La présente invention concerne des thérapies moléculaires pour le traitement du cancer et des infections par le virus VIH dans lesquelles des cellules tumorales ou des cellules immunes sont transfectées de façon stable avec différents gènes introduits grâce à des systèmes de transfert hautement efficaces tels que des vecteurs rétroviraux ou adénoviraux.

Une des stratégies pour le traitement d'affections localisées est de rendre les cellules cibles sensibles à des agents chimiothérapiques normalement atoxiques, en utilisant des gènes dits "suicides" tels que le gène de la thymidine kinase du virus si plex de l'herpès (HSV-tλ) ; le gène tk apparenté du virus Zoster de la varicelle ou le gène gpt de la xanthine/guanine phosphoribosyltransférase bactérienne. HSV- tk, par exemple, convertit le ganciclovir, analogue non toxique de la guanosine, en un composé phosphorylé qui agit en tant que terminateur de chaîne dans la synthèse de l'ADN, tuant sélectivement les cellules en division. Le gène codA d' Escherichia coli qui encode la cytosine désaminase (désigné ci-après CDase) représente éventuellement un deuxième gène suicide pouvant être utilisé pour l'élimination sélective des cellules humaines indésirables. La cytosine désaminase est la première enzyme de l'unique voie métabolique par laquelle la cytosine exogène

ou la cytosine endogène provenant du catabolisme des nucleotides pyrimidiques est utilisée par le biais d'une desamination hydrolytique pour donner de l'uracile et de 1'ammoniaque. Des cytosines désaminases ont été trouvées chez des procaryotes et des eucaryotes inférieurs mais semblent être absentes chez des eucaryotes supérieurs, aussi bien chez les mammifères que chez les plantes. [ (Koechlin et al., Biochem Pharmacol . 15 : 435-446 (1966) (Ross, C. Plant Physiol . 40 : 65-73 (1965)]. La CDase desamine également la fluorocytosine atoxique (désignée FC) en fluorouracile (désignée FU) , composé très toxique quand il est efficacement converti en 5-fluoro-UMP. Les cellules dépourvues d'activité cytosine désaminase, soit suite à une mutation inactivante comme par exemple dans les mutants codA d' Escherichia coli et fcyl de Saccharomyces cerevisiae, soit en raison de leur déficience naturelle pour cette enzyme comme le sont les cellules des mammifères et des plantes, sont résistantes à la 5-fluorocytosine [ (Kilstrup et al. J ^" . Bacteriol . 171 : 2124-2127 (1989) (Jund R. & Lacroute, F. Journal of Bacteriology, 102 : 607-615 (1970)]. Cette propriété est à l'origine de l'utilisation du gène codA d ' E. coli comme gène suicide ou de sélection négative dans bon nombre d'expériences récemment publiées portant sur des cellules de mammifères et de plantes [ (Huber et al., Cancer Res . 53 : 4619-4626 (1993) ; 0 93/01281 ; Mullen et al., Cancer Res . 1503-1506 (1994)] et dans lesquelles il a été montré que des cellules transformées ont acquis une activité cytosine désaminase et une sensibilité à la 5-fluorocytosine.

Dans la demande internationale de brevet W0 93/01281, Mullen et Blaese ont décrit un système de sélection négative

comprenant un gène bactérien modifié de la cytosine désaminase possédant la capacité de produire un antimétabolite toxique à partir de la FC dans des cellules eucaryotes. De plus, Mullen et Blaese revendiquent une double sélection négative basée sur un gène modifié de la cytosine désaminase et sur le gène de la thymidine kinase herpétique dans une sélection impliquant la 5-fluorocytosine et le ganciclovir, un nucléoside acyclique analogue de la guanosine, dont les dérivés triphosphate entrent en compétition avec le dGTP. Cependant, il faut noter qu'une large majorité de cellules tumorales ne sont pas sensibles à cette méthode de thérapie.

La sensibilité différentielle à la FC des cellules parentales et des cellules transfectées par un gène de la cytosine désaminase varie beaucoup selon les lignées cellulaires. Presque aucune sensibilité à la fluorocytosine n'a été observée pour des clones murins de mélanome B16 transfectés par un vecteur contenant le gène codA et sélectionnés pour leur forte expression d'activité cytosine désaminase (comme illustré dans l'exemple 8 ci-après). La faible sensibilité à la fluorocytosine des cellules en culture exprimant une forte activité CDase, représente une situation rencontrée dans beaucoup de tumeurs, (J.D Harris, communication orale au colloque de Cold Spring Harbor Laboratory sur la thérapie génique) , qui peut s'expliquer par au moins deux mécanismes possibles.

L'un est lié au transport de la cytosine. Toutes les nucleobases naturelles et leurs analogues fluorines sont hydrophiles et ne diffusent que très lentement au travers de la membrane plasmique. Leur pénétration efficace est

dépendante des protéines spécifiques du transport. Chez E. coli , le transport de la fluorocytosine est activé par une cytosine perméase spécifique codée par codB. Le rôle crucial d'un système actif de transport de la cytosine en déterminant la sensibilité de la fluorocytosine dans cette bactérie, a été démontré avec des mutants dans lequel le gène codB a été retiré. La situation normale apparaît être l'opposé chez les mammifères. Bien que les cellules de mammifères possèdent un système de transport de l'uracile, la cytosine n'est pas transportée de manière active dans diverses lignées cellulaires ou dans les erythrocytes humains, où la pénétration semble se faire exclusivement par diffusion passive [ (Plagemann et al. Biochim. Biophys . Acta . 947 : 405- 443 (1988)] . L'autre mécanisme est basé sur l'existence et l'importance relative des voies anaboliques et cataboliques qui modulent la concentration en fluorouracile. Chez les microorganismes, l'uracile endogène est directement converti en UMP par l'uracile phosphoribosyltransférase (UPRTase) et peut également être converti en UMP et dUMP par l'action concertée de l'uridine phosphorylase et l'uridine kinase [ (Munch-Petersen A. & Mygind B. In . Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganis s . (1983)] . Cependant, cette voie en deux étapes ne fonctionne que si l'un des substrats de l'uridine phosphorylase, à savoir le ribose-1-phosphate ou le desoxyribose 1-phosphate, et l'uracile sont présents à de fortes concentrations intracellulaires. Chez les cellules de mammifères, l'uracile et le fluorouracile sont métabolisés en deux étapes en UMP

et F-UMP via l'intermédiaire uridine [(Mulkins M.A.& Heidelberger, C. Cancer Res . 42 : 965-973 (1982) ; Schwartz et al. Bioche Pharmacol . 34 : 3585-3589 (1985)] en l'absence d'activité uracile phosphoribosyltransférase [ (Kornberg A. & Baker T. In DMA replication . Freeman, W.M and Company; New York, 53-100 (1992)] . De plus, une proportion d'uracile et de fluorouracile est catabolisée respectivement en dihydrouracile atoxique et dihydrofluorouracile.

La toxicité de la FC pour des cellules exprimant un gène cytosine désaminase introduit dépend donc de la quantité de FU formé qui est converti en 5-fluoro-UMP et ensuite, via la voie de novo de la synthèse des pyrimidines, en 5-fluoro dUMP, un inhibiteur irréversible de la thymidylate synthétase et en conséquence de la synthèse de l'ADN par manque de dTTP [ (Kornberg A. & Baker T. In DNA replication . Freeman, W.M and Company; New York, 53-100 (1992)] .

L'azidothymidine (AZT) utilisé pour le traitement de l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (SIDA) fait partie des médicaments qui sont métabolisés par la voie des nucleosides pyrimidiques.

L'AZT est un des premiers agents chimiothérapiques pour le traitement d'une infection VIH. L'AZT entre facilement dans les cellules où il est converti en nucleosides phosphate AZT-MP, AZT-DP, et AZT-TP par l'action séquentielle de la thymidine kinase, la thymidylate kinase et la nucleoside diphosphokinase. L'AZT est rapidement converti en AZT-MP par la thymidine kinase mais l'AZT-MP s'accumule en raison du fait qu'il est un mauvais substrat de la thymidylate kinase humaine. L'AZT-MP est trouvé de façon reproductible en concentration au moins 50 fois plus

élevée que celle de l'AZT-TP dans des lignées cellulaires humaines [ (Fur an et al. Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 83 : 8333-7 (1986)] . Bien que l'AZT-TP soit un substrat inefficace pour les ADN polymerases cellulaires, l'AZT-MP est incorporé dans 1 'ADN [ (Copeland, J. Biol . Che . 267 : 21459- 64 (1992)] .

La présente invention concerne un groupe de gènes d'origine bactérienne et fongique en entité seule codant pour une UPRTase ou fusionné avec des gènes bactériens et fongiques codant pour une CDase. Les gènes avec la seule activité 1 'UPRTase sensibilisent les cellules de mammifères au 5-FU alors que les gènes hybrides codant pour une enzyme à deux domaines ayant les activités CDase et UPRTase sensibilisent les cellules de mammifères au 5-FU et à la 5- FC et en particulier les cellules de mammifères qui ne sont pas sensibles à la FC lorsqu'elles expriment la seule CDase.

L' invention concerne également un second groupe de nouveaux gènes suicide qui sensibilisent des cellules de mammifères à l'azidothymidine (AZT) . L'invention concerne également des vecteurs eucaryotes contenant les deux groupes de gènes suicide ou l'un des groupes seul ainsi qu'une méthode de traitement in si tu du cancer et de l'infection par le VIH par introduction des dits vecteurs chez les malades. Cette invention s'applique à des situations où les cellules de mammifères transfectées par un gène d'une cytosine désaminase seul ne sont pas sensibles à la FC comme c'est le cas avec de nombreuses cellules tumorales.

La société demanderesse propose l'utilisation d'un gène modifié codant pour une protéine unique à double

activité cytosine désaminase et UPRTase dans des cellules tumorales faiblement sensibles à la FC quand elles sont transfectées par un gène codant uniquement pour la cytosine désaminase. Le raisonnement est basé sur l'hypothèse que dans le cas de deux protéines de fusion, le FU est plus rapidement et plus efficacement converti en 5-fluoro-UMP. Cela devrait en retour générer une augmentation du flux de la FC entrant dans les cellules, particulièrement dans des cellules tumorales dépourvues d'un transport actif de FC. L'exemple 8 illustre l'augmentation considérable de l'effet toxique observé après traitement à la FC, dans des cellules murines de mélanome B16 transfectés, conformément à l'invention, avec un gène hybride codA;;upp en comparaison avec des cellules B16 transfectées avec le gène codA seul. Ces nouveaux gènes suicide, résultant de la fusion traductionnelle entre un gène de la cytosine désaminase et un gène de l'UPRTase, doivent être utilisés de préférence dans toute situation où les cellules cibles doivent être éliminées ou lorsque la croissance des cellules cibles doit être contrôlée. II a été démontré que l'ordre de la fusion

UPRTase: :CDase induit peu ou pas de différence dans l'activité spécifique de l'enzyme comparée à l'enzyme de fusion CDase: :UPRTase. Le gène hybride codA: : upp d ' E. coli semble être tout aussi efficace que le gène hybride fcyl : : furl de S. cerevisiae. he gène fcyl : : upp, plus petit, pourrait être préféré avec des transporteurs tels que des vecteurs rétroviraux, AAV ou adénoviraux dans lesquels l'espace pour insérer le gène est limité. Les gènes bifonctionnels codant pour les activités CDase et UPRTase et les gènes codant pour la seule activité UPRTase

constituent le premier groupe de nouveaux gènes suicide de cette invention.

L'invention concerne également un second groupe de nouveaux gènes suicide qui sensibilisent des cellules de mcimmifères à l'azidothymidine (AZT) et/ou à des analogues de nucleosides pyrimidiques tels que la didesoxythymidine, la trifluoromethylthymidine, l'éthyldesoxyuridine, le bromovinyldesoxyuridine, le bromovinylarabinouracile.

Un gène codant pour une thymidylate kinase avec une bonne affinité pour l'AZT-MP devrait sensibiliser des cellules de mammifères à l'AZT en procurant plus d'AZT triphosphate pour l'incorporation dans l'ADN lors de son élongation causant ainsi l'arrêt de la chaîne et la mort cellulaire. Les enzymes responsables de l'anabolisme de l'AZT chez la bactérie Escherichia coli , qui est très sensible à cette molécule, sont de bons candidats qui remplissent cette exigence. Le gène de la thymidylate kinase tmk d ' E. coli seul ou fusionné au gène de la thymidine kinase tdk d ' E. coli ou au gène de la nucleoside diphosphokinase ndk d ' E. coli , augmentent considérablement l'effet toxique de l'AZT sur des cellules murines de mélanome B16. Ces nouveaux gènes suicide peuvent être utilisés préférentielle ent dans toute situation où les cellules cibles doivent être éliminées ou lorsque la croissance des cellules cibles doit être contrôlée. Le gène tk du virus humain de l'herpès simplex code pour une enzyme à double activité thymidine kinase et thymidylate kinase. L'AZT est un mauvais substrat pour la TK- HSVl même si l'enzyme peut phosphoryler une grande variété d'analogues de nucleosides pyrimidiques et puriques. Lors de ses travaux de recherche d'une thymidylate kinase d'origine

virale, capable de phosphoryler l'AZT-MP, la société demanderesse a découvert que le gène tk du virus Epstein-Barr convertit de façon conséquente l'AZT-MP en AZT-DP. Le gène TK-EBV est donc un bon candidat comme gène suicide pour sensibiliser à l'AZT des cellules de mammifères résistantes à cette molécule. Un autre gène de grand intérêt est le gène tmk codant pour la thymidylate kinase d' Escherichia coli . Lors de la recherche d'un microorganisme naturellement sensible à une faible concentration d'AZT ajouté au milieu de croissance, indiquant un métabolisme efficace de l'AZT, la société demanderesse a trouvé que des souches dérivées d ' E. coli K12 étaient les plus sensibles parmi plusieurs milliers de souches bactériennes et fongiques testées. Le gène tmk d ' E. coli a été isolé par clonage et modifié, après que la séquence nucléosidique ait été déterminée, de telle sorte qu'une fusion génique active a pu être faite avec d'autres gènes métabolisant l'AZT susceptibles ainsi de potentialiser l'action du gène tmk seul . La fusion du gène tmk avec le gène codant pour la thymidylate kinase ou avec le gène ndk codant pour la nucléoside diphosphokinase, toutes deux provenant d' E. coli , sont deux exemples de nouveaux gènes hybrides capables de phosphoryler efficacement l'AZT. Le gène tmk et les gènes bifonctionnels codant pour la thymidylate kinase et une autre activité des voies de synthèse de novo ou de récupération des pyrimidines, constituent le second groupe de nouveaux gènes suicide de cette invention.

Selon une réalisation préférentielle de l'invention, qui rend les nouveaux gènes hybrides plus adaptés aux expériences de transfert d'ADN, les gènes monofonctionnels ou bifonctionnels des deux groupes peuvent être fusionnés

dans un même cadre de lecture avec le petit gène bactérien Jble Sh, rendant ainsi les cellules de mammifères résistantes à un antibiotique de la famille des phléo ycines [ (Armau et al., US Patents 5021344 et 5118620)]. Plusieurs constructions plasmidiques contenant le gène de sélection phléomycine/zeocine avec un phénotype négatif sont présentées dans les Figures 2a, 2b et 2c.

Il faut noter dans le cadre de cette invention que des gènes possédant des fonctions multiples ne sont pas des cas exceptionnels chez les eucaryotes supérieurs. Par exemple, les trois premières étapes de la voie de la biosynthèse de novo des pyrimidines qui sont sous la dépendance de trois gènes non liés chez E.coli, sont catalysées par une seule enzyme codée par un gène résultant de la fusion de trois gènes ancestraux distincts.

L'invention concerne aussi l'association de la fluorocytosine ou le fluorouracile et de l'AZT pour une chimiothérapie combinée des tumeurs par l'expression de deux gènes suicide, sélectionnés pour leur complémentarité dans leur mode d'action et exprimés dans un vecteur eucaryote.

La société demanderesse a trouvé que la carence en dTTP par la FC activé par le gène suicide du premier groupe, permettait à l'AZT ou à un des analogues de nucleosides pyrimidiques activés par un gène suicide du second groupe d'être incorporé dans l'ADN dans de plus grandes quantités. Comme conséquence, des cellules tumorales transformées par deux gènes suicide, un du premier groupe et l'autre du second groupe, devenaient très sensibles à l'effet létal d'un traitement simultané avec de la FC ou du FU et de l'AZT ou un des autres analogues de nucleosides pyrimidiques.

L'antimétabolite AZT-TP entre en compétition avec le nucléotide naturel dTTP, avec cependant une faible efficacité d'incorporation dans l'ADN par les polymerases cellulaires. Plus le rapport de concentration AZT-TP/dTTP est élevé, plus grande est la quantité d'AZT-TP incorporé dans l'ADN. Le bloquage de la synthèse de novo du dTTP n'interférant pas avec la formation d'AZT-TP, devrait modifier ce rapport, tendant à une plus grande incorporation de l'analogue de la thymidine dans les brins d'ADN, stoppant ainsi son élongation. La fluorocytosine, activée par la cytosine désaminase et la FC ou le FU activés par la cytosine désaminase associée avec une UPRTase, sont métabolisées en produit final FdUMP qui agit comme inhibiteur suicide de la thymidylate synthétase, une enzyme clé dans les voies de biosynthèse du dTTP. L'association fluorocytosine et AZT agit en synergie pour tuer les cellules traitées exprimant deux gènes suicide qui activent les deux prodrogues. Ce mécanisme est illustré dans la Figure 1.

Le nucléotide dTTP est un métabolite essentiel finement régulé dans toute cellule. Une carence sévère de dTTP par l'action d'inhibiteurs ou induit par des mutations entraîne la mort des cellules, probablement par l'induction d'une endonucléase responsable de la cassure de l'ADN double brin. L'utilisation de la FC ou du FU, activée par un gène codant pour des activités CDase et UPRTase, a pour but de tuer des cellules cibles par absence de thymidine due au manque de dTTP. La thymidine lève l'effet toxique de la FC par production de dTTP en court-circuitant le bloquage de la thymidylate synthétase via la voie de récupération des pyrimidines (voir Fig.l) . L'utilisation des analogues de la

thymidine ou de la desoxyuridine en association avec la FC ou le FU pour le traitement de cellules exprimant deux gènes suicide activateurs, a un effet opposé. L'incorporation d'analogues triphosphate dans l'ADN lors de la replication et du processus de réparation est facilité par le manque de dTTP compétiteur, entraînant un effet létal plus prononcé.

L'invention comprend donc un vecteur eucaryote comprenant deux unités d'expression de gènes suicide, le premier permettant la sensibilisation des cellules tumorales à la 5-fluorocytosine ou au 5-fluorouracile et le second permettant la sensibilisation des cellules de mammifères ou infectées par le virus VIH à l'azidothymidine de manière synergique.

Selon une réalisation préférentielle de l'invention, le vecteur eucaryote comprend une première unité d'expression d'un gène suicide constituée par un gène codant pour une activité uracile phosphoribosyltransférase ou un gène chimère formé de la fusion de deux gènes, chacun pouvant être d'origine bactérienne ou fongique, codant pour une protéine unique possédant une double activité cytosine désaminase et uracile phosphoribosyltransférase.

Les gènes bactériens sont, de préférence, le gène codA encodant une cytosine désaminase et le gène upp encodant l'uracile phosphoribosyl transférase d' Escherichia coli , et les gènes fongiques sont le gène fcyl encodant la cytosine désaminase et le gène furl encodant l'uracile phosphoribosyltransférase de Saccharomyces cerevisiae .

La seconde unité d'expression d'un gène suicide de l'invention comprend un gène hybride formé par la fusion du gène tmk et du gène tdk encodant respectivement la

thymidylate kinase et la thymidine kinase d'E.coli, ledit gène hybride codant pour une protéine unique à double activité thymidine kinase et thymidylate kinase. Selon l'invention, un autre candidat pour la seconde unité d'expression d'un gène suicide est un gène hybride formé par la fusion d'un gène tirϋ modifié d' Escherichia coli et d'un gène ndk encodant la nucléoside diphosphokinase d ' Escherichia coli et codant pour une protéine unique à double activité thymidylate kinase et thymidine diphosphokinase, de préférence en fusion avec le gène Jle Sh. Selon l'invention, une seconde unité d'expression d'un gène suicide, peut également contenir le seul gène tmk d'E.coli ou un gène tk modifié provenant du virus humain Varicella-Zooster exprimant une double activité thymidine kinase et thymidylate kinase, le dit gène modifié conférant la résistance à la zéocine ou un gène similaire provenant du virus humain d'Epstein-Barr.

Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de traitement in situ d'une tumeur, comprenant les étapes de caractérisation d'une tumeur comme étant toujours résistante aux doses phar acologiques acceptables de la 5- fluorocytosine après introduction sous une forme active d'un gène cytosine désaminase, de transformation cellulaire de ladite tumeur in si tu avec un vecteur d'expression eucaryote portant un gène hybride encodant une double activité cytosine désaminase et UPRTase ou le gène de l'UPRTase seul , puis de traitement de ladite tumeur respectivement avec des doses pharmacologiques acceptables de 5-fluorocytosine (FC) ou de 5-fluorouracile (FU) . Un autre objet de la présente invention est le

traitement in si tu d'une tumeur, comprenant les étapes de transformation cellulaire de ladite tumeur in si tu avec un vecteur eucaryote exprimant un gène d'origine bactérienne ou virale possédant une activitéthymidylate kinase puis de traitement de ladite tumeur avec des doses pharmacologiques acceptables d'azidothymidine (AZT) .

L'invention concerne également une méthode de thérapie pour l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) chez un patient, comprenant les étapes d'insertion in vitro d'un vecteur eucaryote portant un gène codant pour des activités CDases et UPRTases sous le contrôle d'un promoteur ou d'un élément amplificateur provenant du génome VIH dans le génome des cellules hématopoïétiques, de réintroduction des cellules hématopoïétiques transformées dans ledit patient puis de traitement dudit patient avec de la FC ou du FU à des doses pharmacologiques acceptables qui détruiront sélectivement les cellules infectées par le VIH qui ont intégré ledit vecteur eucaryote.

L'invention concerne aussi une méthode de thérapie pour l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) chez un patient, comprenant les étapes d'insertion in vi tro d'un vecteur eucaryote portant un gène codant pour une activité de type thymidylate kinase, sous le contrôle d'un promoteur ou d'un élément amplificateur provenant du génome VIH dans le génome des cellules hématopoïétiques, de réintroduction des cellules hématopoïétiques transformées dans ledit patient puis de traitement dudit patient avec de l'AZT à des doses pharmacologiquement acceptables qui détruiront sélectivement les cellules infectées par le VIH qui ont intégré ledit vecteur eucaryote.

L'invention concerne aussi une méthode de traitement in si tu d'une tumeur comprenant les étapes de transformation in si tu des cellules de ladite tumeur par un vecteur eucaryote exprimant deux gènes suicide, l'un codant pour l'activité UPRTase ou les activités simultanées CDase et UPRTase et l'autre codant pour une activités thymidylate kinase et ensuite de traitement de ladite tumeur simultanément ou en alternance avec de faibles doses de FU ou de FC et d'AZT. L'invention concerne une méthode de traitement in situ d'une tumeur comprenant les étapes de transformation in situ des cellules de ladite tumeur par un vecteur eucaryote exprimant deux gènes suicide, l'un codant pour l'activité UPRTase ou les activités simultanées CDase et UPRTase et l'autre codant pour une activité thymidylate kinase et ensuite de traitement de ladite tumeur simultanément ou en alternance avec de faibles doses de FU ou de FC et d'un analogue de nucléoside pyrimidique tels que la didesoxythymidine, la trifluoromethylthymidine, 1'éthyldesoxyuridine, le bromovinyldesoxyuridine, le bromovinylarabinouracile.

L'invention concerne également un médicament comprenant un vecteur eucaryote contenant les deux groupes de gènes suicide ou l'un des groupes seul. L'invention concerne également un médicament pour le traitement des cellules tumorales sensibles à la 5- fluorocytosine et/ou au 5-fluorouracile comprenant un vecteur eucaryote contenant les deux groupes de gènes suicide ou l'un des groupes seul. L'invention concerne également un médicament pour le

traitement des cellules de mammifères ou des cellules infectées par le VIH comprenant un vecteur eucaryote contenant les deux groupes de gènes suicide ou l'un des groupes seul. La Figure 1 décrit la voie anabolique de la 5- fluorocytosine pour donner le produit final, le FdUMP, inhibiteur spécifique de la thymidylate synthétase, une enzyme clé dans la biosynthèse de novo du thymidylate dTTP. Une carence en dTTP dans des cellules en division par l'action du FC activé par une enzyme à double activité CDase et UPRTase codée par les nouveaux gènes suicide du premier groupe, objet de cette invention, induit une mort appelée "mort par manque de thymidine" probablement par des mécanismes liés à l'apoptose. Les étapes catalysées par des produits des principaux nouveaux gènes suicide du second groupe décrits dans l'invention, dans l'anabolisme de quelques analogues non toxiques de la thymidine et de l'uridine sont aussi indiquées. Ces analogues sont transformés par l'action des nouveaux gènes suicides en dérivés triphosphate qui sont incorporés dans l'ADN, inhibant ainsi l'ADN.

Les Figures 2a, 2b et 2c illustrent les plasmides d'expression contenant les gènes suicide et leur filiation.

Les Figures 3a _x , 3a ₂ , 3b _x et 3b ₂ présentent les cartes plasmidiques des vecteurs d'expression pZEO-SGl ; pZEO-SG2 ; pZEO-SG3 ; pZEO-SG4 contenant deux gènes suicides.

Les exemples suivants, non exhaustifs, sont présentés dans un seul but d'illustration.

Exemple 1

Isolement de mutants tdk codA upp d'une souche K12 d'Escherichia coli

Les bactéries Escherichia coli K12 métabolisent la FC, le FU et l'AZT, analogues toxiques des nucleobases et nucleosides pyrimidiques, sous l'action des enzymes CDase,

UPRTase et thymidine kinase respectivement. Les souches déficientes pour l'une de ces activités sont résistantes à l'analogue correspondant. Dans le but de faciliter le clonage des allèles fonctionnels tdk ^* et upp ⁺ , un mutant de la souche MC1061, déficient pour l'activité thymidine kinase, a été isolé sur la base de la résistance à l'AZT. Puis à partir de ce mutant, un mutant déficient pour l 'UPRTase a été isolé par sélection de clones résistants au FU. Une culture d' E.coli MC1061, ayant poussé toute une nuit, dans du milieu LB, a été étalée sur des boîtes contenant du milieu M9-CA complémenté avec 5 μg ml ^"1 d'AZT. Un mutant MC1061 tdk a été isolé en repiquant un clone parmi les nombreuses colonies résistantes. Une culture de ce clone, dans du milieu LB, ayant poussé une nuit à 37°C, a été bloquée à 4°C pendant 2 heures, puis 10 ⁸ cellules ont été étalées sur des boites M9-CA complémentées avec 30 mg ml ^" de 5-f luorouracile. Vingt colonies individuelles, ayant apparu après 60 heures d'incubation, ont été repiquées sur le même milieu sélectif. Une suspension cellulaire a été préparée à partir des clones et des cellules ont été déposés sur des boites M9-CA contenant des concentrations croissantes de 5-f luorocytosine ou 5- f luorouracile. Un clone résistant à 100 μg ml ^" de f luorouracile et à 1000 μg ml ^" de fluorocytosine a été retenu et désigné CL108. Par la suite, une mutation dans le gène pyrD, qui confère une auxotrophie pour les pyrimidines,

a été introduite dans CL108 par transduction PI, décrite par Miller [ Miller J.H. Experiments in Molecular Genetics Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972) ] . La souche résultante CL109 est incapable d'utiliser la cytosine ou l'uracile comme seule source de pyrimidine. Les gènes codA et codB, codant respectivement pour la cytosine déaminase et la cytosine perméase, forment un opéron qui est étroitement lié à l'opéron lac à 8 minutes sur le chromosome d ' Escherichia coli [ Austin E.A. & Huber B.E. J Bacteriol 175, 3685-6 (1993); Danielsen et coll. Mol Microbiol 6, 1335-44 (1992)]. Les souches d ' E. coli utilisées pour les expériences de complémentation lac Z, basées sur la coloration au XGal, telle que MC1061, portent des délétions de différentes longueurs incluant 1"opéron codBA en aval du gène lac Z et de ce fait sont dépourvues d'un système de transport actif de la cytosine. Dans le but de construire une souche dérivée de MC1061 avec un système de transport actif de la cytosine, et par conséquent de la fluorocytosine, la région comprenant le gène codB et son promoteur a été sous- clonée à partir de pSDH2 et introduite dans pAPTUO, un vecteur portant l'origine de replication P15a [ Cornet et coll. J Bacteriol 176, 3188-95 (1994)]. Le plasmide résultant pAPT codB, sélectionnable par la kanamycine et compatible avec les plasmides basés sur le replicon colEl, a été introduit dans la souche CL108 comprenant ou non un des plasmides pUT du Tableau 1. Le génotype des trois souches sont les suivants: MC1061 (codA codB) ; CL108 (codA codB tdk upp) ; CL109 (codA codB tdk upp pyrD) .

Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des cellules aux FC, FU et AZT ont été déterminées sur des boîtes

contenant du milieu minimum M9 [ Miller J.H. Experiments in Molecular Genetics Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972)], complémenté avec 0,5 % d'acide Casamino, Difco, 0,2 % de glucose, 1 μg ml ^"1 de thiamine et 1,5 % d'agar Difco (M9-CA) . Quand nécessaire, des antibiotiques ont été ajoutés aux concentrations suivantes: ampicilline (Ap, 50 μg ml ^"1 ) , kanamycine (Km, 25 μg ml ¹ ) , tetracycline (Tet, 10 μg ml ^"1 ) et zéocine (Zéo, 20 μg ml ^"1 ) . La Zéocine a été fournie par CAYLA. Les cellules d'une culture stock ont été étalées sur des boites contenant du milieu M9-CA et les antibiotiques appropriés. Après une nuit d'incubation à 37°C, des suspensions cellulaires sont η préparées en resuspendant, dans du milieu M9-CA, environ 10 bactéries ml ^"1 . Les cellules ont été déposées (5 ml) sur la surface de boîtes contenant du milieu M9-CA supplémenté avec des concentrations croissantes de l'analogue. La croissance des cellules a été relevée après 48 heures d'incubation. Les résultats sont montrés au Tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1: Concentrations minimales inhibitrices à la FC et au FU (μg/ml) d'E. coli MC10 (codBA)* and CL108 (codBA upp tdk)** contenant un ou deux plasmides d'expression de gènes la voie de récupération de la cytosine.

Plasmide FC FU

-pAPT codB +pAPTcodB TcodB +pAPTcodB

_* 100 100 0,1 0,1

PSD112 (codBA)* 0,1 ND 0,1 0,1 o

CM _** >100 >100 100 100

PUT816 (codA: :ble Sh)** >100 100 30 10 pUT814 (Sh: :upp) ** 100 100 0,1 0,1

PUT825 ( codA : : bl e Sh : : upp) * * 10 0,1 0,1 0,1

PUT826 (codA: :upp) ** 30 0,1 0,3 0,3 pSDH2 (codBA)** >100 ND 100 ND pUT827 (fcyl: :ble Sh)** >100 >100 100 100

PUT828 (Sh: :furl)** 100 100 0,3 0,3

PUT829 ( fcyl : : bl e Sh : : furl ) * * 30 0,3 0,3 0,1

PUT830 ( fcyl : : furl ) 30 0,1 0,1 0,1

Les valeurs sont les moyennes de trois expériences ND : non déterminé

00

O

Exemple 2

Construction du gène codA: : upp

Les séquences des gènes codA et upp d ' E. coli ont été publiées récemment [ Danielsen et coll. Mol Microbiol 6, 1335- 44 (1992); Austin E.A. & Huber B.E. J Bacteriol 175, 3685-6

(1993); Andersen et coll. Eur J Biochem 204 , 51 -6 (1992)]. Grâce aux techniques de PCR (Polymérase chaîne réaction) , le gène codA a été amplifié à partir du plasmide pSDH2 et le gène upp à partir du chromosome de la souche MC1061 et introduit dans les plasmides pUT687 et pUT614 ras respectivement. Ces deux vecteurs dérivent de pUCl9 par le remplacement du promoteur lacZ et la séquence de l'a peptide par un fragment BamHI portant le gène de sélection Jble Sh qui code pour la résistance à la zéocine et à la phléomycine à la fois chez E. coli et les cellules de mammifères [ Drocourt et coll. Nucleic Acids Res 18, 4009 (1990)] [US 5, 021, 344] [US 5, 118, 620]. Dans pUT687, le gène ble Sh est fusionné en phase à son extrémité 5' au gène de la thymidine kinase d ' Escherichia coli (voir exemple 5) . Dans pUT614 ras, le gène ble Sh est fusionné en phase du côté 3* à une séquence de 47 pb codant pour un bras de fusion polypeptidique flexible et les 12 derniers acides aminés du gène ras humain. Le promoteur bactérien synthétique EM7 et le promoteur animal pTK de pMClnéo [Thomas K.R. & Capecchi M.R. Cell 51, 503-12 (1987)] en tandem permettent l'expression du gène hybride zéo à la fois chez E. coli et les cellules de mammifères. Le gène codA a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes: extrémité 5' 5' GTACCATGGTGTCGAATAACGCTTTACAAAC 3 ' et extrémité 3 ' 5' CTCCTAGGCGTTTGTAATCGATGGCTTCTGGCTG 3 '

Le fragment PCR a été coupé par Ncol et Avril puis inséré à la place du fragment NcoI-AvrII contenant le gène tk- E. coli de pUT687 pour donner pUT816.

Le gène upp a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes: extrémité 5' 5' GTCATGCATCAAGATCGTGGAAGTCAAACACCCA 3 ' et extrémité 3 ' 5' CTGGTCGACAAGCTTATTTCGTACCJUϋWΛTTTTGTCACC 3 ' Le fragment PCR résultant a été coupé avec Nsil et Sali et inséré dans pUT614 ras à la place du fragment Nsil-Sall contenant l'extrémité ras pour donner pUT814. L'utilisation de CL109 a fourni une méthode de sélection positive pour le clonage des gènes codA et upp respectivement. Les transformants possédant le plasmide pUT 816 qui exprime codA: : Sh ont été sélectionnés à partir de CL109 sur du milieu contenant la cytosine comme seule source de pyrimidine alors que les transformants possédant le plasmide pUT 814 qui exprime Sh : : upp ont été isolés sur du milieu contenant de l'uracile. Les deux plasmides pUT 816 et pUT 814 ont été par la suite recombinés in vi tro en ligaturant un fragment BglII- SgrAI d'un des plasmides au fragment complémentaire BglII- SgrAI de l'autre plasmide pour donner pUT825. Le gène résultant codA: : ble Sh : : upp code pour une protéine hybride qui possède trois domaines distincts séparés par des bras flexibles (Fig. 2c) . A partir d'un extrait protéique de la souche C1108 (pUT825) une bande, unique correspondant à une protéine de 75 kD, légèrement inférieure à la taille attendue de 80 kD pour le produit du gène codA.-.-Jle Sh : : upp a été détectée par immuno-détection avec un antisérum de la protéine Sh . La fonctionnalité du gène de fusion codA;:Jb2e Sh : : upp a été confirmée par la capacité de pUT825 à permettre la

FEUILLEDEREMPLACEMENT(REGLE2β)

croissance de la souche CL109 sur un milieu contenant de la cytosine ou de l'uracile comme seule source de pyrimidine et à sensibiliser les cellules à la FC et au FU (Tableau 1) . De plus pUT825 confère aux cellules réceptrices une résistance jusqu'à 200 μg ml ^" de zéocine, niveau de résistance identique à ceux obtenus avec tous les plasmides des Figures 2a, 2b et 2c. Ceci correspond à une augmentation d'un facteur 100 de la résistance par rapport aux souches non transformées.

Enfin, le gène codA : : upp (pUT825) a été construit en remplaçant le fragment Avril- Nsil de pUT829, contenant le gène ble Sh, par un oligonucleotide double brin codant pour un bras de fusion peptidique flexible.

5' CTAGGGATCTCAGGCCTTAATGGCGTATGCA 3' CCTAGAGTCCGGAATTACCGCAT

Exemple 3

Construction du gène fcyl : : furl

Les séquences des gènes fcyl et furl de S. cerevisiae, codant respectivement pour la cytosine désaminase et l'uracile phosphoribosyltransférase, ont été publiées [ (EP 90306131.5; Kern et coll. Gène 88, 149-57 (1990)]. Les deux gènes ont été amplifiés par les techniques de PCR à partir de l'ADN de la souche de levure OLl. Les sites de restriction NcoI-AvrII et Nsil-Sall ont été créés aux extrémités 5' et 3' des séquences codantes des gènes fcyl et furl respectivement en utilisant les oligonucléotides amorces suivants: pour le gène fcyl extrémité 5' 5' GTACCATGGTGACAGGGGGAATGGCAAGCAA 3' et extrémité 3' 5' TCCCTAGGGCCTCACCAATATCTTCAAACCAATCCTG 3' pour le gène furl

FEUILLEDEREMPLACEMENT(REGLE2fl

extrémité 5' 5' TGGATGCATGAACCCGTTATTCTTTTTGGCTTCT 3' et extrémité 3' 5' TCGAGGTCGAC'raTAAACACΛGTAGTATCTGTCVβCAAA 3' Le gène fcyl a été par la suite introduit dans pUT687 au niveau des sites Ncol et Avril et le gène furl dans pUT614 ras au niveau des sites Nsil et Sali pour générer les plasmides pUT827 et pUT828 respectivement. Les transformants d' E. coli possédant pUT828 ( fcyl : :ble Sh) ont été sélectionnés sur du milieu minimum contenant de la cytosine comme seule source de pyrimidine alors que les transformants possédant pUT828 (S ::furl) ont été sélectionnés sur du milieu minimum contenant de l'uracile.

Les deux gènes, fcyl::JIe Sh et ble Sh : : furl , ont été ensuite recombinés en un gène unique fcyl : : ble Sh : : furl en ligaturant un fragment NcoI-SgrAI de pUT827 au fragment complémentaire NcoI-SgrAI de pUT828, pour donner le plasmide pUT829. La fonctionnalité du gène hybride fcyl::Jble Sh : : furl a été contrôlée par la capacité de la souche CL109, transformée par pUT829, à pousser sur du milieu contenant soit de la cytosine soit de l'uracile comme seule source de pyrimidine et par la sensibilité de la souche CL108 transformée par pUT829 à la FC et au FU (Tableau 1) .

Enfin, le gène fcyl : : furl a été construit par une technique similaire à celle du gène codA: : upp en remplaçant un fragment AvrII-Nsil de pUT829 par un oligonucleotide double brin codant pour un bras de fusion peptidique flexible (décrit dans l'exemple 2) pour donner pUT 830.

Les souches bactériennes transformées par pUT829 et pUT830 ont été testées pour les activités CDase et UPRTase. Les cellules récupérées à partir d'une culture de la nuit de 20 ml de milieu LB ont été lavées une fois avec un volume égal

de Tris-HCl 20mM, pH 7,5 puis resuspendues dans 1 ml du même tampon contenant 1 μg ml ^" de lysozyme. Après 10 minutes dans la glace, la suspension cellulaire a été l'objet de 2 cycles de congélation-décongélation puis soniquée cinq minutes par des impulsions de 30 secondes. Les débris cellulaires et les cellules intactes ont été éliminés par centrifugation et les surnageants ont été utilisés pour les dosages enzymatiques. Les dosages in vi tro de la cytosine désaminase et de l'UPRTase ont été réalisés en suivant les protocoles décrits légèrement modifiés [Andersen et coll., (1989)]. Les mélanges réactionnels standard correspondaient à un volume de 100 μl: Tris-HCl 50 mM pH 7,5; DTT 1 mM; 10 μl d'extraits cellulaires pour les deux activités plus de la cytosine (5 mM) pour le dosage de la cytosine désaminase plus de l'uracile 5 mM, MgCl2 5mM et PRPP 2 mM (Sigma) pour celui de l'UPRTase. Les réactions enzymatiques, après 2 heures d'incubation à 30°C, ont été stoppées par refroidissement dans de la glace. Des aliquots de 10 μl ont été déposés sur des plaques en couche mince de cellulose imprégnée de polyethylenimine (Schleicher & Schuell) ainsi que 4 μg de cytosine, uracile et UMP comme témoins. Les plaques en couche mince ont été révélées dans l'eau pour séparer la cytosine et l'uracile de l'UMP, ou dans un mélange butanol-l/H20 (86/14) pour obtenir une séparation nette entre la cytosine et l'uracile. La présence de taches, correspondant au produit formé, visibles sous les UV, ont permis de déceler l'activité enzymatique. Les transformations de la cytosine en uracile et l'uracile en UMP n'ont été observées que dans les extraits cellulaires d ' E. coli transformés par pUT829 ou pUT830.

Exemple 4

Clonage du gène tmk d 'Escherichia coli

Le locus génétique de tmk, le gène codant pour la dTMP kinase, a été positionné autour de 24 minutes sur la carte chromosomique d' E. coli [ Binkley J.P. et Kuempel P.L. J Bact 168, 1457-8 (1986)]. A partir de l'analyse des séquences nucléotidiques, déposées à Genbank, positionnées entre la 24 et 25 minute de la carte génétique, il est possible qu'une seule région non séquencée comprise entre les gènes acpP et holB pouvait contenir le gène tmk. En conséquence, la région intergénique acpP-holB a été amplifiée par PCR à partir du phage 1 E9G1[236] de la banque de Kohara [Kohara et coll. Cell 50, 495-508 (1987)] et clone. Les amorces oligonucléotidiques utilisées pour la PCR ont été: En 5' terminal 5' ATTTCGAATTCCCTCCCTGGAGGACAAACGTGT 3' En 3' terminal 5' CCACCGGTACCATCTCATGCGTCCAACTCCTTC 3 ' L'amorce 5' terminale contenait 25 bases homologues (en gras) à l'extrémité 3' de la séquence publiée du gène acpP [Rawlings M. et Cronan J.J. J Biol Chem 267, 5751-4 (1992)] et des bases additionnelles pour créer un site EcoRI. L'amorce 3' terminale contenait 26 bases homologues (en gras) à la séquence holB [Carter et coll. J Bacteriol 175, 3812-22 (1993); Dong et coll. J Biol Chem 268, 11758-65 (1993)] autour du codon d'initiation ATG et des bases additionnelles pour créer un site Asp718I.

Le fragment d'ADN obtenu après amplification PCR (~

4 kb) a été digéré par EcoRI at Asp718l et inséré dans pZEOSVl

(n° accession Genbank L36849; commercialisé par CAYLA) ouvert par EcoRI et Asp718I. Après transformation d' E. coli par le mélange de "ligation", il n'a pas été possible d'obtenir des

transformants contenant la taille attendue du plasmide recombinant suggérant que la région amplifiée était soit toxique soit létale pour E.coli. Le même résultat a été obtenu après clonage de la région amplifiée réduite à un fragment BglII-Asp718I de 2,5 kb dans pUT58 (commercialisé par CAYLA, digéré par BglII et Asp718l) . Les sous-clonage ultérieurs d'un fragment BglII-PstI de 1,6 kb dans pUT106 (commercialisé par CAYLA, digéré par BglII et PstI) ou d'un fragment PstI-Asp718I de 0,9 kb dans pAPT 110 (digéré par PstI et Asp718l) , ont permis d'obtenir des plasmides recombinants stables appelés respectivement pUT126 et pUT125.

Des amorces oligonucléotidiques ont été synthétisées sur la base des vecteurs de clonage pUT106 et pAPTUO pour initier le séquençage des fragments insérés dans le sens PstI vers Asp718l pour pUT125 et PstI vers BglII pour pUTl26. Les séquences obtenues à l'aide de ces amorces ont été utilisées pour définir de nouvelles amorces et ainsi poursuivre le séquençage des fragments insérés. Cette stratégie a permis d'obtenir des informations concernant la séquence des deux brins de 1288 paires de base. La séquence contenait une région codante de 642 nucleotides qui encode une protéine de près de 25 kD. La comparaison des séquences protéiques des dTMP kinases humaine, de levures ou des virus de la vaccine, de la variole ou de la fièvre du porc africain avec cette protéine d' E. coli déduite de la séquence nucléotidique, démontrait une forte homologie, indiquant bien que le gène de la dTMP kinase d' E. coli a été clone.

Le codon stop du gène tmk d'JE.coli et le codon d'initiation proposé pour holB [Carter et coll. J Bacteriol 175, 3812-22 (1993); Dong et coll. J Biol Chem 268, 11758-65

(1993)] sont imbriqués suggérant un couplage traductionnel de ces deux gènes, formant un opéron. La séquence d'une phase ouverte de lecture, située en amont du gène tmk, a été analysée par comparaison avec les squences déposées dans la banque de données GenBank. Une identité parfaite (100% d'homologie tant au niveau des acides aminés que des acides nucléiques) a été trouvée avec une protéine hypothétique d' E. coli mentionnée dans la région 3' du gène pabC, positionné au préalable à 25 minutes sur le chromosome d' E. coli [Gren et coll. J Bacteriol 174, 5317-23 (192)]. En fonction de ces résultats, il a été conclu que le gène tmk était situé juste avant le gène holB (24,95 min) et juste après la séquence génétique (dans le sens des aiguilles d'une montre sur la carte génétique) acpP-fabF-pabC-orfX. Pour faciliter les expériences de sous-clonage, le gène tmk d' E. coli a été modifié par PCR aux extrémités 5' et 3' terminales. Les sites Ncol et Mscl ont été introduits au début de la séquence codante du gène tmk pour faciliter la construction de fusions de gènes en 5' et optimiser la séquence d'initiation eucaryotique. La région C-terminale a été modifiée par l'introduction d'un site MluI, juste avant le codon stop, pour permettre la construction de fusions de gènes en ' , et d'un site Rsrll juste derrière le codon stop modifié pour faciliter le sous-clonage. La séquence tmk du pUT125 a été utilisée comme matrice pour la réaction d'amplification PCR à l'aide des amorces nucléotidiques suivantes:

En 5' terminal 5' AGGACCATGGCCAGAAGTAAG ATATCGTCA TGAGGGG 3'

En 3' terminal 5' TGCACGGACCGT ACGCGTCCAACTCCT CACCCAGTGG 3' L'activité enzymatique codée par le gène tmk d ' E. coli

a été démontrée par complémentation fonctionnelle d'un mutant dTMP kinase thermosensible de levure ( cdcβ) à température non "permissive". Le fragment d'ADN amplifié par PCR contenant le gène tmk modifié a été digéré par Mscl et Rsrll et introduit dans le vecteur navette E.coli-levure pUT377 (commercialisé par CAYLA) digéré par Mscl et Rsrll. Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer E. coli afin de préparer l'ADN du plasmide recombinant (pUT391) . La souche Saccharomyces cerevisiae CMY 616 (MAT α ura-3 leu-2 his-7 cdc-8 can 1-100) a été transformée avec pUT391. Tous les transformants ura ^* ' sélectionnés à 22°C, ont été ensuite repiqués sur des boites de milieu YEPD et testés pour leur croissance à 32°C (température non permissive du mutant cdc8) . Tous ont poussés à 32°C démontrant le phénotype tmk ^* . Quelques uns d'entre eux ont été étalés sur boites de milieu non sélectif pour obtenir des colonies ura ^" qui sont devenues sensibles à la température (phénotype tmk) , indiquant que la propriété de pousser à 32°C était bien corrélée à la présence du plasmide pUT391.

Exemple 5

Construction des gènes tdk: : tmk et tmk: :ndk

La séquence du gène tdk d'E.coli a été récemment publiée [Bockamp et coll. Gène 101 , 9-14 (1991); Black M.E. et Hruby D.E. Mol Wicrobiol 5, 373-9 (1991)]. La région codante de la thymidine kinase a été amplifiée par PCR en utilisant l'ADN chromosomique de la souche d' E. coli DH5α comme matrice et les amorces nucléotidiques suivantes (bases homologues en gras) : En 5' terminal 5' GTACCATOGCACAOC ATAT TCTACTAT 3' en 3 ' terminal 5 ' CTGGATCCCTAGGTCOTGαCGA GCCT TCC GAATAGCC 3 ' Le fragment PCR obtenu a été coupé par Ncol et Ba Hl

puis inséré à la place du fragment Ncol-Bcll de pUT599 (préparé à partir d'une souche d' E. coli dam ^" ) contenant le gène tk-HSVl pour donner pUT687.

Le fragment d'ADN obtenu par PCR contenant le gène tmk d' E. coli modifié (exemple 4), digéré par Ncol et MluI (traité par Klenow) , a été inséré dans pUT655 (dérivé de pUT599, commercialisé par CAYLA) ouvert au niveau des sites Ncol et PvuII pour donner pUT832.

Le fragment PCR contenant le gène tmk d' E. coli modifié (exemple 4) , digéré par Ncol et Rsrll a été inséré à la place du fragment Ncol-Rsrll de pUT599 contenant la fusion des gènes tk-HSVl et ble Sh pour donner pUT836.

Le fragment EcoRV-Notl de pUT832 contenant la fusion tmk (E. coli) : :ble Sh a été inséré dans pUT833 coupé par EcoRV et Notl pour donner pUT834.

La séquence du gène ndk d' E. coli a été récemment publiée [Hama et coll. Gène 105, 31 -6 (1991)]. La région codante du gène ndk a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche d' E. coli DH5α à l'aide des amorces nucléotidiques suivantes (bases homologues en gras) :

En 5' terminal 5'CCATATG(ΛTGGCTAT GAACGTACPTTT CCATCA CAAA 3 ' En 3 ' terminal 5' TGTGTCGACT AACGGGTGCGCGGGCACACTTCGCC 3'

Le fragment PCR obtenu a été coupé par Nsil et Sali puis inséré dans pUT614 ras à la place du fragment Nsil-Sall contenant le gène Jle Sh : : ras pour donner pUT692.

Le fragment Nco-SgrAI de pUT832 contenant la fusion tmk (E. coli) : :ble Sh a été inséré dans pUT692, coupé par Ncol et SgrAI pour donner pUT835.

Dans pUT837, le gène tmk d ' E. coli est fusionné en 3' en phase avec une séquence de 18 paires de base, codant pour un

bras polypaptidique flexible, et le gène ndk. Pour faciliter cette construction, une nouvelle amorce PCR 3' terminale a été utilisée pour modifier la région codante du gène tmk à partir de pUTl25 (bases homologues en gras) : En 5' terminal 5' AGGACCATGGCCAGAAOTAAG ATATCGTCATTGAGGσG 3' En 3' terminal 5' GACATGCATCCAGGTCCCTH3GTCOϋlCTCCT CACCCAσTGGG C 3'

Le fragment d'ADN obtenu par PCR contenant le gène tmk modifié du côté 3' a été digéré par Ncol et Nsil et introduit dans le vecteur pUT692 coupé par Ncol et Nsil pour donner PUT837.

La fonctionnalité des gènes hybrides contenant le gène tdk a été démontrée dans le mutant d'E.coli tdk ^" CL108 qui devient hypersensible à l'AZT après transformation par un plasmide exprimant le gène tdk. La fonctionnalité des gènes hybrides contenant le gène tmk a été démontrée avec le mutant tmk ^" TD205 d' E. coli par le niveau de résistance à la bromodésoxyuridine (30μg ml ^"1 ), un phénotype associé à l'allèle tmk dans la souche particulière TD205 [Binkley J.P. et Kue pel P.L. J Bacteriol 168, 1457-8 (1986)]

Exemple 6.

Clonage des gènes tk-VZV et tk-EBV. Les gènes tk du virus de l'herpès simplex codent à la fois les activités thymidine et thymidylate kinases. Des études cinétiques ainsi que l'alignement comparatif des séquences nucléiques révèlent ques les gènes des virus Varicella-Zooster

(tk-VZV) et d'Epstein-Barr(tk-EBV) pourraient eux-aussi être liés à une forte activité thymidylate kinase (Baer et al,

Na ture, 310, 207-211 (1984); Lttler et al., EMBO J. 5, 1959- 1966 (1986)) .

Afin de déterminer si les activité TKs de ces deux virus sont capables de phosphoryler l'AZT monophosphate, les gènes tk ont été clones et exprimés dans la souche d'E. coli CL108. Les gènes tk-VZV et tk-EBV ont été amplifiés en utilisant des techniques de PCR à partir d'un fragment EcoRI- BamHI de 2,2 paires de kilobase inséré dans l'AD du bactériophage mpl8 M13 (fourni par Dr R. Gaillard, Burroughs- Wellcome Co, USA) dans le cas de tk-VZV, et du plasmide pUC8X contenant le cadre ouvert de lecture BXLF1 du virus d'Epstein- Barr (fourni par Dr Y. Connolly, Institute for Cancer Research, RU). Les séquences nucléiques étant connues (Mori et al. Intervirology 29, 301-310 (1988); Robertson G. & Whalley J. M. Nucl . Acids Res . 16, 11303-11317) , ils ont été amplifiés tous deux grâce aux amorces oligonucléotidiques suivantes:

Extrémité 5' 5' GTACCATGGCATCAACGGATAAAACCGATGTAAAAATG 3 ' et

Extrémité 3 ' 5' CGCCCTAGGGAAGTGTTGTCCTGAAC 3 ' pour tk-VZV Extrémité 5' 5' GGGAGCGCTGGATT CCAGGAAAC 3' et

Extrémité 3 ' 5' AAGCCTAGGTCCCGAT TCCCCTC C 3 ' pour tk-EBV

Le fragment amplifié contenant tk-E. coli a été digéré par les enzymes Νcol et Avril puis inséré à la place du fragment ΝcoI-AvrII contenant le gène tk-HSV du plasmide pUT687 afin de créer le plasmide pUT820.

Le gène tk-EBV a été clone de façon similaire dans le vecteur pUT687 pour produire le vecteur pUT819. Le gène tdk-EBV contenant toutefois un site Νcol interne, le produit d'amplification PCR a été digéré par les enzymes Eco47III et

Avril. Le fragment Ncol-Avrll du plasmide pUT687 contenant le gène tk-E. coli a été remplacé par le fragment amplifié en pré¬ digérant le vecteur pUT687 pat l'ADN polymérase de Kleenow après coupure par Ncol. Les clones CL108 transformés par les fusions tk-

VZV: ;Jle Sh et tk-EBV; ;i>le Sh ont été sélectionnés sur milieu riche contenant 200 μg/ l de zéocine. L'expression des protéines hybrides a été vérifiée par immunodétection avec un antisérum de la protéine Sh qui a détecté des bandes de 50 kd et 80 kd respectivement. La fonctionnalité des gènes tk a été montrée par l'incapacité des transformants de pousser sur un milieu LB complémenté par 10 μg/ml d'AZT.

Exemple 7 Construction de vecteurs d 'expression porteurs de deux gènes suicides hybrides

Etape 1 : Construction de vecteurs d 'expression porteurs d 'un gène suicide

La construction de vecteurs d'expression portant deux gènes suicide hybrides comprend deux étapes. Dans la première étape, une série de plasmides contenant un seul gène suicide fusionné en phase avec le gène Jble Sh ont été construits. Tous ces plasmides dérivent du pUT 809, un plasmide obtenu par ligation du fragment Asel-BamHI de 2238 bp du pZEO-SVl (distribué par Cayla et Invitrogen, Genbank n°360849) portant le réplicon d ' E. coli col El, l'origine de replication du phage FI, l'amplificateur et le promoteur du gène précoce du cytomégalovirus humain, avec le fragment Asel-BamHI de 1764 bp du pUT 599 (catalogue Cayla) contenant le gène tk-HSVl : : ble Sh . Des cellules compétentes de la souche CL108 tdk ^" (isolée dans

l'exemple 1) ont été transformées avec le mélange de la ligation et une dilution appropriée a été étalée sur du milieu LB contenant 20 μg/ml de zeocine. L'analyse de la séquence d'ADN des plasmides des clones résistants à la zéocine incapables de croître sur le milieu LB + AZT (10 μg/ml) a confirmé la présence de pUT 809.

Ensuite le gène tk-HSVl : :ble Sh du pUT 599 a été successivement remplacé par les quatre gènes suivants : tk- EBV: ;Jble Sh tk-VZV: : ble Sh (tous deux décrits dans l'exemple 6), tdk: :tmk: :ile Sh , tmk: : ble Sh : :ndk (tous deux décrits dans l'exemple 5).

Les gènes de fusion, tk-EBV: : ble Sh , tk-VZV: : ble Sh et tdk: :tmk: :Jble Sh ont été isolés sous forme de fragments BbrPI-RsrlI à partir des plasmides pUT838, pUT 839 et pUT 840 respectivement. Le gène tdk: ;tmk: : ble Sh a été isolé sous forme d'un fragment Asel-Sall à partir de pUT 835 (Figure 2b) qui a substitué le fragment tk-HSVl : :ble Sh contenant le fragment Asel-Sall de pUT 809 pour donner pUT 841. Comme le pUT 809, les trois plasmides recombinants pUT 837, pUT 838 et pUT 839 sensibilisent fortement la souche CL108 à l'AZT et confèrent la résistance à la zéocine.

Etape 2 : Construction de vecteurs d 'expression porteurs de deux gènes suicide hybrides

Le fragment Ba HI codant pour les protéines hybrides CDase et UPRTase, isolé à partir du pUT 826

(Figure 2c) a été inséré dans le site unique Ba HI des pUT 838, pUT 839, pUT 840 et pUT 841 pour donner respectivement pZEO-SGl, pZEO-SG2, pZEO-SG3 et pZEO-SG4

(Figures 3a ₁₍ 3a ₂ , 3b _x et 3b ₂ ) . La bactérie réceptrice CL108 contenant l'un des trois plasmides recombinants pZEO-SGl,

FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 2β)

pZEO-SG2, pZEO-SG3 est sensible au FC, FU et AZT et est capable de pousser sur du milieu LB contenant 200 μg/ml de zéocine.

Les séquences nucléotidiques complètes de pZEO-SGl, PZEO-SG2, pZEO-SG3 et pZEO-SG4 ont été déposées à Genbank (USA) sous les numéros d'accession L37432; L37440, L37441 et L37442 respectivement.

Exemple 8

Les lignées cellulaires de mélanomes B16 exprimant les gènes codA;:ble Sh : : upp (ou fcyl : : ble Sh: : furl sont sensibles au FC) .

La lignée hautement métastatique de mélanome B16 de souris BL6, fournie par Dr S. Cros (Laboratoire de Pharmacologie et de Toxicologie Fondamentales, CNRS, France) a été utilisée pour déterminer l'efficacité des constructions selon l'invention dans les lignées de cellules tumorales. Les clones parentaux et recombinants ont poussé dans un milieu MB16, milieu RPMI1640 (GIBCO BRL) contenant de la L-glutamine, 10% de sérum de cheval (GIBCO BRL) , 2 h/1 de bicarbonate de sodium et ajusté à pH 7.

Le protocole de transfection cellulaire fut le suivant: les cellules à l'état de subconfluence ont été incubées à 37°C dans des boîtes de Pétri d'un diamètre de 35 mm contenant un ml de milieu MB16 sans sérum, 5 pmoles d'ADN plasmidique et 10 μg de polybrène (SIGMA). Après 20 heures d'incubation, les cellules ont été traitées pendant 3 minutes par du DMSO (Sigma) dilué 30% vol/vol dans le milieu MB16. Les cellules ont été ensuite lavées, incubées 72 heures dans le milieu MB16 puis diluées dans des boites de Pétri de diamètre 10 cm dans le milieu MB16 contenant 50 μg/ml de zéocine (CAYLA) . Après 20-25

jours, des clones résistants à la zéocine sont visibles. Trois clones ont été prélevés pour chaque construction, transferrés dans des boîtes à 24 puits puis incubés 7 jours dans un milieu contenant la zéocine. La résistance à la zéocine a permis la sélection des cellules transfectées.

La conversion séquentielle de cytosine marquée radioactivement en uracile puis de l'uracile en uracile monophosphate fut suivi in vitro à partir de lysats cellulaires afin de mettre en évidence les activités cytosine désaminase et uracile phosphoribosyltransférase. Cet essai a été effectué selon les méthodes déjà décrites (Mullen, 1992; Natalini et al., J. Biol . Chem . 254 , 1558-1563 (1979)) : environ 10 ⁶ cellules ont été lavées puis resuspendues dans 10 μl de Tris.HCl 100 mM pH7.8 / EDTA 1 mM / dithiothreitol ImM. Après cinq cycles de congélation-décongélation, 10 μl de lysat cellulaire furent incubés 4 heures en présence de cytosine tritiée et d'uracile marqué au carbone 14. Ces échantillons, auxquels ont été ajoutés 0,4 mg/ml de cytosine, uracile et uracile monophosphate non marqués ont été déposés sur plaques de chromatographie couche mince (plaques Kodak 13254) puis révélés par du 1-butanol (85%) . La radioactivité liée aux bandes découpées sous UV à faible longueur d'onde relative aux molécules de cytosine, uracile et uracile monophosphate a été estimée dans un compteur à scintillation. Le Tableau 2 montre l'influence des deux activités au niveau de la toxicité à la 5FC. De plus l'expression de l'une ou l'autre de ces fonctions n'a pas d'effet négatif sur la croissance cellulaire en absence de 5FC.

Tableau 2: Concentrations Minimales Inhibitrices d'AZT et de 5FC (μg/ml) vis-à-vis de melanomes B16 transfectés par des plasmides portant des gènes suicide gouvernant des voies métaboliques de la biosynthèse des pyrimidines.

Plasmide AZT FC

300 >500

PUT687 ftdk: :ble Sh) 300 ND pUT832 (tmk: :ble Sh) 10 ND pUT834 Ctdk: :tmk: : ble Sh) 1 ND

PUT816 CcodA::Jle Sh) ND 250

PUT814 (ble Sh : : pp) ND 500 pUT825 (codA: : bl eSh : : upp) ND 5 pUT827 (fcyl : :ble Sh) ND 500

PUT828 (ble Sh : : furl ) ND 500 pUT829 ( fcyl : : ble Sh : : furl ) ND 10

Les valeurs indiquées sont les moyennes obtenues après trois expériences identiques. ND: non déterminée

Exemple 9:

Les lignées cellulaires de melanomes B16 exprimant les gènes tdJ ; ;tmk:;Jle Sh et tk-EBV: :Jle Sh sont sensibles à l 'AZT.

Les cellules de melanomes ont été transfectées comme décrit à l'exemple 8 en sélectionnant sur milieu MB16 contenant de la zéocine. Le Tableau 2 montre que la présence de l'activité thymidylate kinase augmente la métabolisation de l'AZT via la voie de récupération des pyrimidines d'un facteur

de 300 (tdk: :tmk: :JbIe Sh) et de 15 ( tk-EBV: : ble Sh) respectivement.

Exemple 10: Les lignées cellulaires de mélanome B16 exprimant à la fois les gènes tdk: : ble Sh : : tmk ou tk-EBV: : ble Sh et le gène codA : : upp sont très sensibles à l 'AZT et au FC.

Les cellules B16 ont été transfectés comme décrit exemple 8 en sélectionnant sur milieu MB16 contenant de la zéocine. Les plasmides utilisés ont été construits dans 1'optique de bloquer la voie de biosynthèse de novo des pyrimidines grâce à la fusion codA::upp (Cf exemple 2) en présence de 5-FC et ce afin d'abaisser le taux intracellulaire de dTTP et donc d'amplifier l'effet toxique de l'AZT. Le Tableau 3 indique qu'une telle conception permet de réduire considérablement les doses létales en AZT.

Tableau 3: Concentrations Minimales Inhibitrices en présence d'AZT (en μg/ml) et en présence de FC (2.5 μg/ml) vis-à-vis de melanomes B16 transfectés par des plasmides portant des gènes suicide gouvernant des voies métaboliques de la biosynthèse des pyrimidines. Plasmide AZT

-FC +FC pZEO SGI 20 1 pZEO SG2 300 300 pZEO SG3 1 <1 pZEO SG4 10 1

Les valeurs indiquées sont les moyennes obtenues après trois expériences identiques. ND: non déterminée

Exemple 11 :

Les lignées cellulaires de melanomes B16 exprimant à la fois le gène tk-VZV: : ble Sh et le gène codA: : upp sont très sensibles à 1 'AZT et au FC. En utilisant le même protocole que celui décrit plus haut, les résultats présentés Tableau 3 ont été obtenus.

La Figure 1 illustre le mécanisme de l'association fluorocytosine et AZT. Dans cette Figure, les abréviations suivantes sont utilisées :

- U : uracile,

- UdR : uridine,

- FU 5-fluorouracile,

- FC 5-fluorocytosine,

- Td thymidine.

Les chiffres 1 à 10 correspondent aux enzymes suivantes :

1 - uridine phosphorylase

2 - uridine kinase 3 - uridine phosphorylase

4 - uridine kinase

5 - uracile phosphoribosyltransférase

6 - cytosine désaminase

7 - thymidylate synthétase 8 - thymidylate kinase

9 - nucleoside diphosphokinase 10- thymidine kinase.

FΘΛLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)