutz bewirken, ohne die Wirk samkeit der Behandlung zu reduzieren, teilweise wird die Wirksamkeit gegenüber der Mo notherapie sogar deutlich erhöht.

Die Ausführungen zeigen, dass a) eine Kombination von Nicarbazin in kommerziell genutz ter Dosierung mit Isoquinolinalkaloiden sowie b) eine Kombination des Impfstoffs zusam men mit den Isoquinolinalkaloiden die gleiche Kokzidiose-verhindernde Wirkung wie das antimikrobielle ionophore Antikozidienmittel Salinomycin hat, jedoch ohne die negativen Folgen einer Resistenzinduktion bei Bakterien.

Figur 16 zeigt Läsionsscores verschiedener Masthähnchengruppen in einer weiteren Studie. Es wurden sechs Gruppen von Masthänchen gebildet, die unterschiedliche Futterzusätze bekamen und abgesehen von einer Kontrollgruppe I mit Kokzidiose infiziert wurden. Die Studiendauer betrug 42 Tage ausgehend vom Tag des Schlüpfens. Es wurden nur männliche Mastküken der Linie Ross 308 verwendet. Als Grundfutter wurde zu Beginn des Versuchs (Tag 1-21) Maisfutter, später ein Futter auf Basis von Weizen- und Sojaschrot verwendet. Jede der in der untenstehenden Tabelle gelisteten Tiergruppen bestand aus 80 Tieren, die zu je 20 Vögeln in vier Versuchsabteilen gehalten wurden.

Am 14. Tag des Versuchs wurden die Tiere aller Gruppen bis auf die Kontrollgruppe I (NC no C) oral mit sporulierten Oozysten von 35.000 E. acervulina, 10.000 E. maxima und 10.000 E. tenella infiziert.

Während einer Kokzidiose entwickelten die Masthähnchen in der Regel einen erhöhten Läsionsscore als Folge der Ausbreitung des Eimeria Erregers. Die Ergebnisse zeigen im Ver gleich zur infizierten IC-Gruppe signifikant verringerte Läsionsscores für die Gruppen „Iso- Nic" und „Nie 100". Die Kombination Iso-Nic erwies sich als die beste Lösung in einem Kok- zidiosepräventionsprogramm, gemessen als Läsionsscoring-Zahlen gegenüber allen ande ren potenziellen chemischen oder natürlichen Lösungen wie Nicarbazin, Oregano oder Adi- cox.

Figur 16 zeigt die beobachtete Oozystenzahl in Ausscheidungen der Tiere der weiteren Stu die. Kokzidien vermehren sich ungeschlechtlich und geschlechtlich. Im Anschluss an die ungeschlechtliche Vermehrungsphase (Schizogonie) bilden sich Geschlechtszellen, nämlich große plasmareiche Makrogameten und kleine begeißelte Mikrogameten, und es vollzieht sich eine geschlechtliche Vermehrung (Gametogonie). Die befruchtete weibliche Zelle (Zy gote) umgibt sich mit einer Hülle (Enzystierung) und wird zur Oozyste. Sie wird mit dem Kot des Wirtes ausgeschieden und ist ein verlässlicher Indikator der Stärke einer akuten Kok zidiose.

Während des Spitzenwertes der Oozystenausscheidung (Tag 18 bis Tag 21) hatte die Iso-Nic Tiergruppe eine 10 bis 100 mal niedrigere Oozystenzahl pro gr Kot als die Gruppen, die mit anderen antikozidialen Interventionen behandelt wurden.

Figur 17 zeigt die beobachtete Oozystenmasse in Ausscheidungen der Tiere der weiteren Studie. Während des Spitzenwertes der Oozystenausscheidung (Tag 18 bis Tag 19) hatte die Iso-Nic Kombinationsgruppe eine Oozystenzahl pro gr Kot, die 10 mal niedriger war als die von Nie allein und 100 mal niedriger als die der infizierten, nicht behandelten Gruppe IC.

Figur 18 basiert auf den Ergebnissen eines weiteren Experiments und zeigt, dass die mit dem Kokzidiose-Impfstoff einhergehenden unerwünscchten Nebenwirkungen (erhöhte Darmpermeabilität) durch die Verabreichung von Isochinolinalkaloiden praktisch vollstän dig kompensiert werden können:

1098 männliche Eintagsküken der Rasse Cobb 500 wurden in 88 Bodenbuchten (1,5 m ² ) mit 12-13 Tieren pro Bucht gehalten. Die Tiere hatten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Das Futter bestand im Wesentlichen aus Mais- und Sojabohnenmehl. Die Tiere wurden in 7 etwa gleich große Gruppen unterteilt, von welchen die folgenden drei Gruppen wie folgt behandelt wurden:

• eine Gruppe „NC" war eine Negativkontrollgruppe („no challenge"), die nicht einer „künstlichen" Kokzidiose-Infektion („Challenge") sondern nur dem natürlichen Kok zidiose-Infektionsdruck ausgesetzt war. Die NC-Gruppe wurde weder geimpft noch auf andere Weise gegen Kokzidien behandelt.

• Die Gruppe „IQ-0" wurde an Tag 0 mit einem Kokzidien-Impfstoff (verabreicht als Augentropfen) geimpft, welcher Oozysten von E. acervulina, E. maxima, E. mivati, und E. tenella enthielt. Der Gruppe „IQ-0" wurden keine Isochinolinalkaloide verab reicht. • Die Gruppe „IQ-90" wurde mit dem gleichen Mittel und Verfahren geimpft wie Gruppe IQ-O. Zusätzlich wurde der Gruppe „IQ-90" ein Tierfutter mit einem Pflan zenextrakt mit Sanguinarin und Chelerythrin (ungefähr im Verhältnis 1:1) verab reicht. Die Konzentration dieser beiden Isochinolinalkaloide im Futter betrug 0,9 ppm (0,9 mg Sanguinarin und Chelerythrin pro kg Futter), wobei die Isochinolinalka loide des Extrakts im Wesentlichen aus Sanguinarin und Chelerythrin bestanden.

Am Tag 28 der Studie wurden verschiedene physiologische Parameter gemessen, darunter der Serum FITC-Dextran Wert. Der FITC-Dextran-Wert ist ein Indikator der Darmpermeabili tät. Er wird durch Verabreichung von FITC-Dextran an die Küken und Entnahme von Blutse rum und die Bestimmung der FITC-Dextran-Konzentration im Serum mittels Fluorometrie einige Stunden später ermittelt. Da das FITC-Molekül zu groß ist um die Barriere eines ge sunden Darms zu durchdringen, zeigt ein hoher Wert eine zu hohe Durchlässigkeit des Darms an. Dies stellt ein gesundheitliches Problem dar, da dies ein Hinweis darauf ist, dass der Darm auch durchlässig ist für Bakerien und Krankheitserreger. Niedrigere Serumkon zentrationen von FITC-Dextran weisen auf eine gesündere Darmbarriere hin.

Der Anmelder hat beobachtet, dass Kokzidiose-Impfstoffe eine besondere Herausforderung für die Darmwand darstellen, da sie lebende Eimeria-Oozysten enthalten, die die Darm wand schädigen und für toxische Moleküle und Krankheitserreger durchgängig machen.

Der Anmelder hat jedoch ebenfalls beobachtet, dass diese negativen Effekte nahezu voll ständig durch die zusätzliche Verabreichung von Isochinolinalkaloiden kompensiert werden können. Somit wird gemäß Ausführungsformen der Erfindung eine Kombination aus Isochi nolinalkaloiden und einem Kokzidiose-Impfstoff, insbesondere einem Kokzidiose- Lebendimpfstoff, verwendet zur Herstellung eines Medikaments, einer Tiernahrung, eines Tränkwassers oder eines Tiernahrungsergänzungsmittels zur Kompensation der durch das Impfmittel bedingten Erhöhung der Darmpermeabilität.

Figur 19 basiert auf dem mit Bezug auf Figur 18 beschriebenen Experiment. Die vier übrigen Gruppen wurden wie folgt behandelt: • Die Gruppe „Nichtionophores Kokzidiostatikum-IQ-O" wurde an Tag 0 mit 25 ppm Nicarbacin (25 mg Nicarbazin pro kg Futter) behandelt und erhielt keine Isochinoli nalkaloide.

• Die Gruppe „Nichtionophores Kokzidiostatikum-IQ-90" wurde an Tag 0 mit 25 ppm Nicarbacin behandelt und erhielt Futter mit einem alkaloidhaltigen Pflanzenextrakt. Die Isochinolinalkaloide des Extrakts bestanden im Wesentlichen aus Sanguinarin und Chelerythrin. Diese beiden Isochinolinalkaloide waren insgesamt in dem Futter in einer Konzentration von 0,90 ppm (0,90 mg pro kg Futter) im Futter enthalten.

• Die Gruppe „ionophores Kokzidiostatikum-IQ-O" wurde an Tag 0 mit 60 ppm Sali- nomycin (60 mg Salinomycin pro kg Futter) behandelt und erhielt keine Isochinoli nalkaloide.

• Die Gruppe „ionophores Kokzidiostatikum-IQ-90" wurde an Tag 0 mit 60 ppm Sali nomycin behandelt und erhielt Futter mit einem alkaloidhaltigen Pflanzenextrakt. Die Isochinolinalkaloide des Extrakts bestanden im Wesentlichen aus Sanguinarin und Chelerythrin. Diese beiden Isochinolinalkaloide waren insgesamt in dem Futter in einer Konzentration von 0,90 ppm (0,90 mg pro kg Futter) im Futter enthalten.

Es wurde in allen sieben Gruppen (einschließlich der drei für Figur 18 beschriebenen drei Gruppen) am Tag 28 derTNF-alpha Wert bestimmt. Der TNF-alpha-Wert ist ein Indikator von Entzündungsprozessen, die als unerwünschte Begleiterscheinung von Impfungen wie auch von Kokzidiostatika auftreten können (Erhöhung des TNF-alpha Wertes in allen Grup pen, die ausschließlich mit einem Kokzidiostatikum oder Impfmittel behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe NC). Dieser Effekt wurde durch die Zusätzliche Gabe von Iso chinolinalkaloiden jedoch abgeschwächt. Gemäß Ausführungsformen wird die Zusammen setzung somit bei der Herstellung einer Medizin, eines Tierfutters, eines Tränkwassers oder Tiernahrungsergänzungsmittel gegen Kokzidiose verwendet, welche weniger Nebenwirkun gen hat, insbesondere weniger entzündliche Prozesse bewirkt und die Darmwand stärkt.

Figur 20 basiert auf den Ergebnissen eines weiteren Experiments, welches ähnlich wie das in Figuren 18 und 19 illustrierte Experiment aufgebaut war. Figur 20 zeigt, dass die mit dem Kokzidiose-Impfstoff einhergehenden unerwünscchte Erhöhung der Darmpermeabilität durch die Verabreichung von Isochinolinalkaloiden praktisch vollständig kompensiert wer den können:

1584 männliche Eintagsküken der Rasse Cobb 500 wurden in 88 Bodenbuchten (1,5 m ² ) mit 18 Tieren pro Bucht gehalten. Die Tiere hatten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Das Futter bestand im Wesentlichen aus Mais- und Sojabohnenmehl.

Die Tiere wurden in 10 etwa gleich große Gruppen unterteilt. Sieben dieser Gruppen wur den behandelt wie bereits im Hinblick auf die Figuren 18 und 19 beschrieben. In drei weite ren Gruppen wurde zusätzlich zu dem ionischen oder nicht-ionischen Kokzidiostatikum bzw. Impfstoff ein Tierfutter mit einem Pflanzenextrakt mit Sanguinarin und Chelerythrin (ungefähr im Verhältnis 1:1) verabreicht. In diesem Futter betrug die Gesamtkonzentration der beiden Isochinolinalkaloide 0,60 mg pro kg Futter, die Gesamtkonzentration an Alkaloi den in diesem Futter betrug 0.75 mg pro kg Futter.

Am Tag 28 der Studie wurden verschiedene physiologische Parameter gemessen, darunter der Serum FITC-Dextran Wert als Indikator der Darmpermeabilität. Es zeigt sich, dass die Kokzidioseimpfung die Darmpermeabilität massiv erhöht, dass dieser Effekt aber durch Zu gabe der Isochinolinalkaloide verhindert werden kann.

Der Anmelder hat beobachtet, dass Kokzidiose-Impfstoffe eine besondere Herausforderung für die Darmwand darstellen, da sie lebende Eimeria-Oozysten enthalten, die die Darm wand schädigen und für Eimeria- und andere Erreger durchgängig machen. Der Anmelder hat jedoch ebenfalls beobachtet, dass diese negativen Effekte nahezu vollständig durch die zusätzliche Verabreichung von Isochinolinalkaloiden kompensiert werden können. Somit wird gemäß Ausführungsformen der Erfindung eine Kombination aus Isochinolinalkaloiden und einem Kokzidiose-Impfstoff, insbesondere einem Kokzidiose-Lebendimpfstoff, verwen det zur Herstellung eines Medikaments, einerTiernahrung, eines Tränkwassers oder eines Tiernahrungsergänzungsmittels zur Kompensation der durch das Impfmittel bedingten Er höhung der Darmpermeabilität.