Introducción Los compuestos tensioactivos son productos orgánicos anfifilos compuestos por una parte hidrófila (-COO-,-S03,-O-, amonio cuaternario) y una hidrófoba (una cadena grasa de 8-18 átomos de carbono). Estos productos presentan un extraordinario interés por su amplia y versátil aplicación en preparados de fuerte incidencia en nuestro más inmediato entorno (emulsionantes alimentarios, productos de limpieza e higiene personal, fármacos, cosméticos, pinturas, tintas, antiestáticos de fibras, etc). Si bien hoy en dia se puede considerar que los sectores industriales disponen de los tensioactivos adecuados para las funciones que deben realizar, las actuales normativas europeas exigen la búsqueda y estudio de nuevas alternativas en las que converjan los siguientes requisitos : inocuidad, multifuncionalidad, eficacia y competitividad.

Una de las estrategias que existe actualmente para conseguir tensioactivos ecológicamente aceptables es la preparación de moléculas cuya estructura molecular mimetiza la de los tensioactivos naturals : lipoaminoácidos, fosfolípidos y glicerolípidos (J. H. Fender, 1989"Membrane Mimetic C'hemisísv, John Wiley & Son) Los glicerolípidos (mono y diacilglicéridos) constituyen actualmente (Zhu, Y., Masuyama, A., Kirito, Y.. Okahara, M., Rosen, M. J., 1992, J. Am. Oil. Chem. Soc, 69 : 6269), el 75% de los emulsionantes empleados en la industria alimenticia debido a sus excelentes propiedades interfaciales y vehiculizantes, siendo los monoacilglicéridos los más importantes debido a su gran funcionalidad. Dentro de este grupo, los compuestos más estudiados y empleados son los esteres alquílicos de glicerol ya que se obtienen fácilmente mediante glicerolisis de triacilglicéridos o por esterificación del glicerol con ácidos grasos (Lipid Technologies and Applications, 1997, Ed. Gunstone, F. D., Padley.

F. B., New York.). Los monoacilglicéridos son compuestos con muy baja solubilidad en agua, por lo que generalmente se añaden a las formulaciones junto con otros emulsionantes de carácter más polar.

El objeto de la presente invención es la síntesis de una nueva familia de tensioactivos derivados de aminoácidos con una estructura mimética a los monoacilglicéridos y diacilglicéridos. Estos tensioactivos están constituidos por un esqueleto central de glicerol que une la parte hidrófoba formada por una o dos cadenas grasas de longitud variable a la parte hidrófila formada por un aminoácido. Estas nuevas estructuras presentan ventajas sobre los mono y diacilglicéridos anteriormente descritos : a) la introducción de un aminoácido como parte polar del tensioactivo aumenta la solubilidad en medio acuoso y b) se pueden obtener compuestos con actividad antimicrobiana dependiendo del aminoácido presente ESTADO DE LA TECNICA Los tensioactivos derivados de aminoácido son compuestos de elevado interés debido a su multifuncionalidad e inocuidad (Takehara, M. 1989, Colloids and Surfaces, 38 : 149 ; Selve, C., Mansuy, L., Allouch, M., 1992, J. Chem. Res. 22 : 401). Estas características han sido las responsables de que en los últimos años se haya llevado a cabo la síntesis y estudio de propiedades de una gran variedad de tensioactivos de este tipo, de carácter iónico, catiónico, no iónico y anfótero (Takehara, M. 1989, Colloids and Surfaces, 38 : 149 ; Sagawa, K., Yokota, H., Ueno, I., Miyosi, T., Takehara, M., XIV Congreso IFSCC, 1986). En esta línea nuestro equipo ha sintetizado mediante metodologías química y enzimática derivados monocatenarios Nα-acil aminoácido, aminoacil N-alquil amidas, aminoacil alquil esteres, así como tensioactivos geminales de arginina. Este estudio ha dado lugar a un gran número de patentes y publicaciones (ES9500061 (1995) ; PI 9500027 (1995) ; PCT/ES96/00026 (1996) ; ES 9700520 (1997) ; ES 9900739 (1999) ; M. R. Infante, J. Molinero, P. Erra, (1992), JAOCS, vol. 69, n°7 ; J. Molinero, M. R. Juliá, P. Erra, M. Robert, M. R. Infante, 1988, JAOCS, Vol. 65, n°6 ; C. Solans, M. A. Pés, N. Azemar, M. R. Infante, 1990, Prog. Colloid Polym Sci 81, pp 144- 150 ; L. Pérez, J. L. Torres, A. Manresa, C. Solans, M. R. Infante, 1996, Languir, 12 (22), pp 5296-5301, Clapis, P., Moran, C., Infante, M. R. (1999) Biotechnol. Bioeng. 63 3 pp333- 343).

Con respecto a los mono y diacilglicéridos, la bibliografía describe con gran detalle sus propiedades y aplicaciones (K. Larsson, 1994,"Lipids. Molecular Organization, Phisical Functions and Technical Applications"The Oily Press LTD). Estas propiedades se ven sensiblemente modificadas cuando el/los extremos hidroxilos libres de la molécula se funcionalizan con ácidos orgánicos del tipo ácido láctico, cítrico y acético ("Food Emulsions", 1997, Ed. by Stig E. Friberg and K. Larsson).

La síntesis de derivados de aminoácidos mono y diacilglicéridos requiere la obtención previa de los derivados del tipo 1-0-L-aminoacil esteres de glicerol. La bibliografia describe la síntesis de estos intermedios utilizando catalizadores químicos. Valivety et al.

(Valivety, R., Gill, I. S., Vulfson, E. N. (1998) J. Surf Deterg. 1 177-185). prepararon diversos compuestos del tipo 1-0-L-aminoacil esteres de glicerol a partir de N'X-Z- aminoácidos y glicerol en presencia de BF3-eterato. Asimismo son numerosas las publicaciones basadas en la síntesis enzimática de enlaces esteres (Cantacuzene, D., Guerreiro, C. (1987) Tetrahedron Letters 28, 5153-5156 ; Kawashiro, K., Inhizaki, H., Sugiyama, S., Hayashi, H. (1993) Biotechnol. Bioeng. 42 309-314 ; Kise, H., Hayakawa, A., Noritomi, H. (1987) Biotechnol. Lett. 9 543-548). Sin embargo, la obtención de gliceril esteres con aminoácidos N-protegidos como productos de partida está muy poco desarrollada. Mitin et al. (Mitin, Y. V., Braun, K., Kuhl, P. (1997) Biotech. and Bioeng 54, 287) describen la obtención de gliceril esteres de aminoácidos para su utilización en la síntesis de péptidos. En todos los casos, el extremo a-amino de los aminoácidos así como las funciones reactivas de sus cadenas laterales está protegido por grupos del tipo benziloxicarbonil (Z) y tert-butiloxicarbonil (Boc).

En relación con la acilación de los grupos hidróxilo del glicerol se ha encontrado descrito la utilización de enzimas del tipo lipasas (Valivety, R., Gill, I. S., Vulfson, E. N. (1998) J.

Surf Deterg. 1 177-185) como catalizadores de la reacción de esterificación.

Las principales novedades de la presente invención son la combinación en una misma molécula de tensioactivos tipo mono y diacilglicéridos y tensioactivos derivados de aminoácido con minima protección así como la utilización de enzimas como sustitutos de los catalizadores químicos convencionales.

DESCRIPCI#N DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una nueva familia de tensioactivos derivados de aminoácido con un esqueleto de glicerol esterificado por una o dos cadenas de ácido graso así como a los procedimientos de síntesis de estos compuestos. La fórmula estructural de estos compuestos se indica (1).

Donde : Rl es un grupo acetil.

R2 puede ser una cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituida, saturada o no saturada o un grupo aromático opcionalmente sustituido.

R3 y R4 pueden ser un hidrógeno o una cadena lineal preferentemente larga saturada o no saturada.

X puede ser : Br-, Cl-, HS04-, CH3COO-, CF3COO-, Na +, K + En la fórmula general R2 es preferentemente un grupo : amida, hidroxibencil, imidazol y carboxilo.

R3 y R4 pueden ser seleccionados de un grupo de cadenas lineales de 8, 9, 10, 12, 14, 16 y 18 átomos de carbono saturadas o no saturadas puras o sus mezclas.

Los materiales de partida pueden ser : Aminoácidos Nα-acetil protegidos de calidad técnica -Glicerol -Ácidos y esteres grasos lineales saturados o no saturados de distinta longitud -Cloruros de ácidos grasos lineales saturados o no saturados de distinta longitud -Catalizadores químicos de calidad técnica.

-Proteasas y lipasas de calidad técnica Se varia en las moléculas el n° de cadenas alquílicas (ló 2), el grado de insaturación, la longitud de las mismas y el aminóacido presente lo cual da lugar a compuestos con un diferente comportamiento en las propiedades biológicas y fisicoquímicas de adsorción y autoagregación. Debido a la procedencia de materias primas renovables e inoculas es de esperar que estos compuestos sean degradables y no tóxicos tanto desde el punto de vista biológico como medioambiental. La utilización del grupo acetil como grupo protector de la función amino permite evitar posibles reacciones secundarias del tipo Mallard, en aplicaciones alimenticias, sin alterar el carácter biocompatible de los productos finales obtenidos.

La obtención de estos compuestos se ha llevado a cabo por metodología química y/o enzimática. A continuación se describen las etapas involucradas en cada uno de los procedimientos : 1) Procedimiento químico : la síntesis de estos compuestos por via química ha tenido lugar en 2 etapas : a) Formación de los derivados 1-0-N'-acetil-aminoacil-glicerol éster (a los cuales se designará como 00aa (Ac) a partir del Nα-acetil L-aminoácido y glicerol utilizando BF3-eterato como catalizador de la reacción de esterificación. b) Formación de los derivados 1-O-Nα-acetil-aminoacil éster 3-O- monoacilglicéridos o l-O-N'X-acetil-aminoacil éster 2, 3-O-diacilglicéridos o (a los cuales se designará como nnaa (Ae)) a partir de 00aa (Ac) utilizando cloruros de ácidos grasos lineales de 8 a 18 átomos de carbono como agentes acilantes en un medio de piridina.

2) Procedimiento enzimático : la síntesis via enzimática se ha llevado a cabo en dos etapas : a) Reacción de condensación del glicerol y el grupo carboxilo libre o esterificado del N°-acetil-L-aminoácido, empleando como catalizadores enzimas hidrolíticos, tipo proteasas y lipasas, en un medio en ausencia de disolvente y con bajo contenido acuoso. b) Reacción de acilación de el/los grupos alcoholes libres del 00aa (Ac) con ácidos grasos libres o esteres de estos ácidos, empleando como catalizadores lipasas. La reacción tiene lugar en un medio en ausencia de disolvente y con un bajo contenido acuoso.

La presente invención se refiere a nuevos compuestos tensioactivos derivados de aminoácidos del tipo mono y diacilglicéridos diseñados para que actúen como agentes de superficie y antimicrobianos. Las variaciones en la actividad serán función del n° de cadenas grasas, la longitud de éstas y el aminoácido presente en la estructura.

La purificación de los productos intermedios y finales se lleva a cabo mediante extracciones líquido/líquido, líquido/sólido, cristalizaciones, cromatografia de intercambio iónico y HPLC preparativo.

Síntesis A modo de ejemplo y sin que ello limite el procedimiento, a continuación se detalla un ejemplo de la obtención de un tensioactivo derivado del ácido aspártico (D) del tipo diacil glicerol éster con cadenas grasas de 8 átomos de carbono por via química (8 8 D (Ac)) y uno del tipo monoacil glicerol éster de cadena grasa de 12 átomos de carbono por via enzimática (12 0 D (Ac)). En ambos casos el aminoácido utilizado es aspártico.

1) Procedimiento químico la) Preparación de 88D (Ac) Se prepara una disolución 1 Molar de OOD (Ac) en piridina a la cual se añade cantidades catalíticas de una base orgánica terciaria (dimetil amino piridina, DMAP). A esta mezcla se le añade lentamente cloruro de octilo en una concentración 2. 5-3 Molar. La mezcla de reacción se mantiene en agitación durante 4-6 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se elimina el disolvente al vacío y la mezcla se purifica mediante extracciones líquido-líquido, MPLC y HPLC preparativa.

2) Procedimiento enzimático Como se ha mencionado en la memoria, el proceso consta de dos etapas : 1 a) Preparación de 0 0 D (Ac) En un reactor con cierre hermético se disuelve Nα-acetil-L-aspártico (1 eq) en glicerol (5 eq) conteniendo un 10 % de agua. La homogeneización del medio tiene lugar mediante la introducción de agitación magnética. A la disolución se añade la preparación comercial de lipasa Novozym 435. La mezcla de reacción se mantiene en agitación de tipo vaivén (200 rpm) o equivalente y termostatizada a 50 °C en un baño de agua. La reacción se sigue por cromatografía liquida de alta eficacia (HPLC) hasta que todo el N-acetil-L-aspártico se ha consumido ; aproximadamente unas 48 horas. El rendimiento en este punto y por HPLC es del 90 %. A continuación se añade al medio de reacción un volumen igual de una mezcla metanol/ácido acético 4 : 1 y se filtra para separar el enzima del medio de reacción con el producto. El filtrado previamente evaporado se disuelve en agua y se adsorbe sobre resina de intercambio aniónico débil. En una primera etapa tiene lugar la elución selectiva del glicerol presente en el medio por tratamiento con agua. Seguidamente se procede a la elución de I-N'-acetil aspártico-sn-glicerol por tratamiento con HAc 400 mM. Tras evaporación y liofilización se obtiene un sólido pardo que se identifica por espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear de protón y carbono. El rendimiento final es del 70 %.

2a) Preparación de 12 C D (Ac) En un reactor abierto conteniendo OOD (Ac) (1 eq) y ácido laúrico (2 eq) a 55 C conteniendo un 4 % (w/+v) de agua, se añade la preparación comercial Novozym 435 manteniendo el medio en agitación y termostatizado a 55 C. La reacción se sigue por cromatografía liquida de alta eficacia (HPLC) hasta que todo el 1-Nα- acetil-aspártico-sn-glicerol se haya consumido ; aproximadamente unas 72 horas.

El rendimiento en este punto y por HPLC es de un 65 %. A continuación se añade al medio de reacción un volumen igual de una mezcla acetonitrilo/agua/ácido acético 80 : 19 : 1 y se filtra para separar el soporte que contiene el enzima del medio de reacción con el producto. La obtención del producto final se consigue mediante técnicas convencionales de cristalización y/o de cromatografía.