La présente invention concerne un substrat dont la surface est anti- thrombogénique en raison de la présence, lié à celle-ci, d'un film adhérent de copolymère polyoléfinique comportant, fixés de manière covalente et distribués suivant un ordre aléatoire sur la chaîne principale, des groupes latéraux carboxyliques et des groupes de formule

-CONH-(CH ₂ ) _n -NH-Œ ₂ R

où R est l'héparine ou un fragment antithro bogéniquement actif dérivé de l'héparine par dépolymérisation de celle-ci, et n est un nombre entier compris entre 2 et 12.

Le présent copolymère peut également contenir, comme groupes latéraux, des groupes -C0NH-(Œ ₂ )- _n -C00H où n vaut de 1 à 12.

Le film copolymère de l'invention présente donc des propriétés anti¬ coagulantes vis-à-vis du sang et convient particulièrement pour revêtir des substrats de natures diverses, notamment les plastiques utilisés dans les dispositifs de transfusion sanguines.

Les groupes -COOH libres du présent copolymère sont en quantité suffi¬ sante stoechio étriquement, et même en excès, pour neutraliser, si besoin est, la basicité résultant de la présence dans le présent copolymère de fonctions aminés et ainsi améliorer l'hémocompatibilite de la surface revêtue du film antithrombogénique (voir, par exemple J.S. BYCK et al.. Soc. Plast. Eng. Techn. Pap. 21, 563-566(1975). r-ar ailleurs, de par le "procédé de fabrication décrit ci-après, le prése.it film est pratiquement dépourvu de groupes amino primaires libres, ce qui lui confère un avantage supplémentaire sur les polymères anticoagulants de l'état de la technique. En effet, le procédé de base utilisé pour fabriquer ceux-ci consiste à fixer, sur un polymère comprenant des groupes amino libres, un fragment de dépolymérisation de l'héparine comportant une fonction réactive vis-à-vis de ces groupes amino libres, notamment des groupes aldéhydiques, par une réaction de SCHIFF suivie d'une réduction de la liaison -N≈C ainsi obtenue. Or, comme la formation des bases de SCHIFF n'est pas quantitative, le polymère à propriétés antithrombogénique résultant du procédé ci-dessus contient des fonctions -NH-, libres qui exercent une activité perturbatrice sur l'activité antithro bine de l'héparine liée.

On trouvera, dans les références suivantes, des détails sur les films

dont la surface présente des propriétés anti-coagulantes connus de par l'état de la technique: EP-A-86 187 EP-A-86 186 M. FUNAHASHI et al, Analy- tical Bioche istry 126, 414-421 (1982); P. OLSSON et al, Annals of the New-York. Academy of Sciences 1984, pp. 525-535; EP-A-98 814; EP-A-92 928. On notera tout particulièrement les documents suivants issus de la recher¬ che effectuée par l'Office des Brevets de Vienne.

Le document US-A-3,673,612 (MIT) divulgue des compositions de poly¬ mères contenant de l'héparine. Dans ces compositions, l'héparine est liée au squelette du polymère par les liaisons acétal ^' ou hémiacétal.

Le document US-A-4.239.664 (RESEARCH CORP) divulgue un polymère de polyvinyl-pyrrolidone et d'héparine dans lequel la liaison entre la liaison entre les chaînons du polymère et l'héparine est un groupe imino. Ce poly¬ mère présente des propriétés antithrombogéniques et est utilisable pour la fabrication de prothèses et dispositifs médicaux en contact avec le sang de patients.

Le document EP-A-46.828 (TEIJIN) divulgue 1'esthérification de l'hépa¬ rine par des dérivés acryliques ou méthacryliques et le greffage de l'hépa¬ rine ainsi estérifiée sur des surfaces polymériques, ces surfaces étant celles d'appareils biomédicaux, tels que cathéters, conduits de transfu¬ sion, membranes de dialyse, composants de pompes, etc. Le greffage est effectué sous irradiation par ultra-violet, des faisceaux électroniques ou des rayons Y - Ce document divulgue encore l'héparinisation de matières plastiques dont la charpente comporta des groupes halogénures d'acide ou anhydride d'acide, la rέatition d'héparinisation comprenant également une estérification.

Le document JP-82-39.851 (TERUMO) divulgue la quaternisation du poly- méthacrylate de N^N-dimét ylaminoéthyle et la fixation, sur ce polymère, d'héparine.

Le document JP-82-18.705 (GIJUÏSUIN) divulgue la préparation d'un matériau anti-coagulant par réaction de l'acrylonitrile avec le méthacry- late de glycidyle puis fixation, -sur le polymère ainsi obtenu, d'héparine. Un tel polymère, quoique se rapprochant en principe de celui de l'inven¬ tion, comporte cependant une ossature bien différente et ne présente pas de groupe carboxylique libre.

De plus, dans le cas où le présent copolymère contient, en addition, des groupes-C0NH(CH ₂ ) -CO0H, ces derniers contribuent, par leur adsorption de l'albumine du plasma, à réduire l'adsorption du fibrinogène, ce qui diminue encore la tendance que le sang pourrait avoir de coaguler au con-

tact d'une paroi revêtue d'un tel copolymère. Le film anticoagulant recou¬ vrant le substrat de l'invention présente donc des avantages significatifs sur les produits connus correspondants. Parmi les divers articles auxquels conviennent le substrat de l'invention, on cite les cathéters, les tuyaux souples de nylon, de polyéthylène, de polyesters ou de polyuréthanne utili¬ sés en chirurgie, les récipients pour conserver le sang, les pompes et organes de pompes et tous autres éléments pouvant être introduits dans le système circulatoire d'un patient et mis en contact avec le sang à l'exté¬ rieur ou à l'intérieur du corps de celui-ci.

Parmi les diverses compositions possibles pour le copolymère constitu ant le film adhésif utilisé dans l'invention, on peut citer les photo- copoly ères à- base d'acide acrylique, de méthacrylate de di éthylaminoé- thyle (DMAEMA), de di éthylacrylamide et d'un co-monomère susceptible de fixer un fragment d'héparine, notamment l'acrylate de N-hydroxysuccinimide (ANHS). De tels copolymères ont l'avantage d'adhérer fortement à la plupart des surfaces plastiques habituelles et d'être obtenues très facilement et rapidement par irradiation, en présence d'un photoinitiateur, d'un film de composit.ion approprié contenant les monomères correspondants. En plus des monomères précités, la présente composition peut également contenir d'au¬ tres monomères acryliques, notamment les acrylates d'alcoyles tels qu'iso- propyle, butyle, amyle et autres, l'acryla ide, et des prépolymères acryli¬ ques tels que ceux cités dans le document US-A-4,451,568, de tels produits, de poids ωol ⁶ ^ul-aire relativement élevé, ayant une influence sur la visco¬ sité lu mélange de monomères. La quantité d'acide acrylique de la composi- tic. ci-dessus est stoechiométriqueraent supérieure à celle du EMAEMA afin que lf 6 yxvupes -CXH soient toujours en excédent par rapport aux groupes di ^chylamino. Ainsi, pour une mole de DMAEMA, on utilise de 1,01 à 2 moles d'acide acrylique.

Le radical R dénommé fragment d'héparine est dérivé des produits de dépolymérisation de l'héparine, par exemple par scission désaminative de l'héparine, tels que décrits par 0LSS0N (voir la référence susmentionnée).

Pour préparer le substrat suivant l'invention, on revêt par les moyens habituels (pincesu, trempé, pulvérisation) un article sélectionné d'une couche mince d'un mélange de monomères photopoly érisable tels qu'évoqués plus haut et contenant un photoinitiateur, on procède à sa photopolymérisa¬ tion par irradiation suivant les moyens habituels; puis, lorsque le film a acquis le degré de durcissement voulu, on le lie avec le dérivé d'héparine par l'intermédiaire d'une dia ine de pontage de formule H ₂ N(CH-) - H ₂ ~ de

manière à réaliser un chaînon de pontage (désigné dans ce qui précède par la formule -NH ⁽ CH_- ¹ _rι " ^N ^~ ⁾ _> ^ce chaînon permettant d'assurer la liaison entre le copolymère et le fragment d'héparine.

De préférence, on réalise ce chaînon par réaction de cette diamine aliphatique avec le groupement -CH0 lié au fragment d'héparine tel qu'il résulte de la fragmentation décrite par 0LSS0N (voir la référence préci¬ tée). En effet, suivant cet auteur, la réaction de l'héparine avec l'acide nitreux convertit le résidu 2-amino-2-desoxy-D-glucopyrannosyle en un rési¬ du aldéhydique de 2,5-anhydro-D-mannose possédant, tout comme l'héparine de départ, des propriétés anticoagulantes. La réaction de couplage ci-dessus fournit donc une base de SCHIFF qu'on réduit ensuite (par exemple par le cyanoborohydrure de sodium), de manière à obtenir un substituant R-CH^- NH ⁽ CH_) -NH * ^< - ^ln ******•••• ^a l° ^rs réagir ce dernier avec le film de polymère sec contenant, comme on l'a vu plus haut, copolymérisé avec les autres monomè¬ res, un groupement susceptible de se lier à la fonction aminé libre du bras de pontage ménagé sur le fragment d'héparine. Ce groupement, notamment le reste N-hydroxysuccinimide (NHS), très labile, réagit ^" tomme suit:

i

Cette opération a donc pour effet de fixer le fragment d'héparine R sur le film de copolymère par l'intermédiaire du chaînon de pontage précité. Pour celui-ci, on utilise volontier comme diamine l'hexaméthylène diamine, mais, bien entendu, toute autre diamine comprise entre les limites indiquées peut convenir, notamment l'éthylène diamine, la propylène diamine, la butylène diamine, etc..

Lorsque la fixation du groupe héparine est achevée, on neutralise les fonctions NHS restantes avec un réactif approprié, par exemple de l'éthano- lamine, de la glycine ou d'autres acides aminoalcoyl carboxyliques, ce qui présente l'avantage, dans ce cas, de fournir des chaînes latérales pourvues de groupes carboxyliques. On peut également, pour réaliser le présent film antithrombogénique, procéder en sens inverse, c'est-à-dire commencer par fixer la diamine sur le copolymère et, ensuite, faire réagir sur le copoly¬ mère aminé le fragment d'héparine par son groupe aldhéhydique, réaction qu'on fait suivre d'une réduction par le cyanoborohydrure de sodium. Dans

un tel cas, la présence éventuelle de groupements -NH~ libres (n'ayant pas réagi avec l'aldéhyde) n'exerce qu'un effet négatif peu prononcé en raison de la présence des groupes: -C00H en excédent.

Comme photoinitiateurs de polymérisation, on peut utiliser la benzo- phénone, ses dérivés et autres photoinitiateurs usuels, tels que ceux décrits dans le document EP-A-69133.

Les Exemples qui suivent illustrent l'invention.

Exemple 1 a) Préparation d'un substrat revêtu d'un film aux propriétés antithrombogénigues.

On a sélectionné des plaquettes de PVC munies d'une alvéole ou puits de titration (Microtiter plate FALCON) et on les a revêtues d'un film de mélange de monomères contenant les ingrédients suivants:

Diméthylacryla ide 45 g

Acide acrylique 15 g

DMAEMA 25 g

ANHS 10 g

P-36 5 g

TOTAL 100 g

Le produit dénommé "P-36" est un photoinitiateur de structure bengω- phénonique fourni par la Société U.C.B. (Belgique).

On a irradié ces plaquettes 5 min sous azote au moyen d'une lampe UV produisant un flux de 30 W/cm à 30 cm de distance ce qui a fourni, sur ? >s parois des puits, un film réactif d'environ 10-50 um d'épaisseur.

Par ailleurs, on a procédé à la désa ination d'un échantillon d'hépa¬ rine suivant J.E. SHIVELY et al, Bioche istry 15 (18), 3392 (1976): on a ajouté â une solution de 0,1 g d'héparine dans 4,5 ml de solution aqueuse d'acide citrique (0,2 M, pH 4) 0,5 ml d'une solution aqueuse 1 M de nitrite de sodium. Après 30 min à température ambiante, on a ajusté le pH à 7 (solution NaCH 0,1 N) et on a procédé à une dialyse dans de l'eau distillée (membrane SPECTRAPOR, porosité: jusqu'à poids moléculaire 1000).

On a ajouté à la solution dialysée de fragments d'héparine aldé¬ hydiques (Hep-CHO) une quantité suffisante d'hexa éthylène diamine (HMD) (solution aqueuse 3 M) pour réaliser une solution finale 0,8 M. Après 3 h

d'incubation à température ambiante, on a procédé à la réduction de l'imine par adjonction de 1 ml de solution aqueuse 1 M de NaCNBH, et après 2 h, on a procédé à une nouvelle dialyse dans l'eau pure, à 4°C avec une membrane identique à celle mentionnée ci-dessus. Finalement, on a porté le volume du produit dialyse (HMD-Hep) à 3,5 ml par mise en contact avec de l'Aquacide (carboxyméthylcellulose sodique). On a ensuite dilué cette solution à 28 mg/ l au moyen d'un tampon phosphate 0,04 M, pH8.

On a introduit dans les puits recouverts d'un revêtement réactif comme décrit plus haut, 200 ul de la solution HMD-Hep et on a laissé 2 jours en incubation. On a rincé par de l'eau distillée, après quoi on a introduit 200 ul d'une solution aqueuse 1 M de glycine afin de neutraliser l'exédent non transformé des groupes hydroxysuccinimide en groupes -C00H. On a en¬ suite procédé à un rinçage sous agitation avec de l'eau d'abord, puis du PBS (Phosphate Buffered Saline: 0,15 M NaCl, 10 mM a ₂ HP0 ₄ , pH 7.4). Les cuvettes ainsi préparées ont été étiquetées "Test 1"

b) Mesure de la capacité de blocage de la thrombine.

La mesure de l'activité antithro bine de l'héparine est basée sur le fait que, en combinaison avec 1'antithrombine III, elle bloque l'activité de la thrombine. La mesure est donc basée sur l'addition d'un excès connu de thrombine à la solution à tester et la détermination de la quantité résiduelle de celle-ci enzymatiquement active.

Les réactifs utilisés sont tirés du "kit" BOEKKINGER (Mannheim) pour mesurer l'héparine en faibles doses. L'excès de thrombine est mesuré par son effet de catalyse sur l'hydrolyse d'un polypeptide p-nitroanilidé (CHROMOZYM TH), laquelle libère la p-nitroaniline qui est titrée colorimé- triquement.

Le réactif "thrombine" est préparé à partir des ingrédients suivants: 10 ml de tampon Tris HC1 200 mM (pH 8,1) , 25 mM NaCl, 6,5 IU/ml 'aproti- nine, 100 ul de solution de thrombine (2,2 U/ml), 300 ul de solution d'antithrombine III SIGMA (10 U/ml).

Pour la mesure proprement dite, on ajoute 100 ul du réactif ci-dessus au puits à tester et après un temps donné d'incubation (par exemple 3 minutes) on ajoute une quantité constante du réactif CHROMOZYM-TH et, après

dilution à un volume donné, on mesure l'intensité de la couleur à 405 nm, celle-ci étant proportionnelle à la quantité de thrombine non inhibée. Les résultats obtenus (test 1) figurent plus loin.

c) Mesure du "temps de thrombine" (Thrombin time).

Pour cette mesure, on a utilisé les réactifs du "kit" de Boehringer: "Thrombin reagents".

Dans un des puits "héparinisé" suivant le procédé décrit plus haut (a), on a ajouté 100 ul de plasma "pauvre en plaquettes" (Platelet Poor Plasma, PPP) et on a agité doucement 2 min à 37°C au moyen d'un barreau magnétique. On a ajouté ensuite 100 ul du réactif "Thrombin reagent" et on a mesuré le temps au bout duquel apparaît un coagulum blanc (de fibrine). Les résultats figurent au tableau ci-après à l'Exemple 2.

Exemple 2

On a sélectionné des plaquettes munies de cuvettes de titration (puits) revêtues de photopolymère irradié telles que décrites au début du paragraphe (a) de l'Exemple 1. On a traité ces cuvettes 1 nuit, avec une solution 1 M de HMD (Test 2). Par .ailleurs, afin d'obtenir un témoin préparé suivant la technique antérieure, on a traité une cuvette avec une solution à 10% en poids de polyéthylèn imine (échantillon ii). On a égale¬ ment préparé un témoin non e tivé (iii) en neutralisant simplement les groupes réactifs NHS du film avec de l'éthanolamine.

On a ensuite utilisé, pour lis t_>_-ais -(cuvettes Test 2, ii et iii), la solution résultant de la désa ination de l'héparine décrite plus haut, après dialyse mais avant addition de HMD, qu'on a préalablement diluée à environ 5 mg/1 dans le tampon phosphate 0,1 M, pH 8. On a introduit 200 ul de cette solution dans chacun des échantillons et, après 1 nuit d'incuba¬ tion à température ambiante, on a ajouté un excès de solution 1 M de cyanoborohydrure de sodium pour réduire la liaison -N=C, et on a rincé à l'eau, au PBS, puis au sérum. En ce qui concerne le témoin (iii), le film ne contenant plus de sites de fixation, on suppose que les fragments d'hé¬ parine n'ayant pu se fixer ont été éliminés au rinçage.

Les échantillons Test 2, ii et iii ont été testés, tout comme l'échan¬ tillon de l'Exemple 1 (Test 1), les résultats figurant au Tableau ci- dessous.

Echantillon Activité antithrombine Temps de thrombine (U) (sec)

Test 1 0,12 > 300 Test 2 0,10 > 300 ii 0,01 22 iii 0,03 28

On voit, de par ces résultats, que le substrat de l'invention (Test 1 et 2) présente une activité antithrombine bien supérieure à celle d'un échantil¬ lon (ii) préparé suivant l'art antérieur. Par aillleurs, on constate que les groupes amino résiduels de l'échantillon (ii) ont une action inhibitri- ce (cf. avec le témoin inactif iii) sur l'activité antithrombine de l'hé¬ parine fixée.