DOMAINE TECHNIQUE

La présente demande concerne le domaine général du greffage de protéines sur un substrat et, en particulier, le greffage de protéines selon un motif prédéfini sur un substrat par un moyen optique.

ARRIÈRE-PLAN

La demande internationale publiée sous le numéro WO 2016/050980 (appelée ci-après la « publication Studer »), concerne un procédé de greffage micro-structuré ou selon un motif, de protéines sur un substrat d’impression ou photochimique, dans lequel le substrat est recouvert d’une couche anti-salissures (en anglais « antifouling ») nanométrique (entre 1 nm et 20 nm), c’est-à-dire une couche antiadhésive pour les cellules vivantes. Ce type de couche antiadhésive est tout particulièrement une brosse de polymère ou d’un polymère et notamment une brosse d’un PEG (Polyéthylène glycol). Une couche antiadhésive pour les protéines est destinée à être mise en contact avec des solutions de protéines, solutions nécessairement aqueuses dans ce procédé connu, et est donc insoluble dans l’eau dans la mesure nécessaire à son utilisation. Une telle couche est aussi destinée à être illuminée par un rayonnement dans le spectre d’absorption de la benzophénone (entre 300 nm et 400 nm) et est donc résistante à ce rayonnement, dans la mesure nécessaire à son impression.

Le procédé de la publication Studer consiste essentiellement à mettre en contact ou déposer sur un substrat traité en surface avec une brosse de PEG, une goutte d’une solution aqueuse d’une benzophénone, puis à éclairer la couche nanométrique de la brosse, en présence de la goutte, avec un rayonnement de longueur d’onde comprise dans le spectre d’absorption de la benzophénone (entre 300 nm et 400 nm) selon un motif prédéfini. Après rinçage de la benzophénone en solution, le substrat obtenu est sélectivement adhésif pour les protéines dans les zones éclairées ; il permet alors l’impression ou le dépôt de protéines puis de cellules sur le substrat et leur multiplication seulement dans les zones du motif, i.e. selon une adhésion spécifique.

La benzophénone utilisée dans la publication Studer est nécessairement une benzophénone soluble dans un solvant qui est l’eau, de façon à pouvoir être mise sous forme de solution aqueuse.

Toutefois, dans le procédé de la publication Studer, la présence d’une goutte de solution aqueuse au moment de l’éclairement de la couche nécessite de compenser l’évaporation inévitable de la goutte pendant le temps d’éclairement pour stabiliser la concentration de la benzophénone dans la solution aqueuse, afin d’obtenir une reproductibilité de l’impression d’un motif de protéines sur le substrat. Le séchage de la goutte de solution aqueuse de benzophénone constitue donc un problème dans ce procédé connu. Une solution pourrait consister à prévoir une alimentation en eau de la goutte, par des moyens micro-fluidiques, pour compenser la perte de liquide occasionnée par le séchage ou l’évaporation de la goutte, de façon à maintenir son volume constant. Une telle solution complique cependant le dispositif expérimental. Ainsi, dans le procédé de la publication Studer, maintenir une concentration de benzophénone constante dans la goutte apparaît donc comme souhaitable mais difficile.

PRÉSENTATION GÉNÉRALE

Dans ce contexte, l’invention concerne un produit pour l’impression de protéines, comprenant un substrat, une première couche de polymère, nanométrique, antiadhésive pour les protéines, déposée sur le substrat, et une deuxième couche solide de benzophénone, déposée sur la première couche. La deuxième couche solide est soluble dans un solvant, et la première couche est insoluble dans le solvant.

Le mot « soluble » sera entendu, dans le présent exposé, comme la propriété pour un matériau solide de pouvoir être dissout dans un solvant donné.

Le mot « solvant » sera entendu, dans le présent exposé, comme désignant un liquide apte à dissoudre un solide ou à disperser ses molécules ou atomes. Le mot « couche » sera entendu, dans le présent exposé, comme un film de matière qui est solide, notamment pâteux ou gélifié, à l’exclusion d’un film de matière liquide. L’épaisseur d’une couche peut être soit constante pour un film à faces planes et parallèles, soit variable pour un film ondulé ou bombé (notamment, en dôme).

Le mot « déposé(e) », sera entendu, dans le présent exposé, comme « en contact mécanique ». Pour une couche d’un matériau disposée sur un substrat solide, ce mot désignera une forme de contact mécanique sans déplacement relatif des atomes du matériau par rapport au substrat ou sans écoulement et signifiera « accrochée », alors que pour une solution d’un matériau dans un liquide, disposée sur un substrat solide, ce mot désignera un contact mécanique avec écoulement ou déplacement relatif possible des atomes du matériau et du liquide, par rapport au substrat.

Le mot couche « mince » ou « nanométrique » sera entendu, dans le présent exposé, comme une couche d’épaisseur comprise entre 1 nm et 2000 nm, sans exclure des couches plus minces qu’un nanomètre et antiadhésives pour les protéines.

Dans des variantes du produit, les dispositions suivantes sont adoptées, de manière indépendante ou combinées entre elles :

- la deuxième couche est soluble dans un solvant polaire;

- la première couche est une brosse d’un polymère;

- le substrat est un verre;

- la deuxième couche est soluble dans l’eau, dans l’éthanol ou dans l’isopropanol;

- le polymère est un polyéthylène glycol (PEG).

L’invention concerne aussi un procédé comprenant les étapes suivantes:

- fournir un substrat,

- déposer sur le substrat une première couche de polymère, nanométrique, antiadhésive pour des protéines ; - déposer sur la première couche une deuxième couche d’une benzophénone, la deuxième couche étant soluble dans un solvant et la première couche étant insoluble dans ce solvant.

Ce procédé permet d'obtenir, ou fabriquer, un produit pour l’impression de protéines telle que précédemment décrit.

Dans une variante du procédé la deuxième couche est déposée sur la première couche selon les étapes suivantes:

- déposer, sur la première couche, la benzophénone en solution dans le solvant; et

- faire s’évaporer le solvant.

Dans une autre variante du procédé, la deuxième couche est déposée, sur la première couche, par un dépôt physique de la benzophénone, en phase vapeur (PVD).

Pour la photo-impression, sur la première couche, d’un motif adhésif pour des protéines, le procédé comprend les étapes supplémentaires suivantes :

- illuminer la première couche, dans un spectre d’absorption de la benzophénone, selon le motif;

- dissoudre la deuxième couche dans le solvant;

- rincer le solvant.

Pour l’impression des protéines, selon le motif, sur la première couche, le procédé comprend les étapes supplémentaires suivantes:

- déposer, sur la première couche, une solution aqueuse des protéines;

- rincer la solution aqueuse des protéines.

Les caractéristiques et avantages précités, ainsi que d'autres, apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit, d'exemples de réalisation de l'invention. Cette description détaillée fait référence aux dessins annexés. Il est toutefois rappelé que l'invention ne se limite pas à ces exemples.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

Les dessins annexés sont schématiques et ne sont pas nécessairement à l'échelle, ils visent avant tout à illustrer les principes de l'invention.

La figure 1 représente un exemple de produit pour l’impression de protéines.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE D’EXEMPLE(S) Le produit pour l’impression de protéines de la figure 1 comprend:

- un substrat en verre 1 ,

- une première couche de polymère 3, nanométrique antiadhésive pour les protéines, accrochée ou déposée sur une des faces du substrat 1 , et

- une deuxième couche, ou dépôt solide, de benzophénone 2 déposée sur la couche de polymère antiadhésive 3 et soluble dans un solvant.

La première couche antiadhésive 3 est en contact mécanique avec le substrat 1 et la couche de benzophénone 2, et la première couche antiadhésive 3 est disposée entre la deuxième couche 2 et le substrat en verre 1. Le substrat 1 peut être plan, comme représenté.

Dans un premier mode de réalisation, le substrat 1 est, de façon connue de l’art antérieur, recouvert de la première couche de polymère 3 antiadhésive pour les cellules vivantes, ou couche antiadhésive, ou encore couche anti- salissures («antifouling » en anglais) au sens de la publication Studer mentionnée ci-dessus. Cette première couche est dans ce premier mode de réalisation, une brosse de polymère et le polymère est un PEG (polyéthylène Glycol). Cette première couche 3 est déposée sur le substrat 1 par des moyens connus de l’art antérieur.

Dans un premier mode d’obtention du produit, on réalise une solution liquide d’une benzophénone soluble dans de l’eau, à partir d’une poudre cristallisée de la benzophénone soluble, non-transparente dans le visible sous cette forme poudreuse, et d’eau dés-ionisée. La benzophénone soluble est, par exemple, de formule chimique : (4-benzoylbenzyl)trimethylammonium chloride.

On dépose ensuite une goutte ou plusieurs gouttes de la solution, sur la première couche 3 jusqu’à étaler la solution, liquide, sur le substrat, i.e. sur le substrat recouvert de la première couche, pour obtenir à sa surface, un film de solution, à faces parallèles ou ondulé ou bombé.

On fait ensuite s’évaporer l’eau de la solution. Pour cela, on peut étuver le système obtenu, par exemple à 70°C ou le laisser sécher naturellement à température ambiante, pour assécher la solution par évaporation. La même méthode s’appliquerait pour un solvant qui ne serait pas de l’eau pourvu que le solvant utilisé soit compatible avec la première couche 3. On obtient ainsi, après séchage, une deuxième couche 2 plus ou moins dure de benzophénone transparente, i.e. non cristallisée.

Il est à noter que l’homme du métier s’attendrait à réobtenir la poudre de benzophénone cristallisée et donc non transparente, séparée de la première couche 3 et du substrat. Cependant, pour ce type de benzophénone, de façon surprenante, la benzophénone reste sous forme solide dans une couche homogène adhérente au substrat et transparente optiquement, non cristallisée, vraisemblablement sous forme de solide amorphe. La consistance de cette deuxième couche et son épaisseur permettent notamment de la rayer de façon durable.

D’une façon générale, toute benzophénone présentant, une fois déposée en couche, une transparence dans le visible ou une non-cristallisation, est conforme à l’enseignement du présent exposé et peut donc être utilisée dans le cadre de l'invention. La couche peut être obtenue par évaporation d’une solution de la benzophénone dans un solvant, ou par toute autre méthode de dépôt d’une couche de cette benzophénone sur la première couche 3.

De façon avantageuse, la non-cristallisation de la couche de benzophénone obtenue, permet la photo-impression de motifs par illumination de la première couche 3, sans dégradation de la couche 3 due aux cristaux. La photo-impression est réalisée avec un rayonnement dans le spectre d’absorption de la benzophénone, à travers la deuxième couche 2 ou à travers le substrat 1 , choisi suffisamment transparent au rayonnement d’illumination.

Après illumination, un éclairage, par exemple dans le visible, en incidence rasante, de cette deuxième couche 2, révèle commodément, à la surface externe de la deuxième couche 2, les motifs qui ont été imagés sur la première couche 3, disposée à la surface interne de la deuxième couche 2, sans avoir besoin d’accéder à la première couche 3.

La photo-impression de motifs est ainsi durable et reconnaissable à l’œil nu, à la surface de la deuxième couche 2, ce qui permet de distinguer aisément une couche photo-imprimée d’une couche non photo-imprimée. De façon connue, le rayonnement utilisé pour illuminer les motifs sera d’une longueur d’onde ou d’un spectre situé dans la bande d’absorption de la benzophénone, qui se situe entre 300 nm et 400 nm.

La couche peut être rayée pour mesurer son épaisseur et des couches supérieures à 100 microns peuvent être obtenues aisément. Il est aussi possible de contrôler la quantité initiale de solution de benzophénone pour obtenir une épaisseur de couche contrôlée. L’homme du métier pourra déterminer dans chaque cas la couche la plus fine qu’il est possible d’atteindre par de simples opérations d’exécution.

Il est à noter que réduire l’épaisseur de la couche permet d’éviter ou de minimiser des interférences du rayonnement entre les faces des couches, et des erreurs d’impression des motifs. Il est aussi possible d’utiliser des mélanges de solvants pour homogénéiser l’étalement de la couche, ces solvants étant ensuite évacués.

Le produit, une fois la couche de benzophénone obtenue, peut être stocké et transporté aisément sans précaution particulière. Il peut être insolé sur un système optique sans moyen de micro-fluidique ou de fluidique, pour s’opposer au séchage ou à l’évaporation d’une goutte de solution aqueuse de benzophénone, qui seraient nécessaires dans le procédé de la publication Studer, pour obtenir une concentration constante de benzophénone au- dessus de la première couche pendant l’illumination, afin d’obtenir aussi une adhésion ultérieure contrôlée pour les protéines, dans les zones illuminées. Cet avantage est obtenu grâce à la deuxième couche 2 de benzophénone, qui est solide (e.g. pâteuse ou gélifiée) et dans laquelle la concentration de benzophénone est plus stable, à l’échelle de temps de l’illumination, que dans une goutte de solution liquide de benzophénone.

On remarquera que l’homme du métier n’utiliserait pas dans l’art antérieur et la publication Studer susmentionnée, un solvant plus volatil que l’eau, afin de ne pas accentuer le problème de séchage de la goutte de solution aqueuse de benzophénone pendant l’illumination. Le produit peut aussi être transporté après photo-impression pour être rincé en salle blanche en dissolvant la deuxième couche dans un solvant approprié.

Ce solvant peut être une eau dés-ionisée mais il a été trouvé que l’éthanol ou l’isopropanol qui sont des solvants polaires sont bien adaptés à l’invention. Une benzophénone soluble dans un solvant polaire sera donc particulièrement adaptée à l’invention.

Après rinçage, on pourra mettre en contact la première couche antiadhésive, rendue adhésive pour les protéines, selon les motifs, grâce à l’illumination, avec une solution de protéines pour obtenir un motif de protéines imprimées sur la première couche, selon les motifs illuminés.

Une benzophénone non soluble dans l’eau pourra également être utilisée si l’on trouve un solvant dans lequel on n’observe pas de cristallisation en séchant la couche. La benzoin ethyl ether pourra ainsi être utilisée en utilisant l’acétone comme solvant.

Dans un deuxième mode de réalisation, la deuxième couche est déposée de façon mieux contrôlée en épaisseur, dans un bâti de PVD (dépôt physique en phase vapeur) ou par toute technique (PVD, CVD, ...) permettant de déposer une couche de benzophénone transparente (non-cristallisée) sur un substrat, sans détruire la couche antiadhésive.

Le dépôt physique en phase vapeur pourra permettre de réaliser des couches minces de benzophénone, d’épaisseur très régulière et induisant donc moins d’interférences lors de la photo-impression. Ce mode de dépôt est donc particulièrement intéressant.

Ce mode est préféré pour des couches minces d’épaisseur inférieure à 1000 nm ou submicronique, qui peuvent être difficiles à obtenir par séchage, au moins sans cristallisation, pour une benzophénone particulière.

Une benzophénone adaptée à ce type de dépôt submicronique en phase vapeur, sera, par exemple, une benzophénone soluble de type sulisobenzone ou benzophénone 4 ou encore une benzophénone de type (4- benzoylbenzyl)trimethylammonium chloride. Pour une benzophénone inconnue à déposer en couche mince d’une épaisseur donnée, lorsque l’observation de la couche séchée sera possible optiquement, un homme du métier pourra observer si elle est non-cristallisée et tout spécialement si elle est homogène et transparente, afin de déterminer si la benzophénone inconnue est bien adaptée à l’invention. En cas de cristallisation l’homme du métier pourra réaliser le dépôt en phase vapeur. L’enseignement de la demande s’étend donc aux benzophénones qui ne cristallisent pas en couches minces lors d’un dépôt d’épaisseur donnée. Ce critère pourra être utilisé pour choisir un procédé de dépôt adapté à une benzophénone inconnue ou pour obtenir une épaisseur nouvelle pour une benzophénone connue. L’homme du métier pourra ainsi d’abord utiliser le séchage d’une goutte de solution de benzophénone, puis le dépôt par des techniques de couches minces en phase vapeur pour déterminer quelle gamme d’épaisseur de couche de benzophénone est accessible selon l’invention pour une benzophénone donnée.

Cette combinaison de dépôt de couches minces en phase liquide ou en phase vapeur permet de réaliser potentiellement une gamme importante d’épaisseurs de couches de benzophénone, pour une benzophénone arbitraire compatible avec la photo-impression de protéines sur une couche antiadhésive d’épaisseur nanométrique déposée sur un substrat.

Tout mode de dépôt de couches minces connu de l’art antérieur et compatible avec le dépôt d’une couche de benzophénone soluble, la plus régulière et d’épaisseur contrôlée devant la longueur d’onde d’illumination pourra être utilisé pour réaliser le produit de l’invention.

Le solvant utilisé pour le rinçage, i.e. la dissolution, de la deuxième couche pourra être quelconque pourvu qu’il soit compatible avec le substrat et la couche antiadhésive, notamment la couche antiadhésive sera insoluble dans ce solvant ainsi que le substrat. Pour sa biocompatibilité avec les cellules vivantes, l’eau sera le solvant préféré pour l’opération de rinçage, les couches antiadhésives pour les protéines et le verre généralement utilisé comme substrat étant résistants à l’eau. Il est à noter que l’opération de dépôt d’une couche solide, notamment sous forme de gel, augmente la concentration de la benzophénone par rapport à un liquide et que le temps de photo-impression, toutes choses égales par ailleurs en est raccourci. Ainsi pour un temps d’impression d’un motif de 40 secondes avec une goutte de solution aqueuse en contact avec la première couche, on obtient aisément un temps d’impression de 0,5 seconde avec une deuxième couche obtenue par évaporation de la goutte selon la présente demande.

Par ailleurs, sachant que l’oxygène ou dioxygène intervient dans le mécanisme permettant de rendre les zones éclairées adhésives pour les protéines, le dépôt d’une couche de benzophénone permet d’avoir un meilleur renouvellement en dioxygène au niveau de la première couche 3, qu’avec une goutte de solution aqueuse, plus épaisse et donc moins perméable à l’oxygène que la deuxième couche 2, et d’améliorer l’homogénéité et la reproductibilité instantanée de la photo-impression.

Il est à noter aussi que la couche déposée de benzophénone déposée selon l'invention par séchage ou CVD ou PVD, est de concentration stable, ce qui améliore la reproductibilité à long terme de l’impression de protéines sur la couche antiadhésive du substrat.

L’invention s’étend à tout dépôt solide transparent ou non-cristallisé, de benzophénone, déposé sur une couche antiadhésive pour les protéines. En effet, dans un troisième mode de réalisation, la couche de benzophénone peut être déposée sous forme d’amas transparent, sans chercher à la rendre tout de suite d’épaisseur sensiblement uniforme, par exemple en déposant une goutte de solution de benzophénone avec une pipette, pour obtenir un film d’épaisseur typique de 100 microns et de forme variable, sensiblement circulaire, notamment bombée ou en dôme et en faisant sécher la goutte sans étalement, en conservant ainsi la transparence ou non-cristallisation. Pour utiliser le dépôt ci-dessus, on déposera une goutte de solvant sur le dépôt solide ou amas ci-dessus pour le dissoudre et on ré-étalera la solution reformée sur la première couche 3. Après évaporation du solvant, une couche non-cristallisée, transparente, réapparaît. En cas de vieillissement, au fil du temps, d’une couche de benzophénone, initialement étalée, déposée selon ce troisième mode, on remarque qu’il est possible ultérieurement de déposer une goutte de solvant sur l’amas ou la couche, pour reconstituer une solution et la sécher sous forme de couche mince d’épaisseur uniforme de l’ordre par exemple de quelques microns. On peut ainsi compenser ou réparer avec cette méthode, un défaut d’étalement du gel de benzophénone en couche mince déformant sa surface sur la première couche 3 antiadhésive pour les protéines.

D’une façon générale, cette méthode de compensation ou de réparation par addition d’une goutte de solvant s’applique à tous les modes de l’invention, i.e. à toute couche de benzophénone déposée.

Finalement, l’enseignement de la présente demande apparaît ainsi s’étendre à toute couche de benzophénone non-cristallisée, transparente ou non, déposée à la surface d’une couche antiadhésive pour les protéines, la couche de benzophénone étant soluble dans un solvant dans lequel la couche antiadhésive est insoluble.

L’invention est susceptible d’application industrielle ou utile dans le domaine de l’impression de protéine sur un substrat.