Die vorliegende Anmeldung betrifft neue substituierte Pyrazolo[ 1 ,5 -a]pyridin-3 -carboxamide, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung allein oder in Kombinationen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe von kardiovaskulären Erkrankungen.

Eines der wichtigsten zellulären Übertragungssysteme in Säugerzellen ist das cyclische Guanosin- monophosphat (cGMP). Zusammen mit Stickstoffmonoxid (NO), das aus dem Endothel freigesetzt wird und hormonelle und mechanische Signale überträgt, bildet es das NO/cGMP-System. Die Guanylatcycla- sen katalysieren die Biosynthese von cGMP aus Guanosintriphosphat (GTT). Die bisher bekannten Vertreter dieser Familie lassen sich sowohl nach strukturellen Merkmalen als auch nach der Art der Liganden in zwei Gruppen aufteilen: Die partikulären, durch natriuretische Peptide stimulierbaren Guanylatcyclasen und die löslichen, durch NO stimulierbaren Guanylatcyclasen. Die löslichen Guanylatcyclasen bestehen aus zwei Untereinheiten und enthalten höchstwahrscheinlich ein Häm pro Heterodimer, das ein Teil des regulatorischen Zentrums ist. Dieses hat eine zentrale Bedeutung für den Aktivierungsmechanismus. NO kann an das Eisenatom des Häms binden und so die Aktivität des Enzyms deutlich erhöhen. Hämfreie Präparationen lassen sich hingegen nicht durch NO stimulieren. Auch Kohlenmonoxid (CO) ist in der Lage, an das Eisen-Zentralatom des Häms zu binden, wobei die Stimulierung durch CO deutlich geringer ist als die durch NO. Durch die Bildung von cGMP und der daraus resultierenden Regulation von Phosphodiesterasen, lonen- kanälen und Proteinkinasen spielt die Guanylatcyclase eine entscheidende Rolle bei unterschiedlichen physiologischen Prozessen, insbesondere bei der Relaxation und Proliferation glatter Muskelzellen, der Plättchenaggregation und -adhäsion, der neuronalen Signalübertragung sowie bei Erkrankungen, welche auf einer Störung der vorstehend genannten Vorgänge beruhen. Unter pathophysiologischen Bedingungen kann das NO/'cGMP- System supprimiert sein, was zum Beispiel zu Bluthochdruck, einer Plättchenaktivie- rung, einer vermehrten Zellproliferation, endothelialer Dysfunktion, Atherosklerose, Angina pectoris, Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt, Thrombosen, Schlaganfall und sexueller Dysfunktion führen kann.

Eine auf die Beeinflussung des cGMP- Signalweges in Organismen abzielende NO-unabhängige Behandlungsmöglichkeit für derartige Erkrankungen ist aufgrund der zu erwartenden hohen Effizienz und gerin- gen Nebenwirkungen ein vielversprechender Ansatz.

Zur therapeutischen Stimulation der löslichen Guanylatcyclase wurden bisher ausschließlich Verbindungen wie organische Nitrate verwendet, deren Wirkung auf NO beruht. Dieses wird durch iokonversion gebildet und aktiviert die lösliche Guanylatcyclase durch Angriff am Eisen-Zentralatom des Häms. Neben den Nebenwirkungen gehört die Toleranzentwicklung zu den entscheidenden Nachteilen dieser Behandlungsweise.

In den letzten Jahren wurden einige Substanzen beschrieben, die die lösliche Guanylatcyclase direkt, d.h. ohne vorherige Freisetzung von NO stimulieren, wie beispielsweise 3 -(5'-Hydroxymethyl-2'-furyl)- 1 - benzylindazol [YC-1 ; Wu et al., Blood 84 (1994), 4226; Mülsch et al., Brit. J. Pharmacol. 120 (1997), 681], Fettsäuren [Goldberg et al., ./ Biol. Chem. 252 (1977), 1279], Diphenyliodonium-hexafluorphosphat [Pettibone et al., Eur. J. Pharmacol. 116 (1985), 307], Isoliquiritigenin [Yu et al., Brit. J. Pharmacol. 114 (1995), 1587] sowie verschiedene substituierte Pyrazol-Derivate (WO 98/16223).

Unter anderem in WO 2012/072512-A1 und WO 2010/117787 sind verschiedene Pyrazolo[l,5-a]pyridin- Derivate beschrieben, die zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung neuer Substanzen, die als Stimulatoren der löslichen Guanylatcyclase wirken, und als solche zur Behandlung und oder Prophylaxe von Krankheiten geeignet sind und ein gleiches oder verbessertes therapeutisches Profil gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verbindungen aufweisen, wie beispielsweise hinsichtlich ihrer in-vivo Eigenschaften, wie beispielsweise ihrem pharmakokinetischem und pharm akodynamischem Verhalten, ihrer Löshchkeit und/oder ihres Metabolismus-Profils und/oder ihrer Dosis- Wirkungsbeziehung.

Die vorliegende Erfindung betrifft rbindungen der allgemeinen Formel (I)

in welcher

R ^ä für eine Gruppe der Formel

steht, wobei

* für die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom steht,

R ^' für Methyl oder Cylcopropyl steht, sowie ihre /V-Oxide, Salze, Solvate, Salze der Λ-Oxide und Solvate der N-Oxide und Salze.

Erfmdungsgemäß e Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, die von Formel (I) umfassten Verbindungen der nachfolgend genannten Formeln und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als Ausführungs- beispiele genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.

Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäß en Verbindungen verwendet werden können.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditions salze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Ben- zolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure,

Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kalium salze), Erdalkali- salze (z.B. Calcium- und Magnesium salze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C -Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexyla- min, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin. Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in unterschiedlichen stereoisomeren Formen existieren, d.h. in Gestalt von Konfigurationsisomeren oder gegebenenfalls auch als Konformationsisomere (Enantiomere und/oder Diastereomere, einschließlich solcher bei Atrop- isomeren). Die vorliegende Erfindung umfasst deshalb die Enantiomere und Diastereomere und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/ oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren; vorzugsweise werden hierfür chromatographische Verfahren verwendet, insbesondere die HPLC-Chromatographie an achiraler bzw. chiraler Phase.

Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomere Formen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen. Unter einer isotopischen Variante einer erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in welcher mindestens ein Atom innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist. Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlen- stoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und lod, wie H (Deuterium), Ή (Tritium), ¹³ C, ¹⁴ C, ¹⁵ N, ¹⁷ 0, ^ls O, ³² P, ³³ P, ³³ S, ³⁴ S, ³⁵ S, ³⁶ S, ¹⁸ F, ³⁶ C1, ⁸² Br, ¹²³ 1, ¹²⁴ I, ¹²⁹ I und ¹³¹ I. Bestimmte isotopische Varianten einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein beispielsweise für die Untersuchung des Wirkmechanismus oder der Wirkstoff- Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit Ή- oder ¹⁴ C-Isotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie beispielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der Verbindung führen, wie beispielsweise eine Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder eine Reduktion der erfor- derlichen Wirkdosis; solche Modifikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen können daher gegebenenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellen. Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausfüh- rungsbeispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem entsprechende isotopische Modifikationen der je- weiligen Reagentien und/oder Ausgangsverbindungen eingesetzt werden.

Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff "Prodrugs" bezeichnet hierbei Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:

In den Formeln der Gruppe, für die R ¹ stehen kann, steht der Endpunkt der Linie, an dem ein Zeichen * steht, nicht für ein Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CIL -Gruppe, sondern ist Bestandteil der Bindung zu dem jeweils bezeichneten Atom, an das R ¹ gebunden sind. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" ein Hemmen, Verzögern, Aufhalten, Lindern, Abschwächen, Einschränken, Verringern, Unterdrücken, Zurückdrängen oder Heilen einer Krankheit, eines Leidens, einer Erkrankung, einer Verletzung oder einer gesundheitlichen Störung, der Entfaltung, des Verlaufs oder des Fortschreitens solcher Zustände und/oder der Symptome solcher Zustände. Der Begriff„Therapie" wird hierbei als synonym mit dem Begriff„Behand- lung" verstanden.

Die Begriffe„Prävention",„Prophylaxe" oder„Vorbeugung" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym verwendet und bezeichnen das Vermeiden oder Vermindern des Risikos, eine Krankheit, ein Leiden, eine Erkrankung, eine Verletzung oder eine gesundheitliche Störung, eine Entfaltung oder ein Fortschreiten solcher Zustände und/oder die Symptome solcher Zustände zu bekommen, zu erfahren, zu erleiden oder zu haben.

Die Behandlung oder die Prävention einer Krankheit, eines Leidens, einer Erkrankung, einer Verletzung oder einer gesundheitlichen Störung können teilweise oder vollständig erfolgen.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel (I), in welcher eine Gruppe der Fora

steht, wobei

* für die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom steht,

R ^; für Methyl steht, sowie ihre TV-Oxide, Salze, Solvate, Salze der Λ-Oxide und Solvate der TV-Oxide und Salze.

Bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung dieVerbindung mit dem systematischen Namen e«/- 7-[(2,6-Difluorbenzyl)oxy]-N-[(25)-l-hydroxy-2-(5-methyl-l,3 ,4-thiadiazol-2-yl)propan-2-yl]-2,5- dimethylpyrazolo[ 1 ,5 -a]pyridin-3 -carboxamid und der Strukturformel

sowie ihre Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze. Bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung dieVerbindung mit dem systematischen Namen rac- 7-[(2,6-Difluorbenzyl)oxy]-N- {2-[2-(difluormethyl)-2H-tetrazol-5-yl]-l-hydroxypropan-2-yl }-2,5- dimethylpyrazolo[ 1 ,5 -a]pyridin-3 -carboxamid und der Strukturformel

sowie ihre Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung dieVerbindung mit dem systematischen Namen ent- N-[2-Amino-2-methyl(4,4,4- ² H3)butyl]-7-[(2,6-difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyraz olo-[l,5-a]pyridm^ carboxamid (Enantiomer A) und der Strukturformel

sowie ihre Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung dieVerbindung mit dem systematischen Namen ent-

N-[2-Amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butyl]-7-[(2,6-difl uorbenzyl)oxy]-2,5-dimethyl-pyrazolo[i,5- a]pyridin-3 -carboxamid (Enantiomer A) und der Strukturformel

sowie ihre Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung dieVerbindung mit dem systematischen Namen ent- N-[2-Amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butyl]-7-[(2,6-difluor benzyl)oxy]-2,5-dimethyl-pyrazolo[l,5- a]pyridin-3-carboxamid (Enantiomer B) und der Strukturformel

sowie ihre Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.

Die als bevorzugt genannten Restedefinitionen gelten sowohl für die Verbindungen der Formel (I) als auch in entsprechender Weise für alle Zwischenprodukte.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel (II)

in welcher R ^~ die oben angegebene Bedeutung hat und

T ¹ für (Ci-O-Alkyl oder Benzyl steht,

in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart einer geeigneten Base oder Säure zu einer Carbonsäure der Formel (III)

in welcher R ² die oben angegebene Bedeutung hat,

umsetzt und diese in der Folge in einem inerten Lösungsmittel unter Amidkupplungsbedingungen mit einem Amin der Formel (IV- A), (IV-B), (IV-C) oder (IV-D)

(IV-A) (IV-B)

(rv-c) (IV-D), in welchem R' für eine Amino-Schutzgruppe, wie beispielsweise tert.-Butoxycarbonyl, Benzyloxycar- bonyl oder Benzyl steht, umsetzt, anschliessend gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen abspaltet, und die resultierenden Verbindungen der Formel (I) gegebenenfalls mit den entsprechenden (i) Lösungsmitteln und/oder (ii) Säuren oder Basen in ihre Solvate, Salze und/oder Solvate der Salze überführt.

Das beschriebene Herstellverfahren kann durch das folgende Syntheseschema (Schema 1) beispielhaft verdeutlicht werden:

[(a) Natriumhydroxid, 1,4-Dioxan, 90°C; (b) HATU, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, Raumtemperatur; (c) Wasserstoff, 10%iges Palladium auf Aktivkohle, TFA, Ethanol].

Die Verbindungen der Formeln (IV- A), (rV-B), (rV-C) und ( IV-D) sind kommerziell erhältlich, literaturbekannt oder können in Analogie zu literaturbekannten Verfahren hergestellt werden.

Inerte Lösungsmittel für die Verfahrensschritte (III) + (TV)— (I) sind beispielsweise Ether wie Diethyl- ether, Dioxan, T etrahydrofuran, Glykoldimethylether oder Diethylenglykoldimethylether, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol, Xylol, Hexan, Cyclohexan oder Erdölfraktionen, Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Trichlormethan, Tetrachlormethan, 1 ,2-Dichlorethan, Trichlorethylen oder Chlorbenzol, oder andere Lösungsmittel wie Aceton, Essigsäureethylester, Acetonitril, Pyridin, Dimethylsulfoxid, A^V-Dimethylformamid, NN-Dimethylacetamid, iV,A ^r -Dimethylpropylenharnstoff (DMPU) oder N- Methylpyrrolidon (NMP). Ebenso ist es möglich, Gemische der genannten Lösungsmittel zu verwenden. Bevorzugt sind Dichlormethan, T etrahydrofuran, Dimethylformamid oder Gemische dieser Lösungsmittel.

Als Kondensationsmittel für die Amidbildung in den Verfahrenss chritte (III) + (IV)— > (I) und eignen sich beispielsweise Carbodiimide wie NN-Diethyl-, NN'-Dipropyl-, Λ ^Γ , V'-Diisopropyl- , NN-Dicyclo- hexylcarbodiimid (DCC) oder N-(3 -Dimemylaminopropy^-A^'-ethylcarb xiiimid-Hydrochlorid (EDC), Phosgen-Derivate wie 7V,iV'-Carbonyldiimidazol (CDI), 1 ,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5- phenyl- 1 ,2-oxazolium-3 -sulfat oder 2-feri.-Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, Acylamino- verbindungen wie 2-Ethoxy- 1 -ethoxycarbonyl- 1 ,2-dihydrochinolin, oder Isobutylchlorformiat, Propan- phosphonsäureanhydrid (T3P), l-Chlor-iV, V,2-trimethylpropl-en-l-amin, Cyanophosphonsäurediethyl- ester, Bis-(2-oxo-3 -oxazolidinyl)-phosphorylchlorid, Benzotriazol- 1 -yloxy-tris(dimethylamino)phospho- nium-hexafluorphosphat, Benzotriazol- 1 -yloxy-tris(pyrrolidino)phosphonium-hexafluorphosphat (Py- BOP), 0-(Benzotriazol- 1 -y^-A^A^A^TV'-tetramethyluronium-tetrafluorborat (TBTU), 0-(Benzotriazol- 1 - yl)-N,N,N', TV'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HBTU), 2-(2-Oxo- 1 -(2Ä)-pyridyl)- 1 , 1 ,3,3-tetra- methyluronium-tetrafluorborat (TPTU), 0-(7-Azabenzotriazol- 1 -yl)-N,N,N', A ^r, -tetramethyluronium-hexa- fluorphosphat (HATU) oder 0-( l//-6-Chlorbenzotriazol- 1 -yl)-l , 1 ,3 ,3 -tetramethyluronium-tetrafluorborat (TCTU), gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Hilfsstoffen wie 1 -Hydroxybenzotriazol (HOBt) oder iV-Hydroxysuccinimid (HOSu), sowie als Basen Alkalic arbonate, z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine, z.B. Triethylamin, _V-Methyl- morpholin, 7V-Methy!piperidin oder A^V-Diisopropylethylamin. Bevorzugt wird TBTU in Verbindung mit -Methylmo holin, HA ^' T ^' U in Verbindung mit A ^T ,A-Diisopropylethylamin oder l-Chlor-TV^V^- trimethylprop- 1 -en- 1 amin verwendet.

Die Kondensationen (III) + (IV)— > (I) und wird im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von -20°C bis +100°C, bevorzugt bei 0°C bis +60°C durchgeführt. Die Umsetzung kann bei normalem, erhöhtem o- der bei erniedrigtem Druck erfolgen (z.B. von 0.5 bis 5 bar). Im Allgemeinen arbeitet man bei Normaldruck.

Alternativ kann die Carbonsäure der Formel (III) auch zunächst in das entsprechende Carbonsäurechlorid überführt werden und dieses dann direkt oder in einer separaten Umsetzung mit einem Amin der Formel (IV) zu den erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden. Die Bildung von Carbonsäurechloriden aus Carbonsäuren erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden, beispielsweise durch Behandlung mit Thionylchlorid, Sulfurylchlorid oder Oxalylchlorid in Gegenwart einer geeigneten Base, beispielsweise in Gegenwart von Pyridin, sowie optional unter Zusatz von Dimethylformamid, optional in einem geeigneten inerten Lösemittel.

Die Hydrolyse der Ester-Gruppe T ¹ der Verbindungen der Formel (II) erfolgt nach üblichen Methoden, indem man die Ester in inerten Lösungsmitteln mit Säuren oder Basen behandelt, wobei bei letzterem die zunächst entstehenden Salze durch Behandeln mit Säure in die freien Carbonsäuren überführt werden. Im Falle der tert.-Butylester erfolgt die Esterspaltung bevorzugt mit Säuren. Im Falle der Benzylester erfolgt die Esterspaltung bevorzugt hydrogenolytisch mit Palladium auf Aktivkohle oder Raney-Nickel. Als inerte Lösungsmittel eignen sich für diese Reaktion Wasser oder die für eine Esterspaltung üblichen organischen Lösungsmittel. Hierzu gehören bevorzugt Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n- Butanol oder tert.-Butanol, oder Etiler wie Diethylether, Tetrahydrofuran, 2-Methyltetrahydrofuran, Dio- xan oder Glykoldimethylether, oder andere Lösungsmittel wie Aceton, Dichlormethan, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid. Ebenso ist es möglich, Gemische der genannten Lösungsmittel einzusetzen. Im Falle einer basischen Ester-Hydrolyse werden bevorzugt Gemische von Wasser mit Dioxan, Tetrahydro- furan, Methanol und/oder Ethanol eingesetzt.

Als Basen für die Ester-Hydrolyse sind die üblichen anorganischen Basen geeignet. Hierzu gehören bevorzugt Alkali- oder Erdalkalihydroxide wie beispielsweise Natrium-, Lithium-, Kalium- oder Bariumhydroxid, oder Alkali- oder Erdalkalic arbonate wie Natrium-, Kalium- oder Calciumcarbonat. Besonders bevorzugt sind Natrium- oder Lithiumhydroxid. Als Säuren eignen sich für die Esterspaltung im Allgemeinen Schwefelsäure, Chlorwasserstoff/' Salzsäure, Bromwasserstoff'Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Tolu- olsulfonsäure, Methansulfonsäure oder Trifluormethansulfonsäure oder deren Gemische gegebenenfalls unter Zusatz von Wasser. Bevorzugt sind Chlorwasserstoff oder Trifluoressigsäure im Falle der tert.- Butylester und Salzsäure im Falle der Methylester. Die Esterspaltung erfolgt im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von 0°C bis +100°C, bevorzugt bei +0°C bis +50°C.

Die genannten Umsetzungen können bei normalem, erhöhtem oder bei erniedrigtem Druck durchgeführt werden (z.B. von 0.5 bis 5 bar). Im Allgemeinen arbeitet man jeweils bei Normaldruck.

Als Amino- Schutzgruppe wird bevorzugt tert. -Butoxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) ver- wendet. Als Schutzgruppe für eine Hydroxy- oder Carboxyl-Funktion wird vorzugsweise tert.-Butyl oder Benzyl eingesetzt. Die Abspaltung dieser Schutzgruppen wird nach üblichen Methoden, vorzugsweise durch Reaktion mit einer starken Säure wie Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Trifluoressigsäure in einem inerten Lösungsmittel wie Dioxan, Diethylether, Dichlormethan oder Essigsäure durchgeführt; gegebenenfalls kann die Abspaltung auch ohne ein zusätzliches inertes Lösungsmittel erfolgen. Im Falle von Benzyl und Benzyloxycarbonyl als Schutzgruppe können diese auch durch Hydrogenolyse in Gegenwart eines Palladium-Katalysators entfernt werden. Die Abspaltung der genannten Schutzgruppen kann gegebenenfalls simultan in einer Eintopf-Reaktion oder in separaten Reaktionschritten vorgenommen werden.

Die Verbindungen der Formel (II) sind literaturbekannt oder können hergestellt werden, indem

[A] eine Verbindung der Formel (V) in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart einer eeigneten Base mit einer Verbindung der Formel (VI)

in welcher

X ¹ für eine geeignete Abgangsgruppe, insbesondere Chlor, Brom, lod, Mesylat, Triflat oder Tosylat, steht,

zu einer Verbindung der Formel (VII)

umgesetzt wird, diese dann mit 0-(2-Mesitylenesulfonyl)hydroxylamin (MSH) in eine Verbindung (VIII)

überführt wird, und diese anschliessend in einem inerten Lösungsmittel mit einer Verbindung der Formel (IX)

in welcher T ¹ und R" die oben angegebenen Bedeutungen haben, umgesetzt wird,

oder

[B] eine Verbindung der Formel (X)

mit 0-(2-Mesitylenesulfonyl)hydroxylamin (MSH) in eine Verbindung (XI)

überfuhrt wird,

diese anschliessend in einem inerten Lösungsmittel mit einer Verbindung der Formel (ΓΧ)

in welcher T ¹ und R ² die oben angegebenen Bedeutung haben, zu einer Verbindung (XII) umgesetzt wird,

in welcher R ^: die oben angegebene Bedeutung hat und

T ¹ für (Ci-C ₄ )-Alkyl oder Benzyl steht, von dieser im Folgenden nach den dem Fachmann bekannten Methoden die Benzylgrappe abspaltet und die resultierende Verbindung (XIII)

in welcher R die oben angegebene Bedeutung hat und

T ¹ für (Ci-C ₄ )-Alkyl oder Benzyl steht, in einem inerten Lösungsmittel unter Mitsunobu-Bedingungen mit einer Verbindung der Formel (XIV)

umgesetzt wird.

Die beschriebenen Verfahren werden durch die nachfolgenden Schemata (Schema 2 und Schema 3) beispielhaft verdeutlicht: Schema 2:

[(a) Ag2CC , THF, Rückfluss; (b) 0-(2-mesitylenesulfonyl)hydroxylamin (MSH), Dichlormethan, Raumtemperatur; (c) K2CO3, DMF, Raumtemperatur]. Schema 3:

[(a) 0-(2-mesitylenesulfonyl)hydroxylamin (MSH), Dichlormethan, Raumtemperatur; (b) K2CO3, DMF, Raumtemperatur, (c) Cyclohexen, Pd/C, Ethanol, Rückfluss; (d) Triphenylphosphin, Diisopropyl-(E)- diazen- 1 ,2-dicarboxylat ( Di AD), THF, Raumtemperatur] . Inerte Lösungsmittel für den Verfahr ensschritt (V) + (VT)— > (VII) sind beispielsweise Ether wie Diethyl- ether, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethoxymethan, Glykoldimethylether oder Diethylenglykoldimethyl- ether oder andere Lösungsmittel wie Aceton, Methylethylketon, Essigsäureethylester, Acetonitril, N,N-Oi- methylformamid, iV,iV-Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, A^A^-Dimethylpropylenharnstoff (DMPU), N-Methylpyrrolidon (NMP). Ebenso ist es möglich, Gemische der genannten Lösungsmittel einzusetzen. Bevorzugt wird Dimethoxyethan verwendet.

Als Basen für den Verfahrensschritt (V) + (VI)— » (VII) eignen sich die üblichen anorganischen oder organischen Basen. Hierzu gehören bevorzugt Alkalihydroxide wie beispielsweise Lithium-, Natrium- oder Kaliumhydroxid, Alkali- oder Erdalkalicarbonate wie Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Cäsi- umcarbonat gegebenenfalls unter Zusatz eines Alkaliiodids wie beispielsweise Natriumiodid oder Kaliumiodid, Alkali- Alkoholate wie Natrium- oder Kaliummethanolat, Natrium- oder Kaliumethanolat oder Natrium- oder Kalium-tert.-butylat, Alkalihydride wie Natrium- oder Kaliumhydrid, Amide wie Natrium amid, Lithium- oder Kalium-bis(trimethylsilyl)amid oder Lithiumdiisopropylamid, oder organische Amine wie Triethylamin, A'-Methylmorpholin, iV-Methylpiperidin, 7V, V-Diisopropylethylamin, Pyridin, 4- (iV,iV-Dimethylamino)-pyridin (DMAP), l,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en (DBN), 1,8- Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) oder l,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO ^® ). Bevorzugt wird Natrium- oder Kalium -tert. -butylat verwendet.

Die Reaktion erfolgt im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von 0°C bis +120°C, bevorzugt bei +20°C bis +80°C, gegebenenfalls in einer Mikrowelle. Die Umsetzung kann bei normalem, erhöhtem oder bei erniedrigtem Druck durchgeführt werden (z.B. von 0.5 bis 5 bar).

Inerte Lösungsmittel für den Verfahrensschritt (VII)— (VIII) sind beispielsweise Dichlormethan, 1,2- Dichlorethan oder andere Lösungsmittel wie Aceton, Methylethylketon, Essigsäureethylester, Acetonitril, iV,iV-Dimethylformamid, V, V-Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, 7V,A ^r '-Dimethylpropylenharnstoff (DMPU), Λ-Methylpyrrolidon (NMP). Ebenso ist es möglich, Gemische der genannten Lösungsmittel ein- zusetzen. Bevorzugt wird Dichlormethan verwendet.

Die Reaktion erfolgt im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von 0°C bis +120°C, bevorzugt bei +20°C bis +80°C. Die Umsetzung kann bei normalem, erhöhtem oder bei erniedrigtem Druck durchgeführt werden (z.B. von 0.5 bis 5 bar).

Inerte Lösungsmittel für den Ringschluss zum Imidazo[ 1 ,2-a]pyrazin-Grundgerüst (VIII) + (IX)— > (II) sind die üblichen organischen Lösungsmittel. Hierzu gehören bevorzugt Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, n-Pentanol oder tert.-Butanol, oder Ether wie Diethylether, Tetrahydrofuran, 2-Methyltetrahydrofuran, Dioxan oder Glykoldimethylether, oder andere Lösungsmittel wie Aceton, Dichlormethan, 1 ,2-Dichlorethan, Acetonitril, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid. Ebenso ist es möglich, Gemische der genannten Lösungsmittel einzusetzen. Bevorzugt wird Ethanol verwendet. Der Ringschluss erfolgt im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von +50°C bis +150°C, bevorzugt bei +50°C bis +100°C, gegebenenfalls in einer Mikrowelle.

Der Ringschluss (VIII) + (IX)— > (II) erfolgt optional in Gegenwart wasserziehender Reaktionszusätze, beispielsweise in Gegenwart von Molekular sieb (3Ä oder 4Ä Porengröße) oder mittels Wasserabscheider. Die Umsetzung (VIII) + (IX) ► (II) erfolgt unter Verwendung eines Überschusses des Reagenzes der

Formel (VIII), beispielsweise mit 1 bis 20 Äquivalenten des Reagenzes (VIII), gegebenenfalls unter Zusatz von Basen (wie z.B. Natriumhydrogencarbonat) wobei die Zugabe dieses Reagenzes einmalig oder in mehreren Portionen erfolgen kann.

Die Abspaltung der Benzylgruppe im Reaktionsschritt (XII)— > (XIII) erfolgt hierbei nach üblichen, aus der S chutzgrupp enchemi e bekannten Methoden, vorzugsweise durch Hydrogenolyse in Gegenwart von eines Palladiumkatalysators, wie beispielsweise Palladium auf Aktivkohle, in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethanol oder Essigsäureethylester [siehe auch z.B. T.W. Greene und P.G.M. Wuts, Protective Croups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1999].

Die Mitsunobu-Kondensationen (XIII) + (XIV) (II) erfolgt in Gegenwart eines Aktivierungsreagenzes, z.B. Diethyl-(E)-diazen- 1 ,2-dicarboxylat ( DO AD) oder Diisopropyl-(E)-diazen- 1 ,2-dicarboxylat ( DI AD), sowie eines Phosphinreagenzes, z.B. Triphenylphosphin oder Tributylphosphin, in einem inerten Lösemittel, z.B. TH F, Dichlomiethan, Toluol oder DMF, bei einer Temperatur zwischen 0 °C und dem Siedepunkt des verwendeten Lösemittels.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen wertvolle pharmakologische Eigenschaften und können zur Vorbeugung und Behandlung von Erkrankungen bei Menschen und Tieren verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen eröffnen eine weitere Behandlungsalternative und stellen somit eine Bereicherung der Pharmazie dar.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen wirken als potente Stimulatoren der löslichen Guanylatcyclase, besitzen wertvolle pharmakologische Eigenschaften, und weist ein verbessertes therapeutisches Profil auf, wie beispielsweise hinsichtlich ihrer in-vivo Eigenschaften und/oder ihres pharmakokinetischen Verhaltens und/oder metabolischen Profils. Sie eignet sich daher zur Behandlung und/ oder Prophylaxe von Erkrankungen bei Menschen und Tieren.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen bewirken eine Gefäßrelaxation und eine Hemmung der Thrombozytenaggregation und führen zu einer Blutdrucksenkung sowie zu einer Steigerung des koronaren Blut- flusses. Diese Wirkungen sind über eine direkte Stimulation der löslichen Guanylatcyclase und einen intrazellulären cGMP -Anstieg vermittelt. Außerdem verstärkt die erfindungsgemäße Verbindung die Wirkung von Substanzen, die den cGMP-Spiegel steigern, wie beispielsweise EDRF (endothelium-derived relaxing factor), NO-Donatoren, Protopo hyrin IX. Arachidonsäure oder Phenylhydrazin-Derivate. Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich zur Behandlung und/oder Prophylaxe von kardiovaskulären, pulmonalen, thrombo embolischen und fibrotischen Erkrankungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können daher in Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von kardiovaskulären Erkrankungen wie beispielsweise Bluthochdruck (Hypertonie), resistente Hypertonie, akute und chronische Herzinsuffizienz, koronare Herzerkrankung, stabile und instabile Angina pectoris, periphere und kardiale Gefäß erkrankungen, Arrhythmien, Rhythmusstörungen der Vorhöfe und der Kammern sowie Überleitungsstörungen wie beispielsweise atrio-ventrikuläre Blockaden Grad l-ll l (AB-Block l-ll l ). supraventrikuläre Tachyarrhythmie, Vorhofflimmern, Vorhofflattern, Kammerflimmern, Kammerflattern, ventrikuläre Tachyarrhytmie, Torsade de pointes-Tachykardie, Extrasystolen des Vorhoffs und des Ventrikels, AV-junktionale Extrasystolen, Sick-Sinus Syndrom, Synkopen, AV-Knoten- Reentrytachykardie, Wolff-Parkinson-White-Syndrom, von akutem Koronarsyndrom (ACS), autoimmune Herzerkrankungen (Perikarditis, Endokarditis, Valvolitis, Aortitis, Kardiomyopathien) , Schock wie kardi- ogenem Schock, septischem Schock und anaphylaktischem Schock, Aneurysmen, Boxerkardiomyopathie (premature ventricular contraction (PVC)), zur Behandlung und/oder Prophylaxe von thrombo embolischen Erkrankungen und Ischämien wie myokardiale Ischämie, Myokardinfarkt, Hirnschlag, Herzhypertrophie, transistorischen und ischämischen Attacken, Präeklampsie, entzündliche kardiovaskuläre Erkrankungen, Spasmen der Koronararterien und peripherer Arterien, Ödembildung wie beispielsweise pulmonales Ödem, Hirnödem, renales Ödem oder Herzinsuffizienz -bedingtes Ödem, peripheren Durchblutungsstörungen, Reperfusionsschäden, arterielle und venöse Thrombosen, Mikroalbuminurie , Herzmuskelschwäche, endotheliale Dysfunktion, zur Verhinderung von Restenosen wie nach Thrombolysefherapien, percutan-transluminalen Angioplastien (PTA), transluminalen Koronarangioplastien (PTCA), Herztransplantationen und Bypass-Operationen, sowie mikro- und makrovaskuläre Schädigungen (Vasculitis), erhöhte Spiegel von Fibrinogen und von LDL geringer Dichte sowie erhöhte Konzentrationen von Plasmi- nogenaktivator- Inhibitor 1 (PAI-1), sowie zur Behandlung und/oder Prophylaxe von erektiler Dysfunktion und weiblicher sexueller Dysfunktion eingesetzt werden.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff Herzinsuffizienz sowohl akute als auch chronische Erscheinungsformen der Herzinsuffizienz, wie auch spezifischere oder verwandte Krankheitsformen wie akut dekompensierte Herzinsuffizienz, Rechtsherzinsuffizienz, Linksherzinsuffizienz, Globalinsuffizienz, ischämische Kardiomyopathie, dilatative Kardiomyopathie, hypertrophe Kardiomyopathie, idiopathische Kardiomyopathie, angeborene Herzfehler, Herzinsuffizienz bei Herzklappenfehlern, Mitralklap- penstenose, Mitralklapp eninsuffizienz, Aortenklappenstenose, Aortenklappeninsuffizienz, Trikuspidalste- nose, Trikuspidalinsuffizienz, Pulmonalklappen Stenose, Pulmonalklappeninsuffizienz, kombinierte Herzklappenfehler, Herzmuskel entzündung (Myokarditis), chronische Myokarditis, akute Myokarditis, virale Myokarditis, diabetische Herzinsuffizienz, alkoholtoxische Kardiomyopathie, kardiale Speichererkrankungen, diastolische Herzinsuffizienz sowie systolische Herzinsuffizienz und akute Phasen der Verschlechterung einer bestehenden chronischen Herzinsuffizienz (worsening heart failure). Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Verbindung auch zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Arteriosklerose, Lipidstoffwechselstörungen, Hypolipoproteinämi en, Dyslipidämien, Hypertriglyceridä- mien, Hyperlipidämien, Hypercholesterolämien, Abetelipoproteinämie, Sitosterolämie, Xanthomatose, Tangier Krankheit, Fettsucht (Adipositas), Fettleibigkeit (Obesitas) und von kombinierten Hyperlipidä- mien sowie des Metabolischen Syndroms eingesetzt werden.

Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von primärem und sekundärem Raynaud-Phänomen, von Mikrozirkulationsstörungen, Claudicatio, peripheren und autonomen Neuropathien, diabetischen Mikroangiopathien, diabetischer Retinopathie, diabetischen Geschwüren an den Extremitäten, Gangren, CREST-Syndrom, Erythematose, Onychomykose, rheumati- sehen Erkrankungen sowie zur Förderung der Wundheilung verwendet werden.

Weiterhin eignen sich die erfindungsgemäß en Verbindungen zur Behandlung urologischer Erkrankungen wie beispielsweise benignes Prostata- Syndrom (BPS), benigne Prostata- Hyperplasie (BPH), benigne Prostata Vergrösserung ( BPH), Blasenentleerungsstörung (BOO), untere Harnwegssyndrome (LUTS, einschließlich Feiines Urologisches Syndrom (FUS)), Erkrankungen des Urogenital - Systems einschliesslich neurogene über aktive Blase (OAB) und (IC), Inkontinenz (UI) wie beispielsweise Misch-, Drang-, Stress-, oder Üb erlauf- Inkontinenz (MUI, UUI, SUI, OUI), Beckenschmerzen, benigne und maligne Erkrankungen der Organe des männlichen und weiblichen Urogenital- Systems.

Weiterhin eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Nierenerkrankungen, insbesondere von aktuer und chronischer Niereninsuffizienz, sowie von akutem und chronischem Nierenversagen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff Niereninsuffizienz sowohl akute als auch chronische Erscheinungsformen der Niereninsuffizienz, wie auch zugrundeliegende oder verwandte Nierenerkrankungen wie renale Hypoperfusion, intradialytische Hypotonie, obstruktive Uropathie, Glomerulopathien, Glomerulonephritis, akute Glomerulonephritis, Glomerulosklerose, tu- bulointerstitielle Erkrankungen, nephropathische Erkrankungen wie primäre und angeborene Nierener- krankung, Nierenentzündung, immunologische Nierenerkrankungen wie Nierentransplantatabstoßung, Immunkompl ex-induzierte Nierenerkrankungen, durch toxische Substanzen induzierte Nephropathie, Kontrastmittel-induzierte Nephropathie, diabetische und nicht-diabetische Nephropathie, Pyelonephritis, Nierenzysten, Nephrosklerose, hypertensive Nephrosklerose und nephrotisches Syndrom, welche diagnostisch beispielsweise durch abnorm verminderte Kreatinin- und/oder Wasser- Ausscheidung, abnorm erhöh- te Blutkonzentrationen von Harnstoff, Stickstoff, Kalium und/oder Kreatinin, veränderte Aktivität von Nierenenzymen wie z.B. Glutamylsynthetase, veränderte Urinosmolarität oder Urinmenge, erhöhte Mikroalbuminurie, Makroalbuminurie, Läsionen an Glomerula und Arteriolen, tubuläre Dilatation, Hy- perphosphatämie und/oder die Notwendigkeit zur Dialyse charakterisiert werden können. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der erfindungsgemäß en Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Folgeerscheinungen einer Niereninsuffizienz, wie beispielsweise Lungenödem, Herz- Insuffizienz, Urämie, Anämie, Elektrolytstörungen (z.B. Hyperkalämie, Hyponaträmie) und Störungen im Knochen- und Kohlenhydrat-Metabolismus.

Weiterhin eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zur Behandlung und/oder Prophylaxe von asthmatischen Erkrankungen, pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) und anderen Formen der pul- monalen Hypertonie (PH), umfassend mit Linksherzerkrankung, HIV, Sichelzellanämie, Thromboembo- lien (CTEPH), Sarkoidose, COPD oder Lungenfibrose assoziierte pulmonale Hypertonie, der chronischobstruktive Lungenerkrankung (COPD), des akuten Atemwegssyndrom (ARDS), der akuten Lungenschädigung (ALI), der alpha- 1 -Antitrypsin-Defizienz (AATD), der Lungenfibrose, des Lungenemphysem (z.B. durch Zigarettenrauch induziertes Lungenemphysem) und der zystischen Fibrose (CF). Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen stellen auch Wirkstoffe zur Bekämpfung von Krankheiten im Zentralnervensystem dar, die durch Störungen des NO/cGMP-Systems gekennzeichnet sind. Insbesondere sind sie geeignet zur Verbesserung der Wahrnehmung, Konzentrationsleistung, Lernleistung oder Gedächtnisleistung nach kognitiven Störungen, wie sie insbesondere bei Situationen/Krankheiten/ Syndromen auftreten wie "Mild cognitive impairment", altersassoziierten Lern- und Gedächtnisstörungen, altersassoziierten Gedächtnisverlusten, vaskulärer Demenz, Schädel-Hirn-Trauma, Schlaganfall, Demenz, die nach Schlaganfällen auftritt ("post stroke dementia"), post-traumatischem Schädel-Hirn- Trauma, allgemeinen Konzentrationsstörungen, Konz entrations Störungen bei Kindern mit Lern- und Gedächtnisproblemen, Alzheimer'scher Krankheit, Demenz mit Lewy-Körperchen, Demenz mit Degeneration der Frontallappen einschliesslich des Pick's-Syndroms, Parkinson'scher Krankheit, progres- siver nuclear palsy, Demenz mit corticobasaler Degeneration, Amyolateralsklerose (ALS), Hunting- ton'scher Krankheit, Demyelinisation, Multipler Sklerose, Thalamischer Degeneration, Creutzfeld- Jacob- Demenz, HIV- Domen/, Schizophrenie mit Demenz oder Korsakoff-Psychose. Sie eignen sich auch zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen des Zentralnervensystems wie Angst-, Spannungsund Depressionszuständen, zentral-nervös bedingten S exualdysfunktionen und Schlafstörungen sowie zur Regulierung krankhafter Störungen der Nahrungs-, Genuss- und Suchtmittelaufnahme.

Weiterhin eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zur Regulation der cerebralen Durchblutung und stellen wirkungsvolle Mittel zur Bekämpfung von Migräne dar. Auch eignen sie sich zur Prophylaxe und Bekämpfung der Folgen cerebraler Infarktgeschehen (Apoplexia cerebri) wie Schlaganfall, cerebraler Ischämien und des S chädel-Hirn-Traumas . Ebenso können die erfindungsgemäßen Verbindun- gen zur Bekämpfung von Schmerzzuständen und Tinnitus eingesetzt werden.

Zudem besitzen die erfindungsgemäß en Verbindungen antiinflammatorische Wirkung und können daher als entzündungshemmende Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Sepsis (SIRS), multiplem Organversagen (MODS, MOF), entzündlichen Erkrankungen der Niere, chronischen Darmentzündungen (IBD, Crohn 's Disease, UC), Pankreatitis, Peritonitis, rheumatoiden Erkrankungen, entzündlichen Haut- erkrankungen sowie entzündlichen Augenerkrankungen eingesetzt werden. Desweiteren können die erfindungsgemäßen Verbindungen ebenfalls zur Behandlung und/ oder Prophylaxe von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden.

Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe fibrotischer Erkrankungen der inneren Organe, wie beispielsweise der Lunge, des Herzens, der Niere, des Knochen- marks und insbesondere der Leber, sowie dermatologischer Fibrosen und fibrotischer Erkrankungen des Auges, geeignet. Im Sinne der vorliegenden Erfindungen umfasst der Begriff fibrotischer Erkrankungen insbesondere die folgenden Begriffe Leberfibrose, Leberzirrhose, Lungenfibrose, Endomyocardfibrose, Nephropathie, Glomerulonephritis, interstitielle Nierenfibrose, fibrotische Schäden in Folge von Diabetes, Knochenmarksfibrose und ähnliche fibrotische Erkrankungen, Sklerodermie, Morphaea, Keloide, hyper- trophe Narbenbildung (auch nach chirurgischen Eingriffen), Naevi, diabetische Retinopathie, proliferative Vitroretinopathie und Erkrankungen des Bindegewebes (z.B. Sarkoidose).

Weiterhin eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Bekämpfung postoperativer Narbenbildung, z.B. in Folge von Glaukom-Operationen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ebenfalls kosmetisch bei alternder und verhornender Haut eingesetzt werden.

Außerdem sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/ oder Prophylaxe von Hepatitis, Neoplasma, Osteoporose, Glaukom und Gastroparese geeignet.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Er- krankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzinsuffizienz, Angina pectoris, Hypertonie, pulmonaler Hypertonie, Ischämien, Gefäß erkrankungen, Niereninsuffizienz, thrombo embolischen Erkrankungen, fibrotischen Erkrankungen, Arteriosklerose, Demenzerkrankungen und erektiler Dysfunktion. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/' oder Prophylaxe von Herzinsuffizienz, Angina pectoris, Hypertonie, pulmonaler Hypertonie, Ischämien, Gefäß erkrankungen, Ni ereninsuffizienz, thrombo- embolischen Erkrankungen, fibrotischen Erkrankungen und Arteriosklerose.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß en Ver- bindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß en Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzinsuffizienz, Angina pectoris, Hypertonie, pulmonaler Hypertonie, Ischämien, Gefäß erkrankungen, Niereninsuffizienz, thromboembolischen Erkrankungen, fibrotischen Erkrankungen, Arteriosklerose, Demenzerkrankungen und erektiler Dysfunktion.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzinsuffizienz, Angina pectoris, Hypertonie, pulmonaler Hypertonie, Ischämien, Gefäßerkrankungen, Niereninsuffizienz, thromboembolischen Erkrankungen, fibrotischen Erkrankungen und Arteriosklerose, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit anderen Wirk- Stoffen eingesetzt werden. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe der zuvor genannten Erkrankungen. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft und vorzugsweise genannt:

• organische Nitrate und NO-Donatoren, wie beispielsweise Natriumnitroprussid, Nitroglycerin, Isosor- bidmononitrat, Isosorbiddinitrat, Molsidomin oder SIN-1, sowie inhalatives NO;

• Verbindungen, die den Abbau von cyclischem Guanosinmonophosphat (cGMP) inhibieren, wie beispielsweise Inhibitoren der Phosphodiesterasen (PDE) 1, 2 und/oder 5, insbesondere PDE 5 -Inhibitoren wie Sildenafil, Vardenafil und Tadalafil;

• antithrombotisch wirkende Mittel, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der Thrombo- zytenaggregationshemmer, der Antikoagulantien oder der profibrinolytischen Substanzen;

• den Blutdruck senkende Wirkstoffe, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der Calcium- Antagonisten, Angiotensin All- Antagonisten, ACE-Hemmer, Endothelin- Antagonisten, Ren inInhibitoren, alpha-Rezeptoren-Blocker, beta-Rezeptoren-Blocker, Mineralocorticoid-Rezeptor- Antagonisten sowie der Diuretika; und/oder · den Fettstoffwechsel verändernde Wirkstoffe, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der Thy- roidrezeptor-Agonisten, Cholesterinsynthese-Inhibitoren wie beispielhaft und vorzugsweise HMG- CoA-Reduktase- oder Squalensynthese-Inhibitoren, der AC AT -Inhibitoren, CETP-Inhibitoren, MTP- Inhibitoren, PPAR-alpha-, PPAR-gamma- und/oder PPAR-delta-Agonisten, Cholesterin- Absorptions- hemmer, Lipase-Inhibitoren, polymeren Gallens äureadsorber, Gallensäure-Reabsorptionshenimer und Lipoprotein(a) -Antagonisten.

Unter antithrombotisch wirkenden Mittel werden vorzugsweise Verbindungen aus der Gruppe der Throm- bozytenaggregationshemmer, der Antikoagulantien oder der profibrinolytischen Substanzen verstanden.

Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Thrombozytenaggregationshemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise Aspirin, Clopidogrel, Ticlopidin oder Dipyridamol, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Thrombin- Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Ximelagatran, Dabigat- ran, Melagatran, Bivalirudin oder Clexane, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem GPIIb/IIIa- Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Tirofiban oder Abci- ximab, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Faktor Xa-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Rivaroxaban (BAY 59- 7939), Edoxaban (DU- 176b), Apixaban, Otamixaban, Fidexaban, Razaxaban, Fondaparinux, Idraparinux, PMD-3112, YM-150, KFA-1982, EMD-503982, MCM-17, MLN-1021, DX 9065a, DPC 906, JTV 803, SSR-126512 oder SSR- 12X428, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit Heparin oder einem low molecular weight (LMW)-Heparin-Derivat verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Vitamin K- Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Coumarin, verabreicht. Unter den Blutdruck senkenden Mitteln werden vorzugsweise Verbindungen aus der Gruppe der Calcium- Antagonisten, Angiotensin AII-Antagonisten, ACE-Hemmer, Endothelin- Antagonisten, Renin- Inhibitoren, alpha-Rezeptoren-Blocker, beta-Rezeptoren-Blocker, Mineralocorticoid-Rezeptor- Antagonisten sowie der Diuretika verstanden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem C alcium- Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Nifedipin, Amlodipin, Verapamil oder Diltiazem, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem alpha- 1 -Rezeptoren-Blocker, wie beispielhaft und vorzugsweise Prazosin, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem beta-Rezeptoren-Blocker, wie beispielhaft und vorzugsweise Propranolol, Atenolol, Timolol, Pindolol, Alprenolol, Oxprenolol, Penbutolol, Bupranolol, Metipranolol, Nadolol, Mepindolol, Carazalol, Sotalol, Metoprolol, Betaxolol, Celiprolol, Bisoprolol, Carteolol, Esmolol, Labetalol, Carvedilol, Adaprolol, Landiolol, Nebivolol, Epanolol oder Bucindolol, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Angiotensin All -Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Losartan, Candesartan, Valsartan, Telmisartan, Embursartan, Irbesartan, Olmesartan, Eprosartan oder Azilsartan oder einem dualen Angiotensin AII-Antagonisten/NEP-Inhibitor, wie beispielsweise und vorzugsweise LCZ696 (Valsartan/'Sacubitril), verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem ACE-Hemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise Enalapril, Captopril, Lisinopril, Ramipril, Delapril, Fosinopril, Quinopril, Perindopril oder Trandopril, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Endothelin- Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Bosentan, Darusen- tan, Ambrisentan oder Sitaxsentan, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Renin- Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Aliskiren, SPP-600 oder SPP- 800, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Mineralocorticoid-Rezeptor- Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Spironolacton oder Eplerenon, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem S chleif endiuretikum, wie beispielsweise Furosemid, Torasemid, Bumetanid und Piretanid, mit kaliumsparenden Diuretika wie beispielsweise Amilorid und Triamteren, mit Aldosteronantagonisten, wie beispielsweise Spironolacton, Kaliumcanrenoat und Eplerenon sowie Thiaziddiuretika, wie beispielsweise Hydro chlorothiazid, Chlorthalidon, Xipamid, und Indapamid, verabreicht.

Unter den Fettstoffwechsel verändernden Mitteln werden vorzugsweise Verbindungen aus der Gruppe der CETP-Inhibitoren, Thyroidrezeptor-Agonisten, Cholesterinsynthese-Inhibitoren wie HMG-CoA- Reduktase- oder Squalensynthese-Inhibitoren, der AC AT -Inhibitoren, MTP-Inhibitoren, PPAR-alpha-, PPAR-gamma- und/oder PPAR-delta-Agonisten, Cholesterin- Absorptionshemmer, polymeren Gallens äu- readsorber, Gallensäure-Reab Sorptionshemmer, Lipase-Inhibitoren sowie der Lipoprotein(a)-Antagonisten verstanden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem CETP-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Dalcetrapib, BAY 60-5521, Anacetrapib oder CETP-vaccine (CETi-1), verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Thyroidrezeptor-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise D-Thyroxin, 3,5,3'-Triiodothyronin (T3), CGS 23425 oder Axitirome (CGS 26214), verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor aus der Klasse der Statine, wie beispielhaft und vorzugsweise Lovastatin, Simvastatin, Pravastatin, Fluvastatin, Atorvastatin, Rosuvastatin oder Pitavasta- tin, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Squalensynthese-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise BMS-188494 oder TAK-475, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem AC AT -Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Avasimibe, Melinamide, Pactimibe, Eflucimibe oder SMP-797, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem MTP-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Implitapide, BMS-201038, R- 103757 oder JTT-130, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem PPAR-gamma-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Pioglitazone oder Rosiglitazone, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem PPAR-delta-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise GW 501516 oder BAY 68-5042, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Cholesterin- Abso tionshemm er, wie beispielhaft und vorzugsweise Ezetimibe, Tiqueside oder Pamaqueside, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Lipase-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Orlistat, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem polymeren Gallens äureadsorb er, wie beispielhaft und vorzugsweise Cholestyra- min, Colestipol, Colesolvam, CholestaGel oder Colestimid, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Gallens äure-Reabsorptionshemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise AS BT (= IBAT)-Inhibitoren wie z.B. AZD-7806, S-8921, ΛΚ-105, BARI- 1741 , SC -435 oder SC-635, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß en Verbindungen in Kombination mit einem Lipoprotein(a)-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Gemcabene calcium (CI-1027) oder Nicotinsäure, verabreicht.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.

Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden. Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende, die erfindungsgemäßen Verbindungen schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nicht -überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfmdungsgemäßen Verbin- dung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Fil- me/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.

Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Κεβθ ΐίοηββοηπΐΐεβ geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. in- tramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern. Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalations arzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Ne- bulizer), Nasentropfen, -lösungen oder -sprays, lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wäßrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen) , lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale thera- peutische Systeme (z.B. Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.

Bevorzugt sind die orale oder parenterale Applikation, insbesondere die orale Applikation.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Lactose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Disper- gier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien. Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 1 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 0.5 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Dosierung etwa 0.001 bis 2 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.001 bis 1 mg/kg Körpergewicht.

Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen. Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung.

Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/ flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen. Beispiele

Abkürzungen:

abs. absolut (= getrocknet)

aq. wässrige Lösung

ber. berechnet

Boc tert-Butyloxycarbonyl

br. Verbreitertes Signal (NMR Kupplungsmuster)

CA S-Nr. Chemical Abstracts Service Nummer

Cbz Benzyloxycarbonyl

δ Verschiebung im NMR Spektrum (Angabe in ppm) d Dublett (NMR-Kupplungsmuster)

DC Dünnschichtchromatographie

DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)

DMAP 4-NN-Dimethylaminopyridin

DMF Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

EDCI A-[3-(Dimethylamino)propyl]-N'-ethylcarbodiimid d. Th. der Theorie (bei Ausbeute)

ent enantiomerenrein

eq. Äquivalent(e)

ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)

Et Ethyl

gef. gefunden

h Stunde(n)

HAT Ii N-[(Dimethylamino)(3H-[l,2,3]ü-iazolo[4,5-b]-pyridin-3- yloxy)methylen]-N-methylmethanaminiumhexafluorophosphat

HOBT 1 H-Benzotriazol- 1 -ol

HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie

HRMS hochaufgelöste Massenspektrometrie

I D Innendurchmesser

konz. konzentriert

LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie LiHMDS Lithiumhexamethyldisilazid

m Multiplett

Me Methyl

min Minute(n) MS Massen spektrometrie

NMR Kernresonanzspektrometrie

PDA Photodiodenarraydetektoi"

Pd ₂ dbas Tris-(dibenzylidenaceton)-dipalladium

Ph Phenyl

q Quartett (NMR Kupplungsmuster)

quint. Quintett (NMR Kupplungsmuster)

rac racemisch

rel relative Stereochemie

Ri Retentionsfaktor (bei Dünnschichtchromatographie)

RT Raumtemperatur

R _t Retentionszeit (bei HPLC)

s Singulett (NMR Kupplungsmuster)

t Triplett (NMR Kupplungsmuster)

THF Tetrahydrofuran

TBTU (Benzotriazol- 1 -yloxy)bisdimethyl aminomethyliumfluoroborat

UPLC -MS Ultradruck-Flüssigchromatographiegekoppelte Massenspektrometrie

UV Ultraviolett-Spektrometrie

v/v Volumen zu Volumen- Verhältnis (einer Lösung)

Xantphos 4,5-Bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene

XPHOS Dicyclohexyl-(2',4',6'-triisopropylbiphenyl-2-yl)-phosphin

LC-MS- und U I. ( ^" -Methoden: Methode 1 (LC-MS):

Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: ! I Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 0.1 min 90% A ♦ 1 .5 min 10% A -> 2.2 min 10% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.33 ml/min; UV-Detektion: 210 nm

Methode 2 (LC-MS):

Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 1.2 min 5% A 2.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 ml min; UV-Detektion: 210 - 400 nm. Methode 3 (LC-MS):

Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 97% A -> 0.5 min 97% A -> 3.2 min 5% A -> 4.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.3 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 4 (präparative HPLC):

Chromatorex C18 10μ 250x20 mm Gradient: A= Wasser + 0,5% Ameisensäure, B = Acetonitril, 0min = 5% B, 3min = 5% B vorspülen ohne Substanz, dann Injektion, 5 min = 5% B, 25min = 30% B, 38min = 30% B, 38.1 min = 95% B, 43.00 min = 95% B, 43.01 min= 5% B, 48.0min = 5% B; Flussrate 20 ml/min, Wellenlänge 210 nm.

Methode 5 (präparative HPLC):

Chromatorex C18 10μ 250x20 mm Gradient: A= Wasser + 0. 5% Ameisensäure, B = Acetonitril, 0 min = 5% B, 3min = 5% B vorspülen ohne Substanz, dann Injektion, 5 min = 5% B, 25 min = 50% B, 38 min = 50% B, 38.1 min = 95% B, 43.00 min = 95% B, 43.01min = 5% B, 48.0 min = 5% B; Flussrate 20 ml/min, Wellenlänge 210 nm.

Methode 6 (präparative HPLC):

X ridge Prep. C18 5μ 50x19 mm Gradient: A= Wasser + 0.5% Ammoniumhydroxid, B= Acetonitril, 0min = 5% B, 3 min = 5% B vorspülen ohne Substanz, dann Injektion, 5 min = 5% B, 25 min = 50% B, 38.0 min = 50% B, 38.1 min = 95% B, 43.00 min= 95% B, 43.01min= 5% B, 48.0 min= 5% B; Flussrate 1 ml/min, Wellenlänge 210 nm

Methode 7 (LC-MS):

Instrument MS: Waters (Micromass) QM; Instrument HPLC: Agilent 1100 Serie; Säule : Agient ZORBAX Extend-C18 3.0x50mm 3.5-Micron; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 mol Ammoniumcarbonat, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 98% A 0.2 min 98% A -> 3.0 min 5% A - 4.5 min 5% A ; Ofen: 40°C; Fluss: 1.75 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 8 (LC-MS):

Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 30 x 2 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 1.2 min 5% A 2.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.60 ml/min; UV-Detektion: 208 - 400 nm.

Methode 9 (präparative HPLC):

Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Waters X-Bridge C18, 18 mm x 50 mm, 5 μπι, Eluent A: Wasser + 0.05% Triethylamin, Eluent B: Acetonitril (ULC) + 0.05% Triethylamin, mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm). bzw.:

Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Phenomenex Luna 5μ C18(2) 100A, AXIA Tech. 50 x 21.2 mm, Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) + 0.05% Ameisensäure, mit Gradient; Fluss: 40 ml/'min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm). Methode 10 (LC-MS):

Instrument MS: Waters SQD; Instrument HPLC: Waters UPLC; Saeule: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50 mm x 2.1 mm, 1.8 μπι; Eluent A: Wasser + 0.025% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) + 0.025% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 98%A - 0.9 min 25%A - 1.0 min 5%A - 1.4 min 5%A - 1.41 min 98%A - 1.5 min 98%A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.600 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 nm. Methode 1 1 (MS):

Instrument: Waters ZQ 2000; Elektrospray-Ionisierung; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure; 25% A, 75% B; Fluss: 0.25 ml/'min.

Methode 12 (PC l-MS):

Instrument: Thermo Fisher-Scientific DSQ; chemische Ionisierung; Reaktantgas IL; Quellentemperatur: 200°C; Ionisierungsenergie 70eV.

Methode 13 (LC-MS):

Instrument MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Instrument HPLC: Agilent 1100 Serie; Säule: YMC- Triart C18 3 μ 50 x 3 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 mol Ammoniumc arbonat, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 100% A 2.75 min 5% A 4.5 min 5% A; Ofen: 40°C; Fluss: 1.25 ml/'min; UV- Detektion: 210 nm.

Methode 14 (GC-MS):

Instrument: Thermo Scientific DSQ II, Thermo Scientific Trace GC Ultra; Säule: Restek RTX-35MS, 15 m x 200 μπι x 0.33 μπι; konstanter Fluss mit Helium: 1.20 ml/'min; Ofen: 60°C; Inlet: 220°C; Gradient: 60°C, 30°C/min -> 300°C (3.33 min halten).

Methode 15 (LC-MS, analytisch): Instrument: Agilent MS Quad 6150; HPLC: Agilent

1290; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A 0.3 min 90% A -> 1.7 min 5% A -> 3.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 ml/'min; UV-Detektion: 205 - 305 nm.

Methode 16 (LC-MS, analytisch):

Instrument MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Instrument Waters UPLC Acquity; Säule : Waters BEH C18 1.7 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 mol Ammoniumformiat, Eluent B: 1 1 Aceto- nitril; Gradient: 0.0 min 95% A -> 0.1 min 95% A -> 2.0 min 15% A 2.5 min 15% A-> 2.51 min 10% A -> 3.0 min 10% A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.5 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 17 ( C-MS):

Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure , Eluent Ii: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 95% A -> 6.0 min 5% A -> 7.5 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.35 ml/min; UV-Detektion: 210 - 400 nm.

Weitere Angaben:

Bei Aufreinigungen von erfindungsgemäßen Verbindungen per präparativer HP I nach den oben beschriebenen Methoden, in denen die Elutionsmittel Zusatzstoffe wie beispielsweise Trifluoressigsäure, Ameisensäure oder Ammoniak enthalten, können die erfindungsgemäß en Verbindungen in Salz-Form, beispielsweise als Trifluoracetat, Formiat oder Ammonium-Salz anfallen, sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen ausreichend basische bzw. saure Funktionalitäten enthalten. Ein solches Salz kann durch verschiedene dem Fachmann bekannte Methoden in die entsprechende freie Base bzw. Säure überführt werden.

So können die Trifluoracetat-, Formiat- oder Ammonium- S alze durch Ausschütteln einer organischen Lösung oder Suspension mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung in die salzfreie Form überführt werden. Des Weiteren können Amidine als freie Verbindungen oder anteilig (abhängig von der Präparation bei Beteiligung von Essigsäure) als Acetat-Salze oder Acetat-Solvate vorliegen.

Wenn bei den im Folgenden beschriebenen Synthese -Intermediaten und Ausführungsbeispielen der Erfindung eine Verbindung in der Form eines Salzes der korrespondierenden Base bzw. Säure aufgeführt ist, so ist die exakte stöchiometrische Zusammensetzung eines solchen Salzes, wie es nach dem jeweiligen Her- stell- und/oder Reinigungsverfahren erhalten wurde, in der Regel nicht bekannt. Sofern nicht genauer spezifiziert, sind daher Namens- und Strukturformel-Zusätze wie beispielsweise "Hydrochlorid", "Trifluoracetat", "Natrium-Salz" bzw. "x HCl", "x CF ₃ COOH", "x Na ⁺ " bei solchen Salzen nicht stöchiometrisch zu verstehen, sondern haben allein deskriptiven Charakter bezüglich der enthaltenen salzbildenden Komponenten.

Sinngemäß gleiches gilt für den Fall, dass Synthese-Intermediate oder Ausführungsbeispiele oder Salze hiervon nach den beschriebenen Herstell- und/oder Reinigungsverfahren in Form von Solvaten, wie beispielsweise Hydraten, erhalten wurden, deren stöchiometrische Zusammensetzung (sofern definierter Art) nicht bekannt ist.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen sekundären Amide als Rotationsisomere/ Isomerengemische, insbesondere bei NMR-Untersuchungen, vorliegen. Reinheitsangaben beziehen sich in der Regel auf ent- sprechende Peak-Integrationen im LC/MS -Chromatogramm, können aber zusätzlich auch unter Zuhilfenahme des 'H-NMR-Spektrums ermittelt worden sein. Wenn keine Reinheit angegeben ist, handelt es sich in der Regel um eine 100%-Reinheit laut automatischer Peak-Integration im LC/MS-Chromatogramm o- der die Reinheit wurde nicht explizit ermittelt.

Angaben zu Ausbeuten in % d. Th. sind in der Regel reinheitskorrigiert, sofern eine Reinheit <100% angegeben ist. Bei lösungsmittelhaltigen oder verunreinigten Chargen kann die Ausbeute formal ">100%" betragen; in diesen Fällen ist die Ausbeute nicht lösungsmittel- bzw. reinheitskorrigiert.

Alle Angaben in 'H-NMR-Spektren geben die Chemischen Verschiebungen δ in ppm an.

Die in den folgenden Paragraphen angegebenen Multiplizitäten von Protonensignalen in H-NMR- Spektren geben die jeweils beobachtete Signalform wieder und berücksichtigen keine Signalphänomene höherer Ordnung. In der Regel bezieht sich die Angabe zur chemischen Verschiebung auf das Zentrum des betreffenden Signals. Bei breiten Multipletts erfolgt die Angabe eines Intervalls. Durch Lösungsmittel oder Wasser verdeckte Signale wurden entweder tentativ zugeordnet oder sind nicht aufgeführt. Stark verbreiterte Signale - z.B. verursacht durch schnelle Rotation von Molekülteilen oder aufgrund von austauschenden Protonen - wurden ebenfalls tentativ zugeordnet (oft als breites Multiplett oder breites Singulett bezeichnet) oder sind nicht aufgeführt.

Die Methyl-Gruppe des chemischen Systems 2-Methyl-pyrazolo[ 1 ,5-a]pyridin" erscheint in Ή-NMR- Spektren als Singulett (oftmals in DMSO-de und im Bereich von 2.40 - 2.60 ppm) und ist etweder klar als solches erkennbar, ist mit den Lösungsmittelsignalen überlagert oder liegt vollständig unter den Signalen der Lösungsmittel.

Schmelzpunkte und Schmelzbereiche, soweit angegeben, sind nicht korrigiert.

Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Literatur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist.

Aiisgangsverbindungen und Intermediate:

Beispiel 1A

2 - [ (2 ,6-Difluorbenzyl)oxy] -4 -methylpyridin

Eine Mischung von 5.00 g (24.2 mmol, 1.0 eq.) 2,6-Dif uorbenzylbromid [CAS -Nr: 85118-00-9] und 3.16 g (29.0 mmol, 1.2 eq.) 2-Hydroxy-4-methylpyridin [CAS-Nr: 13466-41-6] wurden in 50 ml THF gelöst. Die Lösung wurde mit 7.99 g (29.0 mmol, 1.2 eq.) Silbercarbonat versetzt und unter Lichtausschluss über Nacht auf Rückfluss erhitzt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung über Kieselgur filtriert, mit Es- sigsäureethylester eluiert und das Filtrat wurde eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels Biotage Isolera (100 g Kieselgelkartusche, Cyclohexan/Essigsäureethylester-Gradient, 0 % nach 10 % Essigsäureethyles- ter) gereinigt. Es wurden 3.51 g der Titelverbindung (61 % d. Th.) erhalten.

IX (Kieselgel, Cyclohexan/Essigsäureethylester 10: 1): F = 0.50

LC-MS (Methode 2): R _T = 1.17 min

MS (ESpos): m/z = 236 (M+H) ⁺

^S H- MR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 2.26 (s, 3H), 5.35 (s, 2H), 6.66 (s, 1H), 6.86 (d, 1H), 7.12 - 7.21 (m, 2H), 7.47 - 7.56 (m, 1H), 8.06 (d, 1H).

Beispiel 2A

l-Amino-2-[(2,6-difluorbenzyl)oxy]-4-methylpyridinium-2,4 ,6-trimethylbenzolsulfonat

Eine Mischung von 3.4 ml (43.9 mmol, 10 eq.) Trifluoressigsäure und 0.33 ml Wasser wurden auf -5°C gekühlt. Bei dieser Temperatur wurden 1.88 g (6.59 mmol, 1 .5 eq.) Ethy 1- ( lE)-N-[(mesityl sulf onyl) oxy- ]ethanimidoat [CAS-Nr: 38202-27-6] portionsweise zugegeben. Nach 1.5 h wurden 30 ml Eiswasser hin- zugefügt, es wurde kurz nachgerührt und das entstandene 0-(2-Mesitylenesulfonyl)hydroxylamin (MSH) wurde durch eine vorher gekühlte Fritte ab filtriert und mit 30 ml Eiswasser gewaschen. Das wasserfeuchte 0-(2-Mesitylenesulfonyl)hydroxylamin wurde in 12 ml Dichlormethan gelöst, mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und und das Filtrat wurde direkt zu einer Lösung von 1.03 g (4.39 mmol, 1.0 eq.) 2-[(2,6- Difluorbenzyl)oxy]-4-methylpyridin aus Beispiel 1A in 2 ml Dichlormethan getropft. Die Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde Diethylether zugetropft, der anfallende Niederschlag ab filtriert, mit Diethylether gewaschen und getrocknet. Es wurden 1.3 g der Titelverbindung isoliert (59% d. Th, Reinheit 90%).

'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 2.17 (s, 3H), 2.46 - 2.57 (s, 3H und s, 6H überlagert mit den Lösungsmittelsignal), 5.64 (s, 2H), 6.74 (s, 2H), 7.23 - 7.48 (m, 4H), 7.60 - 7.70 (m, 1H), 7.86 (br s, 1H), 8.44 (d, 1H). 'isniel 3A

Ethyl-7-[(2,6-difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyrazolo[ 1 ,5-a]pyridin-3 -carboxylat

1.62 g (3.60 mmol, 1.0 eq.) l-Amino-2-[(2,6-difluorbenzyl)oxy]-4-methylpyridinium-2,4,6- trimethylbenzolsulfonat aus Beispiel 2A wurden in 36 ml DMF gelöst und mit 0.84 ml (7.19 mmol, 2.0 eq.) Ethylbut-2-inoat [CAS-Nr: 4341-76-8] versetzt. Es wurden 0.994 g (7.19 mmol, 2.0 eq.) Kaliumcar- bonat zugegeben und die Mischung wurde 1.5 h bei RT gerührt. Anschließend wurde das Gemisch auf 150 ml Wasser gegossen, kurz ausgerührt, der entstandene Feststoff ab filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 440 mg der Titelverbindung (45% d. Th., 87%) erhalten.

IX -MS (Methode 2): R _t = 1.22 min

MS (ESpos): m/z = 361 (M+H) ⁺

Beispiel 4A

7-[(2,6-Difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyrazolo[l,5-a]pyridi n-3-carbonsäure

Eine Lösung von 0.440 g(1.22 mmol, 1 eq.) Ethyl-7-[(2,6-difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethyl-pyrazolo[l,5- a]pyridin-3-carboxylat aus Beispiel 3A in 12.7 ml Dioxan wurde mit 4.9 ml (4.88 mmol, 4.0 eq.) 1 N wässriger Natronlauge versetzt und 36 h bei 90°C gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch eingeengt und der entstandene Feststoff ab filtriert. Das Filtrat wurde mit 6 N wässriger Salzsäure angesäuert und kurz ausgerührt. Der entstandene Feststoff wurde ab filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 248 mg der Titelverbindung (61% d. Th., Reinheit 60%) erhalten, die ohne weitere Reinigung weiter umgesetzt wurde.

IX -MS (Methode 2): R _t = 0.96 min

MS (ESpos): m/z = 333 (M+H) ⁺

Beispiel 5A

rac-2-Amino-2-methyl(4,4,4- ² H3)butannitri

2.0 g (26.62 mmol) (4,4,4- ² H ₃ )Butan-2-on [CAS Registry Nummer: 53389-26-7] wurden in 22.3 ml 2 N Ammoniak in Methanol vorgelegt und bei Raumtemperatur mit 1.72 g (35.14 mmol) Natriumcyanid sowie 1.88 g (35.14 mmol) Ammoniumchlorid versetzt und 4 Stunden unter Rückfluss gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, mit 40 ml Diethylether versetzt und der enthaltene Feststoff wurde ab filtriert. Das Lösungsmittel aus dem Filtrat wurde unter Normaldruck abdestilliert. Es wurden 2.75 g der Titelverbindung (51 % d. Th. bei einer Reinheit von ca. 50%) als Rückstand erhalten, der ohne weitere Reinigung in die Folgestufe eingesetzt wurde.

GC-MS (Methode 14): R _t = 1.66 min

MS (ESpos): m/z = 86 (M-CH ₃ ) ⁺ Beispiel 6A

rac-Benzyl-[2-cyan(4,4,4- ² H3)butan-2- l]carbamat

2.75 g (13.59 mmol bei einer Reinheit von ca. 50%) rac-2-Amino-2-methyl(4,4,4- ² H3)butannitril aus Beispiel 5A wurden in 33 ml Tetrahydrofuran/Wasser = 9/1 vorgelegt und mit 5.82 g (42.13 mmol) Kali- umcarbonat versetzt. Bei 0°C wurden langsam 2.32 g (13.59 mmol) Chlorameisens äurebenzylest er zugetropft. Dann ließ man unter Rühren langsam auf Raumtemperatur erwärmen und rührte über Nacht bei Raumtemperatur. Das überstehende Lösungsmittel wurde abdekantiert, der Rückstand zweimal mit je 25 ml T etrahydrofuran verrührt wonach das überstehende Lösungsmittel j eweils abdekantiert wurde. Die vereinigten organischen Phasen wurde eingeengt und das Rohprodukt wurde mittels Kieselgelchromatographie gereinigt (Laufmittel-Gradient: Cyclohexan nach Cyclohexan/Dichlormethan-Gradient 1/1 bis 1/2). Es wurden 2.56 g der Titelverbindung (78 % d. Th.) erhalten.

IX -MS (Methode 2): R _t = 0.89 min

MS (ESpos): m z = 236 (M+H) ⁺

'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.51 (s, 3H), 1.75 - 1 .91 (m, 2H), 5.08 (s, 2H), 7.28 - 7.42 (m,

5H), 7.96 (br. s, 1H).

Beispiel 7A

e«i-Benzyl-[2-cyan(4,4,4- ² H ₃ )butan-2- l]carbamat (Enantiomer A)

2.56 g rac-Benzyl-[2-cyan(4,4,4- ² H3)butan-2-yl]carbamat aus Beispiel 6A wurden durch präparative Trennung an der chiralen Phase in die Enantiomere getrennt [Säule: Daicel Chiralcel OJ-H, 5 μπι, 250 x 20 mm, Eluent: 70% iso-Hexan, 30% iso-Propanol, Fluss: 15 ml/min, Temperatur: 47°C, Detektion: 220 um].

Enantiomer A: 1.03 g (>99% ee) R, = 7.11 min [Daicel Chiralcel OJ-H, 250 x 4.6 mm, 5 μπι, Eluent: 70% iso-Hexan, 30% iso-Propanol, Fluss: 1 ml/min, Temperatun 50°C, Detektion: 220 nm].

Bespiel HA

e«/-Benzyl-[2-cyan(4,4,4- ² H3)butan-2-yl]carbamat (Enantiomer B)

2.56 g rac-Benzyl-[2-cyan(4,4,4- ² H ₃ )butan-2-yl]carbamat aus Beispiel 6A wurden durch präparative Trennung an der chiralen Phase in die Enantiomere getrennt [Säule: Daicel Chiralcel OJ-H, 5 μιη, 250 x 20 mm, Eluent: 70% iso-Hexan, 30% iso-Propanol, Fluss: 15 ml/min, Temperatur: 47°C, Detektion: 220 nm].

Enantiomer B: 0.99 g (>99% ee)

Rj = 8.25 min [Daicel Chiralcel OJ-H, 250 x 4.6 mm, 5 μηι, Eluent: 70% iso-Hexan, 30% iso-Propanol, Fluss: 1 ml/min, Temperatur: 50°C, Detektion: 220 nm].

Beispiel 9A

e«/-Benzyl-[l-amino-2-methyl(4,4,4- ² H ₃ )butan-2-yl]carbamat (Enantiomer A)

0.50 g (2.13 mmol) e«i-Benzyl-[2-cyan(4,4,4- ² H3)butan-2-yl]carbamat (Enantiomer A) aus Beispiel 7A wurden in 10 ml 7 N Ammoniak-Lösung in Methanol gelöst und unter Argon mit 0.79 g Raney-Nickel (50%ige wässrige Aufschlämmung) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h im Autoklaven bei 20-30 bar hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über Kieselgur abfiltriert, mit Methanol gespült und eingeengt. Es wurden 387 mg (75% d. Th.) der Zielverbindung erhalten, welche ohne weitere Reinigung in die Folgestufe eingesetzt wurde.

LC-MS (Methode 2): R _t = 0.50 min

MS (ESpos): m/z = 240 (M+H) ⁺ Beispiel 10A

e«^Benzyl-[l-amino-2-methyl(4,4,4- ² H tan-2-yl]carbamat (Enantiomer B)

0.50 g (2.13 mmol) e«^Benzyl-[2-cyan(4,4,4-~H3)butan-2-yl]carbamat (Enantiomer B) aus Beispiel 8A wurden in 10 ml 7 N Ammoniak-Lösung in Methanol gelöst und unter Argon mit 0.79 g Raney-Nickel (50%ige wässrige Aufschlämmung) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h im Autoklaven bei 20-30 bar hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über Kieselgur abfiltriert, mit Methanol gespült und eingeengt. Es wurden 487 mg (94% d. Th.) der Zielverbindung erhalten, welche ohne weitere Reinigung in die Folgestufe eingesetzt wurde.

LC-MS (Methode 2): R _t = 0.53 min

MS (ESpos): m/z = 240 (M+H) ⁺

Beispiel I IA

rac-2-Amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butannitril

13.0 g (90.10 mmol) 4-(Trimethylsilyl)butan-2-on [käuflich erhältlich oder synthetisierbar nach R. Acerete et al. Journal of Organic Chemistry 2011, 76, 10129-10139] wurden in 25 ml 7 N Ammoniak in Methanol vorgelegt und bei Raumtemperatur mit 5.83 g (118.93 mmol) Natriumcyanid sowie 6.36 g (118.93 mmol) Ammoniumchlorid versetzt und 3 Stunden unter Rückfluss gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, und der enthaltene Feststoff wurde ab filtriert. Das Filtrat wurde unter ohne weitere Reinigung in die Folgestufe eingesetzt wurde. Beispiel 12 A

rac-Benzyl-[2-cyan-4-(txirnethylsilyl)butan-2-yl]carbamat

Die Rolllösung von rac-2-Amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butannitril aus Beispiel 11A wurden in 16 ml

Wasser vorgelegt und mit 37.36 g (270.35 mmol) Kaliumc arbonat versetzt. Bei 0°C wurden langsam 23.06 g (135.18 mmol) Chlorameisensäurebenzylester zugetropft. Dann ließ man unter Rühren langsam auf Raumtemperatur erwärmen und rührte über Nacht bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde ab filtriert und der Rückstand wurde mehrmals mit Tetrahydroiuran gewaschen. Das Filtrat wurde eingeengt und das Rohprodukt wurde mittels Kieselgelchromatographie gereinigt (Laufmittel: Cyclohe- xan/Essigsäureethylester = 9/1). Es wurden 11.60 g der Titelverbindung (42 % d. Th. über zwei Stufen) erhalten.

IX -MS (Methode 2): R, = 1.23 min

MS (ESpos): m/z = 305 (M+H) ⁺

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = -0.01 (s, 9H), 0.45 - 0.67 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.73 - 1.90 (m, 2H), 2.24 - 2.52 (m, 2H), 5.08 (s, 2H), 7.29 - 7.44 (m, 5H), 7.94 (br. s, 1H).

Beispiel I3A

e«/-Benzyl-[2-cyan-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl]carbamat (Enantiomer A)

10.0 g rac-Benzyl-[2-cyan-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl]carbamat aus Beispiel 12A wurden durch präpara- tive Trennung an der chiralen Phase in die Enantiomere getrennt [Säule: Daicel Chiralpak AY-H. 5 μπι, 250 x 20 mm, Eluent: 15% Ethanol, 85% iso-Hexan, Fluss: 20 ml/min, Temperatur: 30°C, Detektion: 220 nm].

Enantiomer A: 4.19 g (>99% ee) R, = 5.24 min [Daicel Chiralpak AY-H, 250 x 4.6 mm, 5 μπι, Eluent: 10% Ethanol, 90%> iso-Hexan, Fluss: 1 ml/min, Temperatur: 45°C, Detektion: 220 nmj.

Beispiel 14A

e«i-Benzyl-[2-cyan-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl]carbamat (Enantiomer B)

10.0 g rac-Benzyl-[2-cyan-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl]carbamat aus Beispiel 12A wurden durch präpara- tive Trennung an der chiralen Phase in die Enantiomere getrennt [Säule: Daicel Chiralpak AY-H, 5 μm, 250 x 20 mm, Eluent: 15% Ethanol, 85% iso-Hexan, Fluss: 20 ml/min, Temperatur: 30°C, Detektion: 220 um]. Enantiomer B: 4.24 g (>99% ee)

R, = 6.89 min [Daicel Chiralpak AY-H, 250 x 4.6 mm, 5 μπι, Eluent: 10% Ethanol, 90% iso-Hexan, Fluss: 1 ml/min, Temperatur: 45°C, Detektion: 220 nmj.

Beispiel ISA

e«/-Benzyl-[ l-amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl] carbamat (Enantiomer A)

2.0 g (6.57 mmol) e«i-Benzyl-[2-cyan-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl]carbamat (Enantiomer A) aus Beispiel 13 A wurden in 31 ml 7 N Ammoniak-Lösung in Methanol gelöst und unter Argon mit 2.44 g Raney- Nickel (50%ige wässrige Aufschlämmung) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h im Autoklaven bei 20-30 bar hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über Kieselgur ab filtriert, mit Methanol gespült und eingeengt. Es wurden 1.80 g (87% d. Th.) der Zielverbindung erhalten, welche ohne weitere Reinigung in die Folge stufe eingesetzt wurde.

LC-MS (Methode 16): R _t = 1.66 min MS (ESpos): m/z = 309 (M+H) ⁺

Beispiel 16A

ewi-Benzyl-[ l-amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl] carbamat (Enantiomer B)

2.0 g (6.57 mmol) e»i-Benzyl-[2-cyan-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl]carbamat (Enantiomer B) aus Beispiel 14A wurden in 31 ml 7 N Ammoniak-Lösung in Methanol gelöst und unter Argon mit 2.44 g Raney- Nickel (50% ige wässrige Aufschlämmung) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h im Autoklaven bei 20-30 bar hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über Kieselgur abfiltriert, mit Methanol gespült und eingeengt. Es wurden 1.72 g (83 %> d. Th.) der Zielverbindung erhalten, welche ohne weitere Reinigung in die Folgestufe eingesetzt wurde.

LC -MS (Methode 2): R _t = 0.78 min

MS (ESpos): m z = 309 (M+H) ⁺

^'ispicl 17A

ent- zyl- { 1 -[( {7-[(2,6-difluorbenzyl)oxy] -2,5 -dimethylpyrazolo[ l,5-a]pyridin-3 -yl}carbonyl)amino] -2- methyl(4,4,4- ² H3)butan-2-yl} carbamat (Enantiomer A)

75 mg (0.19 mmol; Reinheit 84%) 7-[(2,6-Difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyrazolo[l,5-a]pyridi n-3- carbonsäure aus Beispiel 4A wurden mit 87 mg (0.23 mmol) HA ^' T ^' U und 0.1 ml (0.57 mmol) N,N- Diisopropylethylamin in 0.70 ml DMF vorgelegt und 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 60 mg (0.25 mmol) e«?-Benzyl-[l-amino-2-methyl(4,4,4- ² H3)butan-2-yl]carbamat (Enantiomer A) aus Beispiel 9A zur Reaktionslösung gegeben und über Nacht bei RT gerührt. Es wurden nochmals 23 mg (0.095 mmol) e« -Benzyi-[l-amino-2-methyl(4,4,4- ² H3)butan-2-yl]carbamat (Enantiomer A) hinzugegeben und das Gemisch wurde 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurde das Gemisch mit 7 ml Wasser versetzt. Der entstandene Niederschlag wurde ab filtriert und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 111 mg der Zielverbindung (80% d. Th.; Reinheit 76%) erhalten.

LC-MS (Methode 2): R _t = 1.17 min

MS (ESpos): m/z = 554 (M+H) ⁺

e«i-Benzyl- { 1 -[( {7-[(2,6-difluorbenzyl)oxy] -2,5 -dimethylpyrazolo[ 1 ,5-a]pyridin-3 -yl}carbonyl)amino] -2- methyl-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl}carbamat Trifluoracetat (Enantiomer A)

75 mg (0.19 mmol; Reinheit 84%) 7-[(2,6-Difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyrazolo[l,5-a]pyridi n-3- carbonsäure aus Beispiel 4A wurden mit 94 mg (0.25 mmol) HATU und 99 μΐ (0.57 mmol) N,N- Diisopropylethylamin in 0.62 ml DMF vorgelegt und 20 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 78 mg (0.25 mmol) ) e«i-Benzyl-[l-amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl]c arbamat (Enantiomer A) aus Beispiel 15A zur Reaktionslösung gegeben und über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde das Gemisch mit 7 ml Wasser versetzt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Aceto- nitril und Wasser verdünnt, mit TFA versetzt und mittels präparativer HPLC gereinigt (RP18 Säule, Laufmittel: Acetonitril Wasser-Gradient unter Zusatz von 0.1%o TFA). Die Produktfraktionen wurden vereinigt, und eingeengt. Es wurden 70 mg der Zielverbindung (50%> d. Th.) erhalten.

LC-MS (Methode 2): R _t = 1.39 min

MS (ESpos): m/z = 623 ( M-TFA+H ) ^' Beispiel 19A

ewi-Benzyl- { 1 -[( {7-[(2,6-difluorbenzyl)oxy] -2,5 -dimethylpyrazolo[ 1 ,5-a]pyridin-3 -yl}carbonyl)amino] -2- methyl-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl}carbamat (Enantiomer B)

75 mg (0.19 mmol; Reinheit 84%) 7-[(2,6-Difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyrazolo[l,5-a]pyridi n-3- carbonsäure aus Beispiel 4A wurden mit 94 mg (0.25 mmol) HATU und 99 μΐ (0.57 mmol) N,N- Diisopropylethylamin in 0.62 ml DMF vorgelegt und 20 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 78 mg (0.25 mmol) e«i-Benzyl-[l-amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl]c arbamat (Enantiomer B) aus Beispiel 16A zur Reaktionslösung gegeben und 2 h bei RT gerührt. Es wurden nochmals 29 mg (0.095 mmol) e«i-Benzyl-[i -amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl]carbamat (Enantiomer B) hinzugegeben und das Gemisch wurde 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurde das Gemisch mit 7 ml Wasser versetzt. Der entstandene Niederschlag wurde ab filtriert und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 134 mg der Zielverbindung (99% d. TL; Reinheit 88%) erhalten.

Li -MS (Methode 2): R _t = 1.39 min

MS (ESpos): m/z = 623 (M+H) ⁺

Beispiel 20A

rac-2-Amino-2-[2-(difluormethyl)-2H-tetrazol-5-yl]propan- 1 -ol

Die Zielverbindung kann durch Entschützung von 1 - { [tert-Butyl(dimethyl) silyl] oxy } -2 - [2 - (difluormethyl)-2H-tetrazol-5-yl]propan-2-amin (herstellbar analog zu Intermediat 300 in WO2014/084312 aus racemischem Ausgangsmaterial) mit Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) in THF bei Raumtemperatur nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden. Ansführniigsbeispiele

Beispiel 1

7-[(2,6-Difluorbenzyl)oxy]-N-[(2S)-l-hydroxy-2-(^^

dimethylpyrazolo[ 1 ,5-a]pyridin-3 -carboxamid Trifluoracetat

20 mg (0.05 mmol) 7-[(2,6-Difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyrazolo[ l,5-a]pyridin-3-carbonsäure aus Beispiel 4A wurden mit 21 mg (0.06 mmol) HATU und 70 μΐ (0.40 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin in 0.2 ml DM F vorgelegt und 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 44 mg (0.15 mmol) (25)-2-Amino-2-(5-methyl- 1 ,3 ,4-thiadiazol-2-yl)propan- 1 -ol (herstellbar analog zu Intermediat 307 in WO2014/084312) zur Reaktionslösung gegeben und 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurde das Gemisch 20 min bei 40°C und 1.5 h bei 60°C gerührt. Dann wurde mit Acetonitril und Wasser verdünnt, mit TFA versetzt und mittels präparativer HPLC gereinigt (RP18 Säule, Laufmittel: Acetonitril/W asser- Gradient unter Zusatz von 0.1% TFA). Die Produktfraktionen wurden vereinigt, und eingeengt. Es wurden 10 mg der Zielverbindung (31% d. Th.) erhalten.

IX -MS (Methode 2): R _t = 0.89 min

MS (ESpos): m z = 488 ( M-T A+H )

TI-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ = 1.81 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 2.68 (s, 3H), 3.77 - 3.85 (m, 2H), 5.46 (s, 2H), 6.58 (s, 1H), 7.21 - 7.30 (m, 2H), 7.35 (s, 1H), 7.57 - 7.67 (m, 2H), [weiteres Signal unter Lösungsmittelsignal verborgen]. Beispiel 2

rac-7-[(2,6-Difluorbenzyl)oxy]-N-{2-[2-(difluormem^

dimethylpyrazolo[ 1 ,5-a]pyridin-3 -carboxamid

40 mg (0.10 mmol) 7-[(2,6-Difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyrazolo[l,5-a]pyridi n-3-carbonsäure aus Beispiel 4A wurden mit 40 mg (0.11 mmol) HATU und 88 μΐ (0.51 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin in 0.4 ml DMF vorgelegt und 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 21 mg (0.11 mmol) rac-2-Amino-2-[2-(difluormethyl)-2H-tetrazol-5-yl]propan-l-o l Beispiel 20A zur Reaktionslösung gegeben und 6 h bei 60 °C gerührt. Dann wurde mit Acetonitril und Wasser verdünnt, mit TFA versetzt und mittels präparativer HPLC gereinigt (RP18 Säule, Laufmittel: Acetonitril/Wasser-Gradient unter Zusatz von 0.1% TFA). Die Produktfraktionen wurden vereinigt und eingeengt. Anschließend wurde der Rückstand in Dichlormethan und wenig Methanol aufgenommen und zweimal mit gesättigter, wässriger Natri- umhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 40 mg der Zielverbindung (74% d. Th.; Reinheit 95%) erhalten.

IX -MS (Methode 2): R _t = 0.98 min

MS (ESpos): m/z = 508 (M+H) ⁺

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ = 1.83 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 3.79 - 3.88 (m, 2H), 5.32 (t, 1H), 5.46 (s, 2H), 6.57 (s, 1H), 7.21 - 7.30 (m, 211), 7.31 (s, 1H), 7.57 - 7.67 (m, 2H), 8.56 (t, 1H), [weiteres Signal un- ter Lösungsmittelsignal verborgen].

Beispiel 3

eK/-N-[2-Amino-2-methyl(4,4,4- ² H3)butyl]-7-[(2,6-difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyraz olo[l,5- a] pyridin- 3 - carboxamid (Enantiomer A)

111 mg (0.15 mmol, Reinheit 76%) e«i-Benzyl-{ l-[({7-[(2,6-difluorbenzyl)oxy]-2,5- dimethylpyrazolo[l,5-a]pyridin-3-yi}carbonyl)amino]-2-methyl (4,4,4- ² H3)butan-2-yl}carbamat (Enanti- omer A) aus Beispiel 17A wurden in 4 ml Ethanol gelöst und unter Argon mit 59 μΐ (0.76 mmol) TFA und 5 mg (0.005 mmol) 10%igem Palladium auf Aktivkohle versetzt und 3.5 Stunden bei Normaldruck hydriert. Die Reaktionslösung wurde mittels Milliporfilter filtriert, mit Ethanol gewaschen und das Filtrat einrotiert. Der Rückstand wurde mit Acetonitril, Wasser und TFA versetzt und mittels präparativer HPLC gereinigt (RP18 Säule, Laufmittel: AcetonitrilAVasser-Gradient unter Zusatz von 0.1% TFA). Die Produktfraktionen wurden vereinigt und eingeengt. Anschließend wurde der Rückstand in Dichlormethan und wenig Methanol aufgenommen und zweimal mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde nochmals mittels Dickschichtchromatographie gereinigt (Laufmittel: Dichlormethan/2N Ammoniak in Methanol = 15/1). Es wurden 32 mg der Zielverbindung (50% d. Th.) erhalten. LC-MS (Methode 2): R _t = 0.70 min

MS (ESpos): m/z = 420 (M+H) ⁺

TI-NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ): δ = 0.96 (s, 3H), 1.27 - 1.38 (m, 2H), 1.48 (br. s, 2H), 2.39 (s, 3H), 3.10 - 3.22 (m, 2H), 5.46 (s, 2H), 6.55 (s, 1H), 7.20 (t, 1H), 7.23 - 7.29 (m, 2H), 7.39 (s, 1H), 7.58 - 7.67 (m, 1H), [weiteres Signal unter Lösungsmittelsignal verborgen]. Beispiel 4

e«/-N-[2-Amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butyl]-7-[(2,6 -difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyrazolo[l,5- a] pyridin- 3 - carboxamid (Enantiomer A)

70 mg (0.09 mmol) e«/-Benzyl-{ l-[({7-[(2,6-difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyrazolo[l,5-a]p yridin^ yl}carbonyl)amino]-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butan-2-yl}car bamat Trifluoracetat (Enantiomer A) aus Beispiel 18A wurden in 2.5 ml Ethanol gelöst und unter Argon mit 36 μΐ (0.47 mmol) TFA und 3 mg (0.003 mmol) 10%igem Palladium auf Aktivkohle versetzt und 2 Stunden bei Normaldruck hydriert. Die Reaktionslösung wurde mittels Milliporfilter filtriert, mit Ethanol gewaschen und das Filtrat einrotiert. Der Rückstand wurde mittels Di ckschichtchromatographie gereinigt (Laufmittel: Dichlormethan/ 2N Ammoniak in Methanol = 20/1). Anschließend wurde der Rückstand in Dichlormethan und wenig Methanol aufgenommen und zweimal mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die wäss- rige Phase wurde zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Es wurden 30 mg der Zielverbindung (65% d. Th.) erhalten.

LC -MS (Methode 2): R _t = 0.87 min

MS (ESpos): m/z = 489 (M+H) ⁺

^S H-NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ): δ = -0.04 (s, 9H), 0.43 - 0.57 (m, 2H), 0.96 (s, 3H), 1.25 - 1.37 (m, 2H), 1.85 (br. s, 2H), 2.40 (s, 3H), 3.16 - 3.23 (m, 2H), 5.46 (s, 2H), 6.55 (s, 1H), 7.21 (t, 1H), 7.22 - 7.29 (m, 2H), 7.38 (s, 1H), 7.58 - 7.67 (m, 1H), [weiteres Signal unter Lösungsmittelsignal verborgen].

Beisgie!_5

e«^N-[2-Amino-2-methyl-4-(trimethylsilyl)butyl]-7-[(2,6- difluorbenzyl)oxy]-2,5-dimethylpyrazolo[l,5- a]pyridin-3-carboxamid (Enantiomer B)

134 mg (0.19 mmol; Reinheit 88%) e«i-Benzyl-{ l-[({7-[(2,6-difluorbenzyl)oxy]-2,5- dimethylpyrazolo[l,5-a]pyridin-3-yl}carbonyl)amino]-2-methyl -4-(ljimethylsilyl)butan-2-yl}carbamat (Enantiomer B) aus Beispiel 19A wurden in 5 ml Ethanol gelöst und unter Argon mit 73 μΐ (0.95 mmol) TFA und 6 mg (0.006 mmol) 10%igem Palladium auf Aktivkohle versetzt und 5 Stunden bei Normaldruck hydriert. Die Reaktionslösung wurde mittels Milliporfilter filtriert, mit Ethanol gewaschen und das Filtrat einrotiert. Der Rückstand wurde mit Acetonitril, Wasser und TFA versetzt und mittels präparativer HPLC gereinigt (RP18 Säule, Laufmittel: Acetonitril/Wasser-Gradient unter Zusatz von 0.1 % TFA). Die Produktfraktionen wurden vereinigt und eingeengt. Anschließend wurde der Rückstand in Dichlormethan und wenig Methanol aufgenommen und zweimal mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlö- sung gewaschen. Die wässrige Phase wurde zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Es wurden 58 mg der Zielverbindung (62% d. Th.) erhalten.

LC -MS (Methode 2): R, = 0.84 min

MS (ESpos): m/z = 489 (M+H) ⁺

ΐ-NMR (500 MHz, DMSO-de): δ = -0.04 (s, 9H), 0.43 - 0.57 (m, 2H), 0.96 (s, 3H), 1.25 - 1.37 (m, 2H), 1.42 (br. s, 2H), 2.40 (s, 3H), 3.15 - 3.24 (m, 2H), 5.45 (s, 2H), 6.55 (s, 1H), 7.20 (t, 1H), 7.22 - 7.29 (m, 2H), 7.38 (s, 1H), 7.59 - 7.67 (m, 1H), [weiteres Signal unter Lösungsmittelsignal verborgen]. B. Bewertung der pharmakologischen Wirksamkeit

Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

ATP Adenosintriphosphat

Brij35 Polyoxy ethyl en(23 ) laurylether

BSA Rinderserumalbumin

OTT Dithiothreitol

TEA Triethanolamin

Die pharmakologische Wirkung der erfindungsgemäß en Verbindungen kann in folgenden Assays ge- zeigt werden:

B-l. Vermessiing von sGC Enzymaktivität mittels PPi Nachweis

Lösliche Guanylylcyclase (sGC) setzt unter Stimulation GTP zu cGMP und Pyrophosphat (PPi) um. PPi wird mit Hilfe des in WO 2008/061626 beschriebenen Verfahrens nachgewiesen. Das im Test entstehende Signal nimmt mit fortschreitender Umsetzung zu und dient als Maß für die sGC-Enzymaktivität. Mit Hilfe einer PPi Referenzkurve kann das Enzym in bekannter Weise charakterisiert werden, z.B. hinsichtlich Umsatzrate, Stimulierbarkeit oder Michaelis Konstante.

Durchführung des Tests

Zur Durchführung des Tests wurden 29 μΕ Enzymlösung (0-10 nM lösliche Guanylylcyclase (hergestellt nach Hönicka et al., Journal of Molecular Medicine 77(1999)14-23), in 50 mM TEA, 2 mM Mag- nesiumchlorid, 0.1 % BSA (FraktionV), 0.005% Brij 35, pH 7.5) in die Mikroplatte vorgelegt und 1 iL der Stimulatorlösung (0-10 μΜ 3-Morpholinosydnonimine, SIN-1, Merck in DMSO) hinzugegeben. Es wurde 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden 20 μΐ Detektionsmix (1,2 nM Firefly Luciferase {Photinus pyralis Luziferase, Promega), 29 μΜ Dehydro-Luziferin (hergestellt nach Bitler & McElroy, Arch. Biochem. Biophys. 72 (1957) 358), 122 μΜ Luziferin (Promega), 153 uM ATP (Sigma) und 0,4 mM D IT ( Sigma) in 50 mM TEA, 2 mM Magnesiumchlorid, 0.1 % BSA (Fraktion V), 0.005% Brij 35, pH 7,5) zugegeben. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 20 μΐ Substratlösung (1.25 mM Gua- nosin-5 ' -triphosphat (Sigma) in 50 mM TEA, 2 mM Magnesiumchlorid, 0.1% BSA (Fraktion V), 0.005% Brij 35, pH 7.5) gestartet und kontinuierlich luminometrisch vermessen. B-2. Wirkung an rekombinanter Giianvlatcvclase-Keporterzclllinie

Die zelluläre Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird an einer rekombinanten Guanylat- cyclase-Reporterzelllinie, wie in F. Wunder et al., Anal. Biochem. 339, 104-112 (2005) beschrieben, bestimmt.

Repräsentative MEC-Werte (MEC = minimal effektive Konzentration) für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in der nachstehenden Tabelle wiedergegeben (zum Teil als Mittelwerte aus Einzelbestimmungen):

Tabelle A;

B-3. Gefäfirelaxierende Wirkung in vitro

Kaninchen werden durch Nacken schlag betäubt und entblutet. Die Aorta wird entnommen, von anhaftendem Gewebe befreit, in 1.5 mm breite Ringe geteilt und einzeln unter einer Vorspannung in 5 ml- Organbäder mit 37°C warmer, Carbogen-begaster Krebs-Henseleit-Lösung folgender Zusammensetzung gebracht (jeweils mM): Natriumchlorid: 119; Kaliumchlorid: 4.8; Calciumchlorid-Dihydrat: 1; Magnesiumsulfat-Heptahydrat: 1.4; Kaliumdihydrogenphosphat: 1.2; Natriumhydrogencarbonat: 25; Glucose: 10. Die Kontraktionskraft wird mit Statham UC2-Zellen erfasst, verstärkt und über A/D- Wandler (DAS- 1802 HC, Keithley Instruments München) digitalisiert sowie parallel auf Linienschreiber registriert. Zur Erzeugung einer Kontraktion wird Phenylephrin dem Bad kumulativ in ansteigender Konzentration zugesetzt. Nach mehreren Kontrollzyklen wird die zu untersuchende Substanz in jedem weiteren Durchgang in jeweils steigender Dosierung zugesetzt und die Höhe der Kontraktion mit der Höhe der im letzten Vordurchgang erreichten Kontraktion verglichen. Daraus wird die Konzentration errechnet, die erforderlich ist, um die Höhe des Kontrollwertes um 50% zu reduzieren (ICso-Wert). Das Standardapplikationsvolumen beträgt 5 μί, der DMSO-Anteil in der Badlösung entspricht 0.1%.

B-4. Blutdruckme sun an narkotisierten Ratten Männliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 300 - 350 g werden mit Thiopental (100 mg/kg i.p.) anästhesiert. Nach der Tracheotomie wird in die Femoralarterie ein Katheter zur Blutdruckmessung eingeführt. Die zu prüfenden Substanzen werden als Lösungen entweder oral mittels Schlundsonde oder über die Femoralvene intravenös verabreicht (Stasch et al. Br. .1. Pharmacol. 2002; 135: 344-355). B-5. Radiotelemetrische Blutdruckmessung an wachen, spontan hvpertensiven Ratten

Für die im Folgenden beschriebene Blutdruckmessung an wachen Ratten wird ein im Handel erhältliches Telemetriesystem der Firma DATA SCIENCES INTERNATIONAL DSI, USA eingesetzt.

Das System besteht aus 3 Hauptkomponenten: Implantierbare Sender (Physiotel® Telemetrietransmitter)

Empfänger (Physiotel® Receiver), die über einen Multiplexer (DSI Data Exchange Matrix ) mit einem

Datenakquisitionscomputer verbunden sind.

Die Telemetrieanlage ermöglicht eine kontinuierliche Erfassung von Blutdruck Herzfrequenz und Körperbewegung an wachen Tieren in ihrem gewohnten Lebensraum. Tiermaterial

Die Untersuchungen werden an ausgewachsenen weiblichen spontan hypertensiven Ratten ( SU R Okamoto) mit einem Körpergewicht von >200 g durchgeführt. SHR/NCrl von Okamoto Kyoto School of Medicine, 1963 wurden aus männlichen Wistar Kyoto Ratten mit stark erhöhtem Blutdruck und weiblichen mit leicht erhöhtem Blutdruck gekreuzt und in der F13 an die U.S. National Institutes of Health abgegeben.

Die Versuchstiere werden nach S enderimplantation einzeln in Makroion - Käfigen Typ 3 gehalten. Sie haben freien Zugang zu Standardfutter und Wasser.

Der Tag - Nacht - Rhythmus im Versuchslabor wird per Raumbeleuchtung um 6:00 Uhr morgens und um 19:00 Uhr abends gewechselt. S enderimpl ant ation

Die eingesetzten Telemetriesender TAI 1 PA - C40 werden den Versuchstieren mindestens 14 Tage vor dem ersten Versuchseinsatz unter aseptischen Bedingungen chirurgisch implantiert. Die so instrumentierten Tiere sind nach Abheilen der Wunde und Einwachsen des Implantats wiederholt einsetzbar.

Zur Implantation werden die nüchternen Tiere mit Pentobabital (Nembutal, Sanofi: 50mg/kg i.p. ) nar- kotisiert und an der Bauchseite weiträumig rasiert und desinfiziert. Nach Eröffnung des Bauchraumes entlang der Linea alba wird der flüssigkeitsgefüllte Meßkatheter des Systems oberhalb der Bifurcation nach cranial in die Aorta descendens eingesetzt und mit Gewebekleber (VetBonD TM, 3M) befestigt. Das Sendergehäuse wird intraperitoneal an der Bauchwandmuskulatur fixiert und die Wunde wird schichtweise verschlossen. Postoperativ wird zur Infektionsprophylaxe ein Antibiotikum verabreicht (Tardomyocel COMP Bayer lml/kg s.c.)

Substanzen und Lösungen

Wenn nicht anders beschrieben werden die zu untersuchenden Substanzen jeweils einer Gruppe von Tieren (n = 6) per Schlundsonde oral verabreicht. Entsprechend einem Applikationsvolumen von 5 ml/kg Körpergewicht werden die Testsubstanzen in geeigneten Lösungsmittelgemischen gelöst oder in 0.5% iger Tylose suspendiert.

Eine Lösungsmittel- behandelte Gruppe von Tieren wird als Kontrolle eingesetzt. Versuchsablauf Die vorhandene Telemetrie - Meßeinrichtung ist für 24 Tiere konfiguriert. Jeder Versuch wird unter einer Versuchsnummer registiert (VJahr Monat Tag).

Den in der Anlage lebenden instrumentierten Ratten ist jeweils eine eigene Empfangsantenne zugeordnet (1010 Receiver, DSI ).

Die implantierten Sender sind über einen eingebauten Magnetschalter von außen aktivierbar. Sie werden bei Versuchsvorlauf auf Sendung geschaltet. Die ausgestrahlten Signale können durch ein Datenakquisi- tionssystem (Dataquest TM A.R.T. for WINDOWS, DSI ) online erfasst und entsprechend aufgearbeitet werden. Die Ablage der Daten erfolgt j eweils in einem hierfür eröffneten Ordner der die Versuchsnummer trägt.

Im Standardablauf werden über j e 10 Sekunden Dauer gemessen Systolischer Blutdruck (SBP) Diastolischer Blutdruck (DBP) Arterieller Mitteldruck (MAP) Herzfrequenz (HR) Aktivität (ACT) Die Messwert erfassung wird rechnergesteuert in 5 Minuten Abständen wiederholt. Die als Absolutwert erhobenen Quell daten werden im Diagramm mit dem aktuell gemessenen B arometerdruck (Ambient Pressure Reference Monitor; APR-1 ) korrigiert und in Einzeldaten abgelegt. Weitere technische Details sind der umfangreichen Dokumentation der Herstellerfirma (DSI) zu entnehmen. Wenn nicht anders beschrieben erfolgt die Verabreichung der Prüfsubstanzen am Versuchstag um 9.00 Uhr. Im Anschluss an die Applikation werden die oben beschriebenen Parameter 24 Stunden gemessen.

Auswertung

Nach Versuchsende werden die erhobenen Einzeldaten mit der Analysis- Software (DATAQUEST TM A. R.T. TM ANALYSIS) sortiert. Als Leerwert werden hier 2 Stunden vor Applikation angenommen, so dass der selektierte Datensatz den Zeitraum von 7:00 Uhr am Versuchstag bis 9:00 Uhr am Folgetag umfasst.

Die Daten werden über eine voreinstellbare Zeit durch Mittelwertbestimmung geglättet (15 Minuten Average) und als Textdatei auf einen Datenträger übertragen. Die so vorsortierten und komprimierten Messwerte werden in Excel-Vorlagen übertragen und tabellarisch dargestellt. Die Ablage der erhobenen Daten erfolgt pro Versuchs tag in einem eigenen Ordner, der die Versuchsnummer trägt. Ergebnisse und Versuchsprotokolle werden in Papierform nach Nummern sortiert in Ordnern abgelegt.

Literatur:

Klaus Witte, Kai Hu, Johanna Swiatek, Claudia Müssig, Georg Ertl and Björn Lemmer: Experimental heart failure in rats: effects on cardiovascular circadian rhythms and on myocardial ß-adrenergic signal- ing. Cardiovasc Res 47 (2): 203-405, 2000; Kozo Okamoto: Spontaneous hypertension in rats. Int Rev Exp Pathol 7: 227- 270, 1969; Maarten van den Buuse: Circadian Rhythms of Blood Pressure, Heart Rate, and Locomotor Activity in Spontaneously Hypertensive Rats as Measured With Radio-Telemetry. Physiology & Behavior 55(4): 783-787, 1994.

B-6. Bestimmung pharmakokinetischer Kenngr lk'ii nach intravenöser und oraler Gabe

Die pharmakokinetischen Parameter der erfindungsgemäß en Verbindungen werden in männlichen CD- 1 -Mäusen, männlichen Wistar-Ratten und weiblichen Beagle-Hunden bestimmt. Die intravenöse Gabe erfolgt bei Mäusen und Ratten mittels einer speziesspezifischen Plasma/DMSO-Formulierung und bei Hunden mittels einer Wasser/PEG400/Ethanol-Formulierung. Die orale Gabe der gelösten Substanz mittels Schlundsonde wird in allen Spezies basierend auf einer Was ser/PEG400/Ethanol -Formulierung durchgeführt. Den Ratten wird zur vereinfachten Blutabnahme vor der Substanzgabe ein Silikonkatheter in die rechte Vena jugularis externa gelegt. Die Operation erfolgt mindestens einen Tag vor dem Versuch unter Isofluran-Narkose und unter Gabe eines Analgetikums (Atropin/'Rimadyl (3/1) 0.1 mL s.c). Die Blutabnahme (in der Regel mehr als 10 Zeitpunkte) erfolgt in einem Zeitfenster, welches terminale Zeitpunkte von mindestens 24 bis maximal 72 Stunden nach Substanzgabe beinhaltet. Das Blut wird bei der Entnahme in heparmisierte Röhrchen geleitet. So dann wird mittels Zentrifugation das Blutplasma gewonnen und gegebenenfalls bis zur weiteren Bearbeitung bei -20°C gelagert. Den Proben der erfindungsgemäßen Verbindungen, Kalibrierproben und Qualifier wird ein interner Standard zugesetzt (dies kann auch eine chemisch nicht verwandte Substanz sein) und es folgt eine Proteinfällung mittels Acetonitril im Übers chuss. Nach Zugabe einer Puffer-Lösung, die an die IX - Bedingungen angepasst ist, und folgendem Vortexen wird bei 1000 g zentrifugiert. Der Überstand wird mittels LC-MS/MS unter Verwendung von C18-reversed-phase-Säulen und variablen Eluenten- Gemischen vermessen. Die Quantifizierung der Substanzen erfolgt anhand der Peakhöhen oder -flächen aus extrahierten Ionenchromatogrammen spezifischer selected ion monitoring-Experimente .

Aus den ermittelten Plasmakonzentration-Zeit- Verläufen werden die pharmakokinetischen Kenngrößen wie AUC, Cmax, ti/2 (terminale Halbwertszeit), F (Bioverfügbarkeit), MRT (Mean Residence Time) und CL (Clearance) mittels eines validierten pharmakokinetischen Rechenprogramms berechnet.

Da die Substanzquantifizierung in Plasma durchgeführt wird, muss die Blut/Plasma-Verteilung der Substanz bestimmt werden, um die pharmakokinetischen Parameter entsprechend anpassen zu können. Dazu wird eine definierte Menge Substanz in heparinisiertem Vollblut der entsprechenden Spezies für 20 min im Taumelrollenmischer inkubiert. Nach Zentrifugation bei 1000g wird die Konzentration im Plasma gemessen (mittels LC-MS/MS; s.o.) und durch Quotientenbildung der CBiut/Cpiasma-Wert ermittelt.

B-7. Metabqlismus-Untersuchuiiß

Zur Bestimmung des Metabolismus-Profils der erfindungsgemäßen Verbindungen werden diese mit re- kombinanten humanen Cytochrom P450 (CYP) Enzymen, Lebermikrosomen oder mit primären frischen Hepatozyten verschiedener Tierspezies (z.B. Ratte, Hund) als auch humanen Ursprungs inkubiert, um Informationen über einen möglichst kompletten hepatischen Phase I- und Phase II-Metabolismus sowie über die am Metabolismus beteiligten Enzyme zu erhalten und zu vergleichen.

Die erfindungsgemäß en Verbindungen wurden mit einer Konzentration von etwa 0.1-10 μΜ inkubiert. Da/u wurden Stammlösungen der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer Konzentration von 0.01- 1 mM in Acetonitril hergestellt, und dann mit einer 1 : 100 Verdünnung in den Inkubationsansatz pipettiert. Die Lebermikrosomen und rekombinanten Enzyme wurden in 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.4 mit und ohne NADPH-generierendem System, bestehend aus 1 mM NA DP ^' , 10 mM Glucose-6- phosphat und 1 Unit Glucose-6-phosphat Dehydrogenase, bei 37°C inkubiert. Primäre Hepatozyten wurden in Suspension in Williams E Medium ebenfalls bei 37°C inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 0 - 4h wurden die Inkubationsansätze mit Acetonitril abgestoppt (Endkonzentration ca. 30%) und das Protein bei ca. 15000 x g abzentrifugiert. Die so abgestoppten Proben wurden entweder direkt analysiert oder bis zur Analyse bei -20°C gelagert. Die Analyse erfolgt mittels Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie mit Ultraviolett- und massen- spektrometrischer Detektion (HPLC-UV-MS/MS). Dazu werden die Überstände der Inkubationsproben mit geeigneten C 18-reversed-phase-Säulen und variablen Eluenten-Gemischen aus Acetonitril und 10 TII M wässriger Ammoniumformiat-Lösung oder 0.05 % Ameisensäure chromatographiert. Die UV- Chromatogramme in Verbindung mit massenspektrometrischen Daten dienen zur Identifizierung, Strukturaufklärung und quantitativen Abschätzung der Metabolite, und der quantitativen metabolischen Abnahme der erfindungsgemäßen Verbindung in den Inkubationsansätzen.

B-8. Caeo-2 Permeabilitäts-Test

Die Permeabilität einer Testsubstanz wurde mit Hilfe der Caco-2 Zelllinie, einem etablierten in vitro Modell für Permeabilitätsvorhersagen an der gastrointestinalen Barriere, bestimmt (Artursson, P. and Karlsson, J. (1991). Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys.175 (3), 880-885). Die Caco-2 Zellen (ACC No. 169, DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braun schweig, Deutschland) wurden in 24-Well Platen mit Einsatz ausgesät und 14 bis 16 Tage kulti- viert. Für die Permeabilitätsstudien wurde die Testsubstanz in DMSO gelöst und mit Transportpuffer (Hanks Buffered Salt Solution, Gibco/Invitrogen, mit 19.9 niM Glukose und 9.8 mM HEPES) auf die finale Testkonzentration verdünnt. Um die Permeabilität von apikal nach basolateral (P _app A-B) der Testsubstanz zu bestimmen, wurde die Lösung mit der Testsubstanz auf die apikale Seite des Caco-2 Zellmonolayers gegeben und Transportpuffer auf die basolaterale Seite. Um die Permeabilität von baso- lateral nach apikal (P _app B-A) der Testsubstanz zu bestimmen, wurde die Lösung mit der Testsubstanz auf die basolaterale Seite des Caco-2 Zellmonolayers gegeben und Transportpuffer auf die apikale Seite. Zu Beginn des Experiments wurden Proben aus dem jeweiligen Donor-Kompartiment genommen, um die Massenbilanz sicher zu stellen. Nach einer Inkubation von zwei Stunden bei 37° C wurden Proben aus beiden Kompartimenten genommen. Die Proben wurden mittels LC-MS/MS analysiert und die ap- parenten Permeabilitätskoeffizienten (P _apP ) berechnet. Die Permeabilität von Lucifer Yellow wurde für jeden Zellmonolayer bestimmt, um die Integrität der Zellschicht sicher zu stellen. Die Permeabilität von Atenolol (Marker für niedrige Permeabilität) und Sulfasalazin (Marker für aktive Exkretion) wurde in jedem Testlauf als Qualitätskontrolle mitbestimmt.

B-9. hERG Kaliumstrom Assay

Der sogenannte hERG (human ether-a-go-go related gene) Kaliumstrom trägt wesentlich zur Repolari- sierung des humanen kardialen Aktionspotentials bei (Scheel et al., 2011). Eine Inhibition dieses Stroms durch Pharmaka kann in seltenen Fällen potentiell letale Herzrhythmusstörungen zur Folge haben, und wird deshalb frühzeitig während der Arzneimittel entwi cklung untersucht.

Der hier verwendete funktionelle hERG Assay basiert auf einer recombinanten HEK293 Zell-Linie, die das KCNH2(HERG)-Gen stabil exprimiert (Zhou et al., 1998). Diese Zellen werden mittels der "whole-cell voltage-clamp" Technik (Hamill et al., 1981) in einem automatisierten System (Patchli- ner™; Nanion, München, D) untersucht, welches die Membranspannung kontrolliert und den hERG Kalium- Strom bei Zimmertemperatur misst. Die PatchControlHT™ Software (Nanion) steuert Patchli- ner System, Datenerfassung und Datenanalyse. Die Spannungskontrolle erfolgt durch 2 EPC-10 quadro Verstärker unter Kontrolle der PatchMasterPro™ Software (beide: HEKA Elektronik, Lambrecht, D). NPC-16 Chips mit mittlerem Widerstand (~2 ΜΩ; Nanion) dienen als planares Substrat für die Voltage-Clamp Experimente.

NPC-16 Chips werden mit intra- und extrazellulärer Lösung (vgl. Himmel, 2007) sowie mit Zellsuspension befüllt. Nach Bildung eines Giga-Ohm-Seals und Herstellen des Ganzzell-Modus (einschliess- lieh mehrerer automatisierter Qualitätskontrollschritte) wird die Zellmembran auf das Haltepotential - 80 mV geklemmt. Das nachfolgende Spannungsklemm- Protokoll ändert die Kommandospannung auf +20 mV (Dauer 1000 ms), -120 mV (Dauer 500 ms), und zurück zum Haltepotential -80 mV; dies wird alle 12 s wiederholt. Nach einer initialen Stabilisierungsphase (ca 5-6 Minuten) wird Testsubstanzlösung in aufsteigenden Konzentrationen (z.B. 0.1, 1, und 10 μιηοΙ/L) zupipettiert (Exposition ca 5-6 Minuten pro Konzentration), gefolgt von mehreren Auswaschschritten.

Die Amplitude des einwärtsgerichteten "Taü"-Stroms, der durch eine Potentialänderung von +20 mV auf -120 mV erzeugt wird, dient zur Quantifizierung des hERG Kaliumstroms, und wird als Funktion der Zeit dargestellt (IgorPro™ Software). Die Stromamplitude am Ende verschiedener Zeitabschnitte (z.B. Stabilisierungsphase vor Testsubstanz, erste/zweite/ dritte Konzentration Testsubstanz) dient zur Erstellung einer Konzentrations- Wirkungs-Kurve, aus der die halbmaximale Hemmkonzentration IC50 der Testsubstanz errechnet wird.

Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FI. Improved patch-clamp techniques for high- resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pfluegers Arch 1981 ; 391 :85-100.

Himmel HM. Suitability of commonly used excipients for electrophysiological in-vitro safety pharma- cology assessment of effects on hERG potassium current and on rabbit Purkinje fiber action Potential. J Pharmacol Toxicol Methods 2007; 56: 145-158.

Scheel O, Himmel I I. Rascher-Eggstein G, Knott T. Introduction of a modular automated voltage- clamp platform and its correlation with manual human ether-a-go-go related gene voltage- clamp data. Assay Drag Dev Technol 2011; 9:600-607.

Zhou ZF, Gong Q, Ye B, Fan Z, Makielski JC, Robertson GA, January CT. Properties of hERG Channels stably expressed in HEK293 cells studied at physiological temperature. Biophys J 1998; 74:230-241.