以下、本発明の一実施形態に係るタンパ� ��質固定化担体およびその製造方法について� ��明する。

 1.タンパク質固定化担体およびその製造方� �
 本発明の一実施形態に係るタンパク質固定� ��担体の製造方法は、塩基性アミノ酸が3個以 上連続した配列を含むタグ配列を有するタン パク質(以下、「タグタンパク質」ともいう� �)を担体に固定化する工程を含む。

 本発明の一実施形態に係るタンパク質固� ��化担体は、タグタンパク質と固定化担体と� ��、タグ配列に結合する官能基(例えば、イミ ノ基、アミド結合)を介して化学結合されて� �る。

 1.1.タグタンパク質
 本実施形態に係るタンパク質固定化担体の� ��造方法において、固定化用担体に固定化さ� ��るタグタンパク質は、塩基性アミノ酸が3個 以上連続した配列を含むタグ配列を含む。

 タグ配列のアミノ酸の数は3個以上であり 、長さの上限に制限は無いが、タンパク質の 性質への影響を抑えるために、通常5~30個が� �適である。

 タグ配列は、その一部または全部が塩基� ��アミノ酸からなるのが好ましく、リジン、� ��ルギニン、およびヒスチジンから選択され� ��塩基性アミノ酸が3個以上連続した配列から なるのがより好ましく、リジン、アルギニン 、およびヒスチジンのうちいずれか1種のア� �ノ酸が3個以上連続する配列を含むことがさ� ��に好ましく、上記いずれか1種のアミノ酸が 3~10個連続する配列のみからなるのが特に好� �しい。

 タグ配列がリジン、アルギニン、および� ��スチジンのいずれか1種類のアミノ酸のみか らなる場合、これらのタグ配列はそれぞれオ リゴリジン、オリゴアルギニン、オリゴヒス チジンである。また、5量体または6量体から� ��るオリゴヒスチジンは、一般に、ヒスチジ� ��タグ(Hisタグ)と呼ばれるタグである。タグ� �列としてヒスチジンタグを用いるのは、市� �の発現ベクターを使用でき、容易に組み換� �タンパク質を構築できる点で好ましい。

 タンパク質にタグ配列を付加する方法と� ��ては、例えば、タンパク質の一次配列にタ� ��配列を組み込む方法や、タンパク質のアミ� ��酸残基にタグ配列をグラフト状に付加させ� ��方法が挙げられる。

 タンパク質の一次配列にタグ配列を組み� ��む場合、タンパク質の性質に与える影響を� ��小限にするために、タンパク質分子の末端� ��あるN末端あるいはC末端にタグ配列を付加� �るのが好ましいが、タンパク質の内部配列� �タグ配列を組み込んでもよい。この場合、� �グタンパク質は、例えば、タンパク質をコ� �ドする遺伝子およびタグ配列をコードする� �伝子を、読み取り枠を一致させた状態で融� �した配列を組み込んだ発現ベクターを調製� �、その発現ベクターで形質転換した大腸菌� �を培養し、発現したタグタンパク質を該大� �菌から分離精製することで調製することが� �きる。

 タンパク質のアミノ酸残基にタグ配列をグ� ��フト状に付加させる場合、例えば、ポリペ� ��チドの固層合成法等を用いて調製したタグ� ��列を、精製されたタンパク質とカップリン� ��することで調製することができる。タンパ� ��質とタグ配列とのカップリング方法として� ��、例えば、タンパク質とタグ配列とを混合� ��た状態で、N-ethyl-N’-(dimethilaminopropyl) carbodi imide(EDC)などのカルボジイミド試薬を用いて� �理することによ
り、タンパク質のアミノ基および/またはイ� �ノ基とタグ配列の末端カルボキシル基との� �、タンパク質のカルボキシル基とタグ配列� �アミノ基および/またはイミノ基との間、あ� ��いはその両方で、タンパク質とタグ配列と� ��カップリングすることができる。

 1.2.固定化用担体
 タグタンパク質を固定化させる固定化用担� ��は、タグタンパク質と化学結合する官能基� ��有することが好ましい。そのような官能基� ��、例えば、カルボキシル基、エポキシ基、� ��よびトシル基から選ばれる少なくとも1種で あるのが好ましい。タグ配列には塩基性アミ ノ酸が含まれるため、固定化用担体が有する 官能基がこれらの官能基からなることにより 、タグ配列中の塩基性アミノ酸に含まれるア ミノ基および/またはイミノ基と上記官能基� �が効率良く反応する結果、タグ配列を介し� �タンパク質と固定化担体とが化学結合する� �とにより、タグタンパク質を固定化用担体� �効率良く固定化することができることが、� �定化量の増大に寄与していると考えられる� �

 また、タグ配列は、塩基性アミノ酸が3分 子連続した配列を含む。塩基性アミノ酸はア ミノ基およびイミノ基もしくはいずれか一方 を有するため、タグ配列では、塩基性アミノ 酸に含まれるアミノ基および/またはイミノ� �の密度が高く、後述するように、該アミノ� �および/またはイミノ基の反応性が高い。こ� ��により、タグタンパク質のうちタグ配列以� ��の部位に存在するアミノ基等よりも、タグ� ��列中の塩基性アミノ酸に含まれるアミノ基� ��よび/またはイミノ基を優先的に固定化担体 の官能基と反応させることができるため、タ ンパク質自体の性質に与える影響を少なくす ることができることが、固定化したタンパク 質の性質の維持に寄与していると考えられる 。上記方法により、タグタンパク質と固定化 担体にタグタンパク質が高効率で化学結合し たタンパク質固定化担体を得ることが出来る 。

 固定化用担体に含まれる官能基は、固定� ��用担体を作成する際に、例えば、共重合、� ��ラフト重合、カップリング、プラズマ処理� ��の操作によって、化学的に導入することが� ��きるほか、固定化用担体に対して練り込み� ��コーティング等の操作によって物理的に導� ��することもできる。官能基の導入効率を考� ��れば、官能基は化学的に導入することが好� ��しい。

 1.3.タグタンパク質と固定化用担体との固定 化
 タグタンパク質と固定化用担体との結合方� ��としては、例えば、固定化用担体中の官能� ��と、タグタンパク質中のアミノ基および/ま たはイミノ基とを反応させることにより、タ グタンパク質と固定化用担体とを化学結合さ せる方法が挙げられる。

 例えば、固定化用担体にカルボキシル基� ��存在する場合、該カルボキシル基とタグタ� ��パク質中のアミノ基および/またはイミノ基 とを、EDCなどのカルボジイミド試薬を用いて アミンカップリング法により結合することが できる。

 本実施形態に係るタンパク質固定化担体� ��製造方法において、固定化させるタンパク� ��として、塩基性アミノ酸が3個以上連続した 配列を含むタグ配列を含むタグタンパク質を 用いる場合、固体化用担体中の官能基とのカ ップリング効率を飛躍的に増大させることが できるため、固定化用担体へのタンパク質の 固定化量を大幅に増やすことができる。その 結果、従来、固定化用担体へ十分な量を固定 化することが困難であったタンパク質(例え� �、Protein GやProtein A)であっても、固定化用� �体に効率良く固定化することができる。

 さらに、本実施形態に係るタンパク質固� ��化担体の製造方法において、タグ配列とし� ��、リジン、アルギニン、およびヒスチジン� ��いずれか1種のアミノ酸が3個以上連続する� �列を用いることにより、固定化用担体中の� �能基とのカップリング効率をさらに増大さ� �ることができる。その原因としては、同一� �アミノ酸が連続してクラスター状に存在す� �と、これらのアミノ酸残基の反応性が増大� �ることが考えられる。この現象の発現の要� �は定かでないが、リジン、アルギニン、お� �びヒスチジンのいずれか1種のアミノ酸が3個 以上連続するタグ配列を用いることにより、 反応に関与するアミノ基やイミノ基の密度が 局所的に高くなるため、反応相手である固定 化用担体の官能基との相互作用が増大するこ と、ならびに、タグ配列のアミノ酸の立体的 配座が反応に適した位置になることなどが考 えられる。

 また、本実施形態に係るタンパク質固定� ��担体の製造方法において、固定用担体が、� ��ルボキシル基、エポキシ基、およびトシル� ��から選ばれる少なくとも1種の官能基を有す る場合(特に、エポキシ基およびトシル基ま� �はいずれか一方である官能基を有する場合)� ��固定化用担体へのタンパク質の固定化量を� ��大させることができる。この場合、タグタ� ��パク質と固定化用担体との結合は、両者を� ��当な溶媒に分散したのち、一定時間混合す� ��ことにより達成することができる。

 固定化用担体の材質は特に限定するもの� ��はなく、例えば、有機、無機、ガラス、金� ��、またはこれらの複合体であってもよい。

 固定化用担体の形態としては、例えば、� ��子状、膜状、スライド状、ディスク状、プ� ��ート状、繊維状、チューブ状が挙げられる� ��

 固定化用担体が粒子状である場合、固定� ��用担体は磁性粒子であることが好ましい。� ��の場合、固定化用担体は粒子の内部または� ��面に磁性体を含有することができる。固定� ��用担体が磁性粒子である場合、磁性体は該� ��子の内部のみに含有され、表面に露出して� ��ないことが好ましい。固定化用担体が磁性� ��子であることにより、磁気作用を用いて粒� ��を固液分離することができる。

 磁性粒子の内部組成は均質であってもよ� ��、あるいは不均質であってもよいが、残留� ��化が少ない、超常磁性の磁性体微粒子を含� ��不均質な粒子であるのが好ましい。また、� ��性粒子は、低比重にすることにより水中で� ��沈降を遅らせ、水への分散が容易になるた� ��、有機物が含まれていることが好ましい。

 不均質な内部組成を有する磁性粒子の内� ��構造としては、(I)有機ポリマーなどの非磁� ��の有機物からなる連続相中に磁性体微粒子� ��分散している粒子、(II)磁性体微粒子の2次� �集体をコアとし、有機ポリマーなどの非磁� �の有機物をシェルとする粒子、(III)有機ポリ マーなどの非磁性体からなる核粒子と、該核 粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の2� �凝集体層(磁性体層)と、磁性体層の外層であ る有機ポリマー層とを有する粒子などが挙げ られる。これらの中では、(III)超常磁性微粒� ��の2次凝集体層を含む核粒子(以下、「超常� �性体微粒子の2次凝集体層を含む核粒子」を� ��母粒子」と表す)の外層に、有機ポリマー層 を有する粒子が好ましい。有機ポリマー層は 2層以上のポリマー層から構成されていても� �い。

 なお、各種粒子に用いられる有機ポリマ� ��は、コア・シェル型粒子のコア部分を除い� ��、粒子最表面を形成するポリマーがカルボ� ��シル基、エポキシ基、およびトシル基から� ��ばれる少なくとも1種の官能基を有している のが好ましい。また、核粒子とその外層(磁� �体層)との界面、ならびに磁性体層とその外� ��(有機ポリマー層)との界面は、両層の成分� �混在した状態であっても構わない。

 上記(I)の粒子の好ましい製造方法として� ��、例えば、特開平9-208788号公報で開示され� �方法が挙げられる。また、上記(III)の粒子の 好ましい製造方法としては、例えば、特開200 4-205481号公報で開示された方法が挙げられる� ��

 磁性体としては、例えば、四三酸化鉄(Fe ₃ O ₄ )、γ-重三二酸化鉄(γ-Fe ₂ O ₃ )等の各種フェライト、鉄、マンガン、コバ� �ト、クロムなどの金属またはこれら金属の� �金などを用いることができる。平均粒子径� �30nm以下の磁性体を用いることにより、実質� ��に超常磁性である固定化用担体を得ること� ��できる。

 磁性体の含有量は、粒子全体の重量に占� ��る割合が10重量%以上であるのが好ましく、2 0~80重量%であることがより好ましい。ここで� ��粒子全体の重量に占める割合が10重量%以下� ��あると、良好な磁気分離性が得られず、分� ��するために相当に長い時間を要するので好� ��しくない。一方、粒子全体の重量に占める� ��合が80重量%以上であると、粒子表面に露出� ��る磁性体が多くなるので好ましくない。

 固定化用担体が粒子状である場合、粒子( 固定化用担体粒子)の粒子径は、特に制限さ� �るものではなく、通常10nm~10mmである。粒子� �は、レーザ回折・散乱法により求める。ま� �、上記粒子の形状は球状である必要はなく� �針状等の異形粒子であってもよい。

 本実施形態に係るタンパク質固定化担体� ��一例として、セファロース製ゲルなどの固� ��化用担体に、抗体分子と親和性を有するタ� ��パク質であるプロテインAやプロテインGを� �定化させた担体が挙げられる。この担体は� �従来の担体に比較してプロテインAやプロテ� ��ンGの固定化量が多いため、抗体の精製容量 を増大することができる。

 また、本実施形態に係るタンパク質固定� ��担体の製造方法において、固定化させるタ� ��パク質が抗体であって、ポリマーラテック� ��等の微粒子を固定化用担体として用い、該� ��粒子に抗体を結合させて得られた固定化担� ��をサンドイッチエライザ法等の免疫診断用� ��体として用いる場合、抗体の固定化量を増� ��させることができる。これにより、分析対� ��の抗原の測定限界濃度が低濃度側および高� ��度側ともに広がるため、測定対象の濃度の� ��イナミックレンジが広く、かつ、短時間で� ��査が可能な診断薬を作製することができる� ��

 さらに、各種のタンパク質や抗体を網羅� ��にチップ上に固定化させて、タンパク質チ� ��プや抗体チップを作成する場合、各種タン� ��ク質間において固定化量のバラツキが少な� ��、精度の高い評価が可能なチップを作製す� ��ことができる。

 2.実施例
 以下、本発明の実施例について説明するが� ��本発明はこれら実施例に限定されるもので� ��ない。

 2.1.合成例1(カルボキシル基を有する固定化� ��担体(磁性粒子)の合成)
 75%ジ(3,5,5-トリメチルヘキサノイル)パーオ� �サイド溶液(日本油脂製「パーロイル355-75(S)� ��2質量部を1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液2 0質量部に混合し、超音波分散機にて微細乳� �した。これを粒子径0.77μmのポリスチレン粒� ��13質量部および水41質量部の入ったリアクタ ーに入れ、25℃で12時間攪拌した。別の容器� �て、スチレン96質量部およびジビニルベンゼ ン4質量部を0.1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶� ��400質量部で乳化させた液を前記リアクター� ��入れ、40℃で2時間攪拌した後、75℃に昇温� �て8時間重合した。室温まで冷却した後、遠� ��分離により粒子のみ取り出したものをさら� ��水洗し、乾燥および粉砕してコア粒子を得� ��。コア粒子の数平均粒子径は1.5μmであった� ��

 次に、油性磁性流体(商品名:「EXPシリー� �」,(株)フェローテック製)にアセトンを加え� ��粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥する� ��とにより、疎水化処理された表面を有する� ��ェライト系の磁性体微粒子(平均一次粒子径 :0.01μm)を得た。

 次いで、上記コア粒子15gおよび上記磁性� ��微粒子15gをミキサーでよく混合し、この混� ��物をハイブリダイゼーションシステムNHS-0� �(奈良機械製作所(株)製)を使用して、羽根(撹 拌翼)の周速度100m/秒(16200rpm)で5分間処理し、� ��性体微粒子からなる磁性体層を表面に有す� ��数平均粒子径が2.0μmの母粒子を得た。

 次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナト� ��ウム0.25重量%およびノニオン性乳化剤(商品� ��:「エマルゲン150」,花王(株)製)0.25重量%を含 む水溶液(以下、「分散剤水溶液」という)375g を1Lセパラブルフラスコに投入し、次いで、� ��記磁性体層を有する母粒子15gを投入し、ホ� ��ジナイザーで分散した後、60℃に加熱した� �分散剤水溶液150gに、メチルメタクリレート2 7g、トリメチロールプロパントリメタクリレ� ��ト(以下、「TMP」という。)3g、およびジ(3,5,5 -トリメチルヘキサノイル)パーオキサイド(日 本油脂社製;パーロイル355)0.6gを入れて分散さ せたプレエマルジョンを60℃にコントロール� ��た前記1Lセパラブルフラスコに1時間30分か� �て滴下した。

 滴下終了後、60℃に保持し1時間攪拌した� ��、分散剤水溶液75gに、シクロヘキシルメタ� ��リレート13.5g、メタクリル酸1.5g、およびジ( 3,5,5-トリメチルヘキサノイル)パーオキサイ� �(日本油脂社製;パーロイル355)0.3gを入れて分� ��させたプレエマルジョンを、60℃にコント� �ールした上記1Lセパラブルフラスコに1時間30 分かけて滴下した。その後75℃に昇温した後� ��らに2時間重合を続けて、反応を完了させた 。

 次いで、前記セパラブルフラスコ中の粒� ��を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用� ��て繰り返し洗浄した。以上により、カルボ� ��シル基を有する磁性粒子を得た(以下、「A� �子」とする)。

 2.2.合成例2(エポキシ基を有する固定化用担� ��(磁性粒子)の合成)
 合成例1で、シクロヘキシルメタクリレート 13.5gおよびメタクリル酸1.5gの代わりにGMA13.5g� ��よびTMP1.5gを用いた以外は合成例1と同様の� �順を行なうことにより、エポキシ基を有す� �粒子(以下、「粒子B」とする)を得た。

 2.3.合成例3(トシル基を有する固定化用担体( 磁性粒子)の合成)
 凍結乾燥により得た粒子B 5gを1Lセパラブル フラスコに取り、1mol/L 硫酸60mlを入れ、60℃� ��6時間撹拌した。次いで、前記セパラブルフ ラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後 、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。

 以上により、2,3-ジヒドロキシプロピル基 を有する磁性粒子を得た。この粒子を凍結乾 燥して得られた乾燥粒子1.0gを8mlのピリジン� �分散させた後、p-トシルクロライド0.2gを加� �て室温で2時間撹拌した。反応後、磁気を用� ��て粒子を分離し、アセトンで4回、続いて蒸 留水で4回洗浄して、2,3-ジヒドロキシプロピ� ��基がトシル化された磁性粒子(以下、「粒子 C」とする)を得た。この磁性粒子(粒子C)の数� ��均粒子径は2.9μmであった。

 2.4.実施例1
 以下の4種類のタンパク質につき、カルボキ シル基を有する粒子Aへの固定化量を評価し� �。4種類のタンパク質は、(i)N末端にヒスチジ ン分子が6個連続した6ヒスチジンタグを有す� ��グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(His6-GST� ��アップステ
イト・バイオテクノロジー(Upstate Biotechnology) 社製、カタログNo.12-35
0、分子量27kDa)、(ii)同じくN末端に6ヒスチジ� �タグを有するAkt1(
His6-Akt1、アップステイト・バイオテクノロジ ー(Upstate Biotechnology)
社製、カタログNo.14-279、分子量59kDa)、(iii)同� ��くN末端に6ヒスチジンタグを有するユビキ� �ン(His6-Ubiquitin、アフィニティー・
リサーチ・プロダクツ・リミテッド(AFFINITI R esearch Products Ltd)社製、カタログNo.UW8610、分� ��量9.4kDa)、(iv)N末端にヒスチジン分子が10個
連続した10ヒスチジンタグを有するユビキチ� ��(His10-Ubiquitin、R
&Dシステムズ・インク(R&D Systems, Inc)社 製、カタログNo.701-UB、分子量10kDa)であった。

 まず、それぞれのタンパク質の溶媒を限� ��濾過によりリン酸ナトリウム緩衝溶液(10mM� �pH7.0)に置換し、吸光度により濃度を1.0mg/mLに 調製した。これらタンパク質の粒子Aへの固� �化量を以下のように評価した。

 粒子A分散液からの粒子1mg分をテストチュ ーブに取り、テストチューブ用の磁気スタン ドを用いて粒子を分離した後、上清を除去し 、次に100μLの0.1M MES緩衝溶液(pH5.0)に分散し� �。そこにEDCのMES溶液(濃度10mg/mL)5μLを加え、2 5℃で30分反応させた。磁気スタンドを用いて 粒子を分離し溶媒を捨て、新たにMES緩衝溶液 100μL加えた。そこに、タンパク質溶液を20μL� ��え、25℃で3時間振とう反応した。最後に粒� ��を0.5mLの洗浄液(0.05% Tween20界面活性剤含有PB S緩衝液)で4回洗浄して、タンパク質固定化磁 性粒子を得た。

 このタンパク質固定化量を、タンパク質� ��量法であるBCAアッセイ法を用いて定量した� ��濃度は測定対象であるタンパク質溶液を標� ��物質として算出した。その結果を表1に示す 。

 2.5.比較例1
 実施例1の比較例として、以下の4種類のタ� �パク質につき、粒子Aへの固定化量を、実施� ��1で用いた方法と同様の方法により測定した 。4種類のタンパク質は、(i)グルタチオン-S-� �ランスフェラーゼ(GST、シグマ社製、プロダ� ��トNo.G5663
、分子量26kDa)、(ii)GSTタグを有するAkt1(GST-Akt1� ��アボヴァ・コーポレーション(Abnova corporatio n)製、カタログNo.H00000207-P01、分子量
79kDa)、(iii)ユビキチン(ユビキチン、ノバス・ バイオロジカル・インク(Novus Biologicals,Inc)社 製、カタログNo.NB800-PC40、分子量8.5kDa)、(iv)N� �端にGSTタグを有するユビキチン(GST-ユビキチ ン、ノバス・バイオロジカル・インク(N ovus� �Biologicals,Inc)社製、カタログNo.NB800-PC42、分子 量35kDa
)である。

 各タンパク質は、限外濾過により溶媒を� ��ン酸ナトリウム緩衝溶液(10mM、pH7.0)に置換� �、吸光度により濃度を1.0mg/mLに調製して使用 した。得られた結果を表1に示す。

 2.6.実施例2
 本実施例では、実施例1で使用した4種のタ� �パク質につき、エポキシ基を有する粒子Bへ� ��固定化量を評価した。粒子B分散液から粒子 1mg分をテストチューブに取り、テストチュー ブ用の磁気スタンドを用いて粒子を分離した 後、上清を除去し、次にLys6-プロテインGの0.1 Mホウ酸緩衝溶液(pH9.5)に分散した。そこに、� ��ンパク質溶液を20μL加え、37℃で24時間振と� ��反応した。最後に粒子を0.5mLの洗浄液(0.05%  Tween20界面活性剤含有PBS緩衝液)で4回洗浄して タンパク質固定化磁性粒子を得た。このタン パク質固定化量を、実施例1で用いた方法と� �様の方法で測定した。その結果を表2に示す� ��

 2.7.比較例2
 本比較例では、実施例2の比較例として、比 較例1で使用した4種のタンパク質につき、エ� ��キシ基を有する粒子Bへの固定化量を、実施 例2で用いた方法と同様の方法で測定した。� �の結果を表2に示す。

 2.8.実施例3
 本実施例では、粒子として粒子Bの代わりに トシル基を有する粒子Cを使用した他は、実� �例2と同様の材料および方法にて、各タンパ� ��質を粒子に固定化する処理を行なった後、� ��ンパク質の固定化量を測定した。その結果� ��表3に示す。

 2.9.比較例3
 本比較例では、実施例3の比較例として、粒 子として粒子Bの代わりにトシル基を有する� �子Cを使用した他は、比較例2と同様の材料お よび方法にて、各タンパク質を粒子に固定化 する処理を行なった後、タンパク質の固定化 量を測定した。その結果を表3に示す。

 2.10.実施例4
 本実施例では、タンパク質としてプロテイ� ��Gを用いて、固定化用担体への固定化量にお けるタグ配列の効果を検討した。プロテイン Gは文献、Bengt Guss et al. (1986) The
EMBO Journal. 5(7) 1567-1575に記載の分子を改変� �て使用した。

 文献中のプロテインGのアミノ酸番号190番 から384番の配列に対して、そのN末端にリジ� �分子が6個連続した6リジンタグ(以下「Lys6」� ��表記)を融合したリジンタグ融合タンパク質 を作成した。文献に記載の方法に従い、アミ ノ酸番号190番から384番の配列をコードする遺 伝子を取得し、そのアミノ末端側の6アミノ� �配列をコードするDNA配列とリジン分子6分子� ��をコードするDNA分子とが結合したDNAを化学� ��成し、これとC末端の12アミノ酸をコードす� ��DNAとをPCRプライマーとして用い、PCR法で増� ��することにより、6リジンタグをコードする DNAを融合させた、プロテインGをコードする� �伝子を作成し、これを発現ベクターに導入� �、大腸菌で発現させた後、該大腸菌を分離� �製することにより、目的のタグ配列(リジン� ��グ)を有するタグタンパク質(Lys6-プロテイン G)を調製した。

 実施例1で用いた方法と同様の方法により 、このLys6-プロテインGを、カルボキシル基を 有する粒子Aに固定化し、その固定化量を測� �した。その結果を表4に示す。

 また、このLys6-プロテインG固定化粒子の� ��ムノグロブリンG(IgG)固定化量を測定した。L ys6-プロテインG固定化粒子の分散液から、粒� ��1mg分をテストチューブに取り、テストチュ� ��ブ用の磁気スタンドを用いて粒子を分離し� ��後、上清を除去し、次に50μLの0.1Mクエン酸- リン酸緩衝溶液(pH5.0)に分散した。そこに、� �トIgG(シグマ社製、商品番号I4506)の0.1Mクエン 酸-リン酸緩衝溶液(1mg/mL、pH5.0)を10μL加え、25 ℃で1時間振とう反応した。未反応のヒトIgG� �0.1Mクエン酸-リン酸緩衝溶液(pH5.0)で数回洗� �した後、粒子に捕捉されたヒトIgGを50μLの0.1 Mクエン酸緩衝溶液(pH2.0)で溶出し、回収され� ��IgG量を吸光度により計算した。得られた粒� ��1mg当たりのIgG結合容量を表4に示す。

 2.11.比較例4
 実施例4で挙げた文献中のプロテインGのア� �ノ酸番号190番から384番の配列に相当するプ� �テインG分子を作成した。文献に記載の方法� ��従い、プロテインGのアミノ酸番号190番から 384番の配列をコードする遺伝子を取得し、そ れを発現ベクターに導入して大腸菌で発現さ せた後、分離精製することにより目的のプロ テインGを調製した。

 実施例1で用いた方法と同様の方法により 、このプロテインGを、カルボキシル基を有� �る粒子Aに固定化し、その固定化量を測定し� ��。その結果を表4に示す。

 また、実施例4で用いた方法と同様の方法 によりヒトIgGの結合容量を測定した。その値 を表4に示す。

 表1~4に示されるように、塩基性アミノ酸� ��3個以上連続した配列を含むタグ配列をタン パク質してタグタンパク質を調製し、このタ グタンパク質を固定化用担体に固定化するこ とにより、固定化用担体へのタンパク質の固 定化量を増大することができることが確認さ れた。

 表1は、カルボキシル基含有粒子Aの1mgあ� �りのタンパク質の固定化量を示している。� �1によれば、何れのタンパク質を用いた場合� ��おいても、固定化用担体(カルボキシル基含 有粒子)への固定化量は、タグ配列(Hisタグ)を 有しないタンパク質よりも、タグ配列(Hisタ� �)を有するタンパク質のほうが多かった。

 表2は、エポキシ基含有粒子Bの1mgあたり� �タンパク質の固定化量を示している。表2に� ��れば、何れのタンパク質を用いた場合にお� ��ても、タグ配列(Hisタグ)を有しないタンパ� �質よりも、タグ配列(Hisタグ)を有するタンパ ク質のほうが多かった。

 表3は、トシル基含有粒子Cの1mgあたりの� �ンパク質の固定化量を示している。表3によ� ��ば、何れのタンパク質を用いた場合におい� ��も、固定化用担体(トシル基含有粒子)への� �定化量は、タグ配列(Hisタグ)を有しないタン パク質よりも、タグ配列(Hisタグ)を有するタ� ��パク質のほうが多かった。

 表4は、カルボキシル基含有粒子1mgあたり のプロテインGおよびLys6-プロテインG固定化� �ならびにヒトIgG結合容量を示している。表4� ��よれば、固定化用担体(カルボキシル基含有 粒子)へのプロテインGの固定化量は、プロテ� ��ンGにLys6タグを融合させたタグタンパク質� �用いることによって向上した。また、タグ� �ンパク質(Lys6-プロテインG)を固定化させた粒 子のIgG結合容量は、Lys6タグを有さないタン� �ク質(プロテインG)を固定化させた粒子のIgG� �合容量と比較して大きいことから、タンパ� �質(プロテインG)にタグ配列(Lys6タグ)を融合� �せて得られたタグタンパク質(Lys6-プロテイ� �G)を用いることにより、タンパク質固定化担 体の性能を向上できることが明らかになった 。

 また、表4に示されるように、タンパク質 としてプロテインGを用いた場合、固定化量� �増大する結果、IgG結合容量で示されるタン� �ク質固定化担体の性能を向上させることが� �きることが確認された。