[0001] Der Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von tensidfreien Emulsionen aus dem einjährigen Beifuss (Artemisia annua) und Pilzen der Gattung Ganoderma, die sich die durch verbesserte Eigenschaften, insbesondere durch Radikalfängereigenschaften und einen Anti-Aging-Effekt auszeichnen und daher vielfältig in der Kosmetik genutzt werden können.

Stand der Technik

1. Festkörperstabilisierte Emulsionen

[0002] Die Herstellung von Festkörperstabilisierten Emulsionen ist seit über 100 Jahren bekannt.

2. Bisherige Nutzung von Artemisia annua

[0003] Der Einjährige Beifuss {Artemisia annua) wird seit Jahrtausenden als Heilpflanze verwendet. Die Pflanze ist in Europa und Asien beheimatet. Sie wächst 2 bis 3 m hoch und hat frischgrüne, stark zerteilte Blätter und winzig cremefarbene Blütenköpfe. Zu medizinischen Zwecken werden die oberirdischen Teile der Pflanze verwendet. Die Herstellung und Anwendung von Extrakten aus Artemisia und deren Anwendung in den Bereichen Ernährung, Kosmetik und Medizin ist aus der Literatur bekannt (z. B. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1990, VoI 24/25, pp 213-222).

[0004] Die Inhaltstoffe des Einjährigen Beifusses {Artemisia annua) besitzen eine hohe Wirksamkeit gegen den Malariaerreger. Im Gegensatz zu anderen Malariamitteln hat der Wirkstoff kaum Nebenwirkungen und auch eine sehr günstige Resistenzlage, wobei er zusätzlich mit anderen Stoffen kombiniert werden kann.

[0005] Der eigentliche Wirkstoff ist das Artemisinin (Artemesin, Cotexin), ein sekundärer Pflanzenstoff (Sesquiterpen mit Peroxidgruppe), der in den Blättern und Blüten des Einjährigen Beifusses {Artemisia annua) vorkommt. Wie alle Pflanzenstoffe sind diese in der Biomasse mit weiteren ähnlichen Substanzen vergesellschaftet, da die biochemischen Wege nicht eingleisig verlaufen. So sind 9 weitere verwandte Substanzen, die ebenfalls gegen den Malariaerreger wirken, in den Pflanzen enthalten. Über 200 Inhaltstoffe konnten in den pflanzlichen Teilen insgesamt nachgewiesen werden.

[0006] Die in der Literatur diskutierte Wirkungsweise des Artemisinins hängt eng mit der chemischen Struktur zusammen. Die im Molekül enthaltene Peroxidgruppe ist in Gegenwart hoher Konzentrationen von Eisenionen instabil und bildet freie Radikale. Solche hohen Konzentrationen werden in roten Blutkörperchen und auch in Malariaerregern gefunden, die Eisen akkumulieren. Gelangt Artemisinin in Erythrozyten, werden freie Radikale gebildet und der Parasit möglicherweise dadurch getötet. Es gibt aber auch Hinweise darauf, dass Artemisinin-Derivate bestimmte Enzyme hemmen.

[0007] Aus dem Artemisinin oder verwandten Pflanzensubstanzen wurden auch mehrere halbsynthetische Derivate hergestellt, die aber alle zur Wirksamkeit die Peroxidgruppierung enthalten müssen.

[0008] Es gibt erste Anhaltspunkte einer Wirkung auf verschiedene menschliche Krebsarten. Nach Ergebnissen des Deutschen Krebsforschungszentrums Heidelberg beruht auch diese Wirkung auf der Bildung freier Radikale durch die Peroxid-Gruppierung in Gegenwart von Eisenionen. Die Prüfung des Artemisinins als potentielles Antikrebsmedikament befindet sich noch in einem frühen Stadium.

[0009] Weitere Anwendungen der peroxidhaltigen Strukturen auf der Haut, beispielsweise zur lokalen Wundbehandlung, werden in US2007269537 beschrieben.

[0010] Es ist davon auszugehen, dass die allgemeine Nachfrage nach Artemisinin - Präparaten in den nächsten Jahren auf mehrere hundert Millionen Behandlungen ansteigen wird. Um dieses Volumen zu produzieren, werden enorme Mengen des pflanzlichen Wirkstoffes benötigt. Es wäre deshalb von großem Vorteil, wenn es eine möglichst hochwertige Verwertung der dabei in großem Überschuss anfallenden Biomasse gäbe.

[0011] Aus einem Hektar Pflanzen lassen sich ein bis zwei Tonnen Blätter ernten, aus denen rund zwei bis drei Kilogramm des Artemisinins gewonnen werden können. Die Gewinnung aus pflanzlichen Rohstoffen wird dadurch erschwert, dass der Artemisinin-Gehalt der Pflanzen sehr gering ist und beträchtliche Schwankungen aufweist. Er liegt meist zwischen 0,1 und 0,4%, bezogen auf das Trockengewicht. Im Idealfall lassen sich von einem Hektar Pflanzenmaterial ein bis zwei Tonnen Blätter ernten, aus denen mittels Extraktion mit unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan und nachfolgender Behandlung mit Petrolether rund 2 bis 3 kg des Artemisinin gewonnen werden können. Es entsteht dabei ein ölig-gelber Extrakt der Pflanze, der zu Gel und anschließend zu weißem, kristallinem Pulver raffiniert wird, welches Artemisinin als so genanntes Blutschizontozid enthält.

[0012] Die restliche Biomasse bleibt bei den bisherigen Verwertungskonzepten weitgehend unbeachtet, da sich die Nutzung der Pflanze bisher auf die Verwendung des Artemisinins als Antimalaria-Mittel konzentriert.

[0013] Im Gegensatz zum Artemisinin sind bisher relativ wenige Anwendungen für die übrigen Inhaltstoffe der Spezies Artemisia beschrieben.

3. Potentielle Kombinationspartner für die Herstellung tensidfreier Emulsionen aus Artemisia annua

[0014] Artemisia annua wird hauptsächlich in Kombinationen eingesetzt. So ist in KR20030051517 ein Nahrungsergänzungsmittel beschrieben, das neben Hovenia dulcis Thunberg and Semisulcospira libertine als Hauptbestandteilen einen Zusatz von 8 % Artemisia luayomogi enthält.

[0015] In KR20030005127 wird ein Nahrungsergänzungsmittel beschrieben, das neben Hoving Dulis Thunb und Alnus rubra Hovenia dulcis als Hauptbestandteilen einen Zusatz von 10 % Artemisia capillaris enthält. Artemisia capillaris wird in CN1615927 u.a. als Mittel gegen Bluthochdruck beschrieben, wobei dem Stand der Technik eine Mischung mit verschiedenen chinesischen Pflanzen entspricht. CN 1969679 beschreibt die kombinierte Anwendung von Artemisia capillaris und G. lucidum in Form eines Tees. [0016] In JP2000143437 wird ein Kosmetikum beschrieben, das wenigstens 2 der folgenden Pflanzenextrakte enthält : Veronica undulata Wall, Ottelia alismoides Pers., Artemisia apiacea Hance, Artemisia annua L., Andrographis Paniculata Nees, Dichroa febrifuga Lour., Eclipta prostrata L., Dipsacus asper Wall, Dipsacus japonicus Miq., Boehmeria nivea Gaud., Polygonum aviculare L., Sterculia lychnophera Hance, Carpesium abrotanoides L. und Polyporus mylittae Cook. Eine Kombination aus Zuckeralkoholen wie Xylitol oder Erythritol und Pflanzenextrakten, die u.a. auch Artemisia capillaries enthalten kann, wird in JP2001081008 für die externe Anwendung auf der Haut beschrieben. [0017] Ein Nahrungsergänzungsmittel, das einen Artemisia capillaris Thunb. -Extrakt enthält, wird in KR20050024920 beschrieben. Diese Nahrungsergänzung soll der Hautalterung entgegen wirken.

[0018] Biologisch aktive Verbindungen aus Pilzen der Gattung Ganoderma sind seit langem beschrieben (U. Lindequist: Ganoderma. In: Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis/ Hrsg F. von Bruchhausen , 5. vollständig neubearbeitete Auflage, Springer- Verlag Berlin- Heidelberg New York 1998, Folgeband 2 Drogen A-K (Hrsg W.Blaschek). S. 750-761. Die gesundheitsfördernden Inhaltstoffe der Gattung Ganoderma werden vielfach mit Extrakten aus Artemisia spec. kombiniert. So enthält die in von KR20020078314 beschriebene Kombination u.a. 3% Artemisia capillaris Thunb. Und 2% G. lucidum. Auch im JP2006143711 wird eine Kombination von Extrakten aus Pflanzen und Pilzen beschrieben, die u.a. auch Artemisia argyi Levl. et Vant und G. lucidum enthält. Das in KR20040032288 beschriebene Nahrungsmittel enthält Artemisia capillaris Thunb in Kombination mit Bierhefe und G. lucidum.

[0019] KR20050001730 beschreibt ein Nahrungsergänzungsmittel mit immunaktivierender und Antitumor- Wirkung, das u.a. G. lucidum (FR) Karst und Artemisia Messerschmidtiana Besser enthält.

[0020] Triterpene, isoliert aus Ganoderma concinna, können die Apoptose in HL-60-Zellen einleiten (Gonzalez AG, Leon F, Rivera A, Padron JI, Gonzalez-Plata J, Zuluaga JC et al. New Lanostanoids from the Fungus Ganoderma concinna. J Nat Prod 2002;65:417 '-2I). [0021] Triterpene, erhältlich aus Ganoderma applanatum, sind gegen Hauttumore der Maus wirksam (Chairul, Tokuyama T, Hayashi Y, Nishizawa M, Tokuda H, Chairul SM, Hayashi Y. Applanoxidic acids A, B, C and D, biologically active tetracyclic triterpenes from Ganoderma applanatum. Phytochemistry 1991;30:4105-9; Chairul, Chairul SM, Hayashi Y. Lanostanoid triterpenes from Ganoderma applanatum. Phytochemistry 1994;35: 1305-8). Eine Derivat des Illudin war in klinischen Studien wirksam (Murgo A, Cannon DJ, Blatner G, Cheson BD. Clinical trials of MGI-114. Oncology 1999;13:233-8).

[0022] Bewährt hat sich die Zuführung von Lentinan in Ergänzung zur Chemotherapie bei Patienten mit Magenkrebs, Darmkrebs und anderen Tumoren (Hazama S, Oka M, Yoshino S, Iizuka N, Wadamori K, Yamamoto et al. Clinical effects and immunological analysis of intraabdominal and intrapleural injection of lentinan for malignant ascites and pleural effusion of gastric Carcinoma. Cancer & Chemotherapy 1995;22: 1595-7). [0023] CN1351886 beschreibt ein Mittel aus 20 Komponenten der chinesischen Medizin, das u.a. G. lucidum und Artemisia capillaris enthält und das bei Lebererkrankungen eingesetzt werden soll. Auch das CN1092295 lehrt die Verwendung von G. lucidum und Artemisia capillaris in einer Kombination vieler Kräuterextrakte zur Bekämpfung verschiedener

Erkrankungen.

[0024] JP2048517 beschreibt ein Haarpflegemittel, das u.a. Artemisia apiacea Hance und

G. lucidum enthält.

[0025] Wie dieser Aufzählung zu entnehmen ist, werden bei den beschriebenen Kombinationen aus Extrakten der Gattungen Artemisia und Ganoderma zwar verschiedene Arten von der Gattung Artemisia eingesetzt, während der Einsatz von Ganoderma-Arten bisher auf die Verwendung der Spezies G. lucidum beschränkt ist. Eine Kombination aus Artemisia annua mit Ganoderma pfeifferi ist bisher nicht bekannt, obwohl Extrakte aus G. pfeifferi aus der deutschen Patentanmeldung DE 10 2005 031 363 Al bekannt sind. [0026] Alle im Stand der Technik beschriebenen Anwendungen nutzen Extrakte aus Artemisia annua. Bei Extrakten wird nur ein Teil der Inhaltstoffe genutzt. Das Verhältnis der Inhaltsstoffe zueinander wird durch den Extraktionsprozess verändert und entspricht nicht mehr den physiologischen Verhältnissen.

[0027] Die Nutzung der Triterpene aus Ganoderma-Arten zur Herstellung von Feststoffstabilisierten Emulsionen wurde bisher nicht beschrieben. Auch tensidfreie Dermatikagrundlagen mit Anti-Aging-Effekt auf der Grundlage einer Kombination von Artemisia annua und Ganoderma spec. sind bisher nicht bekannt. Insbesondere werden bisher weder Artemisia annua noch Ganoderma spec. enthaltende Sprühemulsionen auf der Basis von feststoffstabilisierten Emulsionen zum UV-Schutz eingesetzt, obwohl sich vor allem Sonnenschutz- und Körperpflegesprays im Markt etabliert haben und vom Anwender aufgrund ihrer einfachen Handhabung als angenehm empfunden werden.

4. Stand der Technik bei vorgesehenen Anwendungen Anti-Aging und Sonnenschutz

[0028] Als Hautalterung wird der komplexe biologische Prozess der mit dem Alter einhergehenden Veränderung der Haut bezeichnet. Während die intrinsische Alterung, also die genetisch gesteuerte verminderte Reagibilität der Hautzellen nicht beeinflusst werden kann, kann die durch extrinsischen Faktoren (Umweltfaktoren wie UV-Licht, chemische Reagentien, mechanische Belastung, Stress, Hitze und Kälte) bewirkte Zellalterung durch Anti-Aging-Präparate vermindert werden. Insbesondere unter dem Einfluss freier Radikale kommt es zu einer Erschöpfung der Zellprozesse, der Zellteilung, zu einer erhöhten Permeabilität der Zellmembranen und zu einer Minderversorgung der Zellen.

[0029] Als sichtbare Zeichen dieser umweltbedingten Zellalterung bekommt die Haut tiefe Falten und Runzeln, ihre trockene Oberfläche neigt zu Einrissen und Pseudonarben, die Oberhaut wird dünner. Es wird weniger Fett produziert, die Haut verliert an Elastizität und ist nicht mehr so regenerationsfähig. Da vor allem die UVA-Strahlung tief in die Haut eindringt, erzeugt sie in der Lederhaut Singulett-Sauerstoff. Dieser bewirkt die Produktion von Enzymen, die die kollagenen Fasern schädigen und damit die Straffheit der Haut reduzieren. Gleichzeitig quellen elastische Fasern auf, was zu einem Verlust der Dehnbarkeit der Haut führt.

[0030] Das Problem aller Kosmetikpräparate im Zusammenhang mit Anti-Aging ist jedoch, dass bisher vor allem die sichtbaren äußeren Zeichen der Hautalterung beurteilt werden. Dem stand der Technik entsprechende Cremes können diese sichtbaren Zeichen nur mindern, solange die Ursache - die umweltbedingte Zellalterung - nicht beseitigt wird. Bereits vorhandene Falten kann man nicht zum Verschwinden bringen, sondern der Haut im Wesentlichen Feuchtigkeit und Fett zuführen, so dass sie vorübergehend glatter erscheint. [0031] Da der Einfluss auf die umweltbedingte Alterung der Zellen bisher nicht experimentell nachgewiesen werden konnte, wird der Alterungsprozess der Hautzellen durch dem Stand der Technik entsprechende Mittel praktisch nicht beeinflusst.

[0032] Eine wesentliche Ursache für die vorzeitige Hautalterung ist die UV-Strahlung. [0033] Bei herkömmlichen Sonnenschutzmitteln auf der Basis von Titandioxid (TiO ₂ ) wird die Reflektion und Adsorption durch mikrofeine Partikel aus Titandioxid oder Zinkoxid, die das einfallende UV-Licht reflektieren, ausgenutzt, um eine Erythembildung (Sonnenbrand) zu vermeiden. Als anorganische UV-Filter fungieren. In modernen Präparaten werden die Pigmentpartikel auf etwa 200 Nanometer verkleinert.

[0034] Bei Exposition mit ultraviolettem (UV-) Licht absorbieren photokatalytische Substanzen wie Titandioxid (TiO ₂ ;) in hohem Maße UV-Strahlung. Bei der Reaktion von Titandioxid mit UV-Strahlung bilden sich jedoch in Anwesenheit von Wasser und Sauerstoff freie Radikale. Es ist nachgewiesen, dass durch den photokatalytischen Effekt von Titandioxid bei Anwendung von Titandioxid in UV- Schutzmitteln neben einer vorzeitigen Zellalterung auch Schäden der DNA durch freie Radikale auftreten, deren Bildung durch das Schutzmittel nicht verhindert, sondern infolge der photokatalytischen Reaktion sogar verstärkt wird.

[0035] Praktisch kein Sonnenschutzmittel verzichtet deshalb heute auf den Zusatz von Radikalfängern. Dies ist durchaus sinnvoll, da reaktive Sauerstoffspezies an allen Entzündungsvorgängen beteiligt sind und vor allem die ungesättigten Verbindungen (Aminosäuren, Proteine, Lipide) angreifen, aus denen die Zellwände und DNA- Strukturen der Zellkerne aufgebaut sind. Freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies spielen auch bei der Polymorphen Lichtdermatose - vom Laien oft als Sonnenallergie bezeichnet - eine Rolle. In Sonnenschutzprodukten findet man deshalb eine Vielzahl von Substanzen, die freie Radikale neutralisieren sollen: Vitamin E, Vitamin C, Glucosylrutin, Furalglucitol, Ginkgo -Extrakt, Thermalwasser, Silymarin, Superoxiddismutase, Grüner Tee-Extrakt, Bakterienlysate, Bio Melanin, Ferulasäure oder Carboxymethyl-Glucan. Bei einigen Substanzen ist jedoch fraglich, ob sie auch bei topischer Anwendung als Radikalfänger wirken. [0036] Ein potenter Radikalfänger ist das Flavonoid Glucosylrutin, das in Kombination mit Vitamin E als Pre Sun Creme zur Prophylaxe der Polymorphen Lichtdermatose Tage vor dem Aufenthalt in der Sonne aufgetragen wird (Hadschiew 1997). Dem gleichen Prinzip folgt die Empfehlung, die Haut frühzeitig mit einer hochkonzentrierten Vitamin E-Creme (Beispiel Optolind E) abzusättigen (Heinrich 1994).

[0037] Fast jedes Sonnenschutzmittel enthält Vitamin E (Tocopherol). Reine Vitamin E- Cremes erreichen einen Lichtschutzfaktor von etwa 3. Durch die perorale Aufnahme lassen sich in der Epidermis keine ausreichend hohen Tocopherol-Konzentrationen erreichen. Überdies zeigen Studien, dass sich die Vitamin E-Konzentration in der Haut durch Sonneneinstrahlung um bis zu fünfzig Prozent verringern kann (Thiele 1998). Deshalb ist eine lokale Applikation erforderlich. Als Acetat penetriert Vitamin E gut in die Epidermis, wo es durch Esterasen in freies Vitamin E gespalten wird. Auf Grund seiner Struktur kann es gut in die Zellwand eingelagert werden und schützt diese vor dem Angriff der Radikale. [0038] Zur Charakterisierung der Qualität eines Sonnenschutzmittels wird der Schutz vor Sonnenbrand in Zukunft nicht mehr im Vordergrund stehen. Der Lichtschutzfaktor hilft zwar, bei richtiger Anwendung ein Erythem zu vermeiden, er gibt aber keine Anleitung, wie der Verbraucher eine Immunsuppression oder nicht mehr reparierbare Zellkernschäden vermeiden kann. Dazu braucht man neue Messkriterien. [0039] Bei der photokatalytischen Reaktion entstehen u.a. sehr reaktionsfähige freie OH- Radikale, die eine starke antimikrobielle Wirkung haben (A. Heller: Chemistry and Applications of Photocatalytic Oxidation of Thin Organic Films. Acc. Chem. Res., Vol. 28, No. 12 (1995) 503 / D. Bahnemann: Photocatalytic Detoxification of Polluted Waters. The Handbook of Environmental Chemistry, Springer Verlag 1999, Volume 2, Part L, 285 - 351. Es wird unter photokatalytischer Aktivierung durch UV-Licht eine sehr starke Reduktion des Ausgangskeimgehaltes bei E.faecium auf 0,01 %, bei S. aureus auf = 0,001 % und bei E. coli auf 0,00002 % erreicht. Diese starke biozide Wirkung ist bei Anwendungen auf der Haut unerwünscht.

Aufgabe der Erfindung

[0040] Es war daher eine Aufgabe der Erfindung, neue tensidfreie Hautpflegemittel zu entwickeln, die einerseits die genannten Nachteile vermeiden und andererseits neue Anwendungen der Biomasse von Artemisia annua als kosmetische oder pharmazeutische Mittel ermöglichen.

Darstellung der Erfindung

[0041] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst, erfindungsgemäß durch eine pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung, umfassend Extrakte aus Pflanzen der Art Artemisia annua und Extrakte von Pilzen der Gattung Ganoderma, wobei die Extrakte aus Pflanzen der Art Artemisia annua mit polaren Lösungsmitteln gewonnen werden, nachdem in einem vorher erfolgten Extraktionsschritt mit unpolaren Lösungsmitteln Artemisinin (Sesquiterpen-Peroxide) entfernt wurde.

[0042] Die Teilaufgabe, Anwendungen für diejenigen Inhaltstoffe von Artemisia annua zu finden, die keine Peroxid-Gruppierung tragen und daher nicht zur Malaria-Therapie geeignet sind, wird erfindungsgemäß einerseits durch ein zwei- oder dreistufiges Extraktionsverfahren und andererseits durch geeignete Kombinationen gelöst.

[0043] Bei dem erfindungsgemäßen mehrstufigen Extraktionsverfahren wird im ersten Schritt mit unpolaren Lösemitteln extrahiert. Durch Extraktion mit Pentan, Hexan, Petro lether oder anderen unpolaren Lösemitteln erfolgt die Entfernung von Artemisinin und Lipiden, die einer gesonderten Verwendung zugeführt werden können. Das Extraktionsverfahren mit unpolaren Lösemitteln wie Pentan oder Petrolether kann in bekannter Weise sowohl diskontinuierlich als auch mit kontinuierlichen Verfahren wie der Extraktion mittels Soxhlet-Apparat oder Perkolator durchgeführt werden. Das resultierende Pflanzenmaterial wird in geeigneter Weise, beispielsweise durch Vakuumtrocknung, von dem anhaftenden Restlösemittel befreit.

[0044] Im Rahmen dieser Erfindung wurde festgestellt, dass die resultierende Biomasse - auch in Gegenwart von Eisenionen - im Gegensatz zum Ausgangsmaterial keine Zytotoxizität aufweist. Sie ist daher als Komponente in Kosmetika wesentlich besser geeignet als die im Stand der Technik entsprechende direkte Verwendung des Pflanzenmaterials. Die resultierende Biomasse enthält Wirkstoffe mit einer hohen Radikalfängerkapazität, die die Pflanze selbst vor einer Eigenschädigung durch freie Radikale schützen. Zur Nutzung dieser Radikalfängerkapazität wird die resultierende Biomasse erfindungsgemäß einer zweiten Extraktion unterworfen. Diese wiederum kann alkoholisch, wässrig-alkoho lisch oder wässrig sein, wobei überraschender Weise in jedem Extrakt Wirkstoffe mit Radikalfängereigenschaften gefunden werden.

[0045] Bei der erfindungsgemäßen dreistufigen Extraktion werden zunächst wie beim zweistufigen Verfahren mit unpolaren Lösemitteln wie Pentan, Hexan oder Petrolether Artemisinin und Lipide aus dem Pflanzenmaterial entfernt.

[0046] Das extrahierte Pflanzenmaterial wird beispielsweise durch Vakuumtrocknung, von dem anhaftenden Restlösemittel befreit und einer zweiten Extraktion mit niederen Alkoholen wie Methanol oder Ethanol unterworfen, woraus ein alkoholischer Extrakt resultiert. [0047] In einer dritten Extraktionsstufe können nun nach Entfernung von restlichem Alkohol, z. B. im Vakuum oder auch ohne Entfernung des noch anhaftenden Alkohols, weitere Wirkstoffe durch wässrige Extraktion gewonnen werden.

[0048] Als Extraktionsverfahren für die alkoholische Extraktion bieten sich sowohl diskontinuierliche als auch kontinuierliche Verfahren wie die Extraktion mittels Soxhlet- Apparat oder Perkolator an. Die wässrig-alkoho lische oder wässrige Extraktion wird zweckmäßiger Weise beispielsweise in Form einer Mazeration diskontinuierlich ausgeführt.

[0049] In besonders vorteilhafter Weise wurde die Aufgabe, die Anwendbarkeit der Biomasse von Artemisia annua als gesundheitsfördernde Mittel zu verbessern, gelöst, indem entweder getrocknete und zerkleinerte Pflanzen der Spezies Artemisia annua oder aber die Rückstände der oben beschriebenen Extraktion der Pflanzen mit Pentan, Hexan, Petrolether oder anderen unpolaren Lösemitteln einerseits mit getrocknetem und zerkleinertem Mycel und/oder Fruchtkörper von Pilzen einer oder mehrerer Spezies der Gattung Ganoderma andererseits gemischt werden und das Gemisch einer alkoholischen, wässrig-alkoholischen oder wässrigen Extraktion unterzogen wird.

[0050] Es ist ebenfalls erfinderisch, die mehrstufige Extraktion der getrockneten und zerkleinerten Pflanzen der Spezies Artemisia annua und von Pilzen der Gattung Ganoderma separat durchzuführen und die so gewonnenen verschiedenen Extrakte in einem geeigneten Verhältnis zu mischen.

[0051] Der hohe Triperpengehalt der ausgewählten Spezies der Gattung Ganoderma bildet die Voraussetzung für die Herstellung tensidfreier Emulsionssysteme als Grundlagen für innovative Dermatika und Kosmetika. Triterpene sind biologisch aktive sekundäre Pflanzenstoffe, die antimikrobielle, insbesondere antivirale und antiimmflammatorische Eigenschaften besitzen. Überraschend ist der Gehalt einiger Triterpene in G. pfeifferi teilweise gegenüber G. lucidum bis zum lOOfachen erhöht. Der Gehalt an dem Triterpen Lucialdehyd B in G. lucidum beträgt beispielsweise 0,14mg/100g, in G. pfeifferi dagegen 19,2 mg/100g.

[0052] Zur Herstellung tensidfreier Emulsionssysteme suspensiert man die erfindungsgemäß erhaltenen Pflanzen- und Pilzextrakte -gegebenenfalls unter Zugabe weiterer Triterpene insbesondere von Triterpensäuren wie Ursolsäuren, Betulinsäure und/oder Boswelliasäuren - in natürlichen Wachsen, vorzugsweise in Jojobaöl. Durch Homogenisieren erhält man daraus eine feststoffstabilisierte Emulsion mit Anti-Aging-Effekt, die es erlaubt, verschiedene kosmetische Produkte ohne weitere Emulgatoren, vor allem ohne synthetische Tenside, herzustellen. Erfindungsgemäß tragen als Feststoffe eingearbeitete Mikropigmente, vorzugsweise Metalloxide und/oder andere in Wasser schwerlösliche oder unlösliche Metallverbindungen, sowie eventuell auch die UV-Filter - neben ihrer eigentlichen Zweckbestimmung - auch zur Stabilisierung der Rezeptur bei. Die Mikropigmente binden an die Ölphase des Systems und verbessern dadurch gleichzeitig die Verteilbarkeit der Formulierung auf der Haut. Durch den stabilisierenden Effekt der Mikropigmente kann auf andere oberflächenaktive Hilfsstoffe weitgehend verzichtet werden. Hierdurch wird die Gefahr von Hautunverträglichkeiten insgesamt verringert. In tensidfreien Sonnenschutzemulsionen entfallen mögliche Wechselwirkungen der Tenside mit der Haut. Als relativ kleine grenzflächenaktive Moleküle neigen Tenside insbesondere zu Interaktionen mit den interzellulären Lipiden des Stratum corneum und können so die epidermale Barrierefunktion schwächen. Außerdem können sie aufgrund ihrer penetrationsfördernden Eigenschaften Rezepturbestandteile mit irritativem oder allergenem Potential verstärkt in die Haut schleusen. Seit langem ist bekannt, dass durch das Zusammenwirken von UVA- Strahlung und bestimmten Inhaltsstoffen in Kosmetika, vor allem Lipiden und Tensiden, die so genannte Mallorca- Akne ausgelöst werden kann. Bei Verwendung der erfmdungsgemäßen Zubereitungen, die frei von synthetischen Tensiden sind und gleichzeitig einen hohen UVA- Schutz aufweisen, ist diese typische Hautreaktion nicht zu erwarten. Das in den erfindungsgemäßen Zubereitungen enthaltene Jojobaöl verstärkt den zellschützenden Effekt und vermindert das Risiko von Nebenwirkungen.

[0053] Ein weiterer Vorteil tensidfreier Emulsionssysteme ist, dass sie sich sehr gut als Grundlagen für Sprayprodukte eignen. Tensidhaltige Sprühemulsionen fühlen sich auf der Haut klebrig an. Im Gegensatz dazu schützen die erfmdungsgemäßen feststoffstabilisierte Emulsionen die Haut ohne einen schmierigen Film auf der Haut zu hinterlassen. Insbesondere für die Verwendung als Sonnenschutzmittel ist es vorteilhaft, die erfmdungsgemäßen Sprühemulsionen durch die Zugabe von Copolymeren des Polyvinylpyrrolidons zusätzlich zu stabilisieren. Polymere auf Basis von Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder andere polymere Filmbildner, wie beispielsweise Natriumpolystryrensulfonat, bilden nach dem Verdunsten des Lösemittels einen Film aus, der wesentlichen zur Schutzfunktion beiträgt.

[0054] Die erfmdungsgemäßen Sonnenschutzmittel wirken durch die Kombination von UV- Filtern, Radikalfängern und entzündungshemmenden Substanzen prophylaktisch bei der Vermeidung einer UV-bedingten vorzeitigen Hautalterung und darüber hinaus entzündungshemmend.

[0055] In höheren Konzentrationen zeigen die Extrakte von Artemisia annua eine hohe Radikalfänger-Kapazität, die aber bei höheren Verdünnungen deutlich abnimmt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass bereits geringe Zusätze von Extrakten beispielsweise aus G. pfeifferi eine starke Erhöhung der Radikalfänger-Kapazität bewirken. So wies der wässrige Extrakt aus der Kombination Artemisia annua : Ganoderma pfeifferi = 99 :1 bereits in einer Verdünnung von 1 zu 100 im DPPH-Test eine Radikalfängeraktivität von 89 % auf. Ohne den Zusatz von G. pfeifferi ist die Radikalfängeraktivität von Artemisia annua in dieser Verdünnung nicht ausreichend (Radikalfängeraktivität des wässrigen bzw. des alkoholischen Extraktes im DPPH-Test zwischen 34 bzw. 38 %). Die Kombination mit G. pfeifferi reduziert also zusätzlich den oxidativen Stress und verstärkt die endogene Radikalabwehr und unterstützt damit den Anti-Aging Effekt. Die nur bei G. pfeifferi nachgewiesenen Inhaltsstoffe Ganomycin A und B hemmen bei einer Konzentration von 10 μg/ml die durch Luminol induzierte und die spontane Sauerstoffradikalfreisetzung. [0056] Durch die Kombination wird die Proliferation von humanen Keratinocyten gesteigert. Unter dem Einfluss der Kombination steigt der Glucoseverbrauch von humanen Zellen, was auf eine Anregung des Stoffwechsels hinweist. Es wurde gefunden, dass die Bildung von Proteinen gefördert und die Zellalterung verlangsamt wird.

[0057] Die unter UV-Einfluss erhöhte Zellpermeabilität - messbar durch Bestimmung der LDH-Aktivität im Medium - wird vermindert. Die Regenerationsfähigkeit der Zellen nach einer UV-Schädigung wird deutlich erhöht.

[0058] Bei der photokatalytischen Reaktion entstehen u.a. sehr reaktionsfähige freie OH- Radikale, die eine starke antimikrobielle Wirkung haben. Dementsprechend wird die physiologische Hautflora stark geschädigt. Durch die erfindungsgemäße Kombination wird dieser Effekt stark vermindert.

[0059] In der Kombination von Artemisia annua und Ganoderma spec. sind sowohl bei der gemeinsamen Extraktion der Biomassen als auch bei der Kombination der Extrakte praktisch alle Mischungsverhältnisse möglich. Es können dabei vorteilhaft auch Mischungen verschiedener Ganoderma- Arten eingesetzt werden. In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden dabei Extrakte aus verschiedenen Ganoderma-Arten gemischt. Insbesondere ist es vorteilhaft, den wässrigen Extrakt von G. lucidum mit dem ethanolischen Extrakt von G. pfeifferi zu mischen. Der wässrige Extrakt von G. lucidum enthält Wirkstoffe, die die Apoptose von Tumorzellen einleiten, die Phagozytose durch Makrophagen aktivieren und die Immunantwort stimulieren, der alkoholische Extrakt von G. pfeifferi enthält Wirkstoffe, die den Stoffwechsel von gesunden Zellen stimulieren. Der stimulierende Effekt auf gesunde Zellen ist nur bei lipophilen Extrakten aus G.pfeifferi nachweisbar. Der Glucan- Gehalt des wässrigen Extraktes, der zur Stimulierung des Immunsystems führt, ist bei G.pfeifferi jedoch wesentlich geringer als bei G. lucidum oder G. tsugae. Die Kombination des ethanolischen Extraktes aus G. pfeifferi und des wässrigen Extraktes aus G. lucidum oder G. tsugae führt zur erwünschten Wirkung.

[0060] Ein wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Zubereitungen ist, dass der Zellschutz durch Triterpene aus Ganoderma-Arten vervollständigt wird. Insbesondere Triterpene aus Ganoderma concinna können frühzeitig die Apoptose von Zellen einleiten, bei denen trotz der Radikalfängerwirkung zur Entartung gekommen ist. Tetrazyklische Triterpene und Lanostanoid-Triterpene aus Ganoderma applanatum unterstützen den Körper bei der Tumorabwehr, so dass deren Zumischung besondere Vorteile bringt.

[0061] Aus dem Fruchtkörper und dem Mycel der Gattung Ganoderma stammende Wirkstoffe ergänzen nicht nur die Wirkung der Inhaltstoffe von Artemisia annua als Radikalfänger, sondern bewirken zusätzlich eine Hemmung der Aktivität von neutralen Endopeptidasen und/oder eine Hemmung der Aktivität des Angiotensin-Konverting-Enzyms. [0062] Die erfindungsgemäßen kosmetischen und pharmazeutischen Zubereitungen können weitere Pflanzenextrakte enthalten. Geeignet sind vor allem die Extrakte spezieller Pflanzen wie Grünem Tee, Hamamelis, Kamille, Ringelblume, Paeonie, Aloe Vera, Rosskastanie, Salbei, Weidenrinde, Weißdorn, Lindenblüten, Mandeln, Fichtennadeln, Sandelholz, Kokosnuss, Kiwi, Guave, Limette, Mango, Aprikose, Weizen, Melone, Orange, Grapefruit, Avocado, Rosmarin, Malve, Wiesenschaumkraut, Thymian, Melisse, Eibisch, Malve, Ginseng, Birke, wobei Extrakte aus dem teilungsfähigen Bildungsgewebe bevorzugt werden. Weiterhin kann es bevorzugt sein, in den erfindungsgemäßen Mitteln Mischungen aus mehreren verschiedenen Pflanzenextrakten einzusetzen.

[0063] Die erfindungsgemäßen kosmetischen und pharmazeutischen Zubereitungen können auch mit Algenextrakte kombiniert werden. Geeignete Algenextrakte stammen aus Grünalgen, Braunalgen, Rotalgen oder Blaualgen (Cyanobakterien).

[0064] Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen Zubereitungen, die die Naturstoffe verschiedener Pflanzen und Pilze nutzen, deren Wirkstoffe durch die erfindungsgemäßen feststoffstabilisierten Emulsionen besser nutzen und rascher zur Penetration bringen als durch Formulierungen mit großen Öltropfen.

[0065] Sprays auf der Basis der erfindungsgemäßen tensidfreien Emulsionen können sowohl zum Schutz vor UV-Strahlung als auch als after-sun-Produkte eingesetzt werden. [0066] Zubereitungen zum Schutz vor UV-Strahlung im Sinne der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise mindestens eine UV-A-, UV-B- und/oder Breitbandfütersubstanz. Die Formulierungen können, obgleich nicht notwendig, gegebenenfalls auch ein oder mehrere organische und/oder anorganische Pigmente als UV-Filtersubstanzen enthalten, welche in der Wasser- und/oder der Ölphase vorliegen können. Die Pigmente können vorteilhaft im Sinne der vorliegenden Erfindung auch in Form kommerziell erhältlicher öliger oder wässriger Vordispersionen zur Anwendung kommen. Die Pigmente können vorteilhaft oberflächlich behandelt (gecoatet") sein, wobei beispielsweise ein hydrophiler, amphiphiler oder hydrophober Charakter gebildet werden bzw. erhalten bleibt. Diese Oberflächenbehandlung kann darin bestehen, dass die Pigmente nach an sich bekannten Verfahren mit einer dünnen hydrophilen und/oder hydrophoben anorganischen und/oder organischen Schicht versehen werden. Die verschiedenen Oberflächenbeschichtungen tragen erfindungsgemäß zur Stabilisierung der Emulsion bei.

[0067] Anorganische Oberflächenbeschichtungen im Sinne der vorliegenden Erfindung können bestehen aus Aluminiumoxid (AI2O3), Aluminiumhydroxid Al(OH) ₃ , bzw. Aluminiumoxidhydrat (auch: Alumina, CAS-Nr.: 1333-84-2), Natriumhexametaphosphat (NaPOs) ₆ , Natriummetaphosphat (NaPO ₃ )„, Siliciumdioxid (SiO ₂ ) (auch: Silica, CAS-Nr.: 7631-86-9), oder Eisenoxid (Fe ₂ O ₃ ). Diese anorganischen Oberflächenbeschichtungen können allein, in Kombination und/oder in Kombination mit organischen Beschichtungsmaterialien vorkommen.

[0068] Organische Oberflächenbeschichtungen im Sinne der vorliegenden Erfindung können bestehen aus pflanzlichem oder tierischem Aluminiumstearat, pflanzlicher oder tierischer Stearinsäure, Laurinsäure, Dimethylpolysiloxan (auch: Dimethicone), Methylpolysiloxan (Methicone), Simethicone (einem Gemisch aus Dimethylpolysiloxan mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 200 bis 350 Dimethylsiloxan-Einheiten und Silicagel) oder Alginsäure. Diese organischen Oberflächenbeschichtungen können allein, in Kombination und/oder in Kombination mit anorganischen Beschichtungsmaterialien vorkommen.

[0069] Die Liste der genannten UV-Filter, die im Sinne der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, soll selbstverständlich nicht limitierend sein. [0070] Vorteilhaft enthalten die erfindungsgemäßen Zubereitungen die Substanzen, die UV- Strahlung im UV-A- und/oder UV-B-Bereich absorbieren, in einer Gesamtmenge von z. B. 0,1 Gew.% bis 30 Gew.%, vorzugsweise 0,5 bis 20 Gew.%, insbesondere 1,0 bis 15,0 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitungen, um kosmetische Zubereitungen zur Verfügung zu stellen, die die Haut vor dem gesamten Bereich der ultravioletten Strahlung schützen.

[0071] After-sun-Produkte und Anti-Aging-Produkte auf Basis der erfindungsgemäßen tensidfreien Emulsionen können weitere Wirkstoffe enthalten. Um die Schutzwirkung zu erhöhen, werden vorzugsweise Vitamine und Antioxidantien gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuren (z.B. Glycin, Histidin, Tyrosin, Tryptophan) und deren Derivate, Imidazole, (z.B. Urocaninsäure) und deren Derivate, Peptide wie D,L-Carnosin, D-Carnosin, L-Carnosin und deren Derivate (z.B. Anserin), Carotinoide, Carotine und deren Derivate, Chlorogensäure und deren Derivate, Liponsäure und deren Derivate, Aurothioglucose, Propylthiouracil und andere Thiole (z.B. Thioredoxin, Glutathion, Cystein, Cystin, Cystamin und deren Glycosyl-, N-Acetyl-, Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Amyl-, Butyl- und Lauryl-, Palmitoyl-, Oleyl-, &ggr;-Linoleyl, Cholesteryl- und Glycerylester) sowie deren Salze, Diaurylthiodipropionat, Distearylthiodipropionat, Thiodipropiosäure und deren Derivate (Ester, Ether, Peptide, Lipide, Nukleotide, Nukleoside und Salze) sowie Sulfoximinverbindungen (z.B. Buthioninsulfoximine, Homocysteinsulfoximin, Buthioninsulfone, Penta-, Hexa-, Heptathioninsulfoximin) in sehr geringen verträglichen Dosierungen (z.B. pmol bis &mgr;mol/kg), ferner (Metall-) Chelatoren, Hydroxysäuren (z.B. Citronensäure, Milchsäure, Äpfelsäure), Huminsäure, Gallensäure, Gallenextrakte, Bilirubin, Biliverdin, EDTA, EGTA und deren Derivate, ungesättigte Fettsäuren und deren Derivate, Vitamin C und Derivate (z.B. Ascorbylpalmitat, Magnesium-Ascorbylphosphat, Ascorbylacetat), Tocopherole und Derivate (z.B. Vitamin-E-acetat), Vitamin A und Derivate (z.B. Vitamin-A-palmitat) sowie Koniferylbenzoat des Benzoeharzes, Rutinsäure und deren Derivate, , Ferulasäure und deren Derivate, Furfurylidenglucitol, Carnosin, Butylhydroxytoluol, Butylhydroxyanisol, Nordohydroguajaretsäure,

Trihydroxybutyrophenon, Quercitin, Harnsäure und deren Derivate, Mannose und deren Derivate, Selen und dessen Derivate (z.B. Selenmethionin), Stilbene und deren Derivate (z.B. Stilbenoxid, trans-Stilbenoxid). Mischungen von Antioxidantien sind ebenfalls zur Verwendung in den erfindungsgemäßen kosmetischen Zubereitungen geeignet. In besonderer Weise bevorzugt sind Phenolsäuren und Flavonoide.

[0072] Weiterhin können die erfmdungsgemäßen Zubereitungen zur Unterstützung des Anti- Aging-Effektes Proteinhydrolysate oder deren Derivat enthalten. Erfmdungsgemäß können sowohl pflanzliche als auch tierische Proteinhydrolysate eingesetzt werden. Tierische Proteinhydrolysate sind z. B. Elastin-, Collagen-, Keratin-, Seiden- und Milcheiweiß- Proteinhydrolysate, die auch in Form von Salzen vorliegen können. Erfindungsgemäß bevorzugt sind pflanzliche Proteinhydrolysate, z. B. Soja-, Weizen-, Mandel-, Erbsen-, Kartoffel- und Reisproteinhydrolysate. Wenngleich der Einsatz der zusätzlichen Proteinhydrolysate als solche bevorzugt ist, können an ihrer Stelle gegebenenfalls auch anderweitig erhaltene Aminosäuregemische oder einzelne Aminosäuren wie beispielsweise Arginin, Lysin, Histidin oder Pyrroglutaminsäure eingesetzt werden. Ebenfalls möglich ist der Einsatz von Derivaten der Proteinhydrolysate, z. B. in Form ihrer Fettsäure- Kondensationsprodukte. In den erfindungsgemäßen kosmetischen und pharmazeutischen Zubereitungen sind die zusätzlichen Proteinhydrolysate und deren Derivate in Mengen von 0, 01-10 Gew.-% bezogen auf das gesamte Mittel enthalten. Mengen von 0, 1 bis 5 Gew. %, insbesondere 0, 1 bis 3 Gew.-%, sind besonders bevorzugt.

[0073] Erfindungsgemäß enthalten Anti-Aging-Zubereitungen zur Pflege der Haut anfeuchtende bzw. feuchthaltende Mittel (sogenannte Moisturizer). Den tensidfreien Emulsionen werden daher vorteilhaft Substanzen, gewählt aus der Gruppe Glycerin, Milchsäure und/oder Lactate, insbesondere Natriumlactat, Butylenglykol, Propylenglykol, Biosaccaride Gum-1, Glycine Soja, Ethy lhexy Io xy glycerin, Pyrrolidoncarbonsäure und Harnstoff, zugesetzt. Ferner ist es insbesondere von Vorteil, polymere Moisturizer aus der Gruppe der wasserlöslichen und/oder in Wasser quellbaren und/oder mit Hilfe von Wasser gelierbaren Polysaccharide zu verwenden. Dabei können die erfmdungsgemäßen Zubereitungen Mono-, Oligo- oder Polysaccharide oder deren Derivate enthalten. [0074] Geeignete Monosaccharide sind z. B. Glucose, Fructose, Galactose, Arabinose, Ribose, Xylose, Lyxose, Allose, Altrose, Mannose, Gulose, Idose und Talose, die Desoxyzucker Fucose und Rhamnose sowie Aminozucker wie z. B. Glucosamin oder Galactosamin. Bevorzugt sind Glucose, Fructose, Galactose, Arabinose und Fucose; Glucose ist besonders bevorzugt.

[0075] Geeignete Oligosaccharide sind aus zwei bis zehn Monosaccharid-Einheiten zusammengesetzt, z. B. Saccharose, Lactose oder Trehalose. Ein besonders bevorzugtes Oligosaccharid ist Saccharose. Ebenfalls besonders bevorzugt ist die Verwendung von Honig, der überwiegend Glucose und Saccharose enthält.

[0076] Geeignete Polysaccharide sind aus mehr als zehn Monosaccharid-Einheiten zusammengesetzt. Bevorzugte Polysaccharide sind die aus a-D-Glucose-Einheiten aufgebauten Stärken sowie Stärkeabbauprodukte wie Amylose, Amylopektin und Dextrine. Erfindungsgemäß besonders vorteilhaft sind chemisch und/oder thermisch modifizierte Stärken, z. B. Hydroxypropylstärkephosphat, Dihydroxypropyidistärkephosphat oder die Weiterhin bevorzugt sind Dextrane sowie ihre Derivate, z. B. Dextransulfat. Ebenfalls bevorzugt sind nichtionische Cellulose-Derivate, wie Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose oder Hydroxyethylcellulose, sowie kationische Cellulose-Derivate. Weitere bevorzugte Beispiele sind Polysaccharide aus Fucose-Einheiten. Besonders bevorzugt sind die aus Aminozuckereinheiten aufgebauten Polysaccharide, insbesondere Chitine und ihre deacetylierten Derivate, die Chitosane, und Mucopolysaccharide. Zu den erfindungsgemäß bevorzugten Mucopolysacchariden gehören Hyaluronsäure und ihre Derivate, z. B. Natriumhyaluronat oder Dimethylsilanolhyaluronat, sowie Chondroitin und seine Derivate, z. B. Chondroitinsulfat.

[0077] Die in tensidfreien Systemen eingesetzten polymeren Wirkstoffe dringen aufgrund ihrer Molekülgröße nicht in die Haut ein, sondern verbleiben als Film auf der Hautoberfläche. [0078] Es ist dem Fachmann natürlich bekannt, dass kosmetische Zubereitungen zumeist nicht ohne weitere üblichen Hilfs- und Zusatzstoffe denkbar sind. Die kosmetischen und dermatologischen Zubereitungen können dementsprechend beispielsweise Konsistenzgeber, Füllstoffe, Parfüme, Substanzen zum Verhindern des Schäumens, Farbstoffe, Pigmente, die färbende Wirkung haben, Verdickungsmittel, Insektenrepellentien, Wasser, Salze, proteolytisch oder keratolytisch wirksame Substanzen, Medikamente oder andere übliche Bestandteile einer kosmetischen oder dermatologischen Formulierung enthalten. [0079] Damit können mit den tensidfreien Emulsionen innovative Produkte für die Kosmetik und als Gesundheitspflegemittel mit einer neuen Qualität zur Verfügung gestellt werden. [0080] Durch die erfindungsgemäße Abtrennung der peroxidhaltigen Verbindungen vor der Anwendung als Kosmetikum werden die pflegenden Eigenschaften verbessert. Nicht unwesentlich ist darüber hinaus, dass die Produktion von speziellen Ganoderma-Arten, die bisher noch nicht in größeren Maßstab kommerziell genutzt werden, auf Grund des langsamen Pilzwachstums sehr aufwendig ist. Der Kombinationspartner aus Artemisia annua fällt dagegen bei der Produktion des Wirkstoffes gegen Malaria als Nebenprodukt an. Mit der erfindungsgemäßen Kombination aus speziellen Ganoderma-Arten und Artemisia annua- Reststoffen wird daher eine kostengünstige Möglichkeit zur Produktion eines Anti-Aging- Wirkstoffes mit den Zellstoffwechsel stimulierenden Eigenschaften zur Verfügung gestellt.

[0081] Ein großer Vorteil von tensidfreien Sprühemulsionen ist, dass sie nach der Herstellung autoklaviert werden können. Dies ermöglicht eine keimfreie Anwendung auf der Haut, ohne dass ein Konservierungsmittel eingesetzt werden muss. Auch eine Kontamination beim Gebrauch ist durch die Sprayform weitgehend ausgeschlossen.

[0082] Soll bei anderen Anwendungen der erfmdungsgemäßen Zubereitungen nicht auf Konservierungsmittel verzichtet werden, sind antimikrobielle Wirkstoffe ausgewählt aus der Gruppen der Parabene, wie beispielsweise Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben, Isopropylparaben, Butylparaben, Isobutylparaben, Natrium-Methylparaben, Natrium- Ethylparaben, Natrium-Propylparaben Natriumisobutylparaben, Natriumisopropylparaben oder Natrium-Butylparaben, Imidazolidinyl Harnstoff, Diazolidinyl Harnstoff, lodopropynyl Butylcarbamat, 2-Bromo-2-Nitropropan-l ,3-diol, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Cetyltrimethylammoniumchlorid, Cetylpyridiniumchlorid, Benzethoniumchlorid,

Diisobutylethoxyethyl-dimethylbenzylammoniumchlorid, Diisobutyl-phenoxy- ethoxy-ethyl- dimethylbenzyl-ammoniumchlorid, N-Alkyl-N,N-dimethyl-benzyl- ammoniumchlorid, - bromid, -saccharinat, Trimethylammoniumchlorid, Natriumaluminiumchlorohydroxylactat, Triethylcitrat, Tricetylmethylammoniumchloπd, l^^'-Trichloro-l'-hydroxydiphenylether (Triclosan), 3,4,4'-Trichlorocarbanilid (Triclocarban), Diaminoalkylamid, beispielsweise L- Lysinhexadecylamid geeignet.

[0083] Aus den erfindungsgemäßen Zubereitungen können bei bestimmten Anwendungen Terpene und/oder antimikrobielle Wirkstoffe freisetzt werden. Das ist insbesondere für folgende spezielle Anwendung von Bedeutung.

[0084] Die humanpathogenen Spezies der Gattung Candida besiedeln bei vielen gesunden Menschen Haut und Schleimhäute, ohne Symptome hervorzurufen. Bei starker Vermehrung der Pilzzellen, z.B. nach Schädigung der bakteriellen Schleimhautflora durch Antibiotika oder bei herabgesetzter Immunabwehr verursachen sie aber häufig lokale Entzündungen, die auch als Soor bezeichnet werden. Da immer häufiger empfindliche Textilien, wie z. B. Seide oder Mikrofaser, die nur bei 30 oder 40 ⁰ C gewaschen werden können, zu Kleidungsstücken verarbeitet werden, werden Pilze wie Candida albicans nicht abgetötet. Insbesondere nach einer Pilzinfektion kann es so durch auf den Kleidungsstücken haftenden, nicht abgetöteten Pilzen zu einer Reinfektion kommen. Zur Verhinderung der Infektion durch Pilze und/oder zur Verhinderung der Anhaftung von Pilzen an Oberflächen werden bisher antimikrobielle Substanzen eingesetzt, die entweder das Wachstum der Pilze hemmen (Fungistatika), diese abtöten (Fungizide) und/oder die Adhäsion der Pilze vermindern. Häufig werden dazu nichtselektive antimikrobielle Substanzen eingesetzt, die sowohl gegen Bakterien als auch gegen Pilze wirken. Außerdem werden häufig Verbindungen verwendet, die aufgrund der Konzentration, in der sie eingesetzt werden müssen, toxische Eigenschaften besitzen, zu Hautirritationen führen können oder andere unerwünschte Eigenschaften besitzen. [0085] Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die erfindungsgemäßen Emulsionen in geeigneten Formulierungen Terpene und/oder antifungale Wirkstoffe freisetzen, dazu in der Lage sind, die Anhaftung von Mikroorganismen auf Oberflächen sehr effektiv zu vermindern, wobei es sich bei den Oberflächen sowohl um natürliche Oberflächen als auch um künstliche Oberflächen und hierbei sowohl um biotische als auch um abiotische Oberflächen handeln kann. Für diese besondere Ausführungsform werden die freizusetzenden Terpene ausgewählt aus Terpenalkoholen, also solchen Terpenen, bevorzugterweise Mono-, Sesqui- und/oder Diterpenen, die eine freie Hydroxylgruppe tragen. Besonders bevorzugt sind dabei Citronellole, Geraniol, Farnesol und Patchoulialkohol. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können bei dieser speziellen Anwendung den Emulsionen Duftstoffalkohole, ausgewählt aus Eugenol, Zimtalkohol und Anethol, insbesondere Eugenol, zugesetzt werden.

[0086] Als antifungieller Wirkstoff fungiert 2,5-Dihydroxybenzoesäure, die in G. pfeifferi, nicht aber in anderen Ganoderma Arten gefunden wurden. Die antiadhäsiven Stoffe sind hierbei vorzugsweise in Mengen bis zu 3 Gew.-%, besonders bevorzugt in Mengen von 0,1 bis 1 Gew.-% in den Zubereitungen enthalten. Für bestimmte Anwendungen ist die Kombination der antimikrobiellen peroxidhaltigen Wirkstoffe aus Artemisia annua mit den aus der Biomasse von G. pfeifferi stammenden antimikrobiellen Wirkstoffen insbesondere mit den Ganomycinen, mit 2,4,5-Trihydroxybenzaldehyd und/oder 2,5-Dihydroxybenzoesäure von besonderem Vorteil.

[0087] Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Emulsionen ist, dass diese bei Einhaltung dieser Konzentrationen eine nur sehr geringe Toxizität besitzen, insbesondere im Vergleich zu den herkömmlicherweise verwendeten Antimycotika, Fungiziden und Fungistatika.

[0088] Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden, ohne auf diese beschränkt zu sein:

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1 Gewinnung von Biomasse der Spezies Ganoderma pfeifferi

Methodik: [0089] Frisch geerntete junge Fruchtkörper der Spezies G. pfeifferi wurden gereinigt und unter sterilen Bedingungen aufgebrochen. Aus dem Bereich des Übergangs vom Hut zum Stiel wurden mit einer sterilen Pinzette Gewebestücke entnommen und bei Zimmertemperatur auf Hagem-Agar kultiviert. Nachdem der Pilz sichtbares Wachstum zeigte, wurden einige Mycelstücke ausgestanzt und mit einem Hagem-Flüssigmedium im Bühler-Homogenisator (Edmund Bühler, Tübingen, G) zerkleinert. Anschließend erfolge die weitere Kultur in 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Hagem-Flüssigmedium nach H. Kreisel und F. Schauer (Methoden des myko logischen Laboratoriums, Fischer- Verlag Jena 1987). Jeweils 100 ml Kulturmedium wurden mit 10 ml der wie oben beschreiben hergestellten Impfsuspension versetzt. Die Kultivierung erfolgte bei Raumtemperatur und konstanten Lichtverhältnissen für 30 Tage, wobei eine kontinuierliche Durchmischung mittels einer Schüttelmaschine (Innova 2100, New Brunswick Scientific Co, INC. EDISON, New Jersey, USA) mit einer Geschwindigkeit von 125 U/min erreicht wurde. Die weitere Maßstabsvergrößerung erfolgte durch Überführung in einen Bioreaktor von 10 1 Volumen. Der Fermenter wurde mit 6 1 autoklaviertem HAGEM-Medium (flüssig) versetzt. Dieses wurde mit 60 ml Impfsuspension versetzt. Die Kultivierung im Fermenter erfolgte bei Raumtemperatur unter ständiger Begasung mit steriler Luft, kontinuierlichem Rühren und im Tag-Nacht-Rhythmus. [0090] Das Mycel wurde durch Filtration vom Medium getrennt und lyophilisiert.

Ergebnis:

[0091] Die Kultivierung von G. pfeifferi ist mit Flüssig-Medium möglich. Die Ausbeute beträgt durchschnittlich 5 g Mycel/1. Das lyophilisierte oder an der Luft getrocknete Mycel steht für die Mischung mit der Biomasse von Artemisia annua zur Verfügung.

Beispiel 2 Gewinnung von Extrakten der Spezies Ganoderma pfeifferi Methodik:

[0092] Ganoderma- pfeifferi- Fruchtkörper wurden durch Wildsammlung im Schlosspark Ludwigsburg erhalten. Außerdem wurden kultivierte Fruchtkörper, die durch die Firma GAMU GmbH, Krefeld gewonnen wurden, verwendet.

[0093] Die gesammelten Fruchtkörper von Ganoderma pfeifferi wurden gereinigt, klein geschnitten, an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend im Hochvakuum gefriergetrocknet. Die geschnittenen und getrockneten Stücke wurden dann in einer Analysenmühle pulverisiert und anschließend in lichtundurchlässigen Gefäßen bei Raumtemperatur aufbewahrt. Mittels dreier verschiedener Extraktionsverfahren wurden ethanolische Extrakte gewonnen. Angewandt wurden eine Heiß- bzw. Kaltextraktion und eine Extraktion mit dem Extraktor.

Heißextraktion

[0094] Der pulverisierte Fruchtkörper wurden in einer Papierhülse mit Ethanol 80 % (V/V) versetzt und anschließend nach dem Soxhletverfahren für ca. 24 h extrahiert. Die Einwaage betrug für G. pfeifferi 12,5 g. Die gewonnenen Flüssigextrakte wurden eingeengt und gefriergetrocknet.

Kaltextraktion

[0095] Zur Kaltextraktion wurden jeweils 25 g Drogenmaterial mit 250 ml Ethanol 80 % (V/V) versetzt und 24 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurden die Pilze über einen Filter abgepresst, der resultierende trübe Extrakt zentrifugiert und durch einen Rundfilter filtriert. Die Filtrate wurden eingeengt und gefriergetrocknet. Die Lagerung der gewonnenen Extrakte erfolgte im Kühlschrank.

Extraktion mittels Extraktor

[0096] Die Extraktion erfolgte mittels Extraktor ASE 200. Es wurden jeweils 2 g Drogenmaterial mit 15 g Seesand in eine Papierhülse eingewogen. Extrahiert wurde bei einem Druck von 2000 psi (pounds per Square inch) mit einer Standzeit (Verweildauer des Lösungsmittels in der Extraktionszelle bei jedem Extraktionsschritt) von 2 min. Als Extraktionsmittel wurde EtOH 80% (V/V) bei einer Extraktionstemperatur von 60 ⁰ C verwendet.

Ergebnis:

[0097] Die Ausbeuten der gefriergetrockneten Extrakte wurden in Tabelle zusammengefasst.

Tab. 1 : Extraktausbeuten von G. pfeifferi u

Im Folgenden wurden folgende Bezeichnungen verwendet: GPS gesammelter G. pfeifferi Heißextrakt

GPK gesammelter G. pfeifferi Kaltextrakt

GPKK kultivierter G. pfeifferi Kaltextrakt

GPE gesammelter G. pfeifferi Extraktorextrakt

Beispiel 3 Gewinnung von Gesamtextrakten aus Artemisia annua (einschließlich Artemisinin)

Beispiel 3a: Alkoholische Extraktion (diskontinuierlich)

[0098] 3 g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 30 ml Methanol versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wird das Pflanzenmaterial abgepresst und über einen Faltenfüter filtriert. Es resultieren 20 ml methanolischer Extrakt aus Artemisia annua.

Beispiel 3b: Alkoholische Extraktion (kontinuierlich, Soxhlet-Extraktion)

[0099] 10 g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden in einem Soxhlet - Apparat kontinuierlich mit 150 ml Methanol 1 Stunde lang extrahiert. Es resultieren 130 ml methanolischer Extrakt aus Artemisia annua.

Beispiel 3c: Wässrig-alkoholische Extraktion (diskontinuierlich)

[0100] 3 g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 40 ml 40 %igem wässrigen Ethanol versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wird das Pflanzenmaterial abgepresst und über einen Faltenfilter filtriert. Es resultieren 32 ml wässrig-ethano lischer Extrakt aus Artemisia annua.

Beispiel 3d: Wässrige Extraktion (diskontinuierlich)

[0101] 3 g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 30 ml dest. Wasser versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wird das Pflanzenmaterial abgepresst und die trübe Lösung zentrifugiert. Es resultieren 20 ml wässriger Extrakt aus Artemisia annua.

Beispiel 4 Gewinnung von Extrakten aus Artemisia annua (artemisininfrei) Beispiel 4a: Abtrennung der peroxidhaltigen Verbindungen durch Extraktion von Artemisia annua mit Petrolether (diskontinuierlich)

[0102] 3 g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 30 ml Petrolether versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird abgepresst und filtriert, Es resultieren 20 ml Petroletherextrakt. Das Pflanzenmaterial wird 30 Minuten im Vakuum von den anhaftenden Lösemittelresten befreit.

Beispiel 4b: Abtrennung der peroxidhaltigen Verbindungen durch Extraktion von Artemisia annua mit Petrolether (kontinuierlich)

[0103] 10 g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden in einem Soxhlet - Apparat kontinuierlich mit 150 ml Petrolether 1 Stunde lang extrahiert. Es resultieren 140 ml Extrakt aus Artemisia annua. Das verbliebene Pflanzenmaterial wird im Vakuum von den anhaftenden Lösemittelresten befreit.

Beispiel 4c: Gewinnung von peroxidfreier Extrakte durch Erxtraktion mit Methanol (kontinuierlich)

[0104] Ca. 3 g Pflanzenmaterial aus der vorhergehenden Extraktion nach Beispiel 4 a werden in einem Soxhlet - Apparat kontinuierlich mit 100 ml Methanol 1 Stunde lang extrahiert. Es resultieren 90 ml peroxidfreier methanolischer Extrakt.

Beispiel 4d: Gewinnung peroxidfreier Extrakte durch Extraktion mit Ethanol (diskontinuierlich)

[0105] Ca. 10 g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua aus der vorhergehenden Extraktion nach Beispiel 4 b werden mit 100 ml Ethanol versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird abgepresst und filtriert. Es resultieren 80 ml peroxidfreier Ethanolextrakt.

Beispiel 4e: Wässrig-alkoholische Extraktion (diskontinuierlich)

[0106] 10 g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 80 ml 40 %igem wässrigen Ethanol versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wird das Pflanzenmaterial abgepresst und über einen Faltenfilter filtriert. Es resultieren 70 ml wässrig-ethano lischer Extrakt aus Artemisia annua. Beispiel 4f: Wässrige Extraktion (diskontinuierlich)

[0107] 3 g getrocknetes Pflanzenmaterial Artemisia annua werden mit 30 ml dest. Wasser versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wird das Pflanzenmaterial abgepresst und die trübe Lösung zentrifugiert. Es resultieren 20 ml wässriger Extrakt aus Artemisia annua.

Beispiel 5 Gewinnung der erfindungsgemäßen Anti-Aging-Mittel durch gemeinsame Extraktion von Ganoderma pfeifferi und Artemisia annua. (kontinuierlich)

[0108] 1 g des pulverisierten Fruchtkörpers von G. pfeifferi wurden mit 10 g getrocknetem und durch Extraktion von Artemisinin befreitem Pflanzenmaterial von Artemisia annua in einer Papierhülse mit Methanol versetzt und anschließend nach dem Soxhletverfahren für ca. 2 h extrahiert. Die gewonnenen Flüssigextrakte wurden eingeengt und gefriergetrocknet. Zur Verwendung in kosmetischen Zubereitungen können sie direkt verwendet oder in einem Lösemittel, aufgenommen werden.

Beispiel 6 Gewinnung der erfindungsgemäßen Anti-Aging-Mittel durch gemeinsame Extraktion von Ganoderma pfeifferi und Artemisia annua. ( diskontinuierlich)

[0109] 1 g des pulverisierten Fruchtkörpers von G. pfeifferi wurden mit 10 g getrocknetem und durch Extraktion von Artemisinin befreitem Pflanzenmaterial von Artemisia annua vermischt, mit 80 ml 40 %igem wässrigen Ethanol versetzt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde das Pflanzenmaterial abgepresst und über einen Faltenfilter filtriert. Es resultierten 70 ml wässrig-ethano lischer Extrakt aus Ganoderma pfeifferi und Artemisia annua.

Beispiel 7 Gewinnung der erfindungsgemäßen Anti-Aging-Mittel durch Vermischung von Extrakten von Ganoderma pfeifferi und Artemisia annua.

Heißextraktion

[0110] 0,5 g gefriergetrockneter Extrakt aus G. pfeifferi wurden in 100 ml wässrig- ethanolischem Extrakt aus Artemisia annua (Ethanolgehalt 40 %) aufgenommen, wobei eine klare Lösung entstand. Der resultierende Gesamtextrakt ist direkt in kosmetischen

Zubereitungen einsetzbar. Beispiel 8 Diphenylpikrylhydrazyl (DPPH)-Test

[Olli] Die Bestimmung der antioxidativen Eigenschaften erfolgte dünnschicht- chromatografϊsch (SIEVERS A et al. (2002) Simple thin-layer Chromatographie test for antioxidative Compounds using DPPH assay. CBS Camag Bibliography Service 88: 14-15) und photometrisch (MOLYNEUX P (2004) The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sei Technol 26 (2): 211-219).

Ergebnisse:

[0112] In höheren Konzentrationen (Verdünnungen 1 : 20 oder 1 : 10) zeigen die Extrakte aus Artemisia annua eine hohe Radikalfänger-Kapazität (> 80 %). In der 1 : 100- Verdünnung ist die Radikalfängerkapazität jedoch unzureichend. Durch Zusatz von 1 % G. pfeifferi wird die Radikalfängerkapazität erhöht (Tab. 2).

Tabelle 2:

Beispiel 9: Nachweis der Radikalfängereigenschaft mittels Chemilumineszenz

[0113] Der Nachweis wurde wie folgt geführt:

[0114] A: 30 ml humanes Blut wurden mit 170 ml PBS + Luminol (0,33 mM final) 20 min bei 37°C vorinkubiert.

[0115] B: 30 μl humanes Blut wurden mit 170 ml PBS + Luminol (0,33 mM final) und 20 ml

Substanzverdünnung 20 min bei 37°C vorinkubiert.

[0116] Zu A wurden 20 μl ein Extrakt, der G. pfeifferi in einer Verdünnung 1 : 100 enthielt, und 20 μl Zymosan (10 mg/ml) pipettiert.

[0117] Zu B wurden 20 μl Zymosan (10 mg/ml) pipettiert. [0118] Als Kontrolle verwendeten wir PBS statt Zymosan als Stimulator mit und ohne Substanz in den Ansätzen A und B. Nach intensivem Mischen wurde die Kinetik der Lumineszenz über 60 min gemessen. Die Untersuchungen erfolgten an zwei unterschiedlichen Tagen mit Blut von zwei verschiedenen Blutspendern.

Ergebnis:

[0119] Die Extrakte hemmen eindeutig die durch Luminol induzierte und die spontane

Sauerstoffradikalfreisetzung oder fangen die freigesetzten Radikale ab.

Beispiel 10 Nachweis interzellulärer Proteine Methodik

[0120] Die folgende Methode diente zur Quantifizierung der interzellulären Proteine. Der

Nachweis der Proteine mit Roti - Nanoquant beruht auf einer Modifikation der

Proteinbestimmung nach Bradford.

[0121] Die Roti - Nanoquant - Arbeitslösung wurde durch Verdünnen der Stammlösung im

Verhältnis 1 :5 mit Aqua bidest. hergestellt. Für diesen Versuch wurde eine Kulturflasche

(25 cm ² ) verwendet, die zu mind. 80 % konfluent war. Das Medium wurde aus der Flasche abgegossen und der Zellrasen einmal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 50 μl MMC

1 mg / ml in 5 ml Medium auf die Zellen gegeben. Die so behandelte Flasche wurde im

Brutschrank bei 37 ⁰ C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO ₂ für 2 Stunden inkubiert. Nach

Ablauf der Inkubationszeit wurde das Gemisch MMC / Medium abgegossen und der

Zellrasen zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen vom Flaschenboden abgelöst, die Zellzahl ermittelt und mit Nährmedium auf 200.000 Zellen / ml eingestellt. Es wurden 100 μl / well in eine 96 - well - Platte gegeben. Die Platte wurde 24 h im Brutschrank inkubiert.

[0122] Nach 24 Stunden wurden verschiedene Extrakte in die Zellkulturplatte pipettiert.

Verwendet wurden die gewonnenen Extrakte von G. pfeifferi und Kombinationen mit

Artemisia annua.

[0123] Dazu wurde eine Gebrauchslösung des entsprechenden Extraktes hergestellt. Der

Trockenextrakt wurde genau eingewogen und in 200 μl Ethanol dest. gelöst. Aus dem Ansatz wurde eine Stammlösung von 1 mg / ml in Aqua bidest. hergestellt. Die Gebrauchslösungen wurden durch Verdünnen der Stammlösung mit Nährmedium hergestellt.

[0124] Das alte Medium wurde entfernt und anschließend 200 μl / well der verschiedenen

Gebrauchslösungen auf die Platte gegeben. Als Negativkontrolle wurden einige wells mit 200 μl DMEM (extraktfrei) gefüllt. Die so behandelte Platte wurde 24 h im Brutschrank inkubiert.

Im nächsten Arbeitschritt folgte nun die Zerstörung der Zellwände um die interzellulären Proteine in Lösung zu bringen und sie anschließend quantifizieren zu können. [0125] Hierzu wurde zunächst die Gebrauchslösungen von der Platte entfernt und anschließend 5-mal mit je 200 μl / well PBS gewaschen. Nach Zugabe von 100 μl einer 0,1 % Tritonlösung in Trispuffer (pH 7,2) pro well wurde die Platte für 30 min geschüttelt und anschließend eingefroren. Nach dem Auftauen wurde der Inhalt der Vertiefungen mit Hilfe einer Pipette gut durchgemischt und anschließend bei 4000 rpm 4 Minuten zentrifugiert. Von der so behandelten Platte wurden je 10 μl in das entsprechende well einer neuen Platte überführt, die letzte Reihe wurde für die Kalibrationskurve freigelassen. Hierfür wurde Albumin, Fraktion V verwendet. Es wurde eine Stammlösung mit der Konzentration 1 mg/ml in 0,1 % Tritonlösung in Trispuffer (pH 7,2) hergestellt. Von dieser ausgehend wurden dann die entsprechenden Verdünnungen (0 - 500 μg/ml) hergestellt und je 10 μl in die entsprechenden wells pipettiert. Anschließend wurden 40 μl PBS und 200 μl Roti-Nanoquant- Arbeitslösung pro well hinzu pipettiert. Nach 5 min Inkubationszeit wurde die Optische Dichte (OD) bei 2 Wellenlängen (405 nm und 620 nm) bestimmt. Zur Auswertung wurde der Quotient aus 620 nm und 405 nm gebildet.

Ergebnisse

[0126] Der Proteingehalt steigt unter dem Einfluss von G. pfeifferi (GPS) und von G.pfeifferi enthaltenden Kombinationen auf 110 und 125 %. Bereits bei einem sehr geringen Anteil von G. pfeifferi (5 μg/ml) ist ein Anstieg der interzellulären Proteine gegenüber der Negativkontrolle zu verzeichnen. Eine Erhöhung der G. pfeifferi Anteils im Gemisch führt zu keiner Verbesserung der Wirkung.

Beispiel 11: Zubereitung mit Aloe vera

Methodik

Zellen: FL, Herkunft: USA, ATCC, CCL 62, Katalognummer RIE 81, Lieferant: biometec

GmbH

Medium: DMEM ohne Phenolrot mit lOOOmg/1 Glucose und 110 mg/1 Na-Pyruvat (Gibco), modifiziert mit 20OmM L-Glutamin, IM Hepes, 5U Penicillin/5mg Streptomycin/ml (Sigma) und 10 % FKS (Biochrom KG, Berlin) Ausschaltung der Zellteilung: Zuerst wurde aus 2mg Mitomycin C (Sigma) gelöst in 0,1ml DMSO und 1,9 ml PBS eine Mitomycin C-Stammlösung hergestellt und in 50μl- Aliquoten eingefroren. Zur Mitosehemmung wurde das Zellkulturmedium vom konfluent gewachsenen Zellrasen der FL-Zellkultur abgegossen, durch 5ml Kulturmedium mit 50μl Mitomyxin- Stammlösung ersetzt und 2 Std./37°C inkubiert. Danach wurde 3 x mit PBS (ohne Ca ⁺⁺ ' Mg ⁺⁺ , PAA) gewaschen, die Zellen mit Trypsin/EDTA (Sigma) abgelöst, die Zellzahl bestimmt und auf eine Konzentration von 4 x 10 ⁵ /ml mit Zellkulturmedium eingestellt.

Kultivierung auf den Zellträgern: Je ImI Zellsuspension wurde auf die Zellträger (13mm runde, Thermanox-Plättchen (Nunc Ine, Naperville, IL USA) in einem Minusheet- Zellhaltersystem (Minucells & Minutissue Vertriebs GmbH, Bad Abbach) in einer Mikrokulturwanne eine 24-well-Zellkulturplatte (Nunc GmbH & CoKg, Wiesbaden) pipettiert, 24 Stunden kultiviert (37 ⁰ C, 5%CO ₂ , 97% Luftfeuchte) und dann jeweils 6 Zellträger in eine Perfusionszellkammer aufrecht eingestellt.

Perfusionszellkultur:

Zellkammern: Minucells & Minutissue, Typ 1301, Temperierung auf etwa 37 ⁰ C (Heizplatte: MEDAX, Typ 12501)

Fliessrate: 4,5 μl/min (Pumpe: Ismatec IPC-N 8)

Gas: Low-Gas Typ 110741 -S (5 % Kohlenstoffdioxid, 20 % Sauerstoff, Rest Stickstoff), Air

Liquide

Bestimmung der Glucosekonzentration nach Beckmann (Messintervalle: 12 h +/- Ih), des pH und des Sauerstoffpartialdrucks (Meßintervall 24 h +/- Ih)

Ermittlung der minimal wirksamen Dosis

11.1. Begrenzung der Anwendungsdauer

Die Zugabe von G. pfeifferi zum Medium als 2 % Suspension wurde im Gegensatz zu Beispiel 3 auf 12 h (von H 148 bis auf h 160) begrenzt.

Ergebnis:

Bereits nach dieser kurzen Einwirkungszeit lässt sich ein fördernder Effekt erkennen, der mindestens 3 Tage nachweisbar ist (Fig. 1). Fig 1 zeigt eine Verlängerung der Einwirkungszeit der 2 % Suspension auf 72 h steigert den Effekt (Fig. 2), die fördernde Wirkung ist über einen längeren Zeitraum nachweisbar.

11.2. Begrenzung der täglichen Zuführung

Zur Ermittlung der minimalen wirksamen Konzentration wurde die tägliche Zufuhr auf 0,5 ml der 2 %igen Suspension begrenzt, die innerhalb von 111 min gegeben wurden, d.h. danach erhielten die Zellen über 1329 min ein Medium ohne Wirkstoffzusatz. Die tägliche Zuführung des Wirkstoffs wurde mit dieser Versuchsanordnung auf 0,012 % des Zellkulturmediums reduziert.

Auch bei dieser geringen Konzentration ist ein fördernder Effekt erkennbar (Fig 3). Bei Verdopplung der Konzentration (Zuführung 2 mal täglich für 111 min) ist der Effekt stärker ausgeprägt (Fig. 4).