DESCRIPTION

L'invention concerne une composition à base d'au moins un polysaccharide sulfaté, notamment issu d'une algue, et associé à au moins un ingrédient alimentaire. Cette composition est utile notamment dans le domaine alimentaire ou dans le traitement ou la prévention d'une infection provoquée par une microsporidie chez l'homme ou l'animal.

Elle possède des propriétés utiles comme agent antiparasitaire chez l'homme ou l'animal ; pour le traitement ou la prévention d'une infection provoquée par au moins une microsporidie chez l'homme ou l'animal ; en particulier pour le traitement ou la prévention chez l'abeille d'une infection provoquée par la microsporidie Nosema, de préférence Nosema ceranae ou Nosema apis, ou encore pour stimuler les défenses immunitaires de l'abeille.

L'invention concerne également l'utilisation d'un polysaccharide sulfaté comme agent antiparasitaire chez l'homme ou l'animal dans le traitement ou la prévention d'au moins une infection causée par au moins une microsporidie chez l'homme ou l'animal, de préférence par la microsporidie Nosema chez l'abeille.

L'invention concerne également une méthode pour traiter ou prévenir une infection causée par au moins un parasite chez l'abeille, comprenant l'administration d'une composition selon l'invention.

L'invention concerne également une méthode de production de miel en présence d'une infection causée par au moins un parasite, comprenant l'administration chez l'abeille d'une composition selon l'invention.

L'invention concerne également une méthode pour maintenir la pollinisation des plantes par des abeilles infectées par au moins un parasite, comprenant l'administration d'une composition selon l'invention.

L'invention concerne également une méthode pour stimuler les défenses immunitaires chez l'abeille, comprenant l'administration d'une composition selon l'invention.

US 2003/0181416 concerne une méthode de traitement d'infection microbienne des mammifères au moyen d'un polysaccharide sulfaté.

JP 1 1080003 divulgue un agent de traitement antiparasitaire comprenant un polysaccharide sulfaté. JP 1 1080003 divulgue de manière générique fucoidan, rhamnan sulfaté et carraghenane comme polysaccharides.

Chen et al. (Growth-inhibitory effect of a fucoidan from brown seaweed Undaria pinnatifida on Plasmodium parasites de Chen et al., publié en septembre 2008) rapporte les résultats d'une étude de l'effet antiparasitaire sur Plasmodium falciparum et Plasmodium berghei de trois fractions de fucoidane issues d'une algue brune, Undaria pinnatifida. WO 02/02189 divulgue l'utilisation de polysaccharides sulfatés, notamment de la cellulose sulfatée ou du dextran sulfaté, dans des traitements antiparasitaires. Ces polysaccharides peuvent être administrés sous forme de capsules comestibles ou encore sous forme de crème ou de gel. US 201 1/0172156 concerne l'administration de polysaccharides sulfatés pour améliorer la coagulation sanguine chez un patient. Ces polysaccharides peuvent être extraits d'algues brunes.

WO 2009/14471 1 divulgue une composition nutritive ou cosmétique comprenant un métal et un polysaccharide sulfaté issu d'une microalgue rouge. Cette composition a pour but de permettre l'administration du métal qu'elle contient. Elle est utile pour des traitements nutritionnels ou dermatologiques et possède des propriétés antimicrobiennes. PT 103983 divulgue l'utilisation de polysaccharides sulfatés en tant qu'agents antiviraux ou antibactériens.

Aucun de ces documents ne concerne la prévention ou le traitement d'une infection provoquée par une microsporidie chez l'homme ou l'animal.

Les microsporidies, organismes eucaryotes unicellulaires apparentés aux champignons, sont des parasites intracellulaires obligatoires formant des spores de petite taille qui peuvent persister dans l'environnement pendant de très longs mois. Parmi les 1 300 espèces actuellement répertoriées, la majorité parasite les arthropodes et les poissons. Certaines microsporidies sont ainsi à l'origine de pertes économiques conséquentes en aquaculture, notamment dans les élevages de saumons ou de crevettes. Plusieurs espèces sont également responsables de diverses infections chez les mammifères y compris chez l'homme.

La nosémose, dont l'agent causal est la microsporidie Nosema sp., est l'une des maladies les plus fréquemment rencontrées chez les abeilles adultes. Cette microsporidie s'attaque aux cellules de l'épithélium intestinal de l'insecte et provoque une nosémose aiguë caractérisée par des traces de diarrhée dans les ruches. Elle peut réduire l'espérance de vie des colonies. Récemment, Nosema ceranae une microsporidie parasite de l'abeille asiatique {Apis cerana), a été détectée dans des colonies d'abeilles européennes (Apis mellifera) présentant des signes d'affaiblissement (Higes et al., Nosema ceranae, a new microsporidian parasite in honeybees in Europe. J Invertebr Pathol (2006), 92(2), 93-95 ; Cox-Foster et al., al., A metagenomic survey of microbes in honey bee colony collapse disorder. Science (2007) 318(5848), 283-287).

Étant donnée l'importance écologique (biodiversité), agronomique (rendement agricole) et économique (apiculture) que revêt l'abeille de par ses activités de pollinisation et de production de miel, l'émergence de ce microorganisme a soulevé de nombreuses inquiétudes au sein des communautés scientifique et apicole.

Par ailleurs, l'infection par Nosema ceranae provoque une baisse de l'immunité chez l'abeille (Antùnez et al. , Immune suppression in the honey bee (Apis mellifera) following infection by Nosema ceranae (Microsporidia). Environ Microbiol (2009) 1 1 (9), 2284-2290), la rendant ainsi plus susceptible aux autres infections.

La principale molécule utilisée en traitement contre la nosémose est la fumagilline. Toutefois, cette molécule a été récemment interdite dans de nombreux pays européens, dont la France.

Ainsi, la recherche de nouvelles molécules s'avère nécessaire afin d'identifier des traitements antiparasitaires efficaces, sans effet néfaste sur l'hôte parasité et ne générant pas de résidus dangereux dans les denrées alimentaires issues de la ruche.

La composition selon l'invention permet d'apporter une solution à tout ou partie de ces problèmes ou inconvénients de l'état de la technique.

Ainsi, l'invention fournit une composition comprenant au moins un polysaccharide sulfaté et au moins un ingrédient alimentaire, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une infection provoquée par une microsporidie chez l'homme ou l'animal.

Ainsi, l'ingrédient alimentaire de la composition selon l'invention correspond à la portion de cette composition excluant le polysaccharide sulfaté.

De manière avantageuse, la concentration en poids de polysaccharide sulfaté dans la composition selon l'invention va de 0,01 à 2%, préférentiellement de 0,1 à 1 %.

De manière préférée, la composition selon l'invention comprend un polysaccharide sulfaté qui est d'origine naturelle.

De manière avantageuse, la composition selon l'invention peut comprendre au moins un polysaccharide sulfaté issu d'une macroalgue, d'une microalgue ou d'une cyanobactérie ou encore un mélange de polysaccharides sulfatés issus d'une macroalgue, d'une microalgue ou d'une cyanobactérie.

Comme exemples de polysaccharides sulfatés d'origine naturelle, la composition selon l'invention comprend préférentiellement au moins un polysaccharide sulfaté issu d'une macroalgue, de préférence choisie parmi les macroalgues rouges, les macroalgues vertes ou les macroalgues brunes.

De manière toute préférée, la composition selon l'invention comprend au moins un polysaccharide sulfaté issu

- d'une macroalgue rouge, notamment choisie parmi les Rhodophycées productrices d'agar, de carraghénanes, de porphyranes, de furonanes ou de galactanes sulfatés complexes, préférentiellement des genres Gracilaria, Halymenia, Gelidium, Pterocladia, Acanthopeltis, Campylaephora, Ceranium, Euchema , Chondrus, Porphyra, Laurencia, Furcellaria, Gloiopeltis et Iridea ;

- d'une macroalgue verte, notamment choisie parmi les Chlorophycées produisant des polysaccharides de type ulvane, de préférence du genre Ulva ;

- d'une macroalgue brune, notamment choisie parmi les Phéophycées productrices de fucanes sulfatés, préférentiellement des genres Fucus, Aschophyllum ou Cladosiphon.

Les polysaccharides issus des macroalgues rouges sont préférentiellement construits sur la base d'un enchaînement linéaire d'unités 3-p-galactopyranoses et 4-a- galactopyranoses alternant régulièrement. L'unité β-galactose appartient toujours à la série D, alors que l'unité α-galactose est de configuration D chez les carraghénanes et L chez les agarocolloïdes (par exemple l'agar, le porphyrane, le furonane). Par ailleurs, une partie des résidus 4-a-galactopyranoses peut exister sous la forme de 3,6-anhydrogalactose. La forme 3,6-anhydrogalactose est obtenue par une élimination de l'ester sulfate porté par le carbone 6 de l'unité a-galactose liée en 4, sous l'action de galactose-6-sulfurylases lors de la biosynthèse ou par un traitement alcalin. Certains groupements hydroxyles de ces unités galactopyranoses peuvent être sulfatés, méthylés, pyruvilés ou encore substitués par un monosaccharide Les galactanes sulfatés issus de macroalgues rouges peuvent être représentés par la formule (I) (Delattre et al, Galactans: An Overview of their Most Important Sourcing and Applications as Natural Polysaccharides. Brazilian Archives of Biology and Technology, 201 1 , 54 : 1075-1092) :

(i)

dans laquelle :

• R _A 2 représente un atome d'hydrogène ou S0 ₃ ^" ;

• R _A 4 représente un atome d'hydrogène, S0 ₃ ^" ou l'acide pyruvique;

• R _A 6 représente un atome d'hydrogène, un groupement méthyle, S0 ₃ ^" ou l'acide pyruvique;

• R _B 2 représente un atome d'hydrogène, un groupement méthyle ou S0 ₃ ^" ;

• R _B3 représente un atome d'hydrogène;

• R _B 6 représente un atome d'hydrogène ou S0 ₃ ^" .

Comme exemples de macroalgues vertes, on peut citer les espèces appartenant aux genres Ulvella, Ulva, Caulerpa, Codium, Bryopsis.

En général, trois familles de polysaccharides composent les polysaccharides matriciels d'algues vertes.

La première, majoritaire, est constituée d'un xylorhamnoglycuronane sulfaté désigné par le terme ulvane.

Les polymères de ce type sont solubles dans l'eau et se distinguent des autres polysaccharides extraits d'algues par leur teneur importante en rhamnose (30 à 50 %), en acide glucuronique (10 à 20 %) et en sulfate (16 à 19 %) (Lahaye et al, Structure and function properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds; Biomacromoleculs 8 (2007) 1765-1774 ; Lahaye, NMR spectroscopic characterization of oligosaccharides from two Ulva rigida ulvan samples (Ulvales, Chlorophyta) degraded by a lyase. Carbo ydrate Research (2008) 314 : 1-12). Chez l'espèce Ulva lactuca, les principaux motifs sont composés d'ulvanobiuronate-3- sulfate de type A comprenant du a-L-rhamnose-3-sulfate lié à de l'acide β-D- glucuronique par une liaison de type (1 ,4) et de l'ulvanobiuronate-3-sulfate de type B comprenant du a-L-rhamnose-3-sulfate lié à de l'acide α-L-iduronique par une liaison de type (1 ,4) (McKinnel et al, The acid polysaccharide from the green seaweed, Ulva lactuca. Journal of Chemical Society (1962) 398-399.; Quemener et al, Sugar détermination in ulvans by a chemical-enzymatic method coupled to high performance anion exchange chromatography. Journal of Applied Phycology (1997) 9 : 179-188). Ces motifs issus de l'ulvane ont été récemment complétés par l'identification de structures de type ulvanobioses (Robic, A., Rondeau-Mouro, C, Sassi, J.F., Lerat, Y., Lahaye M. (2009). Structure and interactions of ulvan in the cell wall of the marine green algae Ulva rotundata (Ulvales, Chlorophyceae). Carbohyd. Pol. 10 : 210-216).

Les ulvanes peuvent être représentés par les formules A _3s , B _3s , U _3s et U ₂ ' _3s :

2's3s

La deuxième famille de polysaccharides est composée de D-xyloglucanes liés en β- (1 ,4) et de D-glucuronanes liés en β-(1 ,4). Ces composés peuvent également être représentés par les formules A _3s , B _3s , U _3s et U ₂ ' _3s - La dernière famille est représentée par de la «cellulose» amorphe, contenant des résidus xyloses. Chez les algues vertes de l'ordre des Cladophorales et des Codiales, on peut trouver également des xyloarabinogalactanes sulfatés. Ce sont des polymères composés de galactose, d'arabinose et de xylose. Ils comportent environ 17 % de sulfate. Il n'y a pas vraiment d'unité répétitive, mais plutôt des portions comportant des blocs de (1 ,4)-L-arabinoses, séparés par des unités D-galactoses. Toutes les unités D-xyloses et une partie des unités D-galactoses sont en position terminale. De manière avantageuse, la macroalgue brune est choisie parmi les Phéophycées productrices de fucanes sulfatés, préférentiellement du genre Fucus, Aschophyllum ou Cladosiphon.

Les fucanes représentent un ensemble de polysaccharides sulfatés contenant majoritairement du L-fucose mais également d'autres oses comme le galactose, le mannose, le xylose et des acides uroniques (Melo et al, Isolation and characterization of soluble sulphated polysaccharide from the red seaweed Gracilaria cornea. Carbohydrate Polymers (2002) 49 : 491-498) dont la teneur est inférieure à 10 % (Berteau et al, Sulfated fucans, fresh perspectives : structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide. Glycobiology (2003) 13 (6) : 29-40).

Les fucanes extraits des algues de l'ordre des Fucales {Fucus sp., Ascophyllum sp.) sont des polysaccharides hautement ramifiés (Berteau et al 2003; Patankar et al., 1993; Bilan et al., 2002, 2004, 2006) formés d'une chaîne principale composée de L- fucoses liés en a-(1 ,3) ou en β-(1 ,4) et variablement substitués par 1 ou 2 non sucres (sulfate ou acétate) sur le C2, le C3 ou le C4. Ce sont des homofucanes (Chevolot et al., 1999, 2001 ; Bilan et al., 2002, 2004, 2006; Chizhov et al., 1999). Les ramifications peuvent être monosaccharidiques (Chizhov et al, A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda fi ^' lum. Carbohydrate Research (1999) 320 : 108- 1 19) ), trisaccharidique (Bilan et al, A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus. Carbohydrate Research (2004), 339: 51 1-517) ou tétrasaccharidique (Bilan et al, Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens.Ag. Carbohydrate Research (2002) 337: 719-730). Enfin, la présence de xylose ou galactose en faible quantité a pu être détectée mais leur localisation n'a pas été déterminée (Bilan et al., 2002). Comme autre polysaccharide d'origine naturelle, la composition selon l'invention peut également préférentiellement comprendre un polysaccharide sulfaté issu d'une microalgue, de préférence choisie parmi les microalgues rouges ou les cyanobactéries.

De manière tout aussi préférée, la composition selon l'invention comprend au moins un polysaccharide sulfaté issu

- d'une microalgue rouge choisie parmi les espèces appartenant au genre Porphyridium ou au genre Rhodella ;

- d'une cyanobactérie choisie parmi les espèces appartenant au genre Arthospira comme Arthospira platensis.

Les exopolysaccharides produits par des microalgues rouges marines sont principalement décrits chez les espèces appartenant aux genres Porphyridium et Rhodella. Ces polysaccharides sont des hétéropolymères variablement sulfatés et composés de monosaccharides neutres (xylose, glucose, galactose, mannose, arabinose, fucose), de monosaccharides méthylés (3-O-methyl xylose, 3-0 et 4-0- methyl galactose), d'acides uroniques (acide glucuronique) et d'acides uroniques méthylés (2-O-methyl-acide glucuronique). Les polysaccharides des différentes espèces présentent plusieurs types de liaisons glycosidiques mais ont comme point commun la présence de blocs constitutifs constitués d'un disaccharide qualifié d'acide aldobiouronique (Arad et al, Red microalgal cell-wall polysaccharides: biotechnological aspects. Current opinion in Biotechnology (2010) 21 : 358-364; Capek et al, The extracellular proteoglycan produced by Rhodella grisea. International Journal of Biological macromolecules (2008) 43, 390-393).

Les cyanobactéries produisent des exopolysaccharides de structures très complexes et caractérisées par la présence d'acides uroniques (acides glucuronique et galacturonique) et de groupements sulfate qui confèrent une nature anionique au polysaccharide. Ils sont en outre caractérisés par la présence de taux importants de groupements acétate, de fractions peptidiques et de desoxy-monosaccharides. La plupart des exopolysaccharides décrits chez les cyanobactéries sont composés d'au moins 6 monosaccharides différents et à ce jour 12 monosaccharides ont pu être identifiés chez les EPS de cyanobactéries. Parmi les hexoses on trouve le glucose, le galactose, le mannose et le fructose. Les pentoses sont quant à eux principalement représentés par le ribose, le xylose et l'arabinose alors que les desoxyoses identifiés sont le fucose, le rhamnose et le méthyl rhamnose. Dans certains cas la présence de monosaccharides modifiés comme la N-acétyl glucosamine, le 2,3-O-méthyl rhamnose et le 3-O-methyl glucose ont été décrits. Ces différents monosaccharides sont liés par une large gamme de liaisons glycosidiques (Pereira et al, Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides : composition, structures, inducing factors and putative gènes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiol. Rev. (2009) 33 : 917-941 ).

De manière également avantageuse, la composition selon l'invention peut comprendre au moins un polysaccharide sulfaté obtenu par modification chimique d'un polysaccharide. Le polysaccharide est alors obtenu après avoir été modifié par voie chimique.

De manière habituelle, la composition selon l'invention comprend au moins un polysaccharide sulfaté dont le taux de sulfatation en poids est supérieur ou égal à 5%, de préférence ce taux va de 5 à 50%, avantageusement de 5 à 30%.

La composition selon l'invention peut comprendre des quantités relativement importantes d'au moins un polysaccharide sulfaté.

Généralement, la concentration massique de polysaccharide sulfaté dans la composition selon l'invention va de 50 à 1 000 μg/mL, préférentiellement de 100 à 1 000 μg/mL, avantageusement de 100 à 200 μg/mL.

La composition selon l'invention comprend également au moins un ingrédient alimentaire combiné à au moins un polysaccharide sulfaté.

De manière avantageuse, la concentration en poids de l'ingrédient alimentaire dans la composition selon l'invention va de 98% à 99,99%.

De manière générale, l'ingrédient alimentaire de la composition selon l'invention est un ingrédient qui peut être utilisé dans une composition alimentaire à destination de l'homme ou de l'animal. Cet ingrédient alimentaire répond notamment aux conditions de sécurité et de non-toxicité liées à une telle utilisation.

De manière préférée, la composition selon l'invention comprend au moins un ingrédient choisi parmi un agent protéique alimentaire, un sucre dont le saccharose, du miel ou un de leurs mélanges. De manière avantageuse, la composition selon l'invention comprend un ingrédient alimentaire dont la concentration en poids dans la composition va de 98% à 99,99%, de préférence de 99 à 99,9%. De manière préférée, la composition selon l'invention comprend un ingrédient alimentaire choisi parmi le miel, le saccharose, le fructose, le glucose ou le maltose, de préférence le saccharose, le miel ou leurs mélanges.

Les mélanges préférés d'ingrédient alimentaires pour la composition selon l'invention sont choisis parmi les mélanges de protéines, de miel et de saccharose ; les mélanges de miel et de saccharose. La composition selon l'invention peut comprendre d'autres combinaisons d'ingrédients alimentaires.

Dans la composition selon l'invention le ratio en poids (polysacchande sulfaté/ingrédient alimentaire) peut varier de manière relativement importante.

Généralement, le ratio en poids (polysacchande sulfaté/ingrédient alimentaire) dans la composition selon l'invention va de 0,0001 à 0,002, préférentiellement de 0,0002 à 0,001 , avantageusement de 0,0002 à 0,0005.

La forme de la composition peut être définie de manière assez large. Ainsi, la composition selon l'invention peut notamment se présenter sous forme solide, pâteuse ou liquide.

L'invention concerne également une méthode de préparation d'une composition selon l'invention.

De manière générale, la méthode de préparation selon l'invention comprend le mélange d'au moins un polysaccharide sulfaté et d'au moins un ingrédient alimentaire.

La méthode de préparation de la composition selon l'invention peut notamment comprendre une étape de sulfatation d'au moins un polysaccharide.

Cette étape de sulfatation peut être appliquée à un polysaccharide peu ou pas sulfaté ou à un polysaccharide sulfaté afin d'en accroître le taux de sulfatation.

De manière préférée, la méthode de préparation d'une composition selon l'invention comprenant un polysaccharide sulfaté issu d'une macroalgue, comprend:

- la mise en solution du polysaccharide sulfaté de la macroalgue, éventuellement dépigmentée préalablement, par chauffage à reflux dans l'eau à une température allant de 50 à 100 °C,

- la précipitation par au moins un solvant polaire ou par dialyse du polysaccharide sulfaté,

- le séchage du polysaccharide sulfaté.

La méthode de préparation selon l'invention peut comprendre une étape préalable de dépigmentation de la macroalgue, en particulier au moyen d'au moins un solvant qui peut être choisi parmi l'acétone ou le chloroforme.

De manière avantageuse, la précipitation peut être réalisée au moyen d'un solvant polaire, par exemple l'éthanol ou le propanol.

De manière également avantageuse, le séchage peut être réalisé par lyophilisation ou au moyen d'une étuve, notamment à une température de 50°C.

La méthode de préparation selon l'invention peut être renouvelée plusieurs fois afin d'obtenir un degré de pureté du polysaccharide satisfaisant.

De manière également préférée, la méthode de préparation d'une composition selon l'invention comprenant un polysaccharide sulfaté issu d'une microalgue, comprend:

- la culture de la microalgue, de préférence dans un photobioréacteur,

- la concentration du milieu de culture après extraction de la biomasse, sous vide et à une température allant de 30°C à 50°C,

- l'extraction du polysaccharide sulfaté par diafiltration, précipitation ou dialyse,

- le séchage du polysaccharide sulfaté.

De manière avantageuse, la concentration du milieu est réalisée à une température de 40°C.

De manière également avantageuse, l'extraction par précipitation peut être effectuée par centrifugation.

De manière également avantageuse, le séchage peut être réalisé par lyophilisation ou au moyen d'une étuve, notamment à une température de 50°C.

La méthode de préparation selon l'invention peut être renouvelée plusieurs fois afin d'obtenir un degré de pureté du polysaccharide satisfaisant.

De manière également préférée, la méthode de préparation d'une composition selon l'invention met en œuvre un polysaccharide sulfaté obtenu par modification chimique d'un polysaccharide.

Ce polysaccharide sulfaté peut être préparé par un procédé comprenant une étape de sulfatation. Cette étape de sulfatation peut être effectuée par différentes méthodes connues en tant que telles. On peut notamment réaliser cette sulfatation au moyen d'un complexe S0 ₃ /pyridine ou S0 ₃ /DMF.

L'objectif de cette étape de sulfatation est de conférer au polysaccharide un taux de sulfatation suffisant pour l'utilisation de la composition selon l'invention ou encore cet objectif vise à augmenter le taux de sulfatation du polysaccharide.

L'invention concerne également l'utilisation d'une composition selon l'invention ainsi qu'une composition selon l'invention pour son utilisation :

- antiparasitaire chez l'homme ou l'animal ;

- dans le traitement ou la prévention d'une infection provoquée par au moins une microsporidie chez l'homme ou l'animal ;

- dans le traitement ou la prévention chez l'abeille d'une infection provoquée par la microsporidie Nosema, de préférence Nosema ceranae ou Nosema apis ;

- pour stimuler les défenses immunitaires de l'abeille.

L'invention concerne également l'utilisation d'une composition selon l'invention ainsi qu'une composition selon l'invention pour son utilisation pour la production de miel, en présence d'une infection provoquée par au moins un parasite, et comprenant l'administration à des abeilles d'une composition selon l'invention.

L'invention concerne également l'utilisation d'une composition selon l'invention ainsi qu'une composition selon l'invention pour son utilisation pour maintenir la pollinisation des plantes par des abeilles infectées par au moins un parasite, et comprenant l'administration à des abeilles d'une composition selon l'invention.

L'invention concerne également une composition selon l'invention pour son utilisation antérieure, simultanée, complémentaire, séquencée, alternée ou postérieure à un traitement pour lutter contre Varroa destructor.

Varroa destructor est un acarien hématophage parasite des abeilles adultes, des larves et des nymphes.

Ainsi, l'utilisation d'une composition comprenant au moins un polysaccharide sulfaté et au moins un ingrédient alimentaire est susceptible de maintenir dans le temps, voire de favoriser l'efficacité d'un traitement pour lutter contre Varroa destructor.

La composition utilisée selon l'invention est définie selon l'ensemble des caractéristiques générales, avantageuses ou préférées de la composition selon l'invention. L'invention fournit également un kit comprenant :

- une composition selon l'invention, - un agent pour la lutte contre ou la prévention du Varroa destructor, ainsi qu'un tel kit pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des infections issues de la microsporidie Nosema et de Varroa destructor chez l'abeille. L'invention concerne également un polysaccharide sulfaté défini pour la composition selon l'invention, pour son utilisation :

- antiparasitaire chez l'homme ou l'animal ;

- dans le traitement ou la prévention d'une infection provoquée par au moins une microsporidie chez l'homme ou l'animal ;

- dans le traitement ou la prévention chez l'abeille d'une infection provoquée par la microsporidie Nosema, de préférence Nosema ceranae ou Nosema apis ;

- pour stimuler les défenses immunitaires de l'abeille.

L'invention concerne également un polysaccharide sulfaté défini pour la composition selon l'invention pour son utilisation antérieure, simultanée, complémentaire, séquencée, alternée ou postérieure à un traitement pour lutter contre Varroa destructor.

Le polysaccharide selon l'invention est défini selon l'ensemble des caractéristiques générales, avantageuses ou préférées du polysaccharide de la composition selon l'invention.

Les exemples qui suivent sont donnés à titre d'illustration des différents aspects de l'invention.

Préparation des polvsaccharides sulfatés

· Polysaccharide sulfaté 1 (PS1 ) : iota carraghénane

L'extraction a été basée sur une extraction alcaline (NaOH 0.1 à 1 M) à chaud (60 à 90°C) pendant plusieurs heures, d'un mélange d'algues rouges marines appartenant aux genres Euchema, Kappaphycus, Chondrus et Betaphycus. La suspension obtenue a été filtrée afin d'éliminer les débris cellulaires et précipitée par addition d'isopropanol. Le précipité a ensuite été pressé et séché.

Les iota carraghenanes comprennent une unité de répétition 3-p-D-galactopyranoses et 4-a-D-galactopyranoses alternant régulièrement. Cette dernière unité est sous forme anhydrogalactose à taux de sulfatation significatifs (30 à 50% en moyenne). Le taux moyen de sulfatation est de l'ordre de 30 %

• Polysaccharide sulfaté 2 (PS2) L'extraction a été réalisée après culture d'une microalgue rouge de type Rhodella violacea (souche LMGE) sur milieu Hemerick ou f/2.

L'extraction de la biomasse issue de cette culture a été réalisée par centrifugation à 10 000 g x 30 min à 10°C. Le surnageant a ensuite été concentré (x2) sous vide à 60°C puis dialysé 72 heures contre de l'eau milliQ (9 bains) puis le retentât a été séché par lyophilisation.

La composition en monosaccharides du PS2 ainsi obtenu a été déterminée par chromatographie ionique : xylose (20%), galactose (3%), glucose (0.5%), acide glucuronique (2.5%), arabinose (2%), rhamnose (3%). Les pourcentages sont des pourcentages massiques.

• Polysaccharide sulfaté 3 (PS3)

L'extraction a été réalisée après culture sur milieu f/2 d'une microalgue rouge de type Rhodella violacea (kornmann) Wehrmeyer CCAP 1388/5. L'extraction de la biomasse issue de cette culture a été réalisée par centrifugation à 10 000 g x 30 min à 10°C. Le surnageant a ensuite été concentré (x2) sous vide à 60°C puis dialysé 72 heures contre de l'eau milliQ (9 bains) puis le retentât a été séché par lyophilisation. La composition en monosaccharides du PS3 ainsi obtenu a été déterminée par chromatographie ionique : xylose (20%), galactose (3%), glucose (0.5%), acide glucuronique (2.5%), arabinose (2%), rhamnose (3%). Les pourcentages sont des pourcentages massiques. · Polysaccharide sulfaté 4 (PS4)

L'extraction a été réalisée après culture sur milieu f/2 d'une microalgue de type Rhodella maculata CCAP 1388/2 (cf Evans et al, Studies on the synthesis and composition of extracellular mucilage in the unicellular red alga Rhodella, J.Cell Sci, 1974, 16, 1 -21 ).

L'extraction de la biomasse issue de cette culture a été réalisée par centrifugation à 10 000 g x 30 min à 10°C. Le surnageant a été concentré (x2) sous vide à 60°C puis dialysé 72 heures contre de l'eau milliQ (9 bains) puis le retentât a été séché par lyophilisation.

Les exopolysaccharides de Rhodella maculata comprennent des glucides (50%), des protéines (16%) et une part significative de sulfate (10%). Le monosaccharide majoritaire est le xylose. Des acides uroniques, du galactose et du glucose ont également été identifiés.

• Polysaccharide sulfaté 5 (PS5)

L'extraction a été réalisée après culture sur milieu f/2 d'une microalgue de type Porphyridium purpureum (Bory) Drew & Ross (1965) CCAP 1380/1 A.

L'extraction de la biomasse issue de cette culture a été réalisée par centrifugation à 10 000 g x 30 min à 10°C. Le surnageant a ensuite été concentré (x2) sous vide à 60°C puis dialysé 72 heures contre de l'eau milliQ (9 bains) puis le retentât a été séché par lyophilisation.

• Polysaccharide sulfaté 6 (PS6)

L'extraction a été réalisée après culture sur milieu f/2 d'une microalgue de type Porphyridium marinum Kylin (1937) CCAP 1380/10.

L'extraction de la biomasse issue de cette culture a été réalisée par centrifugation à 10 000 g x 30 min à 10°C. Le surnageant a été concentré (x2) sous vide à 60°C puis dialysé 72 heures contre de l'eau milliQ (9 bains) puis le retentât a été séché par lyophilisation.

• Polysaccharide sulfaté 7 (PS7)

L'extraction a été réalisée après culture sur milieu Zarouk d'une cyanobactérie de type Arthrospira platensis PCC8005. L'extraction de la biomasse issue de cette culture a été réalisée par filtration sur verre fritté de porosité (40 - 100 μηη). Le permeat a ensuite été concentré (x2) sous vide à 60°C puis dialysé 72 heures contre de l'eau milliQ (9 bains) puis le retentât a été séché par lyophilisation.

Les exopolysaccharides d'Arthrospira platensis sont généralement considérés comme des hétéropolysaccharides anioniques sulfatés. Les principaux monosaccharides identifiés sont le galactose (14.9%), le xylose (14.3%), le glucose (13.2%), le fructose (13.2%), le rhamnose (3.7%), l'arabinose (1 %), le mannose (0.3%) et des acides uroniques (13.5% représentés pas l'acide galacturonique et glucuronique) (Trabelsi et al., Partial characterization of extracellular polysaccharide produced by Artrospira platensis. Biotechnol. Bioproc. Eng, 2009,14, 27-31 ).

• Polysaccharide sulfaté 8 (PS8)

Des algues séchées de type Halymenia durvillei ont été lavées à l'eau puis séchées à l'étuve à 60°C.

L'extraction des polysaccharides a ensuite été réalisée par chauffage à reflux dans l'eau milliQ (ratio 1 :20) pendant 4 heures à 90°C puis une filtration sur filtres de porosités décroissantes (de 160 à 40 μηι) a été effectuée. Le filtrat ainsi obtenu a été centrifugé à 10 000 x g pendant 30 min (température ambiante). Le surnageant a ensuite été précipité par addition de 3 volumes d'éthanol à 96 %. Le précipité a ensuite collecté par pressage ou centrifugation (10 000 x g, 20 min, température ambiante) puis séché par lyophilisation.

Le PS8 comprend des unités 3-p-D-galactopyranose et des unités 4-a-D/L- galactopyranose.L

L'unité 3-p-D-galactopyranose est sulfatée en position 2 (26%) et 2/6 (58%).

L'unité 4-a-D/L-galactopyranose est sulfatée en 6 (19%) et en 2,6 (47%) et certains résidus sont de type 3,6 anhydrogalactopyranose.

Le polysaccharide est branché par des monosaccharides de type galactose, xylose, arabinose et fucose en quantités mineures et du pyruvate a également été détecté (1.8 %).

• Polysaccharide sulfaté 9 (PS9)

L'extraction a été réalisée sur une algue sèche de type Ulva lactuca dépigmentée par traitement éthanol, acétone et chloroforme. L'extraction a été effectuée par incubation à reflux pendant 3 heures à 90°C dans une solution d'oxalate de sodium 50 mM, pH6. Après centrifugation à 12 000 x g, 30 min et 4°C, le surnageant a été précipité à l'isopropanol, collecté par centrifugation puis lyophilisé.

Le polysaccharide PS 9 est désigné par le terme ulvane et est constitué d'acide D- glucuronique, d'acide D-irduronique, de D-xylose, de L-rhamnose et de sulfate et est désigné comme un xylorhamnoglycuronane sulfaté. Des unités de répétition qualifiées d'acides aldobiouroniques ont pu être identifiées (Ray et al, Cell-wall polysaccharides from the marine green alga Ulva « rigida » (Ulvales chlorophytal) chemical structure of ulvan. Carbohydrate Research, 1995, 274: 313-318). Exemple 1 : évaluation de la cvtotoxicité de polysaccharides sulfatés selon l'invention Culture de cellules HFF (Human Foreskin Fibroblast) en plaque 96 puits

A partir d'une boîte de cellules HFF de 75 cm ² à confluence, le milieu de culture a été enlevé, puis a été ajouté 2 mL de trypsine-EDTA (trypsine 0,025% et EDTA 0,01 %) (à 37°C). La boîte a ensuite été rincée brièvement et la trypsine a été enlevée. 2 mL de trypsine-EDTA ont ensuite été ajoutés et la boîte a été incubée 5 min dans l'étuve à 37°C. 5 ml_ de milieu de culture (MEM (PARA Laboratories GmbH) + Glutamine (2 mM) + Fungizone (2,5 g/mL) + Pénicilline (100 unités/mL) + Streptomycine (100 g/mL) + Sérum de veau fœtal décomplémenté 15 %) ont été ajoutés puis la boîte a été rincée à la pipette. Le milieu et les cellules ont été récupérés dans un tube. Un comptage sur cellule de Malassez a ensuite été réalisé.

Les cellules ont ensuite été centrifugées à 200 x g, pendant 7 min, puis le surnageant a été enlevé. Le culot a été repris dans le milieu de culture de façon à obtenir 10 ⁵ cellules/mL.

200 μί par puits de cette suspension ont été distribués en laissant vides les puits des colonnes 1 et 12 et des rangées A et H. Les puits laissés vides ont été remplis avec 200 L de milieu de culture afin d'éviter l'évaporation.

Ajout des polvsaccharides sulfatés

Lorsque les cellules ont été à confluence dans les puits (environ 48h), le milieu a été aspiré avec une trompe à vide puis 200 μί de milieu de culture contenant les divers polysaccharides à tester (ceux-ci sont testés à 50, 100, et 200 g/mL) ont été ajoutés. Chaque concentration a été testée en triplicat. Chaque plaque devait contenir un témoin négatif (milieu de culture sans extrait), un témoin positif (milieu de culture contenant 20% de DMSO), et un témoin fumagilline (à 1 μg/mL). Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 .

Test de cvtotoxicité

Après 96 h d'incubation, le milieu contenu dans les puits a été aspiré avec une trompe à vide puis 200 μί de milieu de culture frais et 50 μί de TCA (acide trichloracétique) à 50% ont été ajoutés et le mélange a été laissé 5 min à température ambiante puis 2 h à 4°C.

Le surnageant a été ôté avec une trompe à vide et lavé 5 fois (par retournement de la plaque 96 puits) avec 100 μί d'eau distillée puis la plaque a été séchée (1 h dans la trompe à vide, ou 2 h retournée sur la paillasse). La plaque une fois séchée a pu ainsi être conservée à température ambiante jusqu'à l'utilisation.

100 μί de sulforhodamine B (0,4% dans de l'acide acétique 1 %) ont été ajoutés et le mélange a été incubé 20 min à température ambiante. La sulforhodamine B a été retirée à l'aide d'une trompe à vide. Un lavage répété 5 fois (par retournement de la plaque 96 puits) avec 100 μΙ_ d'acide acétique 1 % a été effectué puis la plaque a été séchée 5 min à température ambiante en la retournant.

Les protéines ont été solubilisées à l'aide de 200 μί de Tris-Base (10 mM) pendant 5 min sur un plateau agitant à température ambiante. La DO (Densité Optique) à 550 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Multiskan FC357, Thermo Scientific).

Les résultats sont présentés dans le tableau 2.

La moyenne de la DO et l'écart type ont été calculés pour chaque échantillon testé afin de conclure sur la toxicité des produits.

Les résultats montrent que les polysaccharides sulfatés selon l'invention ne présentent pas de cytotoxicité, notamment jusqu'à 100 μg/mL. Exemple 2 : évaluation de l'activité anti-parasitaire in vitro sur la microsporidie Encephalitozoon cuniculi, de polysaccharides sulfatés selon l'invention Culture de cellules HFF (Human Foreskin Fibroblast) en plaques 48 puits

A partir d'une boîte de cellules HFF de 75 cm ² à confluence, le milieu de culture a été enlevé puis 2 mL de trypsine-EDTA (trypsine 0,025% et EDTA 0,01 %) (à 37°C) ont été ajoutés.

La boîte a ensuite été brièvement rincée puis la trypsine a été retirée. 2 mL de trypsine- EDTA (trypsine 0,025% et EDTA 0,01 %) ont ensuite été ajoutés et la boîte a été incubée 5 min dans l'étuve à 37°C.

5 mL de milieu de culture (MEM (PARA Laboratories GmbH) + Glutamine (2 mM) + Fungizone (2,5 g/mL) + Pénicilline (100 unités/mL) + Streptomycine (100 g/mL) + Sérum de veau fœtal décompléménté 15 %) ont été ajoutés et la boîte a été rincée à la pipette. Le milieu et les cellules ont été récupérés dans un tube. Un comptage sur cellule de Malassez a été effectué. Puis les cellules ont été centrifugées à 200 x g pendant 7 min. Le surnageant a ensuite été retiré et le culot a été repris dans le milieu de culture de façon à obtenir 10 ⁵ cellules/mL.

400 μί de cette suspension/puits a été distribué en laissant vides les puits des colonnes 1 et 8 et des rangées A et F. Les puits laissés vides ont été remplis avec 400 L de milieu de culture afin d'éviter l'évaporation.

Test ELISA sur microsporidies

Lorsque les cellules ont été à confluence dans les puits (environ 48h), le milieu a été aspiré à l'aide d'une trompe à vide. Puis 400 μί de milieu de culture contenant les divers polysaccharides à tester (ceux-ci ont été testés à la plus forte concentration non-cytotoxique, c'est-à-dire 100 ou 200 g/mL) ont été ajoutés, puis incubés 2 h à l'étuve à 37°C.

Parallèlement, une solution de spores d'Encephalitozoon cuniculi (obtenues à partir de surnageant de culture entretenues au laboratoire) à une concentration de 5 .10 ⁵ spores /mL a été pré-incubée 2 h à 37°C dans du milieu de culture contenant les polysaccharides à tester. Des spores ont également été pré-incubées dans les mêmes conditions mais sans polysaccharide, ces spores ayant servi à infecter des cellules utilisées pour réaliser le témoin négatif cité plus bas. Celle-ci a ensuite été mise en contact pendant 1 h à 37°C avec les cellules, le polysaccharide étant toujours présent. Après un lavage au PBS afin d'éliminer les spores non adhérentes, les divers polysaccharides ont été rajoutés et laissés ainsi le temps de la manipulation (5 jours). Chaque polysaccharide a été testé en triplicat. Chaque plaque contenait un témoin « cellules saines » non infectées, un témoin négatif (cellules infectées sans traitement) et un témoin positif (cellules infectées incubées en présence de fumagilline à 1 μg/mL).

A la fin de la manipulation, le milieu de culture de chaque puits a été éliminé et un lavage avec 200 μΙ_ de PBS a été effectué. Les puits ont été fixés individuellement par 100 μί de méthanol durant 20 minutes, à -80 °C puis les cellules ont été saturées par 100 μί d'une solution de saturation (Tris 100 mM, BSA 2%) pendant une nuit à 4°C.

La solution de saturation a ensuite été éliminée à l'aide d'une trompe à vide, puis 100 L de sérum de lapin infecté naturellement (anticorps primaires) dilué au 1/1000 ^eme dans le tampon de dilution pour anticorps (Tris 10 mM pH=7,4, NaCI 150 mM, Tween 20 0,05 %, BSA 0,2 %) ont été ajoutés. Le mélange a été incubé pendant 2 h à 37°C. Puis un lavage répété 5 fois avec 200 μί de la solution de lavage (Tween 20 0,05%, Tris 10 mM pH=9,8) a été effectué. 100 μί de l'anticorps secondaire anti-lgG de lapin (IgG AP-conjugate Promega 1 mg/mL) couplé à la phosphatase alcaline dilué au 1 /10 QQQeme ^gpg | _e tampon de dilution pour anticorps ont été ajoutés. Le mélange a été incubé pendant 1 h, à 37°C puis un lavage répété 5 fois avec 200 μί de la solution de lavage a été effectué.

200 μί de MUP à 10 mM (4-méthylumbelliferyl phosphate) dilué au 1 /100 ^ème dans la solution de révélation (MgCI ₂ 1 mM, Na ₂ C0 ₃ 50 mM pH=9,8) ont été ajoutés, puis le mélange a été incubé pendant 30 min à l'obscurité, sous agitation légère.

La lecture a été réalisée au fluoroscan avec une longueur d'onde d'excitation et d'émission de 355 nm et 460 nm, respectivement.

Les résultats sont présentés dans le tableau 3.

Les données d'inhibition de développement parasitaire ont été calculées en tenant compte des informations suivantes : le témoin « cellules saines » correspond au blanc, le témoin négatif (cellules infectées sans traitement) correspond à 100% de développement parasitaire.

La capacité d'inhibition des polysaccharides testés a été évaluée selon l'échelle suivante :

< 30 % : faible inhibition,

- entre 30 et 40 % : inhibition moyenne,

entre 40 et 50 % : inhibition satisfaisante, entre 50 et 70 % : forte inhibition,

entre 70 et 90 % : très forte inhibition,

> 90% : excellente inhibition.

Tableau 3

Les résultats montrent que les polysaccharides sulfatés selon l'invention présentent une activité antiparasitaire sur microsporidie satisfaisante. Les polysaccharides sulfatés issu d'une microalgue du genre Porphyridium montrent une excellente activité inhibitrice. Exemple 3 : évaluation de l'activité inhibitrice in vivo de polysaccharides sulfatés selon l'invention sur la nosémose chez les abeilles

Les résultats présentés ici ont été obtenus sur des abeilles d'été.

Récupération d'abeilles émergentes (naissantes) et maintien en cagette d'élevage Après avoir récupéré un cadre (ou plusieurs selon le besoin en abeilles) de couvain au rucher par l'intermédiaire d'un porte-cadre vitré, celui-ci a été placé à l'étuve à 34°C pendant une durée de 24 à 48 h de manière à laisser les abeilles émerger de leurs alvéoles. Puis les jeunes abeilles ont été récupérées sur le cadre à l'aide d'une pince d'entomologiste et placées dans les cagettes d'élevage à raison de 50 abeilles/cagette. 1/6 ^eme d'un bâtonnet de PseudoQueen (Contech enterprises, Canada) a été ajouté dans chacune des cagettes. Nourrissage des abeilles

Chacun des traitements polysaccharidiques a été réalisé en triplicat (3 cagettes/traitement). Chaque manipulation contenait un témoin « abeilles saines » (abeilles non infectées et non traitées), un témoin « abeilles infectées » (abeilles infectées expérimentalement et non traitées) et un témoin fumagilline ; ces témoins étant également en triplicat.

Les abeilles ont été nourries pendant 3 jours avant infection avec du sirop seul (témoins « abeilles saines » et « abeilles infectées »), avec du sirop additionné de 1 μg/mL de fumagilline (témoin fumagilline) ou avec du sirop contenant les divers polysaccharides sulfatés à tester (à la concentration non-cytotoxique la plus élevée, c'est-à-dire 100 ou 200 μg/mL). Le sirop était constitué de 50 % de saccharose, additionné de 1 % de protéines (Provita'bee, Laboratoires Corylis, France).

Le nourrissage des abeilles a été réalisé grâce à des tubes plastiques transparents de 5 mL percés à leur extrémité afin que les abeilles puissent se nourrir.

Infection individuelle des abeilles par Nosema ceranae

Les abeilles ont jeûné pendant 30 à 60 min avant infection. Pendant ce temps, une solution de spores de Nosema ceranae a été préparée en diluant celles-ci dans du sirop de nourrissage à raison de 125 000 spores pour 3 μί. Chaque abeille a été infectée par 125 000 spores.

Les abeilles ont ensuite été gazées au C0 ₂ (environ 1 min/cagette). Lorsque les abeilles ont commencé à se réveiller, celles-ci ont été prélevées à l'aide d'une pince d'entomologiste. Les abeilles ont ensuite été infectées individuellement par voie orale, à l'aide d'une pipette contenant 3 μί de la solution de spores préparée (en veillant à ce que la totalité des 3 μί soient bue par l'abeille). La même manipulation a été effectuée avec les cagettes du témoin « abeilles saines » en veillant à ne donner que du sirop de nourrissage seul. 45 abeilles ont été placées par cagette.

Après l'étape d'infection, à chacune des cagettes ont été ajoutés les tubes de nourrissage correspondant aux différentes conditions (sirop seul pour témoins « abeilles saines » et « abeilles infectées », sirop additionné de 1 μg/mL de fumagilline pour témoin fumagilline, sirop contenant les divers polysaccharides sulfatés). Les abeilles ont été mises à l'étuve à 33°C (hygrométrie 60 - 70 %), et nourries en continu pendant une durée de 20 jours. Suivi de la manipulation durant la phase de post-infection

Au cours de la phase de post-infection (d'une durée de 20 jours), les abeilles mortes ont été comptées et enlevées quotidiennement dans chacune des cagettes afin d'effectuer le suivi de mortalité. Les tubes de nourrissage ont été remplacés tous les deux jours jusqu'à la fin de la manipulation. Il était possible de peser les tubes de nourrissage dans l'optique d'un suivi de la consommation des différents traitements par les abeilles.

Au terme des 20 jours, 30 abeilles vivantes (10 abeilles/cagette) ont été sacrifiées pour chacune des conditions testées, afin de réaliser un comptage de spores de Nosema ceranae dans le but d'évaluer la charge parasitaire des abeilles. Pour cela l'intestin et l'ampoule rectale de chacune des abeilles ont été disséqués puis broyés au broyeur de Potter dans 100 μΙ_ de PBS. Après 3 lavages, le comptage a été réalisé sur cellules de Kovacs.

Les résultats sont présentés dans le tableau 4.

Tableau 4 Les résultats montrent une baisse significative de la mortalité des abeilles lorsqu'elles ont été nourries avec une composition comprenant un polysaccharide sulfaté selon l'invention.

Le polysaccharide sulfaté PS6 issu de Porphyridium marinum montre notamment une baisse importante de la mortalité chez les abeilles.

Ainsi les polysaccharides sulfatés selon l'invention permettent de limiter le développement du parasite (illustré par la baisse du nombre de spores) et ainsi de diminuer significativement la mortalité chez les abeilles atteintes de nosémose.