La présente invention concerne un sucrose octasulfate de zinc, son procédé de préparation et son utilisation dans le domaine pharmaceutique et/ou cosmétique.

Les oligosaccharides sont des glucides dont l'hydrolyse fournie uniquement des oses. Ce sont des sucres constitués par l'union d'au moins deux molécules de sucres simples (ou oses). Parmi les oligosaccharides, on trouve le sucrose, sucre double formé par la condensation de 2 oses : une molécule de glucose et une molécule de fructose.

Les oligosaccharides sulfatés sont connus dans la littérature et possèdent de multiples activités biologiques, cosmétiques et/ou thérapeutiques.

WO2006/017752 décrit une méthode de traitement des inflammations des voies aériennes en employant des oligosaccharides comme substance active. Parmi les oligosaccharides est cité, en outre, Poligosaccharide totalement sulfaté issu de la condensation du glucose et du fructose.

Les oligosaccharides sulfatés, principalement le sucrose octasulfate d'aluminium, sont également employés dans le traitement de l'alopécie (US 5 767 104).

Le sucrose octasulfate est utilisé comme principe actif dans le traitement des ulcères gastriques pour ses propriétés réparatrices/cicatrisantes. FR 2 646 604 décrit des formulations de sucrose octasulfate d'aluminium, ou sucralfate, aux propriétés anti-inflammatoires et cicatrisantes destinées au traitement de plaies ou autres inflammations ulcéreuses. WO 94/00476 décrit une méthode de traitement des lésions et ou inflammations de l'appareil digestif par administration d'un sel de sucrose sulfaté, plus particulièrement le sucrose octasulfate de potassium ou de sodium.

FR 1 390 007 décrit l'utilisation par voie topique de formulation contenant du sucralfate en association avec du sulfate de cuivre et de zinc comme régénérant tissulaire, cicatrisant et apaisant. EP 0 230 023 décrit l'utilisation d'oligosaccharides polysulfatés, plus particulièrement du sucrose octasulfate de potassium, comme agent guérissant les blessures.

L'objet de la présente invention est de proposer un nouveau composé additionnant propriétés réparatrices, antimicrobiennes et anti-radicalaire. Un tel composé apparaît utile dans la préparation de compositions pharmaceutiques et/ou cosmétiques permettant la réparation de la peau, la guérison de blessures et favorisant la cicatrisation. Ce type de composition allie le traitement de la peau à la protection antimicrobienne.

La présente invention concerne les composés de formule générale I

Formule générale I

dans laquelle :

0 < n < 4

n est un nombre entier

Y représente OH, Cl, Br, I, NO _3> CeHsOr, CH ₃ CO ₂ , CF ₃ CO ₂ ou -OCH ₃ .

Dans un mode de réalisation de l'invention, le composé est un composé

Formule II

Dans ce mode de réalisation de l'invention, le composé de formule II correspond à n égal à 4 dans la formule générale I. Dans un mode de réalisation de l'invention, le composé est un composé de formule

Formule III

Dans ce mode de réalisation de l'invention, le composé de formule II correspond à n égal à 3 dans la formule générale I.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le composé est un composé de formule IV

Formule IV

Dans ce mode de réalisation de l'invention, le composé de formule II correspond à n égal à 2 dans la formule générale I.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le composé est un composé de formule

Formule V

Dans ce mode de réalisation de l'invention, le composé de formule II correspond à n égal à 1 dans la formule générale I. Dans un mode de réalisation de l'invention, le composé est un composé de formule VI

Formule VI

Dans ce mode de réalisation de l'invention, le composé de formule II correspond à n égal à 0 dans la formule générale I.

La présente invention a pour objet également le procédé de préparation de ces composés.

Les composés de formule générale I sont préparés selon le schéma 1 :

[ n Zn ²⁺ + (8 - 2n) (ZnY) ⁺ ]

Schéma 1

dans lequel

M représente K, Na ou H

Y représente OH, Cl, Br, I, NO ₃ , BF ₄ , C6H5O7, CH ₃ CO ₂₎ CF ₃ CO ₂ ou

-OCH ₃

0 < n < 4

n est un nombre entier.

Les composés de formule générale I sont obtenus en partant du sucrose octasulfate de potassium (M représente K), du sucrose octasulfate de sodium (M représente Na) ou de la forme acide du sucrose octasulfate (M représente H). Dans le cas où le sel de sucrose octasulfate de départ est le sel de sodium ou de potassium, une étape d'échange des ions potassium ou sodium par des protons est réalisée par passage sur une résine échangeuse d'ions. A la forme acide du sucrose octasulfate est additionné un sel minéral de zinc, choisi parmi Zn(OH)2, ZnC , ZnBr2, Zn , Zn(NOs)2 ou Zn(BF ₄ )2, ou un sel organique de zinc, choisi parmi Zn(CH ₃ CO ₂ )2, Zn(CF ₃ CO ₂ )2, Zn3(C ₆ H ₅ O7)2 ou Zn(CH ₃ O) ₂ . Le sel de zinc est additionné dans les proportions nécessaires pour aboutir à un composé de formule générale I présentant un nombre n entier compris entre, ou égal à, 0 et 4.

L'invention s'étend donc aux procédés de préparation suivants.

Procédé de préparation des composés de formule générale I comprenant les étapes suivantes :

1) dissolution dans l'eau d'un sel de sucrose octasulfate ;

2) passage sur colonne échangeuse d'ions dudit sel ;

3) addition d'un sel de zinc ;

4) précipitation du sucrose octasulfate de zinc.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le sel de sucrose octasulfate de l'étape 1 est choisi parmi le sucrose octasulfate de potassium ou le sucrose octasulfate de sodium.

Le passage sur la colonne échangeuse d'ions permet d'obtenir la forme acide du sel de sucrose octasulfate. Il s'agit plus particulièrement d'une résine échangeuse de cations. Dans un mode de réalisation de l'invention, la résine échangeuse de cations est l'Amberlite.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le sel de zinc est choisi parmi les sels minéraux de zinc tels que Zn(OH)2, ZnO, ZnCk, ZnBr ₂ , Znl ₂ , Zn(NO3)2 ou Zn(BF ₄ ) ₂ ou les sels organiques de zinc tels que Zn(CH3C0 ₂ )2, Zn(CF3C02) ₂ , Ζη3(θ6Ηδθ7)2 ou Zn(CH3O) ₂ . Le sel de zinc est par exemple l'hydroxyde de zinc Zn(OH) ₂ .

Dans un mode de réalisation de l'invention, la précipitation du sucrose octasulftate de zinc est réalisée par addition d'acétone.

Procédé de préparation des composés de formule générale I comprenant les étapes suivantes : 1 ) dissolution dans l'eau de la forme acide du sucrose octasulfate ;

2) addition d'un sel de zinc ;

3) précipitation du sucrose octasulfate de zinc.

Le sel de zinc est choisi parmi les sels minéraux de zinc tels que Zn(OH) ₂ , ZnO, ZnC , ZnBr2, Zn , Zn(NÛ3)2 ou Zn(BF ₄ )2 ou les sels organiques de zinc tels que Zn(CH ₃ CO ₂ )2, Zn(CF ₃ C0 ₂ ) ₂ , Zn ₃ (C6H ₅ 07) ₂ ou Zn(CH ₃ O) ₂ .

Dans un mode de réalisation de l'invention, la précipitation du sucrose octasulftate de zinc est réalisée par addition d'acétone.

Les composés de formule I selon l'invention peuvent être administrés par voie topique ou orale. En particulier le composé peut être administré par la voie topique dans une formulation appropriée. Les dosages des composés de formule I dans les compositions de l'invention peuvent être ajustés afin d'obtenir une quantité de substance active qui est efficace pour obtenir la réponse thérapeutique et/ou cosmétique désirée pour une composition particulière à la méthode d'administration. Le niveau choisi de dosage dépend donc de l'effet thérapeutique et/ou cosmétique désiré, de la voie de l'administration, de la durée désirée du traitement et d'autres facteurs.

L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique et/ou cosmétique comprenant au moins un composé de formule générale I et un excipient pharmaceutiquement et/ou cosmétologiquement acceptable.

L'invention a également pour objet un dispositif médical comprenant au moins un composé de formule générale I et un excipient pharmaceutiquement ou cosmétologiquement acceptable.

Par « pharmaceutiquement et/ou cosmétologiquement acceptable » on se réfère à des entités moléculaires et des compositions qui ne produisent aucun effet adverse, allergique ou autre réaction indésirable quand elles sont administrées à un animal ou un humain.

Dans un mode de réalisation, la composition selon l'invention présente une teneur en sucrose octasulfate de zinc selon la formule générale I comprise entre 0,01 et 30 % en poids. Dans un mode de réalisation selon l'invention, la composition comprend le composé selon la formule II.

L'excipient pharmaceutiquement et/ou cosmétologiquement acceptable en vue d'obtenir une composition selon l'invention est choisi pour permettre une administration topique ou orale.

Avantageusement, la forme topique est choisie parmi le groupe constitué d'un lait, d'une crème, d'un baume, d'une huile, d'une lotion, d'un gel, d'un gel moussant, d'une pommade, d'un spray, d'une pâte, d'un patch, d'un suppositoire, etc.

Avantageusement, la forme orale est choisie parmi le groupe constitué d'un d'une gomme, d'une pastille, d'un comprimé, d'un sucre cuit, d'un gel à boire, d'une poudre à dissoudre, etc.

Au sens de la présente invention, la forme topique inclut les formes galéniques topiques pour application cutanée, pour application buccale (muqueuse buccale), pour application génitale (muqueuse anale, vaginale) et/ou pour application gastrique.

Au sens de la présente invention, la forme orale inclut les formes galéniques orales pour application buccale (muqueuse buccale) et/ou pour application gastrique.

Les compositions pharmaceutiques et/ou cosmétiques selon la présente invention sont destinées à favoriser la cicatrisation.

Les propriétés antimicrobiennes du zinc sont bien décrites. Les compositions pharmaceutiques et/ou cosmétiques selon la présente invention sont donc également destinées à protéger des infections microbiennes.

Ainsi, les compositions pharmaceutiques et/ou cosmétiques selon la présente invention favorisent la cicatrisation et/ou protègent des infections microbiennes.

Il a été montré par des études in vitro que les composés selon l'invention induisent la migration kératinocytaire. En comparaison, le sucrose octasulfate de potassium et le sucrose octasulfate de sodium n'induisent pas la migration cellulaire. Ainsi, de manière surprenante, contrairement au sucrose octasulfate de potassium et au sucrose octasulfate de sodium, le sucrose octasulfate de zinc apparaît posséder des propriétés très intéressantes sur la migration kératinocytaire et donc pour la cicatrisation cutanée.

Les composés de l'invention peuvent donc être utilisés dans le traitement de la peau notamment dans le processus de cicatrisation et d'amélioration de son aspect esthétique.

Les composés de l'invention peuvent donc être employés pour la préparation de compositions et de produits pharmaceutiques et/ou cosmétiques pour favoriser la cicatrisation.

Un autre objet de la présente invention concerne ainsi un composé selon la présente invention pour son utilisation en tant que médicament.

Un autre objet de la présente invention concerne également un composé selon la présente invention pour son utilisation en tant que principe actif cosmétique.

Un autre objet de la présente invention concerne un composé selon la présente invention pour son utilisation en tant que médicament et/ou principe actif cosmétique.

Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, les composés de Formule I sont utilisés pour le traitement de la peau.

Plus particulièrement, les composés de Formule I sont utilisés pour favoriser la cicatrisation. Plus particulièrement, l'invention concerne la cicatrisation de plaies aiguës telles que par exemple les écorchures, les brûlures, les radiodermites, ou chroniques telles que par exemple les ulcères, les escarres, le pied du diabétique.

Plus particulièrement, l'invention concerne la cicatrisation des brûlures (thermiques, mécaniques, chimiques, rayonnement), des radiodermites, des irritations diverses, des dermites, des écorchures, des éraflures, des égratignures, des coupures, des ulcères de jambes, des escarres, des plaies du diabétique, des ulcères gastriques, des aphtes, des diverses plaies de la sphère buccale, de l'acné cicatriciel, des cicatrices de cryothérapie, des cicatrices post chirurgie ou post acte de dermatologie esthétique (laser, épilation, peeling, injection), des ampoules, des chéilites, de l'eczéma, des érythèmes fessiers, des dermatoporoses etc.

Dans un mode particulier de mise en uvre de l'invention, les composés de Formule I sont utilisés pour favoriser la cicatrisation et/ou protéger des infections microbiennes.

Les exemples suivants sont illustratifs et non limitatifs.

EXEMPLE 1 : Préparation du composé de Formule II

a. Méthode de préparation

Une solution de sucrose octasulfate de potassium (1 ,50 g ; 1 ,16 mmol, 1 ,00 equiv, 99%) dans l'eau (20 ml) est placée dans un ballon de 100 ml. La solution est passée à travers une colonne (Φ 40x500 mm) contenant 250 g de o résine échangeuse d'ions d'Amberlite IR 120 H à un débit de 2-3 ml/min à 0 C. La fraction acide (120 ml ; pH = 1 ,2) est collectée et neutralisée immédiatement par ajout d'hydroxyde de zinc fraîchement préparé (600 mg ; 5,76 mmol ; 5,05 equiv, 95%). Le mélange résultant, trouble à environ pH 6, est laissé sous agitation pendant une nuit (env. 12 h) à température ambiante. Toutes ces étapes ont été réalisées à l'abri de la lumière en enveloppant le milieu réactionnel avec du papier d'aluminium.

Le mélange est ensuite filtré et 360 ml d'acétone sont additionnés au filtrat. Le mélange résultant est laissé au repos pour la nuit. Le surnageant est décanté et le sirop restant est lavé à l'acétone. Un solide blanc de sucrose octasulfate de zinc est obtenu (0,40 g ; 28%).

RMN ¹ H (D O, ppm) δ: 4,02-4,50 (m, 10 H); 4,53-4,71 (m, 2 H); 5,03 (d, J = 8,1 Hz, 1 H); 5,70-5,71 (d, J = 3,6 Hz, 1 H). b. Dosage du sucrose octasulfate

La quantité de sucrose octasulfate est déterminée par un dosage spectrophotométrique à l'anthrone (Brooks, J. ; Griffin, V. K.; Kattan, M. W.; « A Modified Method for Total Carbohydrate Analysis of Glucose Syrups, Maltodextrins, and Other Starch Hydrolysis Products »; Cereal Chemistry, 63, 5, 465-466, 1986).

Une solution standard d'anthrone est préparée en dissolvant 50mg d'anthrone dans un mélange de 10ml d'eau distillée et 90ml d'acide sulfurique concentré.

Le sucrose octasulfate de zinc est préalablement déshydraté sous vide (environ 23,5 Pa) à 30°C pendant 6h. Trois échantillons de volume respectif 0,3, 0,6 et 0,7 ml d'une solution aqueuse de sucrose octasulfate de zinc (0,4018 mg/ml) sont dilués avec de l'eau distillée jusqu'à 2ml. 6,0ml de la solution standard d'anthrone sont ajoutés à chaque solution. Les solutions obtenues sont chauffées au bain-marie pendant 10 min. Après retour à température ambiante immédiat, l'absorbance de chaque solution est mesurée à 620nm, en utilisant le sucrose comme référence (Résultats, voir Tableau 1).

Tableau 1 : Dosage du sucrose à l'anthrone

La quantité de sucrose octasulfate présente dans le sucrose octasulfate de zinc est de : 0,296 mM / 0,4018 mg/ml = 0,737 mmol / g. c. Dosage du zinc

Le zinc a été dosé par une titration à l'EDTA.

Le sucrose octasulfate de zinc (0,2009 g) est dissous dans de l'eau déionisée (250 ml). Le sel est titré par une solution aqueuse d'EDTA (0.0101 M) avec 6 ml d'hexaméthylène tétramine (20%) comme solution tampon et 2 gouttes de xylénol orange (0,2%) comme indicateur coloré (Tableau 2).

Tableau 2 : Dosage du zinc à l'EDTA

La quantité de zinc présente dans le sucrose octasulfate de zinc est de : 2,30 mM x 0,250 I / 0,2009 g = 2,86 mmol / g.

Le ratio zinc / sucrose octasulfate est de 2,86 / 0,737, soit de 3,88. d. Recherche d'impuretés de potassium

L'UFLC (Ultra Fast Liquid Chromatography) a été employée pour détecter la présence éventuelle de potassium issu du produit de départ.

Conditions :

Colonne: Merck SeQuant ZIC_HILIC 150x4,6 mm 5pm 200 A

Phase Mobile A : Acétonitrile

Phase Mobile B: 100mM ammonium Acétate pH=5,0

Débit : 0,6ml/min

Température de la Colonne : 35°C

Détecteur: ELSD

Gradient: 15% à 85% B en 11 ,0 minutes, 85% à 95% B en 8,0 minutes, 95% B pendant 5 minutes Résultats :

Le sucrose octasulfate de zinc obtenu selon l'exemple 1 et deux témoins ont été analysés par UFLC :

- ZnC (voir Figure 1 )

- ZnCI ₂ + KCI (voir Figure 2)

- sucrose octasulfate de zinc (Formule II) (voir Figure 3)

L'analyse confirme l'absence de potassium dans le produit synthétisé. Seul le zinc est présent comme cation.

EXEMPLE 2 : Test in vitro sur la migration des cellules

La migration des cellules épithéliales est une étape importante du développement et des processus de réparation tissulaire, tels que l'embryogenèse et la cicatrisation.

Les mécanismes d'initiation, de coordination et d'arrêt des mouvements des cellules, ne sont pas complètement élucidés, cependant, le rôle primordial de la migration cellulaire est bien établi (Santoro M. M. and Gaudino G. Cellular and molecular facets of keratinocyte reepithelization during wound healing Exp. Cell. Res. 304 (1 ) : 274-286, 2005 ; Werner S. and Grose R. Régulation of wound healing by growth factors and cytokines Physiol. Rev. 3(3) : 835-870, 2003 ; Steffensen B, Akkinen L., Lariava H. Proteolytic events of wound healing-coordinated interactions among matrix metalloproteinases (MMPs), integrins, and extracellular matrix molécules Crit. Rev. Oral Biol. Med. 12(5) : 373-398, 2001).

Lors de la cicatrisation cutanée et dans les affections inflammatoires chroniques dermatologiques, les kératinocytes sont "activés" pour entreprendre le processus de migration. Les cellules voient alors leur phénotype influencé par les interactions avec la matrice extracellulaire d'une part et par les interactions cellules-cellules, d'autre part (McMillan JR, Akiyama M., Shimizu H. Epidermal basement membrane zone component : ultrastructural distribution and molecular interactions J. Derm. Se. 31 : 169-177, 2003). Les kératinocytes de l'assise basale des berges d'une plaie, migrent sur la plaie et la recouvrent.

En effet, les kératinocytes sont activés au contact de la fibronectine, du collagène dermique interstitiel (type 1 ), du collagène IV et de la laminine 5 de la lame basale. Ils sont aussi régulés par certains facteurs de croissance polypeptidiques comme le TGFp, le TGFa et l'EGF. De plus, des cytokines (IL1 , TNFa) et chémokines (RANTES et PIL-8) contribuent aussi à augmenter la vitesse de ré-épithélisation d'une plaie, suite à l'activation kératinocytaire (Szabo I., Wetzel M. A., Rogers TJ. Cell-Density-Regulated Chemotactic Responsiveness of Kératinocytes In Vitro J. Invest. Dermatol. 117 : 1083-1090, 2001 ).

Objectif de l'étude

L'objectif de cette étude était d'évaluer l'effet du sucrose octasulfate de zinc sur la migration cellulaire de lignées de kératinocytes HaCAT, à l'aide du Kit de migration cellulaire Oris Cell Migration Assay (Platypus Technologies). Cette étude a été réalisée en comparaison avec le sucrose octasulfate de potassium, et le sucrose octasulfate de sodium.

Ainsi, l'effet des 3 sucroses a été testé sur la migration des cellules HaCat.

Matériels et méthodes

a. Matériel biologique

Lignée de kératinocytes humains HaCaT, spontanément immortalisés, fréquemment citée comme modèle de référence dans la littérature. b. Protocole de migration cellulaire

Le protocole utilisé pour l'étude de la migration cellulaire repose sur l'utilisation d'un kit 96 puits, Oris Cell Migration Assay (Platypus Technologies - TEBU), permettant la miniaturisation et la quantification de ce processus cellulaire. Il est décrit sous le code QRD/TO/154/107.

Le principe de ce test consiste à étudier la migration cellulaire vers le centre du puits de la plaque de 96 puits. Il consiste à placer un stoppeur dans des puits, afin de créer une zone de détection de 2 mm de diamètre. Puis de retirer les stoppeurs une fois que les cellules ont bien adhéré à la surface autour de ceux-ci, et ainsi, de permettre aux cellules de migrer vers la zone de détection. Les plaques sans les stoppeurs et avec les actifs sont mises à incuber à 37°C pendant 24 heures dans du DMEM 0% SVF. On analyse ensuite la quantité de cellules situées dans la zone où il y avait le stoppeur, afin d'évaluer la migration des cellules. Un cache permet de visualiser et de comptabiliser uniquement les cellules situées dans cette zone. Pour chaque condition, la moyenne de 4 à 8 puits est réalisée. c. Produits testés

Témoin positif : TGFpi

Sucrose octasulfate de potassium (SOS-K)

Sucrose octasulfate de sodium (SOS-Na)

Sucrose octasulfate de zinc selon l'exemple 1 (SOS-Zn) d. Analyse des résultats

Les résultats sont exprimés en DO (proportionnelle à la quantité de cellules qui ont migré).

Le pourcentage d'activité par rapport au témoin négatif est calculé par :

DO traite

; ;— x ioo

DO témoin négatif

Le pourcentage d'activité par rapport au TGFp est calculé par :

DO traite — DO témoin négatif

^^ x l OO

DO TGFfi— DO témoin négatif

Résultats

L'effet des 3 sucroses à différentes concentrations a été testé sur la migration des cellules HaCat, l'expérience ayant été reproduite 2 fois (Tableaux 3 et 4). a. Expérience 1

Tableau 3 : résultats de l'expérience 1 - Effet des 3 sucroses sur la migration des kératinocytes

b. Expérience 2

Tableau 4 : résultats de l'expérience 2 - Effet des 3 sucroses sur la migration des kératinocytes

Il a été observé que :

- le TGFP à 5 ng/ml, contrôle positif des expériences, induit la migration des kératinocytes de façon reproductible ; - le sucrose octasulfate de zinc (SOS-Zn) induit aussi la migration cellulaire de façon reproductible à 1 μΜ. A cette concentration il est aussi actif que le contrôle positif TGF ;

- aux concentrations testées, le sucrose octasulfate de potassium (SOS- K) et le sucrose octasulfate de sodium (SOS-Na) n'induisent pas la migration des kératinocytes.

Grâce à ce kit de migration cellulaire, l'effet des 3 sucroses sur la migration des kératinocytes a été étudié.

Nous avons montré que le sucrose octasulfate de zinc induit la migration kératinocytaire. En comparaison, le sucrose octasulfate de potassium et le sucrose octasulfate de sodium n'induisent pas la migration cellulaire.

Contrairement au sucrose octasulfate de potassium et au sucrose octasulfate de sodium, le sucrose octasulfate de zinc apparaît avoir des propriétés très intéressantes sur la migration kératinocytaire et donc pour la cicatrisation cutanée.