La presente invención se refiere a un nuevo proceso para la síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA) y a los PHA obtenidos mediante dicho proceso. Además, la presente invención se refiere al uso de dichos PHA. Por tanto, la presente invención pertenece al campo de la Biotecnología Medioambiental, al de la Microbiología y al de los Biopolímeros. ESTADO DE LA TÉCNICA

Los polihidroxialcanoatos (PHA), conocidos comúnmente como "bioplásticos", son polímeros biodegradables producidos por ciertas bacterias, que se acumulan en el interior celular en forma de gránulos de reserva de fuente de carbono cuando las condiciones de cultivo no son óptimas para el crecimiento (Madison y Huisman, 1999. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63: 21 -53). Estos biopolímeros son biodegradables y las bacterias los sintetizan a partir de fuentes renovables como por ejemplo la glucosa, la fructosa o los ácidos grasos que forman parte de los aceites vegetales. Por tanto, se puede definir el término bioplástico como biopolímero sintetizado a partir de fuentes renovables, que puede ser biodegradado en condiciones controladas y que presenta características físico-químicas similares a las de los plásticos derivados de la industria petroleoquímica (Sarasa et al., 2009. Bioresour. Technol. 100: 3764- 3768).

En general, los gránulos de PHA están compuestos por un poliéster (93-97% del peso seco del gránulo (PSG)) rodeado por fosfolípidos (1-6% del PSG) y proteínas asociadas al gránulo (GAP, del inglés "Granule associated proteins") (1 -2% del PSG), las cuales forman una fina capa en la superficie del gránulo. Hasta el momento se han definido tres clases de GAP en bacterias: i) las PHA sintasas, involucradas en la polimerización del PHA, ii) las PHA despolimerasas, responsables de la degradación del bioplástico y iii) las fasinas, las GAPs más abundantes, con una función estructural o reguladora (Prieto et al. 1999a. Appl. Environ. Microbiol., 65: 3265-3271 ; Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol., 70: 3205-3212). Los PHA se clasifican en dos tipos principales de acuerdo a su estructura química: los PHA de cadena corta (scl-PHA, del inglés "short chain length PHA") obtenidos a partir de monómeros con 4 ó 5 átomos de carbono y los de cadena media (mcl-PHAs del inglés "médium chain length PHA") procedentes de monómeros con entre 6 y 14 átomos de carbono. Los diferentes PHA identificados hasta la fecha son polímeros lineales compuestos de 3- hidroxiácidos grasos exclusivamente de la configuración R (RHA). El peso molecular de estos polímeros varía entre 50.000-1 .000.000 y su diversidad radica en las sustituciones en el carbono asimétrico en posición 3, que le confiere al polímero el carácter quiral (Prieto et al., 1999 J. Bacterio!. 181 : 858- 868).

Es conocido que la composición del polímero depende de la fuente de carbono presente en el medio de cultivo utilizado durante la fermentación de la bacteria productora (Durner, et al., 2001 . Biotechnol. Bioeng., 72: 278-288, Jung et al., 2001 . Biotechnol. Bioeng., 72: 19-24). Por otra parte, es importante resaltar que las características físico-químicas de los polímeros varían según la naturaleza química de los monómeros que los componen (Kessler et al., 2001 . J. Biotechnol., 86: 97-104). Teniendo en cuenta que se han descrito más de 140 RHA diferentes como componentes de los PHA producidos por bacterias (Steinbüchel et al., 1995. Can. J. Microbio/., 41 : 94-105), y que el biopolímero después de su obtención por fermentación puede ser sometido a posteriores modificaciones químicas, tales como el entrecruzamiento y a la adición de grupos funcionales (Lageveen et al., 1988. Appl. Environ. Microbio/., 54: 2924- 2932.), es fácil imaginar la gran diversidad de bioplásticos y RHA diferentes que pueden generarse mediante la combinación de todos estos procesos. Dado que los PHA son biopoliésteres bacterianos no tóxicos, biodegradables y biocompatibles producidos por una amplia gama de bacterias, incluyendo Pseudomonas (P.), estos compuestos tienen mucho potencial en aplicaciones biomédicas y farmacéuticas, debido a su posible uso como biomateriales y a su aplicación en sistemas de liberación controlada de fármacos y en la ingeniería de tejidos. Los PHA también han atraído considerable atención debido a su potencial uso como fuentes de monómeros quirales o sintones, que son de gran utilidad como precursores en la industria farmacéutica, ya que son difíciles de conseguir en estado puro mediante los procesos químicos convencionales. Las propiedades físico-químicas de los PHA abarcan desde rígido y cristalino a lo flexible, amorfo y elastomérico, en función de su composición monómerica y de la longitud de la cadena lateral del polímero.

Se han descrito muchos PHA con grupos funcionales en sus cadenas laterales, tales como bromo, cloro, flúor, un grupo alquilo ramificado, un grupo ciano, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi, un grupo acetoxi, un grupo epoxi, un grupo ciclohexilo, un grupo feniltio y un grupo propiltio (Kim et al., 2007. The Journal of Microbiology. 45, 2, 87-97). Estos dos últimos son los únicos ejemplos de PHA que contienen azufre en la cadena lateral. Los PHA con un grupo tiofenoxi en la cadena lateral se obtuvieron de P. putida 27N01 empleando ácido 1 1 - tiofenoxi-undecanoico como única fuente de carbono (Takagi et al., 1999. Macromolecules 32, 8315-18). Los PHA con un grupo propiltio en su cadena lateral se componen de monómeros de ácido hydroxipropiltioalcanoico. También se han sintetizado PHA que contienen tioéteres en la cadena lateral mediante una cepa recombinante de Ralstonia eutropha muíante para la producción de polihidroxibutirato y para expresar la enzima PHA sintasa de P. mendocina, empleando como sustrato ácido propiltiooctanoico o ácido propiltiohexanoico (Ewering et al., 2002. Microbiology 148, 1397-1406). Esta cepa sintetiza a partir de ácido propiltiooctanoico el terpoliéster compuesto por ácido 3-hydroxipropiltiobutírico, ácido 3-hidroxipropiltiohexanoico y ácido 3- hidroxipropiltiooctanoico, y a partir del ácido propilthiohexanoico, sintetiza el poliéster de 3-hydroxipropiltiobutírico y ácido 3-hidroxipropiltiohexanoico. Todos estos PHA contienen grupos tioéter en las cadenas laterales, pero no se conocen PHA que contengan tioésteres en la cadena lateral.

La síntesis de nuevos PHA sigue siendo de gran interés ya que los nuevos biopolímeros, así como los monómeros que los componen, con nuevas propiedades físico-químicas, tienen potencialmente una enorme utilidad para la industria.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un proceso de síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA), a los PHA obtenidos mediante este proceso y al uso de dichos PHA. Los PHA de la presente invención, denominados PHACOS, tienen una composición monomérica nueva, ya que contienen monómeros con grupos tioéster en la cadena lateral que les confieren nuevas propiedades físico-químicas, como por ejemplo (i) una elevada constante de transición vitrea respecto a los PHA convencionales, (ii) una carencia de punto de fusión, ya que son completamente amorfos, y (iii) que permiten su posterior modificación química. El grupo tioéster en la cadena lateral de los PHACOS supone la ventaja de que facilita su modificación química, lo cual implica que el PHA modificado tendrá unas nuevas propiedades, que proporcionan nuevas aplicaciones y/o mejoras en las mismas. Por ejemplo, el grupo tioéster de la cadena lateral permite la unión de los PHACOS a péptidos u otras moléculas. Los monómeros de los PHACOS son ácidos (RJ-3-hidroxi-aciltioalcanoicos, como el ácido (RJ-3-hidroxi-6-acetiltiohexanoico o el (RJ-3-hidroxi-4- acetiltiobutanoico. Estos monómeros pueden ser fácilmente modificados químicamente, por lo que son muy valiosos para su uso en la industria farmacéutica como sintones. La presente invención describe también un método de obtención de estos (RJ-3-hidroxi-aciltioalcanoicos enantiopuros, a partir de los PHACOS. Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA) que implica cultivar una célula capaz de producir PHA en un sustrato, donde dicho sustrato comprende al menos un compuesto alifático funcionalizado con un grupo tioéster.

La célula puede ser, pero sin limitarse, una célula vegetal, una levadura o una bacteria. La célula vegetal o la levadura pueden estar modificadas genéticamente, es decir, pueden ser células recombinantes.

Preferiblemente, la célula es una bacteria. Una bacteria es un organismo cuya especie pertenece al Reino Bacteria. Preferiblemente, la bacteria pertenece al género Pseudomonas. Una bacteria del género Pseudomonas pertenece a la familia Pseudomonadaceae, al Orden Pseudomonales, a la Clase Gammaproteobacteria, al Filo Proteobacteria y al Reino Bacteria.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la bacteria del género Pseudomonas se selecciona de la lista que comprende: P. putida KT2442, P. putida U, P. oleovorans GPo1 , P. putida KT42FadB y P. putida U AFadBA. Preferiblemente, la bacteria es P. putida KT42FadB. La cepa P. putida KT42FadB ha sido obtenida por los autores de la presente invención a partir de la cepa P. putida KT2442 como está descrito en el ejemplo 1 y en la figura 1 de esta memoria. Además, la cepa P. putida KT42FadB se encuentra depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 7772.

El término "sustrato", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere al compuesto o a los compuestos que la célula va a emplear como reactivo o reactivos en el proceso de síntesis de los PHA.

Un "compuesto alifático" es una molécula orgánica compuesta por carbono e hidrógeno, donde los enlaces C-C pueden ser simples, dobles o triples. Preferiblemente, es una molécula orgánica lineal y/o ramificada de C5-C14. Un "compuesto alifático funcionalizado" es aquel en el que al menos un hidrógeno es sustituido por un grupo funcional. Un "grupo funcional" es un grupo de átomos específico dentro de una molécula que es responsable de la reacción o reacciones químicas que caracterizan a dicha molécula. Algunos ejemplos de grupos funcionales son un grupo éster, un grupo fenol, un grupo hidroxilo o un grupo amino. Se han descrito numerosos sustratos de carbono que contienen grupos funcionalizados y sirven como reactivos en la síntesis de PHA bacterianos, aunque ninguno con un grupo tioéster. Además, los monómeros que componen un PHA están determinados por los sustratos empleados en su síntesis, y hasta la fecha se han descrito más de 140 hidroxialcanoatos (Kim et al., 2007. The Journal of Microbiology. 45; 2: 87-97). Los monómeros de PHA descritos hasta la fecha tienen estructuras muy variadas: lineales, ramificados, saturados, insaturados y aromáticos. La presencia de grupos funcionalizados tiene un interés especial ya que implica una variedad de propiedades físico- químicas, por ejemplo, mecánicas, importante, aparte de que algunos de estos grupos permiten modificaciones químicas. Además, dado que el uso directo de estos poliésteres es difícil debido, principalmente, a su carácter hidrofóbico, la presencia de grupos hidrofílicos en los PHA permite la obtención de polímeros anfifílicos capaces de formar micelas. Los copolímeros en bloque anfifílicos son potenciales espesantes, emulsionantes, dispersantes o espumantes.

Un tioéster es un compuesto con un grupo funcional tioéster, que se representa de la siguiente manera:

Donde: R y R' son independientemente dos grupos orgánicos iguales o diferentes. Un tioéster se forma por la esterificación entre un ácido carboxílico y un tiol. En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el compuesto alifático funcionalizado es un ácido aciltioalcanoico. Preferiblemente, el ácido aciltioalcanoico se selecciona de la lista que comprende los siguientes ácidos: 6-acetiltiohexanoico, 5-acetiltiopentanoico, 2,5-bis(acetilsulfanil)pentanoico, 4- acetiltiolbutanoico, 3-acetilsulfanilbutanoico, 1 1 -acetiltioundecanoico, 16- acetilhiolhexadecanoico, 5-acetiltiooctanoico, 5-propanoyiltiooctanoico, 5- butanoiltiooctanoico, 12-acetiltiododecanoico, 6-acetilsulfanil-8- metilsulfaniloctanoico, 8-acetilsulfanil-6-sulfaniloctanoico, 5-(2- metilpropanoilsulfanil)octanoico, 6,8-bis(acetilsulfanil)octanoico. Preferiblemente, el compuesto alifático funcionalizado es el ácido 6- acetiltiohexanoico (6-ATH).

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el sustrato además comprende un compuesto alifático que no necesariamente tiene que estar funcionalizado con un grupo tioéster, sino que puede tener o no otro tipo de grupos funcionales. Este compuesto alifático es capaz de inducir la síntesis de PHA, por lo que mejora la eficiencia del cultivo y la capacidad de las células de crecer y sintetizar PHA. Preferiblemente, el compuesto no está funcionalizado con un grupo tioéster y es un ácido graso de entre 4 y 28 carbonos que puede estar funcionalizado con un grupo distinto del tioéster. El ácido graso puede ser de cadena sencilla y puede también presentar enlaces dobles o triples. El ácido graso además puede ser cualquiera de los sustratos del grupo A descritos en Kim et al., 2007. The Journal of Microbiology. 45, 2, 87-97. Preferiblemente, el ácido graso se selecciona de la lista que comprende el ácido decanoico, el ácido nonanoico, y el ácido octanoico. Más preferiblemente, este compuesto alifático es el ácido decanoico.

El término "inductor", tal y como se emplea en la presente memoria, hace referencia a la capacidad de un sustrato para mejorar la síntesis de PHA.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el sustrato comprende ácido decanoico y ácido 6-acetiltiohexanoico. Estos compuestos pueden estar presentes en distintas proporciones. En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el sustrato comprende una relación molar del compuesto alifático y compuesto alifático funcionalizado con un grupo tioéster de entre 1 :9 a 9:1 . Preferiblemente, la relación es de entre 1 ,1 :8,9 y 2:8. Más preferiblemente, es de entre 1 ,5:8,5 y 1 ,8:8,2. En una realización más preferida del primer aspecto de la invención, el sustrato consiste en ácido decanoico 2,4 mM y ácido 6-acetiltiohexanoico 12 mM.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el cultivo comprende una o dos fases de fermentación. Preferiblemente, comprende dos fases de fermentación. Preferiblemente, la segunda fase de fermentación tiene una duración de entre 5 y 30 horas. Más preferiblemente, la duración es de entre 7 y 26 horas. Aún más preferiblemente, la duración es de entre 8 y 25 horas. En la realización más preferida, la duración de la segunda fase es de 24 horas.

Una "fase de fermentación" se refiere a que el cultivo se realiza manteniendo durante toda la fermentación las mismas condiciones de cultivo, con un mismo medio y a la misma temperatura. Cuando se cultivan las células en dos fases de fermentación, se emplean unas condiciones de cultivo diferentes en la primera fase de fermentación y en la segunda fase de fermentación. Además, se entiende que en los cultivos que se realizan en dos fases de fermentación, una parte del cultivo o todo el cultivo que se produce en la primera fase de fermentación se utiliza como inoculo para el cultivo en la segunda fase de fermentación.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a los PHA obtenidos mediante el procedimiento del primer aspecto de la invención. Estos PHA en adelante los denominamos PHACOS.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas putida con número de acceso CECT 7772. La cepa P. putida KT42FadB ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) el 21 de julio de 2010 y tiene el número de acceso CECT 7772. La dirección de dicha Autoridad Internacional de depósito es: Universidad de Valencia / Edificio de investigación / Campus de Burjassot/ 46100 Burjassot (Valencia).

Las características de dicha cepa son:

- crece en medio rico LB (de "Luria Bertani" o "Lysogen Broth", medio número 48 de la lista de medios de la CECT, cuya composición es 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levaduray 10 g/l de NaCI en agua, a pH 7,0) suplementado con kanamicina 50 μg/ml.

- crece en agitación orbital a 300 rpm y a 30° C durante 14 horas.

- se conserva a -80° C con glicerol al 15 %.

- se trata de un muíante por inserción disrupcional con el plásmido pk18mob del gen fadB (PP_2136). Dicho plásmido posee un gen de resistencia a la kanamicina.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de los PHACOS para la producción de materiales bioplásticos, tejidos, biomateriales, sistemas de liberación de fármacos, pegamentos o pinturas.

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de los PHACOS para la obtención de ácidos (RJ-3-hidroxi-aciltioalcanoicos enantiopuros. Preferiblemente, los ácidos (RJ-hidroxi-aciltiocanoicos enantiopuros se seleccionan de la lista que comprende: 3-hidroxi-6-acetiltiohexanoico, 3-hidroxi- 4-acetiltiobutanoico, y los derivados hidroxilados de los ácidos 6- acetiltiohexanoico, 5-acetiltiopentanoico, 2,5-bis(acetilsulfanil)pentanoico, 4- acetiltiolbutanoico, 3-acetilsulfanilbutanoico, 11 -acetiltioundecanoico, 16- acetilhiolhexadecanoico, 5-acetiltiooctanoico, 5-propanoyiltiooctanoico, 5- butanoiltiooctanoico, 12-acetiltiododecanoico, 6-acetilsulfanil-8- metilsulfaniloctanoico, 8-acetilsulfanil-6-sulfaniloctanoico, 5-(2- metilpropanoilsulfanil)octanoico, 6,8-bis(acetilsulfanil)octanoico. El término "enantiopuro" tal y como se emplea en la presente memoria, se refiere a que los compuestos, en este caso los ácidos (RJ-3-hidroxi- aciltioalcanoicos, se presentan únicamente en una forma enantiomérica específica.

Los derivados hidroxilados de los ácidos (RJ-3-hidroxi-aciltioalcanoicos son aquellos ácidos que llevan al menos un grupo hidroxilo.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de ácidos (RJ-3-hidroxi-aciltioalcanoicos enantiopuros que comprende la hidrólisis de los PHACOS. La hidrólisis de los PHACOS puede llevarse a cabo con cualquiera de los métodos conocidos en el estado de la técnica. Preferiblemente, la hidrólisis es química. Preferiblemente, la hidrólisis es enzimática. Más preferiblemente, la hidrólisis la lleva a cabo una enzima depolimerasa. Preferiblemente, la enzima depolimerasa es PhaZ. La depolimerasa PhaZ es capaz de hidrolizar gránulos de PHA que contienen monómeros tanto alifáticos como aromáticos (de Eugenio et al., 2007. The Journal of Biological Chemistry. 282; 7: 4951 -62). Un séptimo aspecto de la invención se refiere a los ácidos (RJ-3-hidroxi- aciltioalcanoicos enantiopuros obtenidos mediante el procedimiento del quinto aspecto de la invención. Estos compuestos son de gran utilidad en la industria farmacéutica y/o química para su uso como sintones. Una realización de la invención es un procedimiento para la síntesis de PHA donde se cultiva P. putida KT42FadB en un medio de cultivo con ácido decanoico 2,4 mM como inductor y ácido 6-acetiltiohexanoico 12 mM como compuesto funcionalizado, en dos fases de fermentación, teniendo al segunda fase una duración de 24 horas.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Esquema de la construcción de la cepa P. putida KT42FadB empleando el plásmido pK18mob. El plásmido tiene el promotor del gen lacZ (Plac), un sitio de multiclonación (MCS), el gen alfa-/acZ y un gen de resistencia a kanamicina (km ^R ). Entre las dianas de la enzima de restricción Smal se inserta parte del gen fadB. La enzima de restricción Sphl permite conocer la orientación del inserto. La recombinación homologa permite la inserción del plásmido dentro del gen fadB de P. putida KT2442 para generar así al cepa KT42FadB.

Fig. 2. Crecimiento de P. putida KT2442 y P. putida KT42FadB en placas de agar con medio mínimo M63 0,1 N con octanoato sódico 15mM. La cepa original sí crece pero la cepa muíante no es capaz de hacerlo en este medio. Fig. 3. Curvas de crecimiento de las cepas de P. putida KT2442 y KT42FadB en presencia de ácido decanoico 12mM en una estrategia de fermentación en dos fases.

Fig. 4. Contenido en PHA y composición monomérica de cultivos de P. putida KT2442 (KT) y KT42FadB (FadB) creciendo en presencia de ácido decanoico 12mM en una estrategia de fermentación en dos fases en medio líquido, a distintos tiempos (5, 10, 15, 20, 25, 30 y 90 horas). OH-C6 es ácido hidroxihexanoico, OH-C8 es ácido hidroxioctanoico. OH-C10 es ácido hidroxidecanoico.

Fig. 5. Curvas de crecimiento de las cepas de P. putida KT2442 y KT42FadB creciendo en una estrategia de fermentación en dos fases en presencia de: 6- ATH 15 mM como única fuente de carbono (Δ); 6-ATH 12mM como fuente de carbono y ácido decanoico 2,4 mM como inductor (O); ácido decanoico 2,4 mM a la concentración de inducción ( ).

Fig. 6. Análisis obtenido por GC-MS de los ásteres metílicos de 3- hidroxihexanoato (pico 1 ), 3-hidroxioctanoato (pico 3), 3-hidroxidecanoato (pico 4) y 3-hidroxi-6-acetiltiohexanoato (pico 5) en P. putida KT42FadB usando como fuente de carbono: (A) ácido decanoico 12 mM y (B) 6-ATH 12 mM como fuente de carbono y ácido decanoico 2,4 mM como inductor. El pico 2 corresponde al 3-metilbenzoato, usado como patrón interno.

Fig. 7. Espectro 1 H NMR del polímero aislado de la cepa P. putida KT2442. Fig. 8. Espectro 1 H NMR del polímero aislado de la cepa P. putida KT42FadB. Fig. 9. Termograma TGA de las muestras de polímero aislado de las cepas P. putida KT2442 y P. putida KT42FadB. Se representa el % en peso frente a la temperatura.

Fig. 10. Termograma TGA de las muestras de polímero aislado de las cepas P. putida KT2442 y P. putida KT42FadB. Se representa el flujo de calor frente a la temperatura.

EJEMPLOS A continuación se ilustrará el proceso de síntesis de los PHA de la invención.

EJEMPLO 1 : Estudio del fenotipo de la cepa mutante P. putida KT42FadB en cuanto a su capacidad para metabolizar ácidos grasos y transformarlos en PHA utilizando precursores alifáticos.

Para analizar el fenotipo de la cepa mutante P. putida KT42FadB en cuanto a su deficiencia para utilizar ácidos grasos como fuente de carbono, esta cepa se cultivó primeramente en placas de medio óptimo para la producción de PHA en P. putida KT2442 (medio M63 0,1 N con 15 mM de ácido octanoico). Como se muestra en la Figura 2, P. putida KT42FadB no fue capaz de crecer en placas de agar de este medio, ya que la mutación en el gen fadB le impide utilizar ácido octanoico como fuente de carbono y energía debido a la deficiencia en la producción del complejo enzimático FadAB. Esto confirmó el fenotipo de la interrupción de la ruta de la beta-oxidación de ácidos grasos en este muíante.

También hemos estudiado el crecimiento y la capacidad de producción de PHA utilizando precursores de PHA no relacionados con los ácidos grasos en la cepa P. putida KT42FadB, comparándola con la estirpe salvaje. Ambas cepas de P. putida muestran perfiles de crecimiento similares y son capaces de formar gránulos de PHA cuando se cultivaron en un solo paso de fermentación. Usando ya sea medios ricos como LB, o medios mínimos limitados en nitrógeno con diversas fuentes de carbono, como M63 0,1 N glucosa 20 mM, ó M63 0,1 N succinato 30 mM, no hemos observado ninguna diferencia evidente entre la cepa salvaje y el muíante KT42FadB en términos de producción de PHA, que fue baja en iodos los casos (entre el 15-20% del peso seco). Estos resultados están de acuerdo con una mutación en el complejo de la beta- oxidación que afecta al crecimiento de la cepa muíante sólo cuando utiliza ácidos grasos como fueníe de carbono, pero no cuando las células son fermeníadas con fueníes de carbono difereníes a los ácidos grasos.

Cepas, Medios v Condiciones de Cultivo

En la Tabla 1 se muesíran las cepas bacíerianas uíilizadas en esíe esíudio. Las cepas de E. coli y P. putida se culíivaron en medio LB a 37° C y 30° C, respecíivameníe. Como aníibióíico de selección se empleó kanamicina (50 μg/ml). Las cepas de P. putida se culíivaron íambién en M63 0,1 N (13,6 g/l KH ₂ P0 ₄ , 0,2 g/l (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 0,5 mg/l FeS0 ₄ -7 H ₂ 0, ajusíado a pH 7,0 con KOH), un medio mínimo limiíado en su coníenido en niírógeno, a una íemperaíura de 30° C y agiíación a 250 rpm íal y como se ha descriío previameníe (Moldes C et al., 2004. Appl. Environ. Microbio!. 70, 3205). Esíe medio fue suplemeníado con MgS0 ₄ 1 mM y una solución de elemeníos íraza (composición x l .OOO: 2,78 g/l FeS0 ₄ -7H ₂ 0, 1 ,98 g/l MnCI ₂ -4H ₂ 0, 2,81 g/l CoS0 ₄ -7H ₂ 0, 1 ,47 g/l CaCI ₂ -2H ₂ 0, 0,17 g/l CuCI ₂ -2H ₂ 0, 0,29 g/l ZnS0 ₄ -7H ₂ 0). Como fueníes de carbono se uíilizaron glucosa 20 mM, succinaío 30 mM, octanoato sódico 15 mM, ácido decanoico 12 mM y ácido 6-acetiltiohexanoico (6-ATH) 15 mM, o mezclas de ellos (en la proporción indicada en cada experimento). El crecimiento fue monitorizado con un espectrofotómetro Shimadzu UV-260 a 600 nm. Los medios sólidos se suplementaron con un 1 ,5% (peso/vol) de agar.

Tabla 1. Cepas bacterianas empleadas.

El crecimiento de P. putida KT2442 y la cepa muíante KT42FadB también se realizó en un procedimiento en dos fases. Preinóculos de cada una de estas cepas en medio LB fueron ajustados a una densidad óptica a 600 nm (OD ₆ oo) de 0,3. Después de 16 horas de incubación en LB, las células se recogieron y se diluyeron 1 :2 en medio M63 0,1 N suplementado con la fuente de carbono seleccionada. Esta segunda etapa del crecimiento en medio mínimo también se realizó en placas de 96 pocilios. Para ello, se distribuyeron en las placas multipocillo alícuotas de 200 μΙ de dichos cultivos. Las placas se incubaron a 30° C durante entre 24 y 48 horas, con 20 segundos de agitación orbital intensa cada 15 minutos. En las curvas de crecimiento se muestran los valores promedio de al menos 10 repeticiones (Figuras 3 y 5).

Manipulaciones del ADN y Construcciones de Plásmidos Las manipulaciones genéticas y demás técnicas de biología molecular se realizaron esencialmente según lo descrito previamente (Sambrook J. y Russell D. W. 2001 ., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.). Para la construcción del muíante P. putida KT42FadB un fragmento interno de 707 pares de bases del gen fadB fue clonado en el plásmido pK18mob utilizando los cebadores: sentido (SEQ ID NO: 1 ) 5' TCCCCCGGGAAAAGCTCAAGCTCAATGCCAT 3' y antisentido (SEQ ID NO: 2) 5' TCCCCCGGGTTGAAGAAGTGCATGCC 3'. Los productos de la reacción de amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) resultantes, y el plásmido pK18mob (Schafer, A et al. 1994. Gene 145:69-73) fueron digeridos con Smal y a continuación ligados. La mezcla de ligación se transformó en células de E. coli DH10B competentes. Se seleccionaron dos plásmidos por alfa- complementación que difieren entre sí en la orientación del promotor Plac respecto al fragmento interno del gen fadB. El plásmido pK18FadB1 , que porta el promotor Plac con una orientación opuesta a la del fragmento interno al gen fadB, fue introducido en la cepa P. putida KT2442 mediante conjugación triparental. La correcta inserción del plásmido pK18FadB1 en el gen fadB del genoma de P. putida KT2442 se analizó por medio de PCR (Figura 1 ). Purificación de los polímeros de PHA

Después de 24 horas de incubación los cultivos en segunda fase en medio M63 0,1 N fueron recogidos por centrifugación y resuspendidos en solución salina. Para romper las células se pasaron por la prensa de French dos veces. La solución se centrifugó a 15.000 χ g durante 30 minutos y el precipitado se disolvió en 10 mi de cloroformo. Para extraer los compuestos solubles en agua, se añadieron 2 mi de agua y se mezclaron las fases acuosa y orgánica por agitación, tras lo cual se separaron mediante centrifugación a 5.000 χ g. La fase orgánica (inferior) se transfirió a otro tubo y el procedimiento se repitió añadiendo 10 mi de cloroformo a la fase acuosa. La fase orgánica se precipitó en 10 volúmenes de metanol frío agitado con varilla magnética. Tras decantar la mezcla metanol/cloroformo, el polímero resultante se resuspendió en cloroformo y se secó durante la noche. Los polímeros resultantes almacenaron a temperatura ambiente.

EJEMPLO 2: Producción de PHA en la cepa mutante mediante estrategia de fermentación en dos fases.

La cepa P. putida KT42FadB mutante no es capaz de utilizar los ácidos grasos como única fuente de carbono, y por tanto, es incapaz de producir PHA de manera eficaz a partir de estos precursores cuando crece en una sola fase en medio líquido. La cepa salvaje produce 1 mg/ml de biomasa cuando se cultiva en ácido decanoico 12 mM como fuente de crecimiento y precursor de PHA, mientras que el mutante KT42FadB sólo produce 0,34 mg/ml de biomasa celular. Hemos desarrollado una estrategia consistente en dos pasos de fermentación con el fin de comparar la capacidad del mutante y de la cepa silvestre para producir PHA. En una primera fase las células se cultivaron durante la noche en medio rico LB. Después de recolectar las células mediante centrifugación, se diluyeron 1 :2 veces en medio fresco M63 0,1 N suplementado con 12 mM de ácido decanoico como precursor de PHA. Esta segunda fase, o fase de acumulación de PHA, se realizó en placas multipocillo con el fin de analizar la densidad óptica a 630 nm de los cultivos a lo largo del tiempo de forma comparada. Después de entre 7 y 8 horas de incubación en placas de multipocillo, la densidad óptica de los cultivos de la cepa mutante KT42FadB aumentó significativamente en comparación con la de la cepa de tipo salvaje (Figura 3). Dado que la turbidimetría celular se altera por la acumulación de gránulos de PHA (de Eugenio et al., 2010. Environ. Microbio!. 12: 207-21 ), estos resultados suponen que la estirpe mutante presenta un incremento en la producción de PHA con respecto a la salvaje.

El contenido celular y la composición del PHA se han determinado por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) en sedimentos secos (deshidratados), obtenidos a partir de las células de P. putida KT2442 y KT42FadB tras el segundo paso de la fermentación. Cuando el ácido decanoico 12 mM se utiliza como precursor de PHA, la cepa de P. putida KT42FadB es capaz de acumular mayor concentración de PHA que la cepa salvaje y con una composición monomérica diferente (Figura 4). La falta del complejo enzimático FadAB produce una acumulación de intermediarios metabólicos (R)-3-hidroxiacil-CoA dentro de la célula, que se canalizan a la producción de PHA en lugar de seguir la ruta catabólica de la beta-oxidación. En el PHA producido en la cepa muíante existe una pequeña proporción de monómeros con cadenas laterales más cortas, es decir, que han sufrido un proceso catabólico de beta-oxidación, lo que sugiere la presencia de vías alternativas de beta-oxidación codificadas en el genoma de P. putida KT2442.

EJEMPLO 3: Acumulación de PHACOS en P. putida KT42FadB y en la cepa salvaje a partir de precursores funcionalizados con grupos tioésteres.

La síntesis de PHA funcionalizados con grupos tioéster en la cadena lateral (PHACOS) se comparó en las cepas salvaje y muíante KT42FadB en términos de DO630 cuando se culíivaron en placas mulíipocillo. El ácido 6- aceíilíiohexanoico (6-ATH) fue elegido como precursor funcionalizado debido a la reacíividad del grupo íioésíer en la cadena laíeral, como muesíran las esírucíuras químicas ideníificadas en los poliésíeres PHACOS deíalladas más abajo. Las condiciones ópíimas de crecimienío para la producción de esíe PHA funcionalizado se esíablecieron con ácido decanoico como cosusíraío (6-ATH 12 mM como fueníe de carbono y ácido decanoico 2,4 mM como inducíor) en un culíivo de fermeníación en dos eíapas. En esías condiciones, el muíanle KT42FadB muesíra mayores valores de íurbidimeíría después de 24 horas respecío a los deíecíados en la cepa salvaje (Figura 5). Cuando se uíiliza únicameníe el ácido decanoico, en una conceníración de cosusíraío (2,4 mM) la absorbancia a 630 nm aumenía significaíivameníe hasía las 7 u 8 horas de la segunda fase, y después disminuye. El perfil íurbidiméírico que se observa cuando las células se incuban en presencia de 6-ATH 12 mM y ácido decanoico 2,4 mM comparado con el detectado al añadir únicamente el ácido decanoico 2,4 mM es completamente diferente. Estos resultados demuestran que P. putida KT2442, y en un mayor grado P. putida KT42FadB, son capaces de metabolizar las moléculas de 6-ATH, pero sólo en presencia de un cosustrato como por ejemplo el ácido decanoico.

Hemos analizado la producción de biomasa y PHACOS en ambas cepas tras 24 horas de la fase de acumulación en presencia de 6-ATH 12 mM y ácido decanoico 2,4 mM. En estas condiciones la biomasa alcanzada por ambas cepas es similar: 0,9 mg/ml en la cepa salvaje y 1 ,2 mg/ml en la cepa muíante KT42FadB. Las cepas salvaje y muíante producen, respectivameníe, 0,05 mg/ml y 0,22 mg/ml de PHACOS en relación al peso seco. Cuando las bacíerias se culíivan en una sola fase de crecimienío en presencia de 6-ATH 12 mM y ácido decanoico 2,4 mM, la biomasa de las cepas salvaje es de 0,65 mg/ml y 0,37 mg/ml. La cepa salvaje y la cepa muíanle producen respecíivameníe 0,11 mg/ml y 0,09 mg/ml de PHACOS.

EJEMPLO 4: Composición del polímero PHACOS.

La Figura 6 muesíra el íoíal de iones resulíaníes por GC-MS de cada ésíer meíílico obíenido a partir de los polímeros de la bacíeria P. putida KT42FadB, cuando se culíivan en dos fases. Como muesíra la figura, cada polímero coníiene ácidos 3-hidroxi-alcanoicos (ocíanoico, decanoico y írazas de hexanoico), así como monómeros derivados del 6-ATH cuando esíe es uíilizado como precursor en el crecimienío de las bacíerias.

La cuaníificación de monómeros 3-hidroxi-alcanoicos se basó en las señales relaíivas obíenidas eníre los paírones, consisíeníes en los respecíivos ácidos grasos sin grupo hidroxilo, y el paírón iníerno uíilizado en esíe esíudio, el 3- meíil-benzoaío. Para la cuaníificación del meíilésíer del 3-hidroxi-6-aceíil- íiohexanoaío fue uíilizado como paírón el 6-ATH. La conceníración de cada monómero se obtuvo mediante el cálculo relativo del factor de respuesta, que es una relación del área obtenida de cada compuesto y del patrón interno a partir del cromatograma, así como de la concentración del patrón y de patrón interno utilizado. Se sabe que las bacterias son capaces de convertir parte del ácido decanoico en ácidos grasos más cortos (ácidos octanoico y hexanoico) como paso previo a su incorporación en el polímero. De igual forma se sospecha que la bacteria podría cortar la cadena lateral de 6-ATH para incorporar un monómero con dos carbonos menos en el polímero. Debido a la falta de patrones para los monómeros hidroxilados derivados del 6-ATH, la proporción de éstos en el polímero se determinó de forma precisa mediante resonancia magnética nuclear (RMN).

Vale la pena señalar que la RMN no se puede aplicar para una rápida determinación estructural de los monómeros no funcionalizados del PHA, ya que el patrón del desplazamiento químico es tan complicado que los cambios químicos de monómeros presentes en el poliéster no pueden determinarse fácilmente. Por esta razón, ambas técnicas, GC-MS y RMN, se han utilizado de forma complementaria para identificar y cuantificar cada monómero presente en los polímeros.

Tabla 2. Desplazamiento químico en partes por millón de todos los monómeros presentes en los PHA, analizados mediante RMN 1 H.

Desplazamiento (ppm) Protones

0,8 a

1 ,3 g

1 ,6 h +hi

1 ,7 d i

2,3 bi +b ₂

2,5 e

2,8 Ci

3,2-3,3 h ₂

5,2 f

5,3 f ₂ Las estructuras químicas identificadas en los poliésteres PHACOS son las si uientes:

Las Figuras 7 y 8 muestran los espectros de RMN de los PHACOS producidos por la estirpe muíante y la estirpe salvaje, mientras que en la Tabla 2 se muestran los desplazamientos químicos de los protones señalados (a, bi , b2, etc.) en las estructuras químicas mostradas arriba. Determinación de la composición monomérica

Cabe señalar que el polímero obtenido de la bacteria muíante presenta un porceníaje de 3-hidroxi-6-ATH superior al observado en la esíirpe salvaje. Las bacíerias de íipo salvaje íambién íienen una mayor capacidad para meíabolizar la molécula de 6-ATH, por lo que se observa menor proporción del monómero 3-hidroxi-4-aceíilíiobuíanoaío. La Tabla 3 muestra un resumen de la composición monomérica de los PHACOS obtenidos a partir de la estirpe muíante y de la salvaje cuando se cultivan en dos fases. Para determinar la composición monomérica de los PHA se han empleado el análisis por GC-MS y la RMN. Tabla 3. Composición monomérica en % de los polímeros aislados a partir de las cepas de P. putida KT2442 y KT42FadB

Para el análisis por GC-MS, los monómeros se obtuvieron por metanolísis ácida del poliéster o de las células enteras liofilizadas mediante la resuspensión de entre 3 y 6 mg en 2 mi de metanol acidificado con un 15% v/v de H2SO4 con 0,5 mg/ml de 3-metil-benzoato, empleado como patrón interno, y 2 mi de cloroformo. La mezcla se dispuso en tubos con tapón de rosca y se estos se incubaron a 100° C durante 4 horas. Después de enfriar, se añadió 1 mi de agua destilada a la mezcla para inducir la separación de las fases. La fase orgánica que contiene los ésteres metílicos de los monómeros resultantes fue analizada por GC-MS. El equipo utilizado para este análisis fue un cromatógrafo de gases Agilent 7890A equipado con una columna HP 5 MS (30 m, 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 mm de espesor de película) y un espectrómetro de masas Agilent 5975C. Se inyectó 1 μΙ de la fase orgánica de cada muestra (con una relación de "split" de 1 :50) con helio como gas portador, y la temperatura del horno se programó para mantenerse a 80° C durante 2 minutos y luego aumentar desde 15° C hasta 250° C para la eficiente separación de los picos. La temperatura del inyector fue de 250° C. Los espectros se obtuvieron por impacto electrónico usándose una energía de ionización de 70 eV. Por otro lado, los experimentos de RMN se realizaron en un aparato Bruker 400 MHz con una solución de muestra en CDCI3 (cloroformo deuterado 20 mg/ml) a fin de determinar la relación entre cada monómero. EJEMPLO 5: Caracterización física y térmica del polímero PHACOS.

Según los resultados de análisis termogravimétrico (TGA, atmósfera de aire, 10° C/minuto), los termogramas corroboran que todas las muestras tienen exclusivamente materia orgánica ya que no se detectaron agua ni residuos inorgánicos. El peso se mantuvo estable hasta 200° C para la muestra de PHACOS producida por la cepa salvaje y hasta 220° C para la muestra de PHACOS producida por la cepa muíante. A partir de estas temperaturas se llevó a cabo la degradación de los polímeros, con el máximo centrado en 270° C para la muestra de la cepa salvaje y en 264° C para la muestra de la estirpe muíante. Los residuos detecíados a 700° C fueron de muy baja conceníración y similares en ambas muesíras.

Los ensayos de Calorimeíría Diferencial de Barrido (DSC) mosíraron que ambos poliésíeres son amorfos. Se observó una consíaníe de íransición víírea (T _g ) de -7° C y -18° C para las muesíras de las cepas salvaje y muíanle, respecíivameníe. No se deíecíaron picos de fusión ni de crisíalización cuando se caleníaron y enfriaron las muesíras a 10° C/minuío.

De acuerdo a la caracíerización íérmica de los poliésíeres analizados en esíe írabajo, se observa que ambos presenían valores bajos de íemperaíura de íransición víírea T _g . Esío podría ser un indicador de una buena capacidad de procesado íérmico, ya que los valores bajos de T _g sugieren que, a íemperaíura ambieníe, los dos polímeros se comportan como polímeros amorfos y son relaíivameníe blandos y deformables.

Tabla 4. Pesos moleculares y polidispersidad (PDI) de los polímeros aislados a partir de las cepas de P. putida KT2442 y KT42FadB. KT2442 KT42FadB

M _n (kDa) 71 99

M _w (kDa) 259 366

PDI 3,6 3,7

En cuanto a la determinación de los pesos moleculares, los resultados se muestran en la Tabla 4. Puede observarse que la muestra obtenida a partir del muíante KT42FadB tiene valores más altos de peso molecular promedio tanto en número (M _n ) como en peso (M _w ), lo que es indicativo de que la adición al poliéster de monómeros con grupo tioéster no inhibe el proceso de polimerización.

En cuanto a la polidispersidad (PDI) esta es mayor también en la cepa muíante, indicando mayor grado de variación en los pesos moleculares de esíe polímero.

Con los resulíados que hemos obíenido, podemos decir que hemos siníeíizado dos nuevos PHA hidrofílicos con grupos funcionales que íienen una alia susceptibilidad de ser químicamente modificados y con características térmicas que sugieren una gran facilidad de procesamiento.

Caracterización física y térmica

Los pesos moleculares de los poliésteres se determinaron por cromatografía de exclusión molecular (SEC). Las mediciones se realizaron con un cromatografo de líquidos Shimadzu (Japón) equipado con un detector de índice de refracción RID-10A y un detector UV diodo array SPD-M10A. El set de columnas utilizado estaba compuesto por una columna de 50 mm PLgel Guard de 5 μηπ, dos columnas de 300 mm PLgel MIXED-C de 5 μηι y una columna de 300 mm PLgel 5 μηπ-100 A. La curva de calibrado se realizó con patrones de poliestireno desde 580 hasta 1 ,6x10 ⁶ g/mol. Como fase móvil se utilizó cloroformo y los análisis se realizaron a 25° C a un flujo de 0,8 ml/minuto. El TGA se realizó en un equipo TA Instruments TGA Q5000. Las muestras se calentaron desde temperatura ambiente hasta 700° C a razón de 10° C/minuto en atmósfera de aire. El TGA proporciona una medición cuantitativa de la variación en la masa de los poliésteres asociada con la transición y la degradación térmica.

En el caso de la DSC, las mediciones se realizaron en un equipo TA Instruments DSC 2910. Los materiales fueron expuestos a sucesivos ciclos térmicos de calor-frío-calor entre -90° C y 180° C a 10° C/minuto. La DSC se utilizó para determinar propiedades térmicas de los polímeros tales como la T _g , la temperatura de cristalización (T _c ) y temperatura de fusión (T _m ).

EJEMPLO 6: Producción de PHACOS en otras especies. La producción de PHA con grupos tioéster en la cadena lateral se llevó a cabo en dos fases en M63 0,1 N en presencia de 6-ATH 12 mM y ácido decanoico 2,4 mM empleando otras cepas de Pseudomonas, como P. putida U (0,02 mg/ml de PHACOS), P. putida U AFadBA (muíante fadBA) (0,2 mg/ml de PHACOS) y P. oleovorans GPo1 (0,04 mg/ml de PHACOS). Se detecta producción de gránulos de PHA en todos los casos (Tabla 5).

Tabla 5. Composición monomérica en % de los polímeros aislados a partir de las cepas diferentes a P. putida KT2442.

% Monómeros alifáticos % Monómeros tiol

P. putida U >95% trazas

P. putida U FadBA- 83,50% 16,50%

P. oleovorans GPo1 >95% trazas