Die Erfindung betrifft neuartige, zuckerhaltige Dipeptide, deren Herstellung und ihre Anwendung für verschiedene pharmazeutische, biologische und medizinische Anwendungs¬ gebiete insbesonders im Rahmen von Infektionsprophylaxe, Bekämpfung von Infektionskrankhei en verschiedenen Ur¬ sprungs, von Tumoren und vergleichbaren Krankheitsb ldern, zur Verwendung als Zusatzstoff in verschiedenen z.B. phar¬ mazeutischen Erzeugnissen und Impfstoffen sowie als Adjuvans oder Modulator der Immunantwort.

Nachdem 1974 F. Ellouz et al . die Immunostimulation von Bakterienzel 1wand-Fragmenten in der Form von N-acetyl- muramyl -L-al anyl -D- i sog! utami n (MDP = Muramyl di epti d) /Biochem.Biophys . Res. Commun. 59, 1317 ( 1974)7 • entdeck¬ ten, entstanden eine ielzahl von Publikationen und Patenten, die über die biologische Wirkung von dieser Art von Substanzen berichteten.

Infolge ihrer Wirkung z.B. über eine Erhöhung der Menge von Antikörpern im lebenden Organismus sollten diese Sub¬ stanzen durchweg mehr oder weniger aktiv z.B. gegen Virus- und Bakterien- und andere Infektionen, aber z.B. auch ge¬ gen Tumorerkrankungen sein, wie zum Teil auch durch in vitro-Tests gezeigt werden konnte. Bei in vivo-Tests allerdings zeigten diese Substanzen für sich kaum Schutz-

Wirkungen. In einigen Fällen kann diese Schutzwi kung ^v durch Beifügungen von Zusatzstoffen - z.B. öligen Myco- laten - hervorgerufen werden; allerdings führen diese Zusatzstoffe zu unerwünschten Nebenwirkungen, wie toxi- sehe Effekte, Fieber u.a. [j. Bio!. Resp. Modif., Vol. 3, No. 6, 663-671 (1984)] .

Bis heute gibt es deshalb kaum wirkungsvolle Arzneimittel der beschriebenen Klasse.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neuartige Wirkstoffe und Methoden zu ihrer Herstellung zu entwickeln, deren Anwendung zugleich die oben erwähnten Nachteile und Beschränkungen des Standes der Technik überwindet.

Die Erfindung betrifft zuckerhal ige Dipeptide der Formel (I)

in der

Wasserstoff oder eine C, -C..-A1 kyl gruppe

-HN- CH-CO- Glycin oder einen natürlichen L-Amino-

' 2 R^ säurerest

Wasserstoff oder eine C^-C ₈ -AI yl gruppe und

4 R - Wasserstoff oder eine C,-C ₈ -Al kyl gruppe bedeuten, und der Glutamylrest in der D-Form vorliegt.

überraschenderweise sind die erfindungsgemäßen Substan¬ zen in in vivo-Tests mit und ohne Beifügungen biologisch sehr aktiv, so daß keine unerwünschten Nebenw rkungen zu erwarten sind. Mit ihrer Hilfe könnten gegebenenfalls sehr wirkungsvolle Arzneimittel zur Prophylaxe und Be¬ kämpfung z.B. mikrobieller Krankheiten (Viren, Bakterien, Parasiten, Pilze) , aber auch für andere Erkrankungen z.B. Tumore sowie für im unmodul atori sehe Zwecke z.B. auch als Adjuvans entwickelt werden.

1 4 Die Reste R , R und R in der Formel (I ) stehen bevorzugt für Wasserstoff oder geradkettige oder verzweigte C,-C ₄ -

Alkylreste. Die Reste können gleich oder verschieden sein.

1 3 4 Ganz besonders bevorzugt stehen R , R und R für Wasser¬ stoff, Methyl oder Ethyl .

Zuckerhaltige Dipeptide, in denen HN-CH-CO in Formel (I)

¹ 2 R^ sich von Glycin, L-Alanin, L-Phenyl al ani n , L-Serin, L-Cystein, L-Lysin, L-Histidin, L-Valin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Tryptophan , L-Asparagin, L-Threonin, L-Tyrosin, L-Methionin, L-Ornithin, L-Arginin, L-Prolin oder L-Hydroxyprol i n ableitet, sind ebenfalls bevorzugt

Insbesondere leitet sich -HN-CH-CO in Formel (I) von

¹ 2 R^

Glycin, L-Alanin, L- Phenyl alanin , L-Serin oder L-Threonin ab.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von zuckerhaltigen Dipeptiden der Formel (I)

in der

Wasserstoff oder eine C,-C ₈ -Al kyl gruppe -CO- Glyc n oder einen natürlichen L-A ino¬ säurerest

R - Wasserstoff oder eine C, -C ₈ -AI yl gruppe und

R - Wasserstoff oder eine C,-C _ß -Al kyl gruppe bedeuten, und der Glutamylrest in der D-Form vorliegt, das dadurch ge-

kennzeichnet ist, daß man D-Glucofuranosederivate der Formel (II)

in der R die oben angegebene Bedeutung hat und AKT für eine leicht auswechsel bare, für Acylierungs* reaktionen bekannte Gruppe steht, mit Dipeptidfrag* menten der Formel (III)

CHgCHgCOOfr (in)

H ₂ N - ^' CHCONHCHCÖOR

2 3 4 in dar R , R und R die oben angegebene Bedeutung haben, zur Reaktion bringt und die Schutzgruppen in den Verbindungen der Formel (I) gegebenenfalls abspal tet.

Bevorzugt werden Verbindungen der Formel (II), die in einem ersten Schritt mit einer natürlichen L-Aminosäure umgesetzt, anschließend aktiviert und danach mit D-Glut¬ aminsäure umgesetzt werden.

Weiterhin lassen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen so herstellen, daß man Verbindungen der Formel (II) mit einem Garbonsäureimi dchl ori d der Formel (IV)

Ers

in der

X Wasserstoff, C- _^ -C.-Alkyl , Fluor, Chlor oder N0 ₂ bedeutet, Y Halogen oder N0 _? darstellt und Z die gleiche Bedeutung wie Y besitzt, umsetzt, das erhaltene Diacylamin mit der gewünschten L-Aminosäure zur Reaktion bringt, die so erhaltene Ver¬ bindung erneut mit einem Carbonsäureimidchl orid der Formel (IV) umsetzt und dieses Diacylamin mit D-Glutamin¬ säure zum Endprodukt der Formel (I) reagieren läßt.

Prinzipiell lassen sich die erf ndungsgemäßen Verbindun¬ gen und deren Vorprodukte herstellen, indem man Ver¬ bindungen der Formel (II) mit einem Carbonsäureamidchl ori d der Formel (IV)

in der

X Wasserstoff, C _j -C^-Alkyl, Fluor, Chlor oder N0 ₂ bedeutet, Y Halogen oder N0 _? darstellt und X die gleiche Bedeutung wie Y besitzt,

umsetzt, das erhaltene Diacylamin mit der gewünschten L-Aminosäure oder Peptiden zur Reaktion bringt, die so erhaltene Verbindung erneut mit einem Carbons ureimi d- chlorid der Formel (IV) umsetzt und dieses Diacylamin mit D-Glutaminsäure zum Endprodukt der Formel (I) rea- gieren läßt.

Das Verfahren wird in der Weise durchgeführt, daß man in ,. einem ersten Reaktionsschritt eine Verbindung der allge¬ meinen Formel (II) (AKT=0H) mit einem Carbonsäureimld- chlorid der allgemeinen Formel (IV) umsetzt. Dieser Reak- tionsschritt wird vorzugsweise in einem inerten Lösungs¬ mittel in Gegenwart von basischen Katalysatoren durchge¬ führt. Geeignete Lösungsmi tel sind beispielsweise niedere Alkohole, wie Methanol , Ethanol oder Isopropanol , niedere Carbonsäureester, wie Ethylacetat, polare Ester, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Glykol onomethyl ether oder Glykol d.methyl - ether oder dipolare aprotische Lösungsmittel , wie Dimethyl- for amid, N-Methylacetamid _» Sulfolan oder Hexamethyl phos- phorsäuretria id. Geeignete Lösungsmittel sind ferner Gemische der oben- genannten Lösungsmittel mit inerten unpolaren Lösungs¬ mitteln, wie chlorierten Kohlenwasserstoffen (Dichlor- methan, Trichlormethan oder Tetrachl orethan etc. ) oder aromatische Kohlenwasserstoffe (Benzol , Toluol etc.). Geeignete Basen sind beispielsweise tertiäre Amine, wie •*». Triethyl amin , Triethanol ami n oder N-Methylmorphol i n, AI al i etal 1 hydroxi de , wie Natronlauge oder Kalilauge oder AI kal imetal 1 al kohol ate, wie Natri um ethyl at oder Kai i ummethyl at . Dieser erste Reaktionsschritt wird üblicherweise bei einer Reaktionstemperatur von -20°C bis 100°C durchge¬ führt, wobei eine Temperatur von 0 C bis 30 C bevorzugt angewendet wird.

In der zweiten Stufe des Verfahrens werden die erhaltenen Diacylamine mit der erwünschten L-Aminosäure zur Reaktion gebracht. Auch diese Stufe wird vorzugsweise in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart basischer Katalysatoren durchgeführt. Als Lösungsmittel können die gleichen Sol- ventien wie in dem ersten Verfahrensschritt verwendet

werden. Es ist aber andererseits auch möglich, diese Reak-^ tion in niederen Ketonen (Aceton, Methylethyl eton , Methyl- isobutyl eton etc.) als Lösungsmitteln durchzuführen. Als basische Katalysatoren verwendet man für diesen Verfahrens- schritt vorzugsweise eine der oben genannten tert. Amine. Die Reaktionstemperatur beträgt bei diesem Verfahrens¬ schritt beispielsweise -20°C bis 100°C.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind auch die Verwen¬ dung der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Ver- fahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers sowie Arzneimittel, welche die erfindungsge- äßen. Verbindungen enthalten.

Zum Gegenstand der Erfindung gehören auch Salze der Ver¬ bindungen der Formel (I). Dabei handelt es sich in erster Linie um übl cherweise pharmazeutisch verwendbare, nicht-toxische Salze, z.B. Alkalimetall- oder Ammonium- sal ze .

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen wert¬ volle pharmakol ogi sehe Eigenschaften - insbesondere eine ausgeprägte, die Abwehr steigernde Wirkung - auf. Es wurde gefunden, daß die Verbindungen der vorliegenden

Erfindung die Antikörpersynthese des Immunsystems stei¬ gern und darüber hinaus die unspezifische wirtseigene Abwehr verstärken. Dies kann anhand entsprechender Ver¬ suchsanordnungen gezeigt werden.

Die pharmazeutischen Präparate und Zubereitungen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise Tabletten oder Gelatinekapseln, welche die Wirkstoffe zusammen mit Ver¬ dünnungsmitteln, z.B. Laktose, Dextrose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Cellulose und/oder Schmiermitteln, z.. B . Kieselerde, Talk, Stearinsäure oder Salze davon, wie Mag¬ nesium- oder Calci umstearat, und/oder Polyethyl englykol , enthalten. Tabletten enthalten ebenfalls Bindemittel , wie z.B. Magnesiumaluminiumsilikat, Stärken, wie Mais-, Weizen-, Reis- oder Pfeilwurzstärke, Gelatine, Traganth, Methyl cel 1 ul ose, Natri umcarboxymethyl cel 1 ul ose und/oder Polyvinyl pyrrol i don , und wenn erwünscht, Sprengmittel , z.B. Stärken , ^' Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natri umal gi nat und/oder Brausemischungen, oder Adsorp¬ tionsmittel, Farbstoffe, Geschmackstoffe und Süssmi ttel . ^**' Injizierbare Präparate sind vorzugsweise isotonische wäßrige Lösungen oder Suspensionen. Supposi tori en , Salben oder Cremen sind in erster Linie Fettemulsionen' oder -Suspensionen. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert sein und/oder Hilfsstoffe, z.B. Konservier-, Stabilis er-, Netz- und/oder Emulgiermi tel , Lös! i chkei ts- vermittler, Salze zur Regulierung des osmotischen Druckes und/oder Puffer enthalten. Die vorliegenden pharmazeuti¬ schen Präparate, die, wenn erwünscht, weitere pharmakolo- gisch wertvolle Stoffe enthalten können, werden in an sich bekannter Weise, z.B. mittels konventioneller Misch-, Granulier- oder Dragierverfahren hergestellt und enthalten von etwa 0,1 % bis etwa 75 % , insbesondere von etwa 1 % bis 50 % der genannten Aktivstoffe.

Die oral applizierten Präparate der vorliegenden Erfin¬ dung können auch mit einem gegen Magensaft beständigen Oberzug versehen werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als abwehrstei- gernde und immunpotenzierende Mittel zur Behandlung von chronischen und akuten Infektionen (z.B. bakterielle, virale und parasitäre) und malignen Tumoren verwendet werden. Sie können ebenfalls als Adjuvantien bei der Vakzinierung, bei der Stimulierung von Phagocytose, bei der Dysregulation des Abwehr- und Immunsystems verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Adjuvantien eingesetzt werden. Sie sind besonders wirksam in Verbindung mit Squalen oder Squalan.

• Die nachfolgenden Beispi-ele erläutern die vorstehend beschriebene Erfindung, sie sollen jedoch diese in ihrem Umfange in keiner Weise einschränken.

Zur Untersuchung der ant i robieilen Akti tät wurden bei 20 NMRI-Mäusen je 500 μg der Substanz des Beispiels 1 in 1 % Squal an-in-Wasser-Lösung injiziert. Zur Kontrolle wurden 20 Tiere lediglich mit Kochsalzl sung behandelt. Nach einer Woche wurden alle Tiere mit einem Aerosol von äusepathogenen Inf1 uenza-Vi ren infiziert. Während alle Kontrol 1 ti ere (Kochsalz) starben, überlebten 80 % der Tiere, die mit der T tel Substanz behandelt wurden.

Die immunkompetenten Zellen der mit dieser Substanz behandelten Tiere zeigten erhöhte Aktivität.

Beispiel 1

N- [(D-Glucos-3-O-yl )-acetyl] -L-gl cyl-D-gl utamyl -

_.!_._._.__]_:_.i:-._.r

1 mM [.D-Glucos-3-O-yl ) ^" J -essigsaure £j. Heterocycl . Chem. 19, 981, (1982)] = 318 mg, in 2 ml Ethylacetat wird 1 mM Triethylamin und 1.1 mM = 312 mg N-phenyl -2 ,6- dichl orbenzi idoyl-chl orid angesetzt. Nach 4 Stunden Einwirkung wird die erhaltene Substanz mit Wasser ge¬ waschen und dann das Ethylacetat abgedampft, der Rück- stand in 5 ml Isopropanol gelöst und mit 1 mM Glycyl-D- gl utami nsäuredi ethyl ester in 5 ml Isopropanol betropft. Nach 4 Stunden Reaktion ist das Isopropanol verdampft. 'Es entsteht eine ölige Substanz. Diese wird über Säulen¬ chromatographie (Silikagel , Lösungsmi tel Benzol -Aceton 6:1) gereinigt.

So erhält man 436 mg (82 % Ausbeute) der Ti teTsubstanz . Spektroskopische Prüfungen zeigen den Erfolg der Synthese

- 25

[£ -23.58 (c=0.6, Aceton)

D

NMR (in CDC1,) (δ) 1.31 (3H) , 1.35 (3H) , 1.40 (3H) , 1.47 (3H), 3.67 (3H), 3.73 (3H), 3.85- 4.40 (9H, multiplet), 4.59 (2H, multi* plet), 5.92 (1H, doublet), 7.02 (1H, doublet), 8.20 (1H, triplet). MS: m/z = 532.

Beispiel 2 (= Substanz in Beispiel 1)

340 mg (1 mM) 1 , 2 : 5 ,6-Di-O- i sopropyl den-3-0-carboxy- methyl -D-gl ucofuranose-natri um-Sal z wird in 3 ml Aceton gelöst und die Lösung auf -10 C gekühlt.

Es werden 0,15 ml Triethylamin hinzugefügt. Unter intensivem Rühren werden o, 11 ml Ethylchloroformat zuge¬ tropft. Nach 15 Min. tropft man langsam die Lösung von 1 mM ^' Glycyl -D-gl utami nsäure-dimethylester (aus 232 mg Peptidester-hydrochlorid und 0,14 ml Triethylamin) in

4 ml Aceton hinzu. Man rührt.die Mischung noch 0,5 Stun¬ den unter Kühlung und 4 Stunden bei Raumtemperatur. Das Reaktionsprodukt ird analog Beispiel 1 gereinigt. Man erhält 315 mg (59 % ) rein ^' er Substanz.

Beispiel 3

390 mg (1 mM) N-J ^" ( 1 , 2 : 5 , 6-Di i sopropyl i den-gl ucofuranosyl - 3-0-) -acetylJ-L-al anin werden in Aceton gelöst und auf einem Eisbad gekühlt. Danach werden 0,15 ml Triethylamin und 290 mg N-Phenyl - ( ,6-dichl or-benzi idoyl ) -Chl orid zugege-ben. Die Reaktionsmischung wird während eines Tages bei Raumtemperatur gerührt. Das Aceton wird verdampft, der Rückstand in 5 ml Essigester gelöst und mit Walser gewaschen. Anschließend wird die Esterphase getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wird mit 1 mM D-Gl utami nsäure-di natri um-Sal z in 4 -ml. Dimethyl- formamid 2 Stunden umgesetzt. Danach wird die Reaktions¬ lösung bei 35°C am Rotationsverdampfer stark eingeengt. Das ölige Produkt wird in Essigester gelöst und mit Wasser extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit Essigester be¬ deckt und in der Kälte mit 0,6 N Zitronensäure versetzt. Die organische Phase wird abgetrennt und über MgSO. getrocknet. Nach dem Verdampfen erhält man 425 mg (82 % ) N- -N-( 1,2:5,6-Di-O-isopropyliden-gl ucofuranosy1-3-0- ) - acetyl/-L-al anyl -D-gl utami nsäure als weißen Schaum.

Λ ²⁰ 35 ,80°(c=0,4 in Aceton)

Ers

li -

In analoger Weise erhält man N-/-N- ( 1 ,2 : 5 ,6-Di -0-i so¬ propyl 1 den-gl ucofuranosyl -3-0) -acetyl glycylJ-D-gl utami n- säure mit 79 % der Ausbeute.

Beis iel 4

N-/[l,2:5,6-Di-i sopropyl iden-gl ucofuranosyl -3-0- ) -ace y17- N-(2,6-dichlorbenzoyl ) -ani 1 i n .

Zu einer Lösung aus 680 mg (2 mM) Natrium (1,2:5,6-Di- i sopropyl iden-gl ucofuranosyl -3-0- ) -acetat (J. Heterocyclic

Chem., 19, 981 (1982)) in 5 ml Essigester und 0,5 ml Was- ser werden 595 mg (2,1 mM) N-Phenyl - ( 2 ,6-di -chl orbenz- i idoyl ) -chlori d gegeben und die Mischung 4 Stunden lang gerührt .

Danach wird die Wasserschicht abgetrennt und die organische Lösung über Na _? S0» getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Rotationsverdampfer entfernt. Man erhält 1,114 g eines weißen Schaums, der durch Zugabe von-etwas Isopropanol kristallisiert.

NMR (in CDC1 ₃ ) ( ) 1.28 - 1.50 m 12 H, 4xCH ₃ )

3.60 - 4.24 m 6 H, CH, CH- ₂ )

4.40 - 4.54 m 1H, CH-0-)

4.84 d 1H, CH-0-)

5.96 d lH,-0-CH-0-)

7.12 - 7.68 8H, arom. CH)

Die Substanz wird ebenfalls als Ausgangsprodukt für d e erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt.

Ersatzbfatt

Beispiel 5

N-[ (1,2 : 5,5-Di-0- sopropyl iden-gl ucofuranosyl -3-0- )- acetyl] -L-aminosäure.

Zu 566 mg (1 M) N- [(1 , : 5,6-Di-isopropyl iden-gl uco- furanosyl-3-0- )-acetyl -N- (2 ,6-dich! orbenzoyl )-anil in in 2 ml Dimethyl formamid fügt man bei Raumtemperatur 1 mM L-Amino-säure in Salzform (Na, K, oder Triethylamin) in 2 ml Dimethyl for ami d. Nach 4 - 8 Stunden wird Dimethyl- formamid bei 35 C am Rotationsverdampfer eingedampft und der Rückstand in 1 ml Wasser gelöst. Das Reaktionsprodukt wird unter Kühlung in Essigester bis zu einem pH-Wert von 2 angesäuert, die organische Phase abgetrennt und ge¬ trocknet.

Nach Eindampfen der Lösung erhält msn D i sopropyl i den- gl ucofuranosyl -acetyl -aminosäure als öligen Sirup oder weißen Schaum in 80-90 %iger Ausbeute.

Man erhält so:

N- [(1,2:5, 6-dii sopropyl iden-gl ucofuranosyl -3-0- )-acetyl] - glycin,

N- [(1,2:5, 6-dii sop opyl iden-glucofuranosyl-3-0-)τacetylj- L-al anin,

N-[(l, 2:5, 6-dii sopropyl iden-glucofuranosyl-3-0-)-acetyl]- L- Phenyl alanin als Ausgangsprodukte für die erfindungsgemäßen Verbindungen.