ACEITE DE GIRASOL CON ELEVADA TERMOESTABILIDAD

SECTOR DE LA TéCNICA La invención se enmarca en el sector de Ia agricultura, en el sector alimentario, y en el sector industrial. El aceite de girasol objeto de Ia presente invención presenta una elevada termoestabilidad, muy superior a Ia de otros aceites de girasol existentes en Ia actualidad. La elevada termoestabilidad del aceite Io hace idóneo para procesos domésticos e industriales que requieran o provoquen elevadas temperaturas, tanto en el sector alimentario (frituras) como en el sector industrial (biolubricantes, biocombustibles).

ESTADO DE LA TéCNICA

El empleo de aceites vegetales en procesos que requieran o provoquen elevadas temperaturas demanda que los aceites posean una elevada estabilidad térmica o termoestabilidad. El sometimiento del aceite a condiciones de elevadas temperaturas propias de procesos de elaboración de alimentos (fritura, horneado) o procesos de fricción (lubricación de motores y maquinaria) provoca una serie de procesos degradativos del aceite, tales como oxidación, polimerización, hidrólisis, ciclización, e isomerización, que dan lugar a Ia formación de productos con olores y sabores desagradables y con propiedades negativas desde el punto de vista nutricional (Bastida y Sánchez Muñiz, Thermal oxidation of olive oil, sunflower oil and a mix of both oils during forty discontinuous domestic fryings of different foods. Food Science and Thechnology International, 7:15-21 , 2001 ). La occurrencia de estos procesos degradativos del aceite es tanto menor, y por tanto Ia vida útil del aceite es tanto mayor, cuanto mayor es su termoestabilidad.

La termoestabilidad de los aceites vegetales está principalmente determinada por su grado de insaturación y por Ia presencia en el mismo de substancias con propiedades antioxidantes, que protegen al aceite durante el calentamiento y retrasan Ia aparición de los procesos degradativos. El grado de insaturación del aceite está determinado por su perfil de ácidos grasos. éstos

son más susceptibles a Ia oxidación a medida que aumenta el grado de insaturación o número de dobles enlaces en su cadena hidrocarbonada. Entre los ácidos grasos más comunes en aceites vegetales, el ácido linolénico (poliinsaturado, tres dobles enlaces) es el más susceptible a Ia oxidación, seguido de ácido linoleico (poliinsaturado, dos dobles enlaces), ácido oleico (monoinsaturado, un doble enlace), y ácidos esteárico y palmítico (saturados, sin dobles enlaces) (F. B. Padley y col., 1994; Occurrence and characteristics of oils and fats. En The Lipid Handbook, ed. F. D. Gunstone, J. L. Harwood y F. B. Padley, London: Chapman & Hall, pp 47-223).

Las semillas oleaginosas producen de forma natural substancias con propiedades antioxidantes, dentro de las que destacan los tocoferoles. Los tocoferoles son moléculas formadas por un grupo cromanol y una cadena lateral fitil. Existen en Ia naturaleza cuatro formas diferentes de tocoferoles, denominados alfa-, beta-, gamma-, y delta-tocoferol, que difieren entre sí por el número y posición de grupos metilo (Me) en el anillo cromanol (Fig. 1 ).

Fig. 1. Estructura química de los tocoferoles

RI=Me; R2=Me: Alpha-tocopherol RI=Me; R2=H: Beta-tocopherol R1=H ; R2=Me: Gamma-tocopherol R1=H ; R2=H: Delta-tocopherol

Debido a que son substancias liposolubles, los tocoferoles presentes en semillas oleaginosas pasan al aceite durante el proceso de extracción. Aquí ejercen una doble acción antioxidante. Por un lado, presentan una acción in vitro, es decir, protegen al aceite y a los productos que Io contienen (alimentos elaborados) o de él derivados (biocombustibles, biolubricantes) de Ia oxidación durante el almacenamiento y utilización. Por otro lado, los tocoferoles son compuestos bioactivos, ejerciendo un importante efecto antioxidante in vivo, es

decir, dentro de Ia célula viva. Esta actividad antioxidante in vivo es conocida como actividad de vitamina E (G. Pongracz y col., Tocopherole, Antioxidantien der Natur. Fat Science and Technology 97: 90-104, 1995). Existen grandes diferencias entre los cuatro tipos de tocoferoles en relación con su actividad antioxidante in vitro e in vivo. Así, alfa-tocoferol se caracteriza por poseer Ia máxima eficacia como antioxidante in vivo o vitamina E, pero su actividad in vitro es baja en comparación con los otros tocoferoles. Tomando como referencia una actividad antioxidante de 100% para alfa-tocoferol, Pongracz y col. (1995, obra citada) determinaron una eficiencia relativa como antioxidantes in vivo de 50% para beta-tocoferol, 25% para gamma-tocoferol, y 1% para delta-tocoferol. Por el contrario, Ia eficiencia relativa como antioxidantes in vitro fue de 182% para beta-tocoferol, 194% para delta- tocoferol, y 285% para gamma-tocoferol.

El aceite de girasol posee de forma natural un perfil de ácidos grasos constituido por ácido palmítico (4-8% del total de ácidos grasos), ácido esteárico (2-6% del total de ácidos grasos), ácido oleico (20-45% del total de ácidos grasos) y ácido linoleico (45-70% del total de ácidos grasos). La proporción relativa de los ácidos grasos oleico y linoleico es variable y depende en gran medida de Ia temperatura durante el desarrollo de Ia semilla (Fernández- Martínez y col., Performance of near-isogenic high and low oleic acid hybrids of sunflower. Crop Science 33: 1158-1163, 1993). Mediante mejora genética, se ha desarrollado una amplia gama de líneas de girasol con perfiles modificados de ácidos grasos. Las principales líneas desarrolladas y sus perfiles de ácidos grasos se muestran en Ia Tabla 1.

Tabla 1. Composición media en ácidos grasos (%) del aceite de Ia semilla de los principales mutantes naturales o inducidos de girasol en comparación con el aceite estándar (tomado de Fernández-Martínez y col., Mejora de Ia calidad del girasol. En: Mejora Genética de Ia Calidad en Plantas. Editores: G. Llácer, MJ. Diez, J. M. Carrillo, y M. L. Badenes. Universidad Politécnica de Valencia, pp.

449-471 , 2006)

Mutante Composición en ácidos grasos o línea 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2

Estándar ² 5,7 — 5,8 20,7 64,5

6,5 — 3,0 40,9 49,6

Bajo contenido en ácidos grasos saturados

LS- 1 5,6 0.0 4,1 20,2 67,4

LS-2 8,6 0.0 2,0 10,8 75,0

LP-1 4,7 0.0 5,4 23,8 63,7

RS 1 3,9 0.0 2,6 40,1 51 ,8

RS2 4,4 0.0 3,2 42,9 47,7

Alto contenido en ácido palmítico

275HP 25,1 6,9 1 ,7 10,5 55,8

CAS-5 25,2 3,7 3,5 1 1 ,4 55,1

CAS- 12 30,7 7,6 2,1 56,0 3,1

HP line 23,9 3,4 2,0 20,4 50,7

CAS-37 ³ 29,5 12,3 1 ,4 5,4 38,7

Alto contenido en ácido esteárico

CAS-3 5,1 0.0 26,0 13,8 55,1

CAS-4 5,4 0.0 11 ,3 34,6 48,0

CAS-8 5,8 0.0 9,9 20,4 63,8

CAS- 14 8,4 0.0 37,3 12,4 38,0

CAS- 19 6,8 0.0 15,3 21 ,5 56,4

CAS-20 5,7 0.0 7,7 35,9 50,5

Alto contenido en ácido oleico

Pervenets 3 — — 79,3 14,8

M-4229 3,4 — 4,1 86,1 3,9

M- 3067 3,9 — 5,2 54,6 33,9

Alto contenido en ácido linoleico

F6 sel. — — — — 77,3

2698-1 — — — — 78,0

¹ 16:0=ácido palmítico; 18:0=ácido esteárico; 16:1 = ácido palmitoleico 18:1 =ácido oleico; 18:2=ácido linoleico. 2Datos de cultivares estándar obtenidos en ambientes fríos y cálidos, respectivamente. 3Datos no proporcionados por los autores

El aceite de girasol se caracteriza por poseer de forma natural un perfil de tocoferoles constituido principalmente por alfa-tocoferol, que representa más del 90% del total de tocoferoles, siendo las proporciones de beta-, gamma-, y delta tocoferol inferiores al 5% del total de tocoferoles (Demurin y col., Genetic variability of tocopherol composition in sunflower seeds as a basis of breeding for improved oil quality. Plant Breeding 115: 33-36, 1996). Mediante mejora

genética, se han desarrollado líneas de girasol con alto contenido en beta- tocoferol (más del 50% del total de tocoferoles), alto contenido en gamma- tocoferol (más del 90% del total de tocoferoles), y alto contenido en delta- tocoferol (más del 65% del total de tocoferoles) (Fernández-Martínez y col., 2006, obra citada).

Los aceites de girasol con bajo grado de insaturación, formados principalmente por ácidos grasos saturados (ácido esteárico y ácido palmtítico) y monoinsaturados (ácido oleico) presentan una mayor termoestabilidad que el aceite de girasol estándar, con mayor grado de insaturación (R. Garcés y col., High stable vegetable oils. WO 99/64546). Asimismo, los aceites de girasol en los que alfa-tocoferol ha sido parcialmente substituido por otros tocoferoles con mayor poder antioxidante in vitro, principalmente gamma- y delta-tocoferol, presentan mayor termoestabilidad que el aceite de girasol estándar, con elevado contenido en alfa-tocoferol (L. Velasco y J. M. Fernández-Martínez, Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol. WO 2004/089068). Hasta Ia fecha no se ha desarrollado ningún material vegetal de girasol cuyas semillas produzcan un aceite con bajo grado de insaturación, determinado por un elevado contenido en ácidos grasos saturados y monoinsaturados, y con un bajo contenido de alfa tocoferol en su perfil de tocoferoles.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN Descripción Breve

La presente invención se refiere a un aceite de girasol extraído a partir de semillas de girasol que presenta una serie de propiedades en su perfil de ácidos grasos y en su perfil de tocoferoles que Ie confieren una mayor termoestabilidad en comparación con cualquier otro aceite de girasol desarrollado hasta Ia fecha. El aceite de girasol objeto de esta invención se caracteriza por un contenido en ácidos grasos saturados (ácido palmítico y ácido esteárico) entre el 15% y el 45% del total de ácidos grasos presentes en el aceite, un contenido en ácido oleico entre el 45% y el 75% del total de ácidos grasos. Este aceite puede presentar también un contenido en ácido palmitoleico superior al 5% del total de ácidos grasos, principalmente cuando el ácido graso saturado predominante es ácido palmítico. El contenido en ácido linoleico es inferior al 10%,

preferentemente inferior al 5% del total de los ácidos grasos presentes en el aceite. Asimismo, Ia suma de gamma- y delta-tocoferol representa más del 85% del total de tocoferoles presentes en el aceite, siendo el contenido en alfa- tocoferol inferior al 15% del total de tocoferoles. Y el contenido total en tocoferoles de este aceite está entre 500 mg por kg de aceite y más de 1250 mg por kg de aceite.

Se trata de un aceite con una elevada termoestabilidad, siendo su índice de estabilidad oxidativa (medido en un aparato Rancimat modelo 743 (Metrohm AG, Herisau, Suiza) tras un período de inducción de 10 horas a una temperatura de 110 ⁰ C sobre el aceite sin refinar) entre 35 horas y más de 120 horas.

La presente invención se refiere también a las semillas de girasol que contienen un aceite con las mencionadas características, y las plantas de girasol que al ser autofecundadas producen semillas con las características mencionadas. No existen en Ia actualidad semillas de girasol que produzcan un aceite con Ia combinación de características en los perfiles de ácidos grasos y tocoferoles como Ia conseguida en las semillas objeto de Ia presente invención.

Asimismo constituye otro objeto de Ia presente invención Ia utilización del aceite para Ia alimentación humana y animal, y para Ia elaboración de biolubricantes y biocombustibles.

Descripción Detallada

La presente invención se refiere a un aceite de girasol extraído a partir de semillas producidas por plantas de Ia especie Helianthus annuus L. que producen un tipo especial de aceite con unas características de su perfil de ácidos grasos y perfil de tocoferoles que Ie confieren una termoestabilidad excepcional.

El mencionado aceite se caracteriza por un elevado contenido en ácidos grasos saturados, ácido palmítico y ácido esteárico, (15-45% del total de ácidos grasos en el aceite), un elevado contenido en ácido oleico (45-75% del total de ácidos grasos), y un elevado contenido de Ia suma de gamma- y delta-tocoferol (superior a 85% del total de tocoferoles presentes en el aceite). La combinación de estas tres propiedades confieren al aceite una elevada termoestabilidad.

Este aceite puede presentar también un contenido en ácido palmitoleico superior al 5% del total de ácidos grasos, principalmente cuando el ácido graso saturado predominante es ácido palmítico. Con un contenido en ácido linoleico inferior al 10%, preferentemente inferior al 5% del total de los ácidos grasos presentes en el aceite.

En una realización particular de Ia invención, el contenido en ácido palmitoleico es superior al 10% del total de ácidos grasos en el aceite.

La máxima estabilidad oxidativa del aceite Ia confieren los ácidos grasos saturados. Sin embargo, un contenido muy elevado de estos ácidos grasos en el aceite determina un bajo punto de humo (smoke point) en frituras y un bajo valor nutricional de aceite. El ácido oleico confiere al aceite menor estabilidad oxidativa que los ácidos grasos saturados, pero un mayor punto de humo y un mayor valor nutricional. Los tocoferoles gamma y delta confieren al aceite una estabilidad oxidativa superior a Ia conferida por los tocoferoles beta y alfa. El contenido en alfa-tocoferol del aceite de Ia invención es inferior al 15% del total de los tocoferoles presentes en el aceite. Asimismo, el contenido total en tocoferoles puede oscilar entre 500 mg por kg de aceite y más de 1250 mg por kg de aceite.

La obtención de este aceite se consiguió recombinando los siguientes caracteres individuales, ya desarrollados previamente en girasol:

a) Alto contenido en ácidos grasos saturados. Existen diversas líneas de girasol que presentan entre el 15% y el 45% de los ácidos grasos en el aceite de sus semillas en Ia forma de ácidos grasos saturados, tanto en forma de ácido palmítico (16:0) como en forma de ácido esteárico (18:0). Se emplearon dos tipos de líneas: 1 ) alto esteárico, cuyo contenido en ácido esteárico se encuentra entre el 15% y el 45% del total de ácidos grasos en el aceite de las semillas, y 2) alto palmítico, cuyo contenido en ácido palmítico se encuentra entre el 15% y el 45% del total de ácidos grasos en el aceite de las semillas y el contenido en ácido palmitoleico (16:1 ) se encuentra entre el 5 y el 15% del total de ácidos grasos en el aceite de las semillas. b) Alto contenido en ácido oleico (18:1 ). Las líneas de girasol denominadas "alto oleico" utilizadas presentan entre el 85% y el 95% de los

ácidos grasos en el aceite de sus semillas en forma de ácido oleico. El contenido en ácido linoleico (18:2) se encuentra entre el 2% y el 10% del total de ácidos grasos en el aceite de sus semillas. c) Alto contenido en Ia suma de gamma-tocoferol y delta-tocoferol. Este carácter está presente en diversas líneas de girasol, en los que Ia suma de ambos tocoferoles representa más del 85% del total de tocoferoles presentes en las semillas. Se emplearon dos tipos de líneas: 1 ) alto gamma-tocoferol, en las que el contenido en gamma-tocoferol representa más del 85% del total de tocoferoles en las semillas, pudiendo alcanzar un valor de hasta el 99% del total de tocoferoles en las semillas, y 2) alto delta-tocoferol, en las que el contenido en delta-tocoferol representa más del 65% del total de tocoferoles en las semillas y el contenido en gamma-tocoferol representa más del 20% del total de tocoferoles en las semillas, siendo Ia suma de delta-tocoferol y gamma-tocoferol superior al 85% del total de tocoferoles en las semillas, pudiendo alcanzar un valor de hasta el 99% del total de tocoferoles en las semillas. Las semillas de ambos tipos de líneas dan lugar a un aceite cuyo contenido total en tocoferoles se encuentra entre 500 y 1500 mg por kg de aceite, con los perfiles de tocoferoles antes mencionados.

Al tratarse de caracteres de gran complejidad genética, Ia recombinación se realizó en dos etapas que se describen a continuación:

1 ) Recombinación de los caracteres "alto contenido en ácidos grasos saturados" y "alto contenido en ácido oleico". Se realizaron cruzamientos controlados entre las líneas con alto contenido en ácidos grasos saturados (ácido palmítico y ácido esteárico) y Ia línea con alto contenido en ácido oleico, se obtuvo Ia semilla híbrida F ₁ . Esta semilla se germinó y las correspondientes plantas se autofecundaron para obtener Ia semilla F ₂ , que presentó segregación para ambos caracteres. Debido a que cada uno de los caracteres individuales está controlado por 1-3 genes, Ia mayoría de ellos recesivos, fue necesario analizar una media de 100 semillas F ₂ de cada uno de los cruzamientos para obtener una semilla que presentara Ia combinación de los caracteres buscados, es decir, alto contenido en ácidos

grasos saturados y alto contenido en ácido oleico. La baja frecuencia de ocurrencia de semillas que combinaran los dos caracteres hizo necesario el análisis de un promedio de 2.000 semillas de cada uno de los cruzamientos para obtener un número suficiente de semillas con los dos caracteres combinados.

Para que Ia combinación de caracteres modificados del perfil de ácidos grasos resulte de utilidad comercial, los caracteres deben ser heredables y deben expresarse con independencia de las condiciones ambientales en las que se cultivan las plantas. Por este motivo, se realizó un proceso de selección conducente a fijar los caracteres y a verificar su estabilidad bajo diferentes condiciones ambientales. Para ello, se sembraron las semillas F ₂ seleccionadas y Ia estabilidad genética de los caracteres combinados se confirmó mediante el análisis de las semillas F3 procedentes de Ia autofecundación de cada una de las plantas F ₂ , y de semillas F ₄ procedentes de un elevado número de plantas F ₃ cultivadas en varios ambientes.

Como resultado de esta primera etapa se obtuvieron plantas cuyas semillas contienen un elevado contenido en ácidos grasos saturados, entre el 15% y el 45% del total de ácidos grasos presentes en el aceite, un elevado contenido en ácido oleico, entre el 45% y el 75% del total de ácidos grasos, y un bajo contenido en ácido linoleico, inferior al 10% del total de ácidos grasos.

2) Recombinación del nuevo carácter "alto contenido en ácidos grasos saturados y alto contenido en ácido oleico" con el carácter "alto contenido en Ia suma de gamma- y delta-tocoferol". En esta segunda etapa, se emplearon plantas obtenidas en Ia etapa anterior 1 ) que combinaban un alto contenido en ácidos grasos saturados (15- 45% del total de ácidos grasos presentes en el aceite) y alto contenido en ácido oleico (45-75% del total de ácidos grasos presentes en el aceite), así como plantas con alto contenido de Ia suma de gamma-tocoferol y delta-tocoferol (más del 85% del total de tocoferoles presentes en las semillas).

Tras realizar cruzamientos controlados entre las líneas con alto contenido de Ia suma de gamma- y delta-tocoferol con plantas F ₃ con alto contenido en ácidos grasos saturados y alto contenido en ácido oleico, se obtuvo Ia semilla

híbrida Fi . Esta semilla se germinó y las correspondientes plantas se autofecundaron para obtener Ia semilla F ₂ , que presentó segregación para los tres caracteres objeto de Ia recombinación, es decir, alto contenido en ácidos grasos saturados (ácido palmítico y ácido esteárico), alto contenido en ácido oleico, y alto contenido en Ia suma de gamma- y delta-tocoferol. Debido a que el perfil buscado de ácidos grasos está controlado por 4-6 genes, y el perfil buscado de tocoferoles está controlado por 1-3 genes, en general de carácter recesivo, fue necesario analizar una media de 400 semillas F ₂ de cada uno de los cruzamientos para obtener una semilla que presentara Ia combinación de los caracteres buscados, es decir, alto contenido en ácidos grasos saturados, alto contenido en ácido oleico, y alto contenido de Ia suma de gamma- y delta- tocoferol. La baja frecuencia de ocurrencia de semillas que combinaran los dos caracteres hizo necesario el análisis de un promedio de 5.000 semillas de cada uno de los cruzamientos para obtener un número suficiente de semillas con los dos caracteres combinados.

Para que Ia combinación de caracteres modificados del perfil de ácidos grasos resulten de utilidad comercial, deben ser heredables y deben expresarse con independencia de las condiciones ambientales en las que se cultivan las plantas. Por este motivo, se realizó un proceso de selección conducente a fijar los caracteres y a verificar su estabilidad bajo diferentes condiciones ambientales. Para ello, se sembraron las semillas F ₂ seleccionadas se sembraron y Ia estabilidad genética de los caracteres combinados se confirmó mediante el análisis de las semillas F ₃ de cada una de las plantas F ₂ , y de semillas F ₄ procedentes de un elevado número de plantas F ₃ . Estas plantas se cultivaron en diferentes ambientes, Io que sirvió para confirmar que Ia expresión simultánea de alto contenido en ácidos grasos saturados, alto contenido en ácido oleico, y alto contenido de Ia suma de gamma-tocoferol y delta-tocoferol es el resultado de una herencia genética fijada y estable, que se expresa con independencia de las condiciones de cultivo de las plantas. Como resultado de esta segunda etapa se obtuvieron plantas cuyas semillas contienen un elevado contenido en ácidos grasos saturados, entre el 15% y el 45% del total de ácidos grasos presentes en el aceite, un elevado contenido en ácido oleico, entre el 45% y el 75% del total de ácidos grasos, un

contenido en Ia suma de gamma-tocoferol y delta-tocoferol superior al 85% del total de tocoferoles presentes en el aceite. Cuando Ia fuente de ácidos grasos saturados fue una línea con alto contenido en ácido palmítico (15-45% del total de ácido grasos en el aceite), se observó asimismo Ia presencia de un contenido en ácido palmitoleico superior al 5% del total de ácidos grasos en el aceite.

Teniendo en cuenta el rango en el contenido de ácidos grasos (ácido palmítico, esteárico,y oleico) y tocoferoles de las líneas de girasol utilizadas en las distintas etapas de recombinación, las realizaciones particulares de Ia invención obtenidas incluyen aceites con un contenido en ácido esteárico superior al 15%, superior al 25% y superior al 35% del total de ácidos grasos presentes en el aceite. Otras realizaciones particulares de Ia invención presentan un contenido en ácido palmítico superior al 15%, superior al 25% y superior al 35% del total de ácidos grasos presentes en el aceite. En otras dos realizaciones particulares de Ia invención el aceite de Ia invención presenta un contenido en gamma-tocoferol superior al 85% y superior al 95% del total de los tocoferoles presentes en el aceite.

Y en otras realizaciones particulares de Ia invención, el aceite presenta un contenido en delta-tocoferol superior al 25%, superior al 55% y superior al 75% del total de los tocoferoles presentes en el aceite.

Debido al perfil de ácidos grasos con un bajo nivel de insaturación, que es Ia principal causa de Ia oxidación y baja termoestabilidad de los aceites vegetales, y a Ia presencia de una elevada proporción de tocoferoles con fuerte acción protectora frente a Ia oxidación y el efecto de Ia elevada temperatura, el aceite extraído de las semillas producidas por las plantas arriba descritas presenta una termoestabilidad excepcional, muy superior a Ia que presenta cualquier aceite de girasol convencional, y también superior a Ia que presenta cualquier otro aceite de girasol que presente únicamente modificado el perfil de ácidos grasos o el perfil de tocoferoles. El índice de Estabilidad Oxidativa (OiI Stability Index; OSI) del aceite objeto de Ia presente invención, medido en un aparato Rancimat modelo 743 (Metrohm AG, Herisau, Suiza) tras un período de inducción de 10 horas a una temperatura de 11O ⁰ C sobre el aceite sin refinar oscila entre 35 y 120 horas.

La degradación termooxidativa de un aceite se evalúa estudiando Ia degradación de los tocoferoles presentes en dicho aceite y Ia aparición de compuestos polares y polímeros durante el calentamiento. El aceite objeto de Ia presente invención presenta una degradación termooxidativa menor que el aceite obtenido de las semillas utilizadas como parentales, presentando un porcentaje menor (Ia mitad) de formación de polímeros y de compuestos polares.

Dadas estas características técnicas del aceite de Ia invención, con una alta estabilidad oxidativa y alta resistencia a Ia degradación termooxidativa, este aceite puede ser utilizado de forma idónea en alimentación humana y/o animal.

Igualmente el aceite de Ia invención puede ser utilizado en Ia elaboración de biolubricantes y/o biocombustibles.

En una realización particular de Ia invención, el aceite de Ia invención es obtenible a partir de Ia extracción de semillas de girasol de Ia línea de semillas IAS-1265, depositada el 20 de marzo de 2007 en el NCIMB (National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria) Ltd., Aberdeen, Escocia, con número de acceso NCIMB-41477.

Las mezclas de aceites que contienen el aceite de Ia invención también constituyen un objeto de Ia presente invención, así como Ia harina obtenida como el residuo del proceso de extracción del aceite a partir de las semillas de girasol.

Constituyen otro objeto de Ia presente invención las semillas de girasol que contienen un aceite con las características del aceite de Ia invención. Se trata de semillas que dan lugar a plantas que tras su germinación contienen en sus semillas, al ser autofecundadas, un aceite con las características del aceite del a invención, con independencia de las condiciones de cultivo de las plantas. En una realización particular las semillas de Ia invención proceden de Ia línea de girasol IAS-1265, depositada con fecha 20 de Marzo de 2007 en el banco de semillas de NCIMB Ltd., Aberdeen, Escocia, con el número de acceso NCIMB- 41477. Las semillas objeto de Ia presente invención pueden ser utilizadas para

Ia obtención del aceite de Ia invención.

Asimismo las plantas de girasol (Helianthus annuus L) que al ser autofecundadas producen semillas que contienen el aceite de Ia invención también constituyen otro objeto de Ia presente invención.

EJEMPLOS DE REALIZACIóN Obtención de las semillas

5.1. Recombinación de ios caracteres "aito contenido en ácidos grasos saturados" y "aito contenido en ácido oieico"

Cuarenta y ocho semillas de cada una de las líneas de girasol NP-40, con alto contenido en ácido palmítico en el aceite (superior al 15% del total de ácidos grasos), desarrollada mediante mutagénesis química, y BSD-2-423, con alto contenido en ácido oieico en el aceite (superior al 85% del total de ácidos grasos), se tomaron al azar y se analizó Ia composición o perfil de ácidos en el aceite de cada una de las semillas individuales. Debido a que el análisis de las semillas no puede ser destructivo, pues tras el análisis las semillas deben poder germinarse, éste se realizó mediante el procedimiento de Ia media semilla. éste consiste en cortar un pequeño trozo de Ia semilla distal al embrión, de forma que el corte no afecta a Ia capacidad germinativa de Ia semilla. La porción cortada es entonces analizada para su perfil de ácidos grasos mediante cromatografía gaseosa de los esteres metílicos de los ácidos grasos (R. Garcés y M. Mancha, One-step lipid extraction and fatty acid methyl esters preparation from fresh plant tissues. Analytical Biochemistry, 211 :139-143, 1993), y el resto de Ia semilla, que contiene el embrión, es guardada en condiciones óptimas para proceder a su germinación en función de los resultados analíticos. Una vez confirmado el perfil de ácidos grasos de cada una de las semillas, éstas se germinaron y las correspondientes plantas se cultivaron en invernadero y se realizaron cruzamientos controlados entre plantas de NP-40 y plantas de BSD-2-423. éstos consisten en eliminar los estambres u órganos masculinos de las flores a primera hora de Ia mañana, antes de que las anteras se abran para liberar el polen, en las plantas que se van a emplear como parentales femeninos, seguido de Ia polinización artificial empleando polen de las plantas que se van a emplear como parentales masculinos. En este ejemplo, las plantas de BSD-2-423 se emplearon como parental femenino y las plantas

de NP-40 se emplearon como parental masculino, aunque igual resultado se obtiene empleando los parentales en el sentido inverso.

Las semillas híbridas resultantes de los cruzamientos, denominadas semillas Fi, se analizaron para su perfil de ácidos grasos mediante el procedimiento de Ia media semilla explicado anteriormente. El contenido medio en ácido palmítico en las semillas Fi fue de 7.3% del total de ácidos grasos en el aceite, frente a 30.0% en las semillas de las plantas de NP-40 y 3.5% en las semillas de las plantas de BSD-2-423. El contenido medio en ácido oleico de las semillas Fi fue de 69.8% del total de ácidos grasos en el aceite, comparado con 8.0% en las semillas de NP-40 y 89.6% en las semillas de BSD-2-423.

Se germinaron 150 semillas F ₁ y las correspondientes plantas se autofecundaron para obtener las semillas F ₂ , que fueron analizadas para perfil de ácidos grasos. Se analizaron 2.348 semillas F ₂ , observándose segregación para los contenidos en ácido palmítico y en ácido oleico. El contenido en ácido palmítico en las semillas F ₂ varió entre el 3.1 % y el 37.8% del total de ácidos grasos en el aceite. El contenido en ácido oleico en semillas F ₂ mostró un rango de variación entre el 6.9% y el 92.2% del total de ácidos grasos en el aceite. De las 2.348 semillas analizadas, 104 de ellas mostraron una combinación de alto contenido en ácido palmítico, superior a 15% del total de ácidos grasos, y alto contenido en ácido oleico, superior a 45% del total de ácidos grasos en el aceite. De estas 104 semillas, aquella con mayor contenido en ácido palmítico presentó un contenido de ácido palmítico de 34% y un contenido de ácido oleico de 55% del total de ácidos grasos, mientras que aquella con mayor contenido en ácido oleico presentó un contenido de ácido palmítico de 18% y un contenido de ácido oleico de 73% del total de ácidos grasos.

Las semillas F ₂ seleccionadas se sembraron y Ia estabilidad genética de los caracteres combinados se confirmó mediante el análisis de las semillas F ₃ de cada una de las plantas F ₂ . El análisis de un total de 3.744 semillas F ₃ dio como resultado una composición en ácidos grasos del aceite de las semillas constituida por un contenido medio de 27.7% ± 3.4% (media ± desviación estándar) de ácido palmítico, 7.2% ± 1.7% de ácido palmitoleico, 1.4% ± 0.3% de ácido esteárico, 59.8% ± 4.9% de ácido oleico, y 3.9% ± 1.0% de ácido linoleico.

5.2. Recombinación de los caracteres "alto contenido en ácidos grasos saturados y alto contenido en ácido oleico" con el carácter "alto contenido en Ia suma de gamma- y delta-toco ferol" Se tomaron cuarenta y ocho semillas F3 obtenidas en Ia etapa anterior, que combinaban un alto contenido en ácido palmítico (mayor de 15%) y un alto contenido en ácido oleico (mayor de 45%), y 48 semillas de Ia línea T2100, con alto contenido de gamma-tocoferol (mayor de 85%), y se analizó para cada semilla tanto Ia composición o perfil de ácidos en el aceite como Ia composición o perfil de tocoferoles de cada una de las semillas individuales. Este análisis se realizó mediante el procedimiento de Ia media semilla, descrito anteriormente. La porción cortada de Ia semilla se dividió en dos mitades y en una mitad se analizó el perfil de ácidos grasos mediante cromatografía gaseosa de los esteres metílicos de los ácidos grasos (R. Garcés y M. Mancha, 1993, obra citada) y en Ia otra mitad se analizó el perfil de tocoferoles mediante cromatografía líquida de alta eficiencia - HPLC (F. Goffman y col., Quantitative determination of tocopherols in single seeds of rapeseed, Brassica napus L., Fett/Lipid 101 :142-145, 1999).

Una vez confirmado el perfil de ácidos grasos y de tocoferoles de cada una de las semillas, éstas se germinaron y las correspondientes plantas se cultivaron en invernadero y se realizaron cruzamientos controlados entre plantas procedentes de semillas F3 y plantas de T2100, de modo similar a como se describió en el apartado 5.1. Las semillas Fi se analizaron para sus perfiles de ácidos grasos y tocoferoles. El contenido medio en ácido palmítico en las semillas Fi fue de 6.8% del total de ácidos grasos en el aceite, frente a 28.9% en las semillas de las plantas de NP-40 y 3.2% en las semillas de las plantas de T2100. El contenido en ácido oleico de las semillas F ₁ fue de 72.6.8% del total de ácidos grasos en el aceite, comparado con 90.3% en las semillas de BSD-2- 423 y 12.1 % en las semillas de T2100. El contenido en gamma-tocoferol de las semillas Fi fue de 1.2% del total de tocoferoles, comparado con 0.0% en las semillas de NP-40 y BSD-2-423 empleadas como control, y 99.2% en las semillas de T2100.

Se germinaron 100 semillas Fi y las correspondientes plantas se autofecundaron para obtener las semillas F ₂ , que fueron analizadas para perfil de ácidos grasos. Se analizaron 8.952 semillas F ₂ , observándose segregación para los contenidos en ácido palmítico, en ácido oleico, y en gamma-tocoferol. El contenido en ácido palmítico en las semillas F ₂ varió entre el 2.2% y el 37.6% del total de ácidos grasos en el aceite. El contenido en ácido oleico en semillas F ₂ mostró un rango de variación entre el 5.8% y el 94.2% del total de ácidos grasos en el aceite. El contenido en gamma-tocoferol mostró una variación entre el 0.0% y el 99.6% del total de tocoferoles en Ia semillas De las 8.952 semillas analizadas, 51 de ellas mostraron una combinación de alto contenido en ácido palmítico, superior a 15% del total de ácidos grasos, alto contenido en ácido oleico, superior a 45% del total de ácidos grasos en el aceite, y alto contenido en gamma-tocoferol, superior a 85% del total de tocoferoles en Ia semilla. Las semillas F ₂ seleccionadas se sembraron y Ia estabilidad genética de los caracteres combinados se confirmó mediante el análisis de las semillas F ₃ de cada una de las plantas F ₂ . El análisis de un total de 3.204 semillas F ₃ dio como resultado una composición en ácidos grasos del aceite de las semillas constituida por un contenido medio de 28.9% ± 3.3% (media ± desviación estándar) de ácido palmítico, 7.3% ± 1.1 % de ácido palmitoleico, 1.6% ± 0.5% de ácido esteárico, 52.5% ± 3.9% de ácido oleico, y 4.2% ± 0.7% de ácido linoleico, y una composición de Ia fracción de tocoferoles formada por 2.8% ± 1.3% de alfa-tocoferol, 96.6% ± 1.8% de gamma-tocoferol, y 0.6% ± 0.2% de delta-tocoferol.

Extracción del aceite

Un lote de 150 g de semillas F ₃ se empleó para extracción de aceite empleando éter de petróleo (punto ebullición 40-60 ⁰ C) y un sistema extractor Soxhlet, siguiendo el procedimiento de Ia Asociación Española de Normalización (Catálogo de normas UNE. Madrid, 1991 ). El aceite fue analizado para composición en ácidos grasos y en tocoferoles, dando como resultado una composición en ácidos grasos constituida por 29.2% de ácido palmítico, 7.5% de ácido palmitoleico, 1.7% de ácido esteárico, 52.4% de ácido oleico, y 4.2%

de ácido linoleico, y una composición de Ia fracción de tocoferoles formada por 2.4% de alfa-tocoferol, 96.4% de gamma-tocoferol, y 1.2% de delta-tocoferol.

Características técnicas del aceite obtenido a) Estudio del índice de Estabilidad Oxidativa (OiI Stabilitv Index; OSI) en diferentes tipos de aceites de girasol

Se midió el índice de estabilidad oxidativa (OSI) tras calentamiento a 11O ⁰ C durante 10 horas, siguiendo el protocolo estándar de Ia American OiI Chemists' Society (Official Methods and Reccomended Practices of the American OiI Chemists' Society, 4 ^a edición, AOCS, Champaign, IL, EE.UU., 1994) en los siguientes tipos de aceite de girasol:

Aceite 1 : Aceite de girasol estándar (perfil estándar de ácidos grasos y de tocoferoles) Aceite 2: Aceite con alto contenido en ácido oleico y perfil estándar de tocoferoles

Aceite 3: Aceite con alto contenido en ácido palmítico, alto contenido en ácido oleico, y perfil estándar de tocoferoles

Aceite 4: Aceite objeto de Ia presente invención, con alto contenido en ácido palmítico, alto contenido en ácido oleico, y perfil modificado de tocoferoles (alto contenido en gamma-tocoferol).

La composición en ácidos grasos y tocoferoles de los cuatro tipos de aceite de girasol, así como el OSI tras calentamiento a 11O ⁰ C durante 10 horas se muestra en Ia Tabla 2:

Tabla 2. Composición en ácidos grasos y tocoferoles y valores de su OSI tras calentamiento a 110 ⁰ C durante 10 horas de cuatro tipos de aceite de girasol:

a16:0=ácido palmítico; 18:0=ácido esteárico; 18:1=ácido oleico; 18:2=ácido linoleico; 16:1 ácido palmitoleico bA-T=alfa-tocoferol; B-T=beta-tocoferol; G-T=gamma-tocoferol; D-T=delta- tocoferol

b) Estudio de Ia degradación de los tocoferoles v de Ia aparición de compuestos polares y polímeros durante el calentamiento

Para estudiar el efecto sinérgico de Ia modificación del perfil de tocoferoles sobre perfiles ya modificados de ácidos grasos en el aceite, se procedió a someter a los aceites 3 y 4 descritos en el apartado a), a una elevada temperatura (180 ⁰ C) durante un período prolongado de tiempo (25 h), y se midieron los siguientes parámetros directamente relacionados con Ia degradación termooxidativa del aceite: - Contenido total en tocoferoles, expresados como mg totales de tocoferoles por kg de aceite, medidos según el método estándar de Ia International Union of Puré and Applied Chemistry (IUPAC, Standard methods for the analysis oils, fats and derivatives. 1st supplement to 7th edition. Pergamon Press, Oxford, Reino Unido, 1992). - Formación de compuestos polares, expresados como % del peso total del aceite, medidos según el método descrito por M.C. Dobarganes y col. (High- performance size exclusión chromatography of polar compounds in heated and non-heated fats, Fat Science and Technology 90: 308-311 , 1988).

- Formación de polímeros, expresados como % del peso total del aceite, medidos según según el método estándar de Ia International Union of Puré and Applied Chemistry (IUPAC, 1992, obra citada).

Los resultados se muestran en Ia Tabla 3.

Tabla 3. Contenido total en tocoferoles (mg kg ^"1 ), contenido en compuestos polares (%) y en polímeros (%) de dos tipos de aceite tras calentamiento a 18O ⁰ C durante 25 horas.

aA-T=alfa-tocoferol; B-T=beta-tocoferol; G-T=gamma-tocoferol; D-T=delta- tocoferol blndican los niveles iniciales (0) y los obtenidos tras 25 horas de calentamiento

(25) en las condiciones arriba indicadas