Die Entwicklung multimodaler Therapiestrategien mit Chemotherapie und Bestrahlung haben die Behandlung von Leukämieerkrankungen im Kindesalter in den letzten vier Jahrzehnten revolutioniert und die vormals düstere Prognose dieser Patienten erheblich verbessert. So können heute z. B. ca. 80 % der Kinder mit einer akuten lymphatischen Leukämie durch eine Polychemotherapie dauerhaft geheilt werden (Harms und Janka 2000 ; Schrappe et al. 2000). Doch gelingt auch mit der Polychemotherapie bei vielen Rezidiv-und bestimmten Hochrisikopatienten der akuten Leukämien sowie bei Patienten mit chronischen Verlaufsformen keine Heilung. Für diese Patienten stellt zur Zeit die allogene hämatopoetische Stammzelitransplantation den einzig möglichen kurativen Behandlungsansatz dar. Dabei hat sich in den letzten Jahren gezeigt, dass weniger die intensive chemo-und strahlentherapeutische Behandlung im Rahmen der Konditionierung als vielmehr die durch die Transplantation induzierten immunologischen Vorgänge die entscheidende Rolle für die Prognose nach allogener Transplantation spielt. Diese als"graft-versus-leukemia" (GvL) -Effekte be- zeichneten immunologischen Phänome beruhen in erster Linie auf der Erkennung und Vernichtung der Empfänger-Leukämiezellen durch die transplantierten Spender-T-Zellen. Daneben sind wahrscheinlich auch andere Zellen des Immunsystems, wie z. B. NK-Zellen und Dendritische Zellen, beteiligt.

Der GvL-Effekt steht in einem besonderen Verhältnis zu der sogenannten Spender-gegen-Empfänger-Krankheit ("graft-versus-host disease"; GvHD). Hierbei reagieren die transplantierten reifen Spender T-Zellen auch gegen andere Zellen des Patienten, die vor allem in der Haut, der Leber, dem Gastrointestinaltrakt, in exokrinen Drüsen und im Lungengewebe lokalisiert sind. Dabei kann das Ausmass dieser Reaktion lebensgefährliche Ausmasse annehmen. Auch chronische Verläufe sind

nicht selten. Die Entstehung einer schweren akuten oder chronischen GvHD ist für einen grossen Teil der Morbidität und Mortalität nach allogener Stammzelltransplantation verantwortlich. GvHD und GvL-Effekt sind nicht obligat miteinander assoziiert. Viele Untersuchung im Mausmodell und auch in klinischen Studien belegen vielmehr die prinzi- pielle Möglichkeit einer dissoziierten Induzierbarkeit von GvL-Effekt und GvHD, die auf unterschiedlichen Immunant\, vorten (GvL : Th2/Tc2- Polarisierung ; GvHD : Th1/Tc1-Polarisierung ; zur Übersicht siehe Fowler und Cress 2000) und Apoptosemechanismen (GvL : Perforin-System ; GvHD : Fas-System ; Schmaltz et al. 2001) zu beruhen scheinen. Die Kontrolle und Stabilisierung der schmalen Balance zwischen GvL-Effekt und GvHD ist heute ein vorrangiges Ziel vieler Forschungsbemühungen im Bereich der hämatologischen Transplantationsimmunologie und- immunpathologie (als Obersichstartikel : Bordignon et al. S999).

Eine besondere Nutzung des GvL-Effektes ist der Einsatz von Spenderlymphozyten (donor lymphocyte infusion = DLI) zur Behandlung von Rezidiven einer chronischen myeloischen Leukämie (CML), einer aku- ten myeloischen Leukämie (AML), eines Multiplen Myeloms und eines NHL-Lymphoms (Kolb et al. 1990,1995 ; Porter et al. 1994 ; Tricot et al.

1996). Die Ansprechrate ist bei der Behandlung eines CML-Rezidives nach allogener Stammzelltransplantation mit einer Komplettremission bei bis zu 70% der mit DLI behandelten Patienten eindrucksvoll (Kolb et al.

1995) und deutlich höher als bei den anderen aufgeführten Anwendungen.

Doch scheinen immerhin auch ca. 20-30% der Patienten mit AML-Rezidiv nach allogener Stammzelltransplantation von Spenderlymphozytengaben zu profitieren (Kolb et al. 1995 ; Mehta et al. 1997).

Bei der Behandlung von Post-Transplantations-Rezidiven einer akuten lymphatischen Leukämie (ALL), wie sie vor allem bei Kindern und

Jugendlichen zu finden sind, spielen Spenderlymphozytengaben meistens nur in Einzelfallberichten eine positive Rolle (Lawson und Darbyshire 1998 ; Saw et al. 1997 ; Atra et al. 1997 ; Chang et al. 1998). Bei grösseren Fallzahlen scheint sich kein signifikant positiver Therapieeffekt von DLI bei der Behandlung von ALL-Rezidiven nach allogener Knochenmarktransplantation zu zeigen : In der Studie von Kolb et al.

(1995) konnten von 12 Patienten mit Post-Transplantations-Rezidiv einer ALL kein einziger durch alleinige Spenderlymphozytengaben in Remission gebracht werden, bei Mehta et al. (1997) war es ebenfalls nur einer von sechs Patienten. Doch scheint ein ALL-Rezidiv bei Kindern nach ailogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation durch prophylaktische Spenderlymphozytengaben in einer Vielzahl der Fälle abwendbar zu sein.

In einer Pilotstudie (Bader et al. 1999) wurden bei insgesamt 5 Kindern, die nach Transplantation aufgrund eines zunehmenden gemischten hämatologischen Chimärismus ein deutlich erhöhtes ALL-Rezidivrisiko aufwiesen (Bader et al. 2000), durch Reduktion der Immunsuppressiva und/oder Spenderlymphozytengaben erneut ein kompletter hämatologischer Chimärismus induziert. Drei der fünf Kinder blieben dauerhaft in Remission, bei zweien stellte sich mehrere Monate später ein Rezidiv ein. Bei Kindern mit erhöhtem MDS- (myelodysplastischen Syndrom-) und AML-Riskos bei zunehmenden gemischten Chimärismus zeigten sich ähnlich gute Behandlungszahlen. Die Fortführung dieser Pilotstudie als prospektive Multizenterstudie (Beck et al. 2001) bestätigte den therapeutischen Wert der DLI-Therapie zur Prävention eines Rezidives : In einer Gruppe von 43 Kindern mit ALL, AML oder MDS (myelodysplastischem Syndrom) und zunehmenden gemischten Chimärismus nach allogener Stammzelltransplantation wurden 24 Kinder prophylaktisch mit Spenderlymphozytengaben behandelt, 19 Kinder wurden dieser Immuntherapie nicht unterzogen. Elf der 24 prophylaktisch behandelten Kinder blieben in der Nachbeobachtungszeit rezidivfrei, dagegen nur eines der übrigen, nicht spezifisch vorbehandelten 19 Kinder.

Der prophylaktische Wert einer adoptiven Immuntherapie mit Spenderlymphozyten lässt sich eventuell auch auf ALL-Patienten mit einer minimalen Resterkrankung (minimal residual disease = MRD) vor Transplantation ausweiten. Patienten mit MRD haben ein signifikant erhöhtes Rezidivrisiko nach Transplantation (Bader et al. 2001). Gerade in der pädiatrischen Onkologie könnte also durch Monitoring von Prä-und Post-Transplantations-Risikofaktoren für ein ALL-Rezidiv Patientengruppen definiert werden, die von prophylaktischen Spenderlymphozytengaben profitieren würden.

Eine wichtige Voraussetzung für den erfolgsversprechenden therapeutischen und auch prophylaktischen Einsatz von Spenderlymphozyten bleibt die Anzahl der applizierten T-Zellen. Hier ist wiederum die Balance zwischen GvL-Effekt und GvHD-Induktion entscheidend. Bei niedrigen T-Zell-Dosen ist der gewünschte Therapie- oder Präventionseffekt nicht sicher gegeben. Bei einer höheren DLI-Dosis steigt dagegen das GvHD-Risko erheblich an. In der Regel erkranken ca.

50% der Patienten nach Spenderlymphozytengaben an einer mässiggradigen bis schweren GvHD (GvHD II°-IV° ; Kolb et al. 1995 ; Collins et al. 1997). Das Vorliegen einer schweren GvHD zieht in der Regel eine erneute Erhöhung der Immunsuppression mit sich. Das wiederum kann, wie von Bader et al. (1999) bei einem Einzelpatienten beschrieben, den präventiven Wert einer Spenderlymphozytengabe aufheben und damit das Auftreten eines Rezidivs erneut begünstigen.

Um eine möglichst grosse Zahl an Spenderlymphozyten für einen kurativen GvL-Effekt applizieren zu können, ohne dabei das Leben des Patienten durch eine nicht mehr kontrollierbare GvHD zu gefährden,

wurden von einigen Arbeitsgruppen die Spender-T-Zellen mit Suizidgenen transduziert. Suizidgene kodieren für Enzyme pro-oder eukaryontischen Ursprungs, die eine inerte Substanz ("prodrug") in eine zytotoxische Substanz bzw. einen aktiven Metaboliten überführen können. Die toxischen Metaboliten werden nur in den transduzierten Zellen gebildet und führen spezifisch zum Absterben dieser Zellen. Das bislang beim Menschen ausschliesslich verwandte Suizidgen ist das Gen für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk), die Nukleosidanaloga wie Ganciclovir und Acyclovir in zytotoxische Metabolite umwandeln kann (s. z. B. US 6,048, 525). Durch den in vitro-Gentransfer können mit den heutigen Vektorsystemen unter Anwendung spezifischer Transduktions- und Selektionsverfahren mehr als 99% aller Spenderlymphozyten mit HSV-tk erfolgreich transduziert werden. Sollte bei einem Patienten nach Transfusion solcher genetisch manipulierter Spenderlymphozyten eine schwere GvHD auftreten, so sollten die HSV-tk-positiven Effektorzellen der GvHD-Induktion durch eine Ganciclovir (GCV)-Behandlung abgetötet werden (s. z. B. US 6, 048, 525). Das Prinzip dieses Verfahrens ist in einigen klinischen Studien erfolgreich aufgezeigt worden (Bordignon et al.

1995 ; Bonini et al. 1997 ; Verzeletti et al. 1998 ; Tiberghien et al. 2001).

Doch nicht bei allen Patienten konnte eine GvHD erfolgreich behandelt werden. Dies wurde vor allem auf eine Vernichtung der genetisch modifizierten Lymphozyten durch eine Immunreaktion zurückgeführt, die wahrscheinlich gegen das nicht-humane Genprodukt, das HSV-TK- Protein, gerichtet ist (Verzeletti et al. 1998). Tiberghien und Mitarbeiter (2001) wollten in ihrer klinischen Studie diese Immunreaktion dadurch verhindern, dass die HSV-tk-transduzierten Spenderlymphozyten nicht erst einige Wochen nach Stammzelltransplantation (z. B. im Rezidivfall einer CML), sondern prophylaktisch parallel mit der Gabe von T-Zell- depletierten Transplantaten infundiert wurden. Hierdurch sollte eine

Toleranz der neugebildeten T-Zellen gegenüber dem HSV-TK Protein induziert werden. Tatsächlich lag trotz der vorliegenden in vitro- Manipulation der T-Zellen die GvHD-Rate mit ca. 25% in der Grössenordnung, wie sie auch bei Gabe von nichtmanipulierten Spenderlymphozyten zu erwarten ist. Ob jedoch nicht trotzdem eine partielle Inaktivierung der Spenderlymphozyten durch zytotoxische Immunreaktionen gegen die HSV-Thymidinkinase stattfand, kann nicht ausgeschlossen werden. Zumindestens konnte auch in der Studie von Tiberghien et al. (2001) in einem Patienten die durch DLI induzierte GvHD nicht allein durch Ganciclovir-Gaben eingedämmt werden. Erst die zusätzliche Corticosteroidgabe brachte den gewünschten klinischen Erfolg.

Eine offensichtliche Ganciclovir-Resistenz der genetisch modifizierten Lymphozyten ist ebenfalls schon in Vorläuferstudien beobachtet worden (Bonini und Bordignon 1997). Neben der immunologischen Inaktivierung wird auch ein genetisch bedingter Funktionsverlust des HSV-tk-Genes angenommen. Garin et al. (2001) konnten nachweisen, dass Spenderlymphozyten nicht selten aufgrund bestimmter Splice-Varianten mit einem fünktionsuntüchtigen HSV-tk-Gen transduziert werden, das eine 200 Basenpaare umfassende Deletion zeigt.

Weiterhin ist es durchaus auch möglich, dass durch Abschalten der viralen Promotoren ("silencing"), die die HSV-tk-Expression steuern, Ganciclovir- Resistenzen entstehen. Man weiss aus Langzeitexpressionsstudien, dass der 5 LTR-Promotor retroviraler Vektoren in Säugetierzellen sehr oft inaktiviert wird (Hoeben et al. 1991).

Eine partielle Ganciclovirresistenz bei der Behandlung einer chronischen GvHD wurde von Verzeletti et ai. (1998) auch auf die proliferationsabhängige Wirkunsgweise des HSV-tk/Ganciclovir-Systems zurückgeführt. Eine geringe Proliferationsaktivität der T-Zellen, wie sie bei einer chronischen GvHD vorliegen kann, reicht eventuell nicht aus, um eine effektive Zytotoxizität mit GCV auszulösen.

Zuguterletzt können natürlich auch rein pharmakologisch bedingte Resistenzen gegenüber Ganciclovir zu einer Abschwächung des Zytotoxizitätseffekts führen. Hier ist z. B. an Inaktivierungsereignisse in nachgeschalteten Signalkaskaden des Zytotoxizitäts-bzw.

Apoptosemechanismus zu denken.

Zusammengefasst ergeben sich also die folgenden nachgewiesenen und vermuteten Inaktivierungsmechanismen des HSV-tk/Ganciclovirsystems in Spenderlymphozyten : 1) Immunologische Eliminierung der T-Zellen durch Immunisierung gegenüber dem HSV-TK-Protein 2) Genetische Inaktivierung durch Mutation/Deletion im HSV-tk-Gen 3) Genetische Inaktivierung durch Promotor-Silencing 4) Funktionelle Ineffektivität durch unzureichende Zellzyklusprogression 5) Pharmakologische Resistenz durch Inaktivierung auf der Ebene nachgeschalteter Zytotoxizitätsmechanismen Diese Inaktivierungsmechanismen stellen einen deutlichen Nachteil des HSV-tk/Ganciclovirsystems, also des Standes der Technik, dar, so daß die notwendige biologische Sicherheit bei Anwendung von

Spenderlymphozyten nicht zufriedenstellend gewährleistet ist. Somit besteht ein Bedarf nach Alternativen und Verbesserungen. Es ist daher Aufgabe der im folgenden beschriebenen Erfindung, neue Suizidgenstrategien zu entwickeln, die den unterschiedlichen Nachteilen des HSV-tk/GCV-Systems bei der Anwendung in Spender-T-Zellen Rechnung tragen sollen. Die möglichen Einschränkungen 1,4 und 5, wie sie der obigen Liste vermuteter Inaktivierungsmechanismen des HSV- tk/Ganciclovirsystems in Spenderlymphozyten zu entnehmen sind, sollen durch die Wahl a ! ternativer Suizidgensysteme überwunden werden.

Zusätzlich wird auch den Einschränkungen 2 und 3 durch ein verändertes Vektordesign möglichst überwunden. Dabei wurden die folgenen Anforderungen der Lösungssuche zugrundegelegt : 1) Zur schnellen und effektiven Verhinderung und Behandlung einer lebensgefährlichen GvHD müssen die Spenderlymphozyten durch das Suizidgensystem zuverlässig und schnell abgetötet werden.

2) Die Substanz, die verwendet wird, soll wenig toxisch sein für die übrigen Körperzellen.

3) Das Suizidgensystem soll eine möglichst geringe Eigenimmunität aufweisen.

Daher ist Gegenstand der Erfindung ein DNA-Abschnitt enthaltend eine erste Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und eine zweite Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs) kodiert.

Ebenso ist Gegenstand der Erfindung ein viraler Vektor enthaltend eine erste Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und eine zweite Sequenz, die für das Cytochrom P450

Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs) kodiert.

Auch ist Gegenstand der Erfindung ein retroviraler Vektor enthaltend eine erste Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und eine zweite Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs) kodiert.

Für alle diese Gegenstände der Erfindung, den erfindungsgemäßen DNA- Abschnitt, den erfindungsgemäßen viralen Vektor oder den erfindungsgemäßen retroviralen Vektor gilt, daß dieser mindestens zwei Promotoren, von denen vorzugsweise einer, insbesondere beide, eukaryontischen Ursprungs ist/sind, und/oder mindestens ein Selektions- oder Reportergen bzw. selektierbares Markergen enthält, und/oder die zweite Sequenz für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert.

Die zentrale Lösung dieser Erfindung ist die Wahl des cyp4B1 als Element hier günstiger Suizidgensysteme, insbesondere in Kombination mit dem bereits bekannten HSV-tk/Ganciclovir (GCV)-System. Als Alternativen lagen neben dem HSV-tk/GCV-System noch mindestens 12 weitere Enzymgensysteme mit ihren Substraten vor (Aghi et al. 2000). Als einziges System neben HSV-tk/GCV ist das E. coli Cytosindeaminase <BR> <BR> (cd)/5-Fluorcytosin (5FC) -System (Mullen et al. 1994) bereits in klinischen Tumorgentherapiestudien erprobt (Crystal et al. 1997 ; Pandha et al. 1999 ; Harvey et al. 1999). Das hätte dieses System empfohlen. Es stellte sich aber überraschend heraus, daß das aus dem Kaninchen stammende <BR> <BR> Cytochrom P450 4B1 (cyp4B1) -System (Rainov et al. 1998a) wie auch das System mit menschlicher Folylpolyglutamatsynthetase (fpgs) (Aghi et al. 1999a, b) hier am geeignetsten war.

Das cyp4B1-System kann zwei chemisch verschiedene Substanzen aktivieren, 4-Ipomeanol (41P0) und 2-Aminoanthracen (2AA). 41P0 ist, in höherer Dosierung eingesetzt, ein in klinischen Phase 1-Studien getestetes Chemotherapeutikum (Rowinsky et al. 1993 ; Kastun et al. 1998). Die cyp4B1/41P0-und cyp4B1/2AA-Systeme sind bereits als eine Möglichkeit der Krebstherapie beschrieben (s. z. B. W099/05299 der University of Boston, USA). Die cyp4B1/41P0-und cyp4B1/2AA-Systeme wurden in bezug auf Toxizitätsprofil und-kinetik und auf den Bystander effect"hin in Rattengliomzellen näher charakterisiert. Hierbei zeigte sich überraschenderweise, dass cyp4B1-transduzierte Zellen sowohl mit 2AA als auch 41P0 wesentlich schneller abgetötet werden als HSV-tk- exprimierende Zellen, die mit GCV inkubiert werden. Schon kurze Inkubationszeiten von 15-30 min Behandlung mit 2AA oder 41P0 bewirken eine signifikante Zytotoxizität im cyp4B1-System. Nach Behandlung von infizierten Lymphozyten mit unterschiedlichen Wirkkonzentrationen von 41P0 zeigt sich, dass mit höheren Dosen von 41P0 bereits nach eintägiger Behandlung nur noch 20-30% der ursprünglich über 80% cyp4B1/egfp- transduzierten Zellen leben.

Dabei ist der auch bei grosser Zelldichte minimale oder gar fehlende nBystander effect"ein großer Vorteil des Suizidgensystems mit cyp4B1.

Dieser stark ausgeprägte Bystander effect", also das Phänomen, dass auch nichttransduzierte Zellen in unmittelbarer Nachbarschaft der transduzierten Zellen von den toxischen Metaboliten der aktivierten Prodrug geschädigten werden (Moolten und Wells 1990), ist hingegen eine deutliche Limitierung des HSV-tk-Systems. So sind in der Zellkultur nur 10% HSV-tk-positive Zellen notwendig, um die gesamte Zellpopulation durch eine für nichttransduzierte Zellen untoxische Ganciclovirbehandlung abzutöten. Voraussetzung hierfür ist aber ein enger Zell-zu-Zell-Kontakt.

Unter ähnlichen Zellkulturbedingungen mit engen interzellulären Kontakten zeigte sich dagegen im cyp4B1-System unter 2-M nur ein schwacher, unter 41P0 sogar gar kein"Bystander effect". Eine Behandlung mit dem cyp4B1/41PO-System zeigt ein großes therapeutisches Fenster in menschlichen Lymphozyten. Während unter Behandlung mit 50 pg/ml 41PO die transduzierten Zellen innerhalb der ersten zwei Tage absterben, weisen die nichtinfizierten und die infizierten, aber nichttransduzierten Zellen keine signifikante Zytotoxizität im Vergleich zu unbehandelten Lymphozyten auf.

Insgesamt erfüllt also das cyp4B1/IPO-System wesentliche Anforderungen für die Verwendung in Spenderlymphozyten : die schnelle Wirksamkeit und eine geringe Toxizität auf nichttransduzierte Zellen, erkennbar an dem geringen bzw. fehlenden"Bystander effect". Dazu kommt die eukaryontische Herkunft mit einer daraus folgenden geringeren Immunität als bei den Suizidgensystem viraler oder bakterieller Herkunft.

Es liegen außerdem erste vorläufige Ergebnisse mit menschlichen T- Lymphozyten vor, die zu beweisen scheinen, daß die in Rattengliomzellen gefundenen Ergebnisse auf humane Lymphozyten übertragen werden können (s. Beispiele).

Bezüglich der Transfektionrate konnten nach retroviraler Infektion auf Fibronectin mit einem Transduktionsprotokoll gemäß Hanenberg et al.

1996 ; Hanenberg et al. 1997 und Pollok et al. 1998 in initialen Versuchen auch ohne weitere Selektion mehr als 80% der menschlichen T-Zellen mit einem cyp4B1-egfp-Fusionsgen transduziert werden. Damit liegt das erreichte Transduktionsergebnis deutlich über den in der Literatur vorbeschriebenen Transduktionseffizienzen ohne Selektionsverfahren von

10-50% (Di lanni et al. 1999 ; Movassagh et al. 2000 ; Maddens et al.

2000). Durch dieses gute Ergebnis nach alleiniger Infektion ergibt sich eine gute Ausgangssituation, um durch anschliessende Selektion die Gesamttransduktionsrate auf nahezu 100% zu steigern und damit das Risiko einer unkontrollierten GvHD durch initial nichttransduzierte Lymphozyten nahezu auszuschliessen.

Das zweite neue System, das fpgs-System, ist kein Suizidgensystem im eigentlichen Sinne. Es aktiviert nämlich keine unwirksame Vorläufer- substanz. Vielmehr verstärkt dieses Gen die Wirkung des an sich schon potenten Chemotherapeutikums Methotrexat (MTX), indem es seine intrazelluläre Verweildauer verlängert. So konnte durch Transfer des fpgs- Genes im Rattenhirntumormodell die tumorwirksame Methotrexatdosis abgesenkt und damit die Nebenwirkungsrate auf normale Körperzellen verringert werden (Aghi et al. 1999a). Auch das fpgs/MTX-System zeigt keinen"Bystander effect"und verspricht aufgrund seiner menschlichen Herkunft deutlich verringerte Eigenimmunität. Niedrigdosiertes MTX wird bereits in der klinischen Routine zur GvHD-Prophylaxe nach allogener Stammzelltransplantation eingesetzt. Die Wirksamkeit von MTX auf T- Zellen zur Unterdrückung einer GvHD ist damit erwiesen.

Besonders bevorzugt und daher im Zentrum dieser Erfindung stehend ist die Kombination von zwei Suizidgensystemen. Diese Kombination mehrerer Suizidgensysteme, also des bekannten HSV-tk-Systems mit dem cyp4B1-oder fpgs-System, hat sich als vorteilhaft für die biologische Sicherung von Spenderlymphozyten herausgestellt, da sie dem bereits beschriebenen genetischen Mechanismen der Systeminaktivierung effektiv entgegenwirken kann. Durch die Verwendung von zwei Suizidgenen, insbesondere solcher, die unter der Kontrolle von unabhängigen Promotoren stehen, wird das Risiko einer Inaktivierung

durch Mutation/Deletion des Suizidgens oder durch Abschalten der Promotoraktivität erheblich reduziert : Bei Inaktivierung des einen Suizidgenes greift nämlich immer noch das zweite Gen. Die gleichzeitige Inaktivierung beider Systeme kann in diesem Zusammenhang als relativ unwahrscheinliches Ereignis angesehen werden, zumindestens um ein Vielfaches unwahrscheinlicher als die Inaktivierung eines Einzelsystems.

Die Kombination unterschiedlicher Suizidgensysteme wirkt zusätzlich auch der Entwicklung pharmakologischer Resistenzen entgegen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen retroviralen Vektors gilt daher, daß der Promotor, unter dessen Kontrolle die Expression der ersten Sequenz erfolgt, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, sich von dem Promotor unterscheidet unter dessen Kontrolle die Expression der zweiten Sequenz erfolgt, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs) kodiert.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen retroviralen Vektors gilt, daß der Vektor neben der ersten Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und der zweiten Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs) kodiert, folgende Funktonselemente enthält : a) einen 5'-LTR und einen 3'-LTR vorzugsweise von einem Retrovirus, b) mindestens einen, vorzugsweise zwei, Promotoren, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus : SV40-Promotor, 5'- LTR mit Promotor-Funktion, CD25-Promotor und CD69-Promotor, vorzugsweise 5'-LTR mit Promotor-Funktion, CD25-Promotor und CD69-Promotor ;

c) mindestens ein Selektions-oder Reportergen, bzw. selektierbares Markergen ausgewählt aus : dem vorzugsweise trunkierten Gen für den humanen"low affinity NGF Rezeptor" (LNGFR) und/oder dem vorzugsweise trunkierten humanen CD34-Gen (CD34), d) mindestens ein retrovirales Verpackungssignal (ni) und e) gegebenfalls ein IRES-Element (IRES) mit dem die Expression des Selektions-oder Reportergens, bzw. selektierbares Markergens an die Expression der ersten oder zweiten Sequenz gekoppelt ist.

Gerade die CD25-und CD69-Promotoren bieten sich zur möglichen Verminderung der Immunogenität an, da sie spezifisch für aktivierte T- Zellen sind, z. B. der CD69-Promotor der Promotor für das T-Zell- Aktivierungsantigen CD69 ist oder der CD25-Promotor der Promotor für die kurze Kette des IL-2-Rezeptors ist. Bei Verwendung solcher Promotoren z. B zur HSV-tk-Expression wäre die Expression des Suizidgenes mit der T-Zell-Aktivierung assoziiert. Eine verminderte Expression des Fremdproteins im nichtaktivierten Zustand der T-Zellen senkt so die Wahrscheinlichkeit einer Immunisierung. Ausserdem wird so ein viraler Promotor durch einen humanen Promotor ersetzt, was das Risiko einer Promotorinaktivierung reduziert.

Weiter ist es günstig, die Expression eines der Suizidgene über ein IRES- Element mit der Expression des trunkierten humanen CD34-Gens gekoppelt. Diese Koppelung bietet Vorteile. Das CD34-Antigen ist humanen Ursprungs und markiert hämatopoetische Progenitorzellen, aber keine reifen T-Zellen. Es existieren klinisch zugelassene, kommerziell erhältliche Selektionskits (z. B. von Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach), über die CD-34-positive Zellen mittels Microbeads selektioniert und angereichert werden können. Das gilt auch für an sich CD-34-negative reife T-Zellen, die durch retrovirale Transduktion das CD34-Antigen

exprimieren. Der humane Ursprung dieses Selektions-und Reportergens schliesst eine Immunisierung gegen dieses zusätzliche genetische Material weitgehend aus. Außerdem ist die cDNA für das humane CD34- Antigen z. B. von ATCC, Manassas, USA, kommerziell erhältlich. Das zweite neben CD34 günstige Selektions-und Reportergen ist das trunkierte Gen für den humanen low affinity NGF Rezeptor (=LNGFR).

Dieses Gen wurde bereits als Selektionsmarker in den klinischen Studien der Gruppe um Claudio Bordignon, Mailand, Italien, mit dem HSV-tk/GCV- System in DLIs erfolgreich eingesetzt. Die Selektion erfolg. wie bei CD34 über das MACS-System unter Vermittlung eines spezifischen Antikörpers.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen retroviralen Vektors gilt, daß es sich um einen Maus Leukämie Virus- (murine leucemia virus/MuLV)-Vektor handelt, vorzugsweise mit einer der folgenden Abfolgen der Funktionselemente : 5'-LTR-v-cyp4B1-IRES-CD34-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,<BR > 5'-LTR-v-fpgs-IRES-CD34-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,<BR&g t; 5'-LTR-v-fpgs-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,<BR& gt; 5'-LTR-v-cyp4B1-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,<B R> 5'-LTR-v-HSV-tk-IRES-CD34-CD69-Promotor-cyp4B1-3'-LTR,<BR > 5'-LTR-v-HSV-tk-IRES-CD34-CD69-Promotor-fpgs-3'-LTR,<BR&g t; 5'-LTR--HSV-tk-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-cyp4B1-3'-LTR oder 5'-LTR-v-HSV-tk-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-fpgs-3'-LTR.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines infektiösen Retroviruspartikels, in dem a) eine Retrovirus-Verpackungszelle mit einem erfindungsgemäßen retroviralen Plasmid-Vektor transfiziert wird,

b) die Retrovirus-Verpackungszelle in einem geeigneten Medium in vitro und/oder in vivo so kultiviert wird, daß infektiöse Retroviruspartikel gebildet werden.

Unter infektiösen Partikeln sind insbesondere verpackte retrovirale Vektoren in Envelope-Proteinen zu verstehen. Es bieten sich hier die Verpackungszellinien PA3 17 und AMIZ mit dem amphotropen MuLV-env- Protein und pgl3 mit dem GALV (gibbon ape leukemia virus) -env-Protein an. Diese Verpackungszellinien werden alle für die Herstellung klinischer Vektoren genutzt.

Daher ist es besonders bevorzugt, wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Retrovirus-Verpackungszelle einer Zellinie ausgewählt aus den Verpackungszellinien PA317 und AMIZ mit dem amphotropen MuLV- env-Protein und pg13 mit dem GALV (gibbon ape leukemia virus) -env- Protein entstammt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein infektiöses Partikel, das durch das voranstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Wirtszelle enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen DNA-Abschnitt, erfindungsgemäßen viralen Vektor, erfindungsgemäßen retroviralen Vektor und/oder erfindungsgemäßes infektiöses Partikel.

Dabei kann es sich prinzipiell um jede Art von pro-oder eukaryontischer Zelle handeln. Bevorzugt ist allerdings eine Säugetierzelle, insbesondere eine humane Zelle. Es ist besonders bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Wirtszelle eine-vorzugsweise humane- Lymphozytenzelle ist.

Ein weiterer Gegenstand der Anmeldung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, worin die Zelle mit einem ersten und einem zweiten erfindungsgemäßen retroviralen Vektor in Form eines erfindungsgemäßen infektiösen Partikels transfiziert wird, wobei der erste und der zweite erfindungsgemäße retrovirale Vektor gleich oder unterschiedlich sein können, wobei gilt, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen infektiösen Partikel Retrovirus-Verpackungszellen unterschiedliche Zellinie mit unterschiedlichen Verpackungsproteinen verwendet werden.

Die simultane Infektion (Kotransduktion) mit zwei verschiedenen oder gleichen (Kombinations) vektoren hat bedeutende Vorteile. Die Verwendung von zwei gleichen Kombinationsvektoren hat den Vorteil, dass durch die Doppelinfektion eine höhere Expression der jeweiligen Suizidgene erreicht werden kann und eine stärkere Suizidgenexpression bedeutet auch eine höhere Wirksamkeit der biologischen Sicherungssysteme. Die Kotransduktion von Lymphozyten mit unterschiedlichen Kombinationsvektoren eröffnet wiederum die Möglichkeit, dass statt einer einzelnen Zweier-Suizidgenkombination zwei verschiedene Suizidgenkombinationen parallel eingesetzt werden können.

So kann bei nicht ansprechender Behandlung einer floriden GvHD mit der ersten Suizidgenkombination in einfacher Weise auf die zweite Kombination gewechselt werden, um doch noch eine wirksame GvHD- Kontrolle zu erreichen.

Grundvoraussetzung für die Simultaninfektion von Lymphozyten mit zwei retroviralen Vektoren ist jedoch, dass beide retroviralen Vektoren von unterschiedlichen Verpackungzellinien mit unterschiedlichen Envelope- Proteinen generiert und verpackt werden. In einer früheren Arbeit

(MacNeill et al. 1999) wurde gezeigt, dass bei Verpackung von verschiedenen retroviralen Vektoren mit unterschiedlichen Envelope- Proteinen keine negativen Interferenzen bei der Transduktion der gleichen Zellpopulation auftreten. Es bieten sich für die hier vorgestellten Kombinationsvektoren die klinisch genutzten Verpackungszellinien PA317 und AMIZ mit dem amphotropen MuLV-env-Protein und pg13 mit dem GALV (gibbon ape leukemia virus) -env-Protein an.

Weiterhin bietet sich an, dass die beiden verschiedenen Kombinationsvektoren mit unterschiedlichen Selektions-bzw.

Reportergenen ausgestattet werden. So kann bei Kotransduktion auf zweifache Weise selektioniert werden, was der Gesamttransduktionseffizienz sicherlich zugute kommt. Ausserdem kann die Verteilung der Vektoren in der transduzierten Lymphozytenpopulation für jeden Einzelvektor getrennt, aber auch in Kombination per FACS visualisiert werden. Neben CD34 kommt das LNGFR in Frage.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine doppeltmarkierte Zelle enthaltend eine erste DNA-Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und in einem separaten Molekül eine zweite DNA-Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs), vorzugsweise cyp4B1, kodiert, jeweils in Form eines DNA-Abschnitts, eines viralen Vektors, eines retroviralen Vektors und/oder eines infektiösen Partikel und/oder enthaltend zum einen rekombinant exprimierte HSV-tk und zum anderen rekombinant exprimierte/s cyp4B1 oder fpgs, vorzugsweise cyp4B1.

Dabei kann es sich prinzipiell um jede Art von pro-oder eukaryontischer Zelle handeln. Bevorzugt ist allerdings eine Säugetierzelle, insbesondere eine humane Zelle. Es ist besonders bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße doppeltmarkierte Zelle eine-vorzugsweise humane- Lymphozytenzelle ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen doppeltmarkierten Zelle, worin die Zelle mit einem ersten und einem zweiten erfindungsgemäßen retroviralen Vektor in Form eines erfindungsgemäßen infektiösen Partikels transfiziert wird, wobei der erste und der zweite erfindungsgemäße retrovirale Vektor gleich oder unterschiedlich sein können, wobei gilt, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen infektiösen Partikel Retrovirus-Verpackungszellen unterschiedliche Zellinie mit unterschiedlichen Verpackungsproteinen verwendet werden, oder die Zelle mit einem ersten retroviralen Vektor enthaltend eine erste DNA- Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und mit einem zweiten retroviralen Vektor enthaltend eine zweite DNA-Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs), vorzugsweise cyp4B1, kodiert, jeweils in Form eines infektiösen Partikels transfiziert wird, wobei gilt, daß beim Verfahren zur Herstellung der infektiösen Partikel Retrovirus-Verpackungszellen unterschiedlicher Zellinie mit unterschiedlichen Verpackungsproteinen verwendet werden.

Die simultane Infektion (Kotransduktion) mit zwei verschiedenen oder gleichen Vektoren hat bedeutende Vorteile. Die Verwendung von zwei gleichen Kombinationsvektoren hat den Vorteil, dass durch die Doppelinfektion eine höhere Expression der jeweiligen Suizidgene erreicht

werden kann und eine stärkere Suizidgenexpression bedeutet auch eine höhere Wirksamkeit der biologischen Sicherungssysteme. Die Kotransduktion von Lymphozyten mit unterschiedlichen Kombinationsvektoren eröffnet wiederum die Möglichkeit, dass statt einer einzelnen Zweier-Suizidgenkombination zwei verschiedene Suizidgenkombinationen parallel eingesetzt werden können. So kann bei nicht ansprechender Behandlung einer floriden GvHD mit der ersten Suizidgenkombination in einfacher Weise auf die zweite Kombination ge- wechselt werden, um doch noch eine wirksame GvHD-Kontrolle zu erreichen.

Grundvoraussetzung für die Simultaninfektion von Lymphozyten mit zwei retroviralen Vektoren ist jedoch, dass beide retroviralen Vektoren von unterschiedlichen Verpackungzellinien mit unterschiedlichen Envelope- Proteinen generiert und verpackt werden. In einer früheren Arbeit (MacNeill et al. 1999) wurde gezeigt, dass bei Verpackung von verschiedenen retroviralen Vektoren mit unterschiedlichen Envelope- Proteinen keine negativen Interferenzen bei der Transduktion der gleichen Zellpopulation auftreten. Es bieten sich für die hier vorgestellten Kombinationsvektoren die klinisch genutzten Verpackungszellinien PA317 und AMIZ mit dem amphotropen MuLV-env-Protein und pg13 mit dem GALV (gibbon ape leukemia virus) -env-Protein an.

Weiterhin bietet sich an, dass die beiden verschiedenen Kombinationsvektoren mit unterschiedlichen Selektions-bzw.

Reportergenen ausgestattet werden. So kann bei Kotransduktion auf zweifache Weise selektioniert werden, was der Gesamttransduktionseffizienz zugute kommt. Ausserdem kann die Verteilung der Vektoren in der transduzierten Lymphozytenpopulation für

jeden Einzelvektor getrennt, aber auch in Kombination per FACS visualisiert werden. Neben CD34 kommt das LNGFR in Frage.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein humaner Lymphozyt enthaltend mindestens einen DNA-Abschnitt, einen viralen Vektor, einen retroviralen Vektor und/oder ein infektiöses Partikel, der oder das jeweils eine DNA-Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert, und/oderenthaltend rekombinantexprimiertes cyp4B1.

Insbesondere für therapeutische Zwecke kommen vorgenannt transfi- zierte Spenderlymphozyten in Betracht.

Gerade dieser Lymphozyt ist ein Kem dieser Erfindung, da dieser durch den geringen Bystander-Effekt" kombiniert mit der Effektivität des Cyp4B1 der ideale, sichere Spenderlymphozyt für eine DU ist mit geeignetem Suizidgensystem ist, da notfalls 41PO und eingesetzt werden können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel enthaltend mindestens ein/einen erfindungsgemäßen DNA-Abschnitt, erfindungsgemäßen viralen Vektor, erfindungsgemäßen retroviralen Vektor, erfindungsgemäßes infektiöses Partikel, erfindungsgemäße Wirtszelle, erfindungsgemäße doppeltmarkierte Zelle und/oder erfindungsgemäßen humanen Lymphozyten und gegebenenfalls mindestens einen pharmazeutisch kompatiblen Hilfs-und/oder Trägerstoff.

Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Arzneimittel als flüssige oder feste Arzneiformen insbesondere in Form von Injektionslösungen Tabletten, Kapseln oder Dragees verabreicht werden. Bevorzugt ist aber entweder der Einsatz als Therapeutikum in der Gentherapie, insbesondere der In-vitro Gentherapie, bei der Zellen außerhalb des Körpers vor dem therapeutischen Einsatz transfiziert werden, oder der Einsatz in geeigneter Form pharmzeutisch zubereiteter erfindungsgemäßer Zellen, die implantiert oder in anderer Form appliziert werden. Geeignete Hilfs- und/oder Trägerstoffe sind z. B. Lösungs-oder Verdünnungsmittel,

Stabilisatoren, Suspensionsvermittler, Nährlösungen oder-stoffe, Transfektionshilfsmittel, Salze, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, sowie Farbstoffe, Füllstoffe, und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel parenteral, intravasal, intravenös, intraperitoneal oder intramuskulär appliziert werden soll. Für alle parenteralen Applikationen eignen sich Zubereitungen in Form von Suspensionen und Lösungen sowie leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung a) eines erfindungsgemäßen DNA-Abschnitts, eines erfindungsgemäßen viralen Vektors, eines erfindungsgemäßen retroviralen Vektors, eines erfindungsgemäßen infektiösen Partikel, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, einer erfindungsgemäßen doppeltmarkierten Zelle, eines erfindungsgemäßen humanen Lymphozyten und/oder eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, b) eines DNA-Abschnitts, eines viralen Vektors, eines retroviralen Vektors und/oder eines infektiösen Partikel, der oder das jeweils eine DNA-Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert ; einer Zelle enthaltend mindestens einen DNA-Abschnitt, einen viralen Vektor, einen retroviralen Vektor und/oder ein infektiöses Partikel, der oder das jeweils eine DNA- Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert ; einer Zelle enthaltend rekombinant exprimiertes cyp4B1 ; und/oder des Enzyms cyp4B1, c) von 4-lpomeanol (41PO), 2-Aminoanthracen (2AA), Methotrexat (MTX) und/oder einer Kombination von 4-Ipomeanol (41P0), 2- Aminoanthracen (2AA) oder Methotrexat (MTX) mit Ganciclovir

(GCV), vorzugsweise zusammen mit einem Gegenstand aus den Gruppen a) und/oder b), zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von bzw. zur Behandlung von Leukämie, insbesondere der chronischen oder akuten myeloischen Leukämie (CML oder AML) sowie der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) wie auch des myelodysplastischen Syndroms (MDS), des Multiplen Myeloms und des NHL-Lymphoms, und/oder zur Behandlung von oder Prophylaxe gegen Graft versus Host-Reaktionen, insbesondere nach Applikation von Spenderlymphozyten.

Generell gilt im Rahmen dieser Erfindung, daß die Verwendung eines Gegenstands zur Behandlung einer Krankheit oder Prophylaxe gegen diese Krankheit auch als Verwendung dieses Gegenstands zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung dieser Krankheit oder Prophylaxe gegen diese Krankheit verstanden werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung a) eines DNA-Abschnitts, eines viralen Vektors, eines retroviralen Vektors und/oder eines infektiösen Partikel, der oder das jeweils eine DNA-Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert ; einer Zelle enthaltend mindestens einen DNA-Abschnitt, einen viralen Vektor, einen retroviralen Vektor und/oder ein infektiöses Partikel, der oder das jeweils eine DNA- Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert ; einer Zelle enthaltend rekombinant exprimiertes cyp4B1 ; und/oder des Enzyms cyp4B1, b) von 4-Ipomeanol (41P0) und/oder von 2-Aminoanthracen (2AA), vorzugsweise zusammen mit einem Gegenstand aus der Gruppe a)

in Kombination mit Reportergenen für klinische Genmarkierungsexperimente, in Kombination mit therapeutischen Genen in therapeutischen Gen-Ersatz-Ansätzen, zur Umwandlung von Donor-Lymphozyten für die Leukämie Rezidiv-Prophylaxe und zur Behandlung nach allogenetischer Knochenmarkstransplantation (allo-BMT).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung a) eines erfindungsgemäßen DNA-Abschnitts, eines erfindungsgemäßen viralen Vektors, eines erfindungsgemäßen retroviralen Vektors, eines erfindungsgemäßen infektiösen Partikel, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, einer erfindungsgemäßen doppeltmarkierten Zelle, eines erfindungsgemäßen humanen Lymphozyten und/oder eines erfindungsgemäßen Arzneimittels oder b) von 4-Ipomeanol (41PO), 2-Aminoanthracen (2AA), Methotrexat (MTX) und/oder einer Kombination von 4-Ipomeanol (41P0), 2- Aminoanthracen (2AA) oder Methotrexat (MTX) mit Ganciclovir (GCV) zusammen mit einem Gegenstand aus der Gruppe a) in der Gentherapie. Dabei kann es sich um In-Vivo-oder In-vitro- Gentherapie handeln. Besonders bevorzugt ist hier die In-vitro Gentherapie, bei der Zellen außerhalb des Körpers vor dem therapeutischen Einsatz transfiziert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Behandlungsverfahren, bei dem einem Menschen oder Tier, das eine solche Behandlung benötigt, in geeigneter Form ein erfindungsgemäßes Arzneimittel appliziert wird.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Behandlungsverfahren zur Behandlung von Leukämie, insbesondere der chronischen oder akuten myeloischen Leukämie (CML oder AML) sowie der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) wie auch des myelodysplastischen Syndroms (MDS), des Multiplen Myeloms und des NHL-Lymphoms, und/oder zur Behandlung von oder Prophylaxe gegen Graft versus Host-Reaktionen, insbesondere nach Applikation von Spenderlymphozyten, bei dem in einem ersten Schritt a) entweder eine erfindungsgemäßen Wirtszelle, eine erfindungsgemäße doppeltmarkierte Zelle, ein erfindungsgemäßer humaner Lymphozyt, eine Zelle enthaltend mindestens einen DNA-Abschnitt, einen viralen Vektor, einen retroviralen Vektor und/oder ein infektiöses Partikel, der oder das jeweils eine DNA-Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert ; oder eine Zelle enthaltend rekombinant exprimiertes cyp4B1 nach den üblichen Methoden hergestellt werden, oder Spenderlymphozyten mit einem erfindungsgemäßen DNA-Abschnitt, einem erfindungsgemäßen viralen Vektor, einem erfindungsgemäßen retroviralen Vektor, einem erfindungsgemäßen infektiösen Partikel oder mit einem DNA-Abschnitt, viralen Vektor, retroviralen Vektor und/oder infektiösen Partikel, der oder das jeweils eine DNA-Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert, (möglichst vollständig) transfiziert werden, diese dann dem Patienten in einem zweiten Schritt b) appliziert werden, und gegebenenfalls in einem dritten Schritt c), falls schwerwiegende Graft versus Host-Reaktionen dies notwendig erscheinen lassen, dem Patienten 4-Ipomeanol (41PO), 2-Aminoanthracen (2AA), Methotrexat (MTX) und/oder einer Kombination von 4-Ipomeanol (41PO), 2- Aminoanthracen (2AA) oder Methotrexat (MTX) mit Ganciclovir (GCV), in

geeigneter pharmazeutischer Zubereitung und geeigneter Dosis und Form appliziert werden, um die in Schritt b) applizierten Zellen wieder abzutöten.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn das verwendete Suizidgensystem mindestens Cyp4B1 umfaßt bzw. Zellen eigesetzt werden, die mit Sequenzen transfiziert wurden, die für Cyp4B1 kodieren, oder rekombinant exprimiertes Cyp4B1 enthalten. Ebenfalls vorteilhaft ist dann der differenzierte Einsatz der zu aktivierenden Wirkstoffe 41PO und 2AA in einem Therapieschema, das ihre Wirkungsunterschiede und Vorteile berücksichtigt, also die schnellere und stärkere Wirkung von 2AA auf der einen und der fehlende Bystander-Effekt von 41PO auf der anderen Seite.

Ein Beispiel wäre bei einer starken Graft-versus-Host-Reaktionen nach Applikation von mit Cyp4B1 transfiziertenSpenderlymphozyten der sofortige Einsatz von 2AA, um möglichst effektiv und schnell die Symptome zu bekämpfen, gefolgt von einer langfristigeren Behandlung mit 41PO, um eine vollständige Abtötung der Spenderlymphozyten zu erreichen, -aber ohne Schädigung des restlichen Gewebes.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Behandlungsmethode mittels eines Suizidgensystems mit Cyp4B1 zur Behandlung von Krebsarten, bei denen ein nBystander Effekt"langfristig nicht erwünscht ist, in denen explizit cyp4B1 in Kombination mit 2AA und insbesondere mit 41PO eingesetzt wird. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die zu aktivierenden Wirkstoffe 41PO und 2AA differenziert in einem Therapieschema eingesetzt werden, das ihre Wirkungsunterschiede und Vorteile berücksichtigt, also die schnellere und stärkere Wirkung von 2AA auf der einen und der fehlende Bystander-Effekt von 41PO auf der anderen Seite. Ein Beispiel wäre der frühe Einsatz von 2AA, um möglichst effektiv und schnell die Krebszellen zu bekämpfen, gefolgt von einer langfristigeren Behandlung mit 41PO, um eine vollständige Abtötung der Krebszellen ohne Schädigung des restlichen Gewebes zu erreichen.

Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung weiter durch Beispiele erläutert, ohne sie darauf zu beschränken.

Beispiele und Abbildungen : Abbildungen : Abbildung 1 zeigt die retroviral vermittelte Transduktion von menschlichen Lymphozyten mit dem cyp4B1-egfp Fusionsgen.

Abbildung 2 : Persistenz vitaler transduzierter Lymphozyten unter 1-8 tägiger Behandlung mit unterschiedlichen Dosen von 41PO.

Abbildung 3 : Abtötungskinetik menschlicher Lymphozyten unter Behandlung mit 41PO [, ug/ml] in Abhängigkeit vom Infektions-und Transduktionsstatus.

Abbildung 4 zeigt die Zytotoxizität von 2AA und 41PO in mit cyp4B1 transduzierten 9L-Zellen (9L-4B1) und von GCV in mit HSV-tk transduzierten 9 L-Zellen (91-tk). Die Überlebenrate wurde nach einem Tag im Verhältnis zu den unbehandelten Zellen (=100%) errechnet. Es werden die durchschnittlichen prozentualen Ergebnisse von bis zu 5 unterschiedlichen Experimenten gezeigt.

Abbildung 5 zeigt die Zytotoxizität von 2AA und 41PO in mit cyp4B1 transduzierten 9L-Zellen (9L-4B1) und von GCV in mit HSV-tk transduzierten 9 L-Zellen (91-tk). Die Oberlebenrate wurde nach zwei Tagen im Verhältnis zu den unbehandelten Zellen (=100%) errechnet. Es

werden die durchschnittlichen prozentualen Ergebnisse von bis zu 5 unterschiedlichen Experimenten gezeigt.

Abbildung 6 zeigt den"Bystander effect"in verschiedenen Cokulturen nach Behandlung mit 41PO (A) und 2AA (B). Die"Bystander" Abtötungsrate wurde in Cokulturen mit verschiedenen Verhältnissen zwischen untransduzierten und transduzierten 9L-Zellen (9L/9L-4B1) in Gegenwart von 5 pg/ml 41PO oder 2AA gemessen. Die Überlebensrate wurde nach 1 und 2 Tagen Wirkstoffbehandlung bestimmt. Die gezeigten Ergebnisse sind der Durchschnitt aus wenigstens 2 unabhängigen Expperimenten.

Beispiele Es ist anzumerken, daß der Inhalt der zitierten Literatur vollinhaltlich Teil der vorliegenden Beschreibung ist. Insbesondere bezüglich experimenteller Bedingungen sind diese Literaturstellen als Teil der Offenbarung dieser Erfindung zu betrachten.

Beispiel 1 : Retroviral vermittelte Transduktion von menschlichen Lymphozyten mit dem cyp4B1-egfp Fusionsgen.

Für die Transduktion von T-Zellen wurde das cyp4B1-egfp-Fusionsgen (Rainov et al. 1998b ; Steffens et al. 2000) in einen retroviralen Vektor eingebaut, so dass die Identifizierung erfolgreich transduzierter Zellen im FACS (fluorescence-activating cell sorting) über die Eigenfluoreszenz der egfp-Komponente (egfp = enhanced green fluorescence protein) sehr einfach ist. Dabei wurde bereits in früheren Arbeiten (Steffens et al. 2000)

nachgewiesen, dass die Zytotoxizität des Suizidgens und die Eigenfluoreszenz des egfp im Fusionsgen erhalten bleibt und eng miteinander korreliert sind. Nach retroviraler Infektion auf Fibronectin mit einem Transduktionsprotokoll nach Hanenberg et al. 1996 ; Hanenberg et al. 1997 und Pollok et al. 1998 konnten in initialen Versuchen, wie in Abbildung 1 gezeigt, auch ohne weitere Selektion mehr als 80% der menschlichen T-Zellen mit dem cyp4B1-egfp-Fusionsgen transduziert werden. Damit liegt das erreichte Transduktionsergebnis deutlich über den in der Literatur vorbeschriebenen Transduktionseffizienzen ohne Selektionsverfahren von 10-50% (DI lann ! et al. 1999 ; Movassagh et al.

2000 ; Maddens et al. 2000). Durch dieses gute Ergebnis nach alleiniger Infektion ergibt sich eine gute Ausgangssituation, um durch anschliessende Selektion die Gesamttransduktionsrate auf nahezu 100% zu steigern und damit das Risiko einer unkontrollierten GvHD (Graft- versus-Host-Disease) durch initial nichttransduzierte Lymphozyten nahezu auszuschliessen.

Beispiel 2 : Retroviral vermittelte Transduktion von 9L-Zellen mit Fusionsgenen sowie Untersuchungen.

9L Ratten Glioma Zellen wurden bei 37°C und 5% C02 in RPMI-Medium ergänzt mit 1mM Natrium-Pyruvat, 2mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum kultiviert. Es wurden 9L-Zellen hergestellt, die stabil cyp4B1 (9L-4B1), HSV-tk (9L-tk) und egfp (enhanced green fluorescent protein) der Fusionsgene (cyp4B1/EGFP (9L-4B1/EGFP) und egfp/HSV-tk (9L- tk/EGFP) exprimieren. Die Zellinie 9L-4B1/EGFP wurde durch liposomale Transfektion von 9L-Zellen mit dem Plasmid p4b1-egfp, das das cyp4b1/egfp Fusionsgen und das Neomycinresistenz vermittelnde Gen

enthält, hergestellt, gefolgt von einer Selektion einzelner Zellklone durch G418 Behandlung [1 mg/ml].

Zu Feststellung zytotoxischer Effekte wurden die Zellen in 6-Well-Platten in einer Dichte von 4 x 105 Zellen pro Well ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit 2AA, 41PO und CGV behandelt, wobei die Behandlung vorzugsweise mit 5 Fug/ml [25uM] 2AA, 5 ug/ml [30, uM] 41PO oder 10Ng/ml [39M] CGV erfolgte. Das Prodrug enthaltende Medium wurde nach definierten Zeiträumen zwischen 15 Minuten und 8 Stunden entfernt und die Zellen weiter 1 oder 2 Tage auf Medium belassen, das keine Prodrugs enthielt. Als Kontrollen wurden Zellen durchgehend 1 oder 2 Tage in Prodrug (oder kein Prodrug) enthaltendem Medium belassen. In jedem Falle wurden die Zellen nach jeweils 1 oder 2 Tagen trypsinisiert und über einen Coulter Counter Z1 gezählt. Es wurde das Verhältnis überlebender Zellen zur Anzahl unbehandelter Kontrolizellen (100%) bestimmt. Die Zellzahlen von bis zu 5 unabhängigen Experimenten wurden statistisch ausgewertet, wobei der Student-t-Test zur Bestimmung signifikanter Differenzen zwischen den verschiedenen Suizidgen- Therapie-Systemen verwendet wurde. Die Signifikanzbewertung wurde für jeden Zeitmeßpunkt der Prodrugbehandlung vorgenommen und die statistische Signifikanz auf p< 0,05 festgelegt.

Zur Abgrenzung cytotoxischer Effekte von cytostatischen in Abhängigkeit von der Länge der Prodrugbehandlung wurden 9L-4B1 und 9L-tk-Zellen wie oben beschrieben behandelt. Nach einem Tag wurden die überlebenden Zelle trypsinisiert, gezählt und wieder auf 100 mm Petrischalen mit einer Dicht von 103 Zellen pro Schale in einem kein Prodrug enthaltenden Medium ausplattiert. 9 Tage später wurden nach Fixierung mit 80% Ethanol und Anfärbung mit Gram's Kristaliviolett Kolonien mit einem Duchmesser < 1 mm gezählt.

Beispiel 3 : Wirksamkeit des cyp4B1141P0-Suizidgensystems Nach Behandlung der nach Beispiel 1 infizierten Lymphozyten mit unterschiedlichen Wirkkonzentrationen von 41P0 zeigt sich, dass mit höheren Dosen von 41P0 (25-50 mg/ml) bereits nach eintägiger Behandlung nur noch 20-30% der ursprünglich über 80% cyp4B1/egfp- transduzierten Zellen leben. Auch mit geringeren Dosen von 5-10 pg/ml 41P0 sind nach ca. 4tägiger Behandlungsdauer weniger als 10% vitale transduzierte Lymphozyten nachweisbar (Abbildung 2).

Beispiel 4 : Therapeutisches Fenster des cyp4B1141P0-Suizidgensystems Abbildung 3 dokumentiert das therapeutische Fenster einer 41PO- Behandlung in menschlichen gemäß Beispiel 1 behandelten Lymphozy- ten. Während unter Behandlung mit 50 pg/ml 41PO die transduzierten Zellen innerhalb der ersten zwei Tage absterben, weisen die nichtinfizierten und die infizierten, aber nichttransduzierten Zellen keine signifikante Zytotoxizität im Vergleich zu unbehandelten Lymphozyten auf.

Die Versuche mit infizierten, aber nichttransduzierten Lymphozyten bestätigen damit nachdrücklich die Abwesenheit eines Bystander effects" unter Behandlung mit dem cyp4B1/41PO-Suizidgensystems Beispiel 5 : Zytotoxizität von 2AA und 41PO mit cyp4B1 im Vergleich zu GCV mit HSV-tk Hier wird die Zytotoxizität von 2AA und 41PO in mit cyp4B1 transduzierten 9L-Zellen (9L-4B1) und von GCV in mit HSV-tk transduzierten 9 L-Zellen

(9L-tk) gezeigt, wobei die Transduktion gemäß Beispiel 2 erfolgte. 9L-4B1- Zellen wurden mit 5pg/ml 2AA [25pM] oder 41P0 [30M] über die angegebene Zeit behandelt, wobei eine Inkubation in regulärem Medium folgte. Die Parallelexperimente wurden mit 9L-tk-Zellen durchgeführt, die mit 10 ug/ml GCV [39pM] behandelt waren. Für Kontrollexperimente wurden 9L-, 9L-4B1-, 9L4B1-/EGFP-, 9L-tk-und 9L-tk/EGFP-Zellen ohne Wirkstoffbehandlung kultiviert.

Die Überlebenrate wurde nach einem Tag (Abbildung 4) und zwei Tagen <BR> <BR> (Abbildung 5) im Verhältnis zu den unbehandelten Zellen (=100%) errechnet. Es werden die durchschnittlichen prozentualen Ergebnisse von bis zu 5 unterschiedlichen Experimenten gezeigt.

2AA zeigte den schnellsten und stärksten Effekt, während 41PO ähnliche Effektivität wie CGV zeigte.

Beispiel 6 : Bystander effect"in verschiedenen Cokulturen nach Behandlung mit 41PO (A) und 2AA (B) Der"Bystander effect"in verschiedenen Cokulturen nach Behandlung mit 41PO (A) und 2AA (B) wurde untersucht. Um den"Bystander effect zu untersuchen wurde eine Cokultivierung mit transduzierten (9L-4B1) und nativen 9L-Zellen durchgeführt, wobei die Transduktion gemäß Beispiel 2 erfolgte. Verschiedene Verhältnisse von 9U9L-4B1 Zellen wurden in 6 Well-Platten in einer Dichte von 4x 105 Zellen pro Well ausplattiert und anschließend für 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden mit 5ug/mi 2AA [25uM] oder 41PO [30, uMl für 1 bis 6 Tage gefolgt von der Bestimmung der Zellüberlebensrate behandelt.

Es zeigte sich (s. Abbildung 6), daß 2AA nur einen moderaten bis geringen"Bystander effect"zeigte (geringer als bei GCV), während er bei 41P0 völlig fehlte. Die gezeigten Ergebnisse sind der Durchschnitt aus wenigstens 2 unabhängigen Experimenten.

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