ANALOGUES SYNTHETIQUES DES PHOSPHATIDYL-MYO-INOSITOL

MANNOSIDES POURVUS D'UNE ACTIVITE INHIBITRICE DE LA

REPONSE INFLAMMATOIRE

DESCRIPTION

Domaine technique

La présente invention se rapporte à de nouveaux dérivés synthétiques des phosphatidyl-myo-inositol mannosides (ci-après PIM), leur procédé de préparation et leur utilisation dans la prévention ou le traitement d'une maladie associée à la surexpression de cytokines ou de chimiokines, notamment du TNF et/ou de l'IL-12.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins un dérivé synthétique de PIM. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.

Etat de la technique

L'inhibition de l'expression des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF et l'interleukine 12 (ci-après IL-12) p40 impliquées dans de nombreuses réponses inflammatoires constitue un réel besoin médical.

Les indications liées à l'expression de ces cytokines incluent les maladies inflammatoires, allergiques et autoimmunes dont le polyarthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, la sclérose en plaque, le psoriasis, le diabète mellitus, le lupus erythematosus, le choc sceptique et les inflammations pulmonaires chroniques et aiguës.

Les molécules classiquement utilisées dans ces indications sont des stéroïdes. Plusieurs agents bloquants le TNF (anticorps ou récepteurs solubles) sont commercialisés depuis 2000. Quatre classes de molécules inhibant la sécrétion d'IL-12 dont des anticorps font l'objet d'un brevet/demande de brevet [1].

Toutefois, les stéroïdes ont des effets secondaires qui en limitent l'application. Les anticorps monoclonaux ou récepteurs solubles sont des protéines coûteuses nécessitant des injections sous-cutanées. De plus, ces anticorps peuvent avoir des effets indésirables sur la résistance aux infections, comme cela a été montré pour les anticorps anti TNF qui peuvent induire la réactivation de la tuberculose latente. Le hyaluronan, décrit comme inhibiteur de la production d'IL-12, a un très haut poids moléculaire, est peu défini moléculairement et difficilement synthétisable

[2]. II subsiste donc un réel besoin médical pour trouver de nouveaux inhibiteurs des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF et l'IL-12 palliant ces défauts.

Les phosphatidyl-myo-inositol mannosides (ci-après PIM) sont des précurseurs de lipoglycanes complexes comme, par exemple, les lipoarabinomannanes (LAM) et les lipomannanes (LM), extraits des parois des mycobactéries. Selon leur structure, les PIM peuvent avoir des activités immunomodulatoires différentes.

Les PILAM, provenant d'une espèce avirulente à croissance rapide telle que M. smegmatis, sont des molécules pro-inflammatoires stimulant la production du TNF et de IL-12. En revanche, les LAM couverts avec des résidus mannosyle (ManLAM), provenant de myobactéries à croissance lente telles que M. tuberculosis and M. bovis BCG, sont des molécules anti-inflammatoires capables d'inhiber la production d'IL-12 et de TNF et d'augmenter la production d'IL-10 par les cellules dendritiques ou par des lignées de monocytes [8].

Les PILAM stimulent les macrophages par l'intermédiaire de récepteurs Toll-like (TLR)-2, qui sont des récepteurs impliqués dans l'immunité innée, en stimulant la voie de signalisation du NF-kB [9]. Les effets anti-inflammatoires de ManLAM ont été attribués à leur liaison aux récepteurs du mannose [10] ou à DC-SIGN [11].

Les LM, précurseurs biosynthétiques des LAM, sont composés d'un squelette de carbohydrates comportant un noyau constitué de D- mannane et d'un point d'ancrage de mannosyl-phosphatidylinositol (ci- après PIM) à l'extrémité réduite en mannane dudit noyau. Les LM sont dépourvus de domaine D-arabinane et des coiffes trouvées dans les LAM [12]. Les LM sont pro-inflammatoires mais les inventeurs ont récemment décrit que les LM de différentes origines bactériennes, y compris M. bovis BCG, M. tuberculosis, M. chelonae and M. kansasii, présentent également des propriétés anti-inflammatoires importantes [13]. En particulier, les LM tri- et tetra-acylés de Mycobacterium bovis BCG induisent la stimulation des macrophages et l'expression de cytokines pro-inflammatoires par l'intermédiaire de TLR2, de TLR4 et de la protéine adaptatrice MyD88 [14], alors que les LM di-acylés et, jusqu'à un certain niveau les LM tri-acylés, inhibent la production des cytokines inflammatoires par les macrophages stimulés à travers la voie TLR4, de manière indépendante de TLR2 [15]. Par conséquent, le degré d'acylation influence l'effet modulateur des LM de M. bovis. Les auteurs ont proposé que l'acylation différentielle des LM de la paroi myobactérienne peut représenter un moyen additionnel pour réguler la réponse inflammatoire de l'hôte.

Les PIM sont des molécules de faible poids moléculaire (environ 1000-2500) comprenant en général de 1 à 4 chaînes acylées, un résidu phosphatidyl-myo-inositol et 1 à 6 résidus mannose. Ainsi, les PIM naturels peuvent se présenter sous différentes formes avec un nombre variable de résidus mannose et acyle.

ParmMes PIM naturels, les phosphatidyl-myo-inositol dimannoside (ci-après PIM ₂ ) et phosphatidyl-myo-inositol hexamannoside (ci-après PIM ₆ ) sont les plus couramment trouvés chez Mycobacterium bovis BCG et Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Un exemple de structure de PIM ₆ à l'état naturel est représentée dans la Figure 1. On note que dans ces

structures naturelles, les résidus mannosyles sont portés par le D-myo- inositol en positions 2 et 6.

Plusieurs fonctions ont été récemment attribuées aux PIM.

Il a été démontré que les PIM sont des agonistes de TLR2 [3] et sont reconnus par les cellules T CD4OD8 ^" α/β humaines dans le contexte de cellules présentatrices d'antigènes exprimant CD1 b [4]. L'interaction de haute affinité entre les protéines CD1b et les chaînes latérales acylées de

PIM ₂ a été établie [5]. La fraction phosphatidyl-inositol semble jouer un rôle central dans le processus de liaison des PIM aux protéines CD1b. Par ailleurs, il a été démontré que les PIM ₂ pouvaient augmenter le recrutement des cellules NKT (Natural Killer T cells), qui jouent un rôle primordial dans la réponse granulomateuse [6], [7].

Il a été trouvé que les souches Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium tuberculosis H37Rv et Mycobacterium smegmatis 607 contenaient essentiellement deux familles de PIM, dimannosylés (PIM ₂ ) et hexamannosylatés (PIM ₆ ) [7]. PIM-i, PIM ₃ , PIM ₄ and PIM ₅ ont été observés en faibles quantités suggérant que ce sont des intermédiaires biosynthétiques. Les PIM sont synthétisés à partir de phosphatidyl-inositol par addition séquentielle de résidus de mannose à des positions spécifiques. Les trois gènes codant pour les mannosyl transférases impliquées dans l'addition des trois premières unités d'α-Manp sont maintenant connus. L'étape d'initiation, catalysée par l'enzyme pimA [16], consiste à transférer un résidu α-Manp au myo-inositol du phosphatidyl- inositol pour former PIM ₁ . L'addition d'un second résidu α-Manp au myo- inositol du phosphatidyl-inositol pour générer PIM ₂ est catalysée par l'enzyme- pimB [17], L'élongation-se -fait- grâce au pimC [18]- pour-créer-

PIM3 par addition d'un troisième résidu α-Manp.

Différentes formes acylées de PIM, en particulier des PIM ₂ et PIM ₆ , ont été purifiés et caractérisées [7]. Quatre formes acylées majeures (mono- au tétra-acylés) ont été décrites pour PIM ₂ et PIM ₆ (Acr

à Ac ₄ -PIM ₂ et PIM ₆ ; voir Tableau 1). Leur activité biologique consistant à stimuler les macrophages à produire des cytokines a également été mise en évidence.

Tableau 1 : Les formes majeures acylées de PIM ₆ mis en évidence M. bovis BCG.

m/z Fragment Gro Manp Myo- %

Acyle Ins

1 2 6 3

ACiPIM ₆ 1543.6 Ci ₆ Ci ₆ 1585.7 C-19 C19

Ac ₂ PIM ₆ 1781.8 C-I6, Ci6 Ci6 Ci ₆ 35 1823.9 C-16, C-I9 Ci6 C19 65

Ac ₃ PIM ₆ 2062.1 2C-] ₆ , C-|9 Ci6 C19 Ci ₆ 100

Ac ₄ PIM ₆ 2300.3 3Ci _6i C19 Ci ₆ Ci9 Ci ₆ Ci ₆ 56 2342.4 2Ci ₆₁ 2Cig Ci ₆ C19 Cie C19 44

L'abondance relative des différentes espèces pour chaque forme acylée a été déterminée à partir de l'intégration des signaux monoisotopiques correspondants [19].

Les inventeurs ont précédemment montré que PIM ₂ et PIM ₆ induisent une activation faible des macrophages pour sécréter TNF par

TLR2 et l'adaptateur MyD88, quelque soit leur structure acylée [7],[19]. Toutefois, comme les PIM sont des précurseurs de LM, et en vue de la récente démonstration par les inventeurs selon laquelle le LM di-acylé et tri-acylé possède un effet anti-inflammatoire fort, ils ont déterminé que certains PIM naturels, y compris les PIM ₆ di- et tri-acylés, sont des inhibiteurs de la libération, par les macrophages, de cytokine pro- inflammatoire. Ce travail fait l'objet de la demande de brevet français no.

06/10136 du 20 novembre 2006 publiée sous le numéro FR 2908658.

Les synthèses totales de PIM2 et de PIM ₆ ont été décrites [20]. Les inventeurs ont déjà réalisé la synthèse des PIMi di-acylés et ont montré l'inhibition de la libération de cytokines pro-inflammatoires.

Comme indiqué précédemment, un réel besoin médical existe pour trouver de nouveaux inhibiteurs des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF et l'IL-12 palliant aux défauts, inconvénients et obstacles des inhibiteurs de l'art antérieur tels que les stéroïdes ou les anticorps monoclonaux.

Les dérivés synthétiques de PIM peuvent constituer une alternative intéressante pour répondre à ce besoin.

Ainsi, il existe donc un réel besoin de nouveaux dérivés synthétiques des PIM à la fois simple à synthétiser, facile à mettre en œuvre et de coût réduit, ayant des propriétés inhibitrices de l'expression de cytokines proinflammatoires, voire supérieurs, aux inhibiteurs de l'art antérieur.

Description de l'invention

La présente invention a précisément pour but de répondre à ce besoin en fournissant de nouveaux composés de formule générale (I) :

(D

dans laquelle :

• Ri et R ₂ représentent, indépendemment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C ₂ 0, un radical acyle en C ₁ -C20, étant entendu que lorsque l'un des substituants Ri ou R ₂ est un atome d'hydrogène l'autre substituant est différent d'hydrogène ; « Zi et Z ₂ représentent, indépendemment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, au moins un sucre choisi dans le groupe comprenant le mannose, le glucose, le galactose, étant entendu que lorsque l'un des substituants Zi ou Z ₂ est un atome d'hydrogène l'autre substituant est différent d'hydrogène ; - Q représente -OP(O) ₂ O-, -OCO ₂ -, -NHCO ₂ -, -NHCONH- ;

" Y représente un atome d'hydrogène, un radical hydroxyl, un radical alkoxy en Ci-C ₆ , -(CH ₂ ) _n -OH avec n est nombre entier égal à 1 , 2 ou 3, étant entendu que lorsque Y est un radical hydroxyl, Zi et Z ₂ ne représentent pas tous les deux un atome d'hydrogène ; " A représente -CH ₂ - ;

• X représente un atome d'hydrogène ;

• ou A et X forment ensemble une liaison pour conduire à un cycle à 6 chaînons dans lequel

• A représente un -CH-, • X représente un -CH ₂ -, -CH(OH)-, un atome oxygène, un

-NR ₃ - dans lequel R ₃ est un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Ci-C ₆ ou un radical acyle en Ci-C ₂₀ , étant entendu que, lorsque

• A et X forment une liaison pour conduire à un cycle à 6 chaînons,

• X = -CH(OH)-,

^• Y =- -OH, et

• Zi et Z ₂ représentent, indépendemment l'un de l'autre, au moins un sucre choisi dans le groupe comprenant le mannose, le glucose, le galactose,

le cycle à 6 membres est de configuration myo-inositol avec Zi ou Z ₂ en position 1 et représentant, au moins un sucre; ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

Dans le cadre de l'invention, on entend par myo-inositol la structure suivante avec la numérotation indiquée selon les recommandations de l' International Union of Biochemistry (1988).

myo-inositol I

Selon un mode de réalisation de l'invention, les composés de l'invention dans lesquels A et X forment ensemble une liaison pour conduire à un cycle à 6 chaînons, peuvent être de formule (Ia)

(Ia) dans laquelle

- Ri et R ₂ , Zi et Z ₂ , Q et Y sont tels que définis précédemment ;

• A représente un -CH- ;

• X représente un -CH2-, -CH(OH)-, un atome oxygène, un -NR3- dans lequel R ₃ est un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Ci-Ce ou un radical acyle en C1-C20, étant entendu que, lorsque - X = -CH(OH)-

• Y = -OH, et

• Zi et Z ₂ représentent, indépendemment l'un de l'autre, au moins un sucre choisi dans le groupe comprenant le mannose, le glucose, le galactose, le cycle à 6 chaînons est de configuration myo-inositol avec Zi ou Z ₂ en position 1 et représentant au moins un sucre ; ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

Un exemple de ce mode de réalisation peut être un composé dans lequel A et X forment ensemble une liaison pour conduire à un cycle à 6 chaînons, ledit composé pouvant alors être un composé dans lequel

• Ri et R ₂ représentent, indépendemment l'un de l'autre, un radical acyle en Ci-C ₂ O ;

" Zi représente un atome d'hydrogène;

• Z ₂ représente le mannose; - Q représente -OP(O) ₂ O- ;

• A représente un -CH- ;

• X représente un -CH(OH)-

• Y représente un radical hydroxyl ;

" le cycle à 6 chaînons est de configuration myo-inositol avec Zi en position 1 ; ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

Un autre exemple de ce mode de réalisation peut être un composé dans lequel A et X forment ensemble une liaison pour conduire à un cycle à 6 chaînons, ledit composé pouvant alors être un composé dans lequel " Ri et R ₂ représentent, indépendemment l'un de l'autre, un radical acyle en Ci-C ₂ Q ;

- Zi représente le mannose ;

• Z ₂ représente un atome d'hydrogène ; - Q représente -OP(O) ₂ O- ;

• A représente un -CH- ; - X représente un -CH(OH)-

• Y représente un radical hydroxyl ;

• le cycle à 6 chaînons est de configuration myo-inositol avec Zi en position 1 ; ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. Lorsque A et X forment ensemble une liaison pour conduire à un cycle à 6 chaînons, les composés de l'invention peuvent également être, par exemple, des composés dans lesquels » Ri et R ₂ , sont tels que définis précédemment ;

• Q représente -OP(O) ₂ O- ; " A représente un -CH- ;

- X représente -CH(OH)-,

• Y représente un radical hydroxyl ;

• Zi et Z ₂ représentent, indépendemment l'un de l'autre, au moins un sucre choisi dans le groupe comprenant le mannose, le glucose, le galactose, le cycle à 6 chaînons est de configuration myo-inositol avec Zi ou Z ₂ en position 1 et représentant au moins un sucre ; ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

Toujours, dans le cas où A et X forment ensemble une liaison pour conduire à un cycle à 6 chaînons, les composés de l'invention peuvent encore être, par exemple, des composés dans lesquels

• Ri et R ₂ , Zi et Z ₂ et Y sont tels que définis précédemment ; » Q représente -OP(O) ₂ O- ;

• A représente un -CH- ;

• X représente un -NR ₃ - dans lequel R ₃ est un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Ci-Ce ou un radical acyle en Ci-C ₂ O ; ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les composés de l'invention peuvent être de formule (Ib)

(Ib)

dans laquelle

• Ri et R ₂ , Zi et Z ₂ , Q et Y sont tels que définis précédemment ;

• A représente -CH ₂ - ; " X représente un atome d'hydrogène ; ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

De manière tout à fait inattendue, il a été observé que les dérivés synthétiques des PIM conformément à l'invention permettent de séparer la propriété de ces dérivés à agir comme agoniste des récepteurs TLRs impliqués dans la réponse immunitaire, et ainsi de séparer l'activité pro- et anti-inflammatoire de ces nouveaux PIM.

Par ailleurs, les dérivés de PIM selon l'invention sont de faibles poids moléculaires (environ 1000). Ils sont bien définis moléculairement et leur synthèse est plus aisée que les PIM naturels. Ils sont en outre, non cytotoxiques.

De plus, ces dérivés possèdent une activité immunomodulatrice au moins comparable, de préférence supérieure à celle des PIM naturels.

On entend par « alkyle » au sens de la présente invention, un radical carboné linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé, éventuellement substitué, comprenant 1 à 20 atomes de carbone, par exemple 1 à 15 atomes de carbone, par exemple 1 à 6 atomes de carbone. A titre indicatif, on peut citer les radicaux méthyle, éthyle, propyle, butyle, isobutyle, pentyle, hexyle, octyle, nonyle, décyle, undécyle, dodécanyl, tridécanyle, tétradécanyle, pentadécanyle, hexadécanyle, heptadécanyle, octadécanyle octadécanyle, nonadécanyle, eicosanoyle et leurs isomères ramifiés.

On entend par « acyle » au sens de la présente invention, un radical -COR' dans lequel R' est un radical alkyle tel que défini ci-dessus. Le groupe acyle peut également signifier le groupe tuberculostéaryle.

On entend par « alkoxy» au sens de la présente invention, un radical -OR' dans lequel R' est un radical alkyle tel que défini ci-dessus.

Dans le cadre de la présente invention, le terme « sels pharmaceutiquement acceptables » comprend les sels préparés avec des acides ou bases, non toxiques, en fonction des substitituants présents sur les composés. Lorsque les composés de l'invention comportent des fonctions acides, les sels correspondants peuvent être obtenus par addition d'une base organique ou inorganique sur le composé sous forme neutralisée en présence éventuellement d'un solvant de préférence inerte. Des exemples de sel d'addition d'une base peuvent être les sels de sodium, potassium, calcium, ammonium, amino (organique), ou magnésium. Lorsque les composés de l'invention comportent des fonctions basiques, les sels correspondants peuvent être obtenus par addition d'un acide organique ou inorganique éventuellement dans un solvant de préférence inerte. Des exemples de sels d'addition d'acide inorganique peuvent être les sels hydrochlorique, hydjobromique, riitrique, carbonique, monohydrogencarbonique, phosphorique, monohydrogenphosphorique, dihydrogenphosphorique, sulfurique, monohydrogensulfurique, hydriodique. Des exemples de sels d'addition d'acide organique peuvent être les sels acétique, propionique, isobutyrique, maléique, malonique,

benzoïque, succinique, subérique, fumarique, lactique, mandélique, phthalique, benzènesulfonique, p-tolylsulfonique, citrique, tartarique, méthanesulfonique. Sont également couverte par cette invention, des sels d'acides aminés tels que l'arginate, et des sels d'acides organiques tels que les acides glucuronique ou galactunorique.

Les composés de formule générale (I), (la) et (Ib) peuvent être sous forme racémique ou enrichie en un énantiomère ou enrichie en un stéréoisomère.

Un des composés préférés de l'invention est le composé de formule (la) de structure suivante (isoPIMi-C16C18) :

. „ . .. . α-D-mannopyranose

1 D-myo-mositol

L'invention concerne également le procédé de préparation de composés selon l'invention tels que définis précédemment, dans lequel : a) on condense un dérivé di-O-acylé ou di-O-alkylé du glycérol de formule (III)

dans laquelle

• G = OH ou NH ₂

• Ri et R ₂ ont les mêmes définitions que précédemment avec un agent de phosphitylation, de phosphorylation ou de carbonylation pour donner un intermédiaire de formule (IV)

(IV) dans laquelle

• J = O ou NH,

• K = P-OBn , P(O)-OBn ou C=O,

• L = groupe sortant

• Ri et R ₂ ont les mêmes définitions que précédemment ; b) on condense l'intermédiaire (IV) avec un dérivé d'un polyol ou aminopolyol de formule générale (V)

dans laquelle

• G = OH ou NH ₂

• Z ₃ et Z ₄ représentent indépendamment l'un de l'autre un hexopyranose de configuration manno, gluco ou galacto et portant des groupes protecteurs acétyle ou methoxyacétyle, ou un groupement benzyle, étant entendu que l'un au moins des groupes Z ₃ et Z ₄ représente un sucre protégé

• R ₄ représente un groupe protecteur choisi dans le groupe compenant un groupe benzyle, ou un radical alkoxyacétyle en Ci- Ce,

ou on condense l'intermédiaire (IV) avec un composé cyclique de formule générale (VI)

(VI) dans laquelle

- G = OH ₁ NH ₂

• Z ₃ et Z ₄ ont les mêmes définitions que précédemment

• Y ₂ = H ou un groupe -OR ₄ ou un groupe -(CH ₂ ) _n OR ₄ dans lequel R ₄ a la même définition que précédemment

• X ₂ = -CH ₂ , -CHOR ₄ , -NR ₃ ou O dans lequel R ₃ est un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Ci-Ce ou un radical acyle en C-i- C ₂ o et R ₄ représente un groupe protecteur, comme un groupe benzyle, ou un radical alkoxyacétyle en Ci-C ₆ éventuellement en présence d'un agent de couplage ; c) on soumet, éventuellement, le composé obtenu à l'étape b) à une réaction d'oxydation, pour donner un composé de formule générale (VII)

(VlI) dans laquelle

• J et J' = O ou NH

• M = P(O)OBn ou C=O

• Z3, Z ₄ , R-i, R ₂ , R ₄ ont les mêmes définitions que précédemment

ou un composé de formule générale (VIII)

(VlII) dans laquelle

^• J et J' = O ou NH

• M = P(O)OBn ou C=O

^• X2, Y2, Z ₃ , Z ₄ , R ₁ , R ₂ , R ₄ ont les mêmes définitions que précédemment

d) on soumet le produit de formule générale (VII) ou de formule générale

(VIII) à une déprotection en deux étapes qui consiste en ce que l'on les traite d'abord avec une alkylamine choisi dans le groupe comprenant la t-

butylamine pour couper sélectivement les groupes acétyles ou méthoxyacétyles puis soumet les produits désacylés à une hydrogénation catalytique pour éliminer les groupements benzyles.

Comme exemple d'agent de phosphitylation, on peut citer la chlorobis(diisopropylamino)phosphine, la benzyloxydichlorophosphine, la bis(benzyloxy)-N,N-diethylaminophosphine et composés apparentés.

Comme exemple d'agent de phosphorylation, on peut citer le diphenylchlorophosphate, le dibenzyl phosphorochloridate, le xylylenechlorophosphate et composés apparentés. Comme exemple d'agent de carbonylation, on peut citer le carbonyldiimidazole, le triphosgène et les composés apparentés.

Par « groupe protecteur » on entend un groupe qui permet la transformation d'un groupe fonctionnel en un groupe qui sera inerte dans les conditions réactionnelles choisies afin d'empêcher des réactions secondaires de se produire dans la suite de la synthèse. A ce titre on peut citer, par exemple, le groupe benzyle, le groupe t-butyldiméthylsilyle, le groupe acétyle ou le groupe méthoxyacétyle.

Par « groupe sortant ou partant », on entend un groupe susceptible d'être substitué par un réactif nucléophile, comme par exemple, les halogénures ou les tosylates.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par « agent de couplage ou agent de liaison », un agent permettant la condensation d'un dérivé d'acide phosphorique ou d'un acide carboxylique avec un alcool ou une aminé pour former les liaisons esters ou amides correspondantes. A ce titre on peut citer, par exemple, la dicyclohexylcarbodiimide (DCC), la N- ethyl N-dimethylamino-propylcarbodiimide (EDCI).

Dans un mode de réalisation de l'invention, les composés de formule (I) dans laquelle Q représente -OP(O) ₂ O-, peuvent également être préparés selon un procédé dans lequel : a) on condense un dérivé di-O-acylé ou di-O-alkylé du glycérol de formule (IX)

(IX) dans laquelle Ri et R ₂ ont les mêmes définitions que précédemment avec un agent de phosphitylation, pour donner un intermédiaire de formule (X)

(X) dans laquelle L = groupe sortant b) on condense alors l'intermédiaire (X) avec un dérivé d'un polyol de formule générale (XI)

(XI) dans laquelle

• Z ₃ et Z ₄ représentent indépendamment l'un de l'autre un hexopyranose de configuration manno, gluco ou galacto et portant 15. _dasL_ groupes _ protecteurs ..acétyle. ou methoxyacétyle, ou_. un groupement benzyle avec la condition que l'un au moins des groupes Z ₃ et Z ₄ représente un sucre protégé

• R ₄ représente un groupe protecteur, comme un groupe benzyle, ou un radical alkoxyacétyle en CI-C _θ ou avec un composé cyclique de formule générale (XII)

dans laquelle

• Z ₃ et Z ₄ ont les mêmes définitions que précédemment

• Y ₂ = H ou un groupe -OR ₄ ou un groupe -(CH ₂ ) _n OR ₄ dans lequel R ₄ a la même définition que précédemment et n peut prendre des valeurs de 1 à 3

• X ₂ = -CH ₂ , -CHOR ₄ , -NR ₃ ou O dans lequel R ₃ et R ₄ ont la même définition que précédemment en présence d'un agent de couplage choisi dans le groupe comprenantle 1 H-tetrazole, c) on soumet ensuite le phosphite intermédiaire à une réaction d'oxydation, pour donner un composé de formule générale (XIII)

(XIII)

dans laquelle Z ₃ , Z ₄ , R ₁ , R ₂ , Rs _τ R ₄ ont les mêmes définitions que précédemment

ou un composé de formule générale (XIV)

(XIV) dans laquelle X ₂ , Y ₂ , Z ₃ , Z ₄ , R ₁ , R ₂ , ont les mêmes définitions que précédemment

d) on soumet alors les composés (XIII) et (XIV) obtenus à l'étape c) à une déprotection en deux étapes qui consiste en ce que l'on les traite d'abord avec une alkylamine telle que la t-butylamine pour couper sélectivement les groupes acétyles ou méthoxyacétyles puis soumet les produits désacylés à une hydrogénation catalytique pour éliminer les groupements benzyles.

Un autre objet de la présente invention est une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé selon l'invention tel que défini précédemment et tout excipient pharmaceutiquement acceptable.

La composition selon l'invention peut comprendre, en outré, des composants bien connus de l'homme du métier dans le domaine pharmaceutique, comme des agents stabilisants, des agents émulsifiants, des agents de tonicité, des agents conservateurs, des colorants, des excipients, des liants, des lubrifiants notamment.

La composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisée pour la prévention ou le traitement de désordres ou de maladies inflammatoires ou autoimmunes.

Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'une composition telle que décrite précédemment pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie associée à la surexpression de cytokines ou de chimiokines, notamment du TNF et/ou de NL-12 chez un sujet.

Par sujet, on entend un mammifère, de préférence un humain.

La maladie associée à la surexpression cytokines ou de chimiokines, notamment du TNF et/ou de l'IL-12 comprend:

A) les maladies immunes ou auto-immunes choisies dans le groupe comprenant la polyarthrite rhumatoïde, le diabète sucré, le lupus érythémateux disséminé ou la maladie de Basedow ;

B) le rejet de greffe,

C) les infections virales et/ou parasitaires ;

D) les chocs résultant d'une infection chronique ou aiguë d'origine bactérienne, virale et/ou parasitaire ;

E) les maladies inflammatoires choisies dans le groupe comprenant les maladies inflammatoires chroniques (la sarcoïdose, l'affection abdominale inflammatoire, l'arthrite rhumatoïde, la rectocolite hémorragique, la maladie de Crohn) et les maladies inflammatoires vasculaires (le syndrome de défibrination, l'arhtérosclérose, la maladie de Kawazaki) ;

F) les maladies neurodégénératives choisies dans le groupe comprenant les maladies démyélinisantes (la sclérose en plaques et la myélite transverse aiguë), les maladies extrapyramidales et cérébelleuses (les

lésions du système corticospinal ou les désordres des noyaux gris centraux) ;

G) les pathologies malignes impliquant des tumeurs sécrétant du TNF ou impliquant le TNF choisies dans le groupe comprenant la leucémie (aiguë, myélocytique, lymphocytique ou myélodispastique chronique), le lymphome (Hodgkin ou malin (Burkitt) et

H) l'hépatite induite par l'alcool.

L'invention concerne encore l'utilisation d'un composé tel que défini précédemment, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie associée à la surexpression de cytokines ou de chimiokines, notamment du TNF et/ou de NL-12, ladite maladie comprenant :

A) les maladies immunes ou auto-immunes choisies dans le groupe comprenant la polyarthrite rhumatoïde, le diabète sucré, le lupus érythémateux disséminé ou la maladie de Basedow ;

B) le rejet de greffe,

C) les infections virales et/ou parasitaires ;

D) les chocs résultant d'une infection chronique ou aiguë d'origine bactérienne virale et/ou parasitaire ; E) les maladies inflammatoires choisies dans le groupe comprenant les maladies inflammatoires chroniques et les maladies inflammatoires vasculaires ;

F) les maladies neurodégénératives choisies dans le groupe comprenant les maladies démyélinisantes, les maladies extrapyramidales et — cérébelleuses-; —

G) les pathologies malignes impliquant des tumeurs sécrétant du TNF ou impliquant le TNF choisies dans le groupe comprenant la leucémie, le lymphome ; et

H) l'hépatite induite par l'alcool.

De préférence, ledit médicament est destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie inflammatoire chez un sujet.

Ledit médicament peut être administré par injection (intraveineuse, intramusculaire, sous-cutané, intracutané, etc.), administration nasale, orale, percutanée ou par inhalation. En fonction du mode d'administration, ledit médicament peut être préparé sous forme de solutions, d'émulsions, de cachets, de poudres, d'onguents, de lotions, de gels, de suppositoires ou de sprays. Dans ledit médicament, la concentration en composé de formule (I) ou de son sel pharmaceutiquement acceptable n'est pas limitée et est comprise de préférence entre 0,1 et 100% (p/p) et de manière particulièrement préférée entre 0,5 et 20%.

D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.

Brève description des figures La figure 1 représente une structure de PIM _θ naturel comportant trois groupes acyle dont la chaîne alkyle est linéaire et en Ciβ et un groupe acyle dont la chaîne alkyle est ramifiée et en C ₁₉ .

Les figures 2a, 2b et 2c représentent le schéma synthétique du composé de l'exemple 1 isoPIMiPIM1-2Ci ₆ (SFPIM91 ; figure 2a), du composé de l'exemple 2 isoPIMi-Ci ₆ Ci ₈ (SFPIM219; figure 2b) et des composés des exemples 3 et 4 PIM-2-mimNCOCF ₃ (SFPIM324-t4) et PIM-

2-mimNH (SFPIM324-t8) (figure 2c).

La figure 3 représente l'inhibition de l'expression de TNF par les macrophages primaires stimulés avec le LPS en présence de la forme « isomère » de PIMi isoPIMi-2Ci6 (SFPIM91 ), en comparaison avec les

PIM naturels Ac2PIM ₆ et Ac3PIM ₆ , et le PIM ₁ synthétique (SFPIM135), titrés à 1 , 3 et 10 μg/mL.

La figure 4 représente l'absence de cytotoxicité de l'isoPIMr 2C ₁₆ (SFPIM91 ), les PIM naturels Ac2PIM ₆ et Ac3PIM ₆₎ et le PIM ₁ synthétique (SFPIM135), titrés à 1, 3 et 10 μg/mL.

La figure 5 représente l'inhibition de l'expression d'IL-6 par les macrophages primaires stimulés au LPS, avec ou sans IFNγ, en présence de l'isoPIMi-2Ci ₆ (SFPIM91 ), en comparaison avec les PIM naturels Ac2PIM ₆ et Ac2PIM ₆ , et le PIM ₁ synthétique (SFPIM135), à 10 μg/mL - La figure 6 représente l'inhibition de l'expression d'IL-12 p40 par les macrophages primaires stimulés avec le LPS en présence de l'isoPIMr 2C- _I6 (SFPIM91 ), en comparaison avec les PIM naturels Ac2PIM ₆ et Ac3PIM ₆ , et le PIM ₁ synthétique (SFPIM135), à 1 μg/mL.

La figure 7 représente l'inhibition de l'expression de KC par les macrophages stimulés avec le LPS en présence de PIM ₁ synthétique (SFPIM135) et de l'isoPIMi-2Ciβ (SFPIM91 ), à 10μg/mL.

La figure 8 représente l'inhibition par le PIMi synthétique (SFPIM135) et l'isoPIMi-2Ci ₆ (SFPIM91 ) de la réponse des voies respiratoires à une administration locale d'endotoxine. L'abbréviation « AUC » signifie la zone sous la courbe.

La figure 9 représente l'inhibition par le PIM ₁ synthétique (SFPIM 135) et l'isoPIMi-2Ci ₆ (SFPIM91 ) du recrutement de cellules inflammatoires, majoritairement des neutrophiles, dans l'espace bronchoalvéolaire en réponse à l'endotoxine. - La figure 10 représente l'inhibition par le PIM ₁ synthétique

(SFPIM135) et l'isoPIMi-2Ci _β (SFPIM91 ) de la sécrétion de chimiokine KC, _ qui participe au recrutement des .neutrophiles, dans le .lavage bronchoalvéolaire en réponse à l'endotoxine.

La figure 11 représente l'inhibition par le PIMi synthétique (SFPIM135) et l'isoPIMi-2Ciβ (SFPIM91 ) de la sécrétion de TNF dans le lavage broncho-alvéolaire en réponse à l'endotoxine.

La figure 12 représente l'inhibition de l'expression de TNF par les macrophages primaires stimulés avec le LPS en présence de la forme « isomère » de PIMi isoPIMi-Ci ₆ Ci ₈ (SFPIM219), titré à 1 , 3 et 10μg/mL.

La figure 13 représente l'absence de cytotoxicité de PisoPIMr 5 Ci ₆ Ci8 (SFPIM219), titré à 1 , 3 et 10μg/mL

La figure 14 représente l'inhibition de l'expression d'IL-12 p40 par les macrophages primaires stimulés avec le LPS en présence de la forme « isomère » de PIMi isoPIMi-Ci ₆ Ci ₈ (SFPIM219), titré à 1 , 3 et 10μg/mL. 0 - La figure 15 représente l'inhibition de l'expression de TNF par les macrophages primaires stimulés avec le LPS en présence de PIMi synthétique (SFPIM145), l'isoPIMi-CiβCi ₈ (PIM219), et les composés PIM- 2-mimNCOCF3 (SFPIM324 t2) et PIM-2-mimNH (SFPIM324 t8), titrés à 1 , 3, 10 et 30μg/mL 5 - La figure 16 représente la viabilité des macrophages primaires stimulés avec le LPS en présence de PIMi synthétique (SFPIM 145), risoPIMi-Ci ₆ C-i8 (PIM219), et les composés PIM-2-mimNCOCF3 (SFPIM324 t2) et PIM-2-mimNH (SFPIM324 t8), titrés à 1 , 3, 10 et 30μg/mL. 0 - La figure 17 représente l'inhibition de l'expression d'IL-12 p40 par les macrophages primaires stimulés avec le LPS en présence de PIMi synthétique (SFPIM145), IïSOPIMI-CI ₆ CI ₈ (PI M219), et les composés PIM- 2-mimNCOCF3 (SFPIM324 t2) et PIM-2-mimNH (SFPIM324 tβ), titrés à 1 , 3, 10 et 30 μg/mL. 5

EXEMPLES

- - Solvants- et réactifs- — - — — - -

Le dichlorméthane (CH ₂ CI ₂ ) et le toluène sont distillés, sous atmosphère d'argon, sur CaH ₂ , le tétrahydrofurane (THF) est distillé, sous0 atmosphère d'argon, sur sodium et benzophénone. Le diéthyl éher est distillé, sous atmosphère d'argon, sur CaH ₂ et conservé à 0-4 ⁰ C sous

argon sur Tamis moléculaire 4â. Les autres solvants utilisés proviennent du fournisseur Carlo-Erba.

Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) Les spectres ¹ H et ¹³ C sont effectués sur un appareil Bruker DPX250 ou sur un appareil Bruker AV400. Les déplacements chimiques (δ) des spectres RMN ¹ H sont calibrés selon le témoin tétraméthylsilane (TMS) ayant pour valeur de δ 0.00 ppm. Les δ des spectres de RMN ¹³ C sont calibrés sur la valeur de référence du solvant tel que décrit dans l'article Gottlieb et al, J. Org. Chem., 1997, 62, 7512. Les spectres RMN ³¹ P sont réalisés sur un appreil Bruker AV400 et sont calibrés selon une référence externe contenant 80% d'acide phosphorique (H ₃ PO ₄ ) (δ = 0.00 ppm). Les spectres ¹⁹ F sont enregistrés sur un appareil Bruker AV400 équippé d'une sonde multinoyaux automatique et sont calibrés selon une référence externe contenant du BF ₃ étherate (δ = 0.00 ppm). Les mesures sont effectuées à 25°C dans des tubes de 5 mm de diamètre. Le spectres sont effectués dans des solvants deutérés provenant des fournisseur Aldrich ou SDS.

Chromatoαraphie Les chromatographies sur couche mince (CCM) sont réalisées sur des plaques d'aluminium « TLC Silica gel 6OF254 » de Merck . Les composés sont révèles sous lampe UV ou/et sont trempés dans le révélateur à l'acide phosphomolybdique dans l'acide sulfurique et l'éthanol suivi d'un chauffage avec un décapeur thermique. Les colonnes chromatographiques sont réalisées avec un gel de silice (Silica gel 60 (40-63 μm) de Merck.

Soectrométrie de masse

Masse ESI : Les échantillons sont analysés sur un spectromètre Perkin Elmer Sciex API 300 dans des solvant de qualité « pour Analyse ».

Masse haute résolution : les échantillons sont analysés au centre de mesures physique de l'université Biaise Pascal à Aubière.

EXEMPLE 1 :

1) Synthèse de l'iso PIMi- 2C^ (SFPIM91):

Diméthyl acétal du L-camphre (composé 2, figure 2a)

SFPIM-97 Préparation selon Lindberg ét al. Tetrahedron, 2002, 58, 1387-1398

[24]. De l'acide sulfurique (H ₂ SO ₄ ) (194 μl_) est ajouté à une solution de L- camphre commercial (>95%, Fluka) (20 g, 0.131 mol) dans un mélange de triméthyl orthoformate (95 mL, 0.908 mol, 6.9 éq) et de méthanol (20 mL). Après 48h d'agitation, le mélange est neutralisé par ajout de méthoxyde de sodium (NaOMe) (400 mg) et les solvants sont évaporés. Le résidu est collecté par distillation sous un vide (25 mbar) à 125 ⁰ C pour donner le composé 2 (21 g, 81 %) sous forme d'un liquide incolore. Spectre de ¹ H- RMN conforme.

1 ,2-O-(L-1 ,7,7-triméthylbicyclo[2,2,1]hept-6-ylidène)-D-myo-inosîto l (composé 3, figure 2a)

SF P I M- 10

Préparation selon Lindberg ét al. Tetrahedron, 2002, 58, 1387-1398 [24]. De l'acide sulfurique H ₂ SO ₄ (173 μL) est ajouté à une solution de composé 2 (8.06 g, 0.041 mol, 2.4 éq) et de myo-inositol commercial >99% (Aldrich) (3.1 g, 0.017 mol) dans du diméthylsulfoxide (DMSO) (34 mL). Le mélange résultant est agité 3h à 75°C, puis neutralisé par addition de Et ₃ N (1 mL) et concentré sous vide à 8O ⁰ C. Au résidu sont ajoutés du DMSO (3 mL), du chloroforme (CHCI ₃ ) (52 mL), du méthanol (MeOH) (3.2 mL), de l'eau (H ₂ O) (1 mL), et de l'acide p-toluène sulfonique (APTS) (11.6 mg). Le

mélange réactionnel est agité 18h puis neutralisé par addition de Et ₃ N (0.4 mL). Le précipité ainsi formé est filtré sur verre fritte et lavé avec du CHCI3 (2 x 40 mL). Le produit brut est recristallisé dans du méthanol (MeOH) (contenant 0.1% NEt ₃ ) pour donner le composé 3 (1.738 g, 32%) sous forme d'un solide blanc. Spectre de ¹ H-RMN conforme.

S.^δ.β-Tétra-O-benzyl-i^-O-tL-IJJ-triméthylbicyclop.a .ilhept-e- ylidène)-D-/rjyo-inositol (composé 4, figure 2a)

SFPIM-72 De l'hydrure de sodium (NaH) (1.16 g, 0.048 mol, 12 eq, 60% en dispersion dans l'huile minérale) est ajouté, sous atmosphère d'argon, à une solution précédemment refroidie à 0 ⁰ C de composé 3 (1.266 g, 4.02 mmol) dans du DMF anhydre (30 ml). Après 15 min d'agitation à 0 ⁰ C, du bromure de benzyle (2.9 mL, 0.024 mmol, 6 éq) est ajouté goutte à goutte, puis le mélange réactionnel est agité 24h à température ambiante (environ 20°C). Il est ensuite refroidit à 0 ⁰ C, puis l'excès de NaH est détruit par addition de MeOH (3 mL) et le milieu est dilué avec du toluène (250 mL). La phase organique est lavée avec de l'eau (100 mL), puis avec une solution de NaCI saturée (3 x 100 mL), puis séchée sur MgSO ₄ . Les solvants sont évaporés et une purification par colonne chromatogaphique sur gel de silice (Hexane/éther diéthylique 8/1) conduit au composé 4 (2.15 g, 80%) sous forme d'un sirop incolore. C ₄₄ H ₅₀ O ₆ (M = 674.89 g/mol). RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ) δ 0.86 (s, 3H, CH ₃ ), 0.87 (s, 3H, CH ₃ ), 1.09 (s, 3H, CH ₃ ), 1.22-1.33 (m, 3H) ₁ 1.34-1.45 (b, 1 H), 1.47 (s, 0.5H), 1.50 (s, 0.5H), 1.68-1.76 (m, 2H), 1.9-2.02 (m, 2H), 3.44 (dd, 1 H, H5, J _5-6 = 8.2 Hz, J _4-5 = 9.6 Hz), 3J4 (dd, _. 1 H, H4, J _4-3 = 7.2 Hz), 3.77 (t, 1 H, H1 , Ji _-2 = 4.2, Hz), 3.84 (dd, 1 H, H6, J _1-6 = 8.4Hz), 3.96 (dd, 1 H, H3, J _2-3 = 6.2 Hz), 3.44 (dd, 1 H, H5, J _5-6 = 8.2 Hz, J _4-5 = 9.6 Hz), 4.30 (dd, 1 H, H2), 7.20-7.45 (m, 2OH, 4Ph).

RMN ¹³ C (100 MHz, CDCI ₃ ) δ 10.27 (CH ₃ ), 20.52 (CH ₃ ), 20.75 (CH ₃ ), 27.76 (CH ₂ ), 29.89 (CH ₂ ), 45.08 (CH ₂ ), 45.31 (CH), 48.08 (Cq), 51.67 (Cq), 72.55 (CH ₂ , CH ₂ Ph), 73.19 (CH, CZ), 74.00 (CH ₂ , CH ₂ Ph), 75.08(CH ₂ , CH ₂ Ph), 75.25 (CH ₂ , CH ₂ Ph), 76.32 (CH, C3), 77.50 (CH, C1 ), 80.86 (CH, C6), 82.22 (CH, C5), 83.31 (CH, C4), 117.77 (Cq), 127.55-128.44 (CH, Ph), 138.55-138.89 (Cq, Ph, 4 lines).

SM-IS: M calculée 674.36; trouvée: 675.5 [M+H] ⁺ , 692.5 [M+NH ₄ ] ⁺ , 697.5 [M+Na] ⁺ , 713.5 [M+K] ⁺ .

3,4,5,6-Tétra-O-benzyl-D-myo-inositol (composé 5, figure 2a)

SFPIM-17

Le composé 4 (1.53 g, 2.26 mmol) est mis en suspension dans une solution aqueuse d'acide acétique à 80% (75 mL) et le milieu est agité à

100 ⁰ C pendant 4h. Les solvants sont évaporés sous vide puis coévaporés avec du toluène. Le résidu est purifié par colonne chromatogaphique sur gel de silice (toluène/acétone 35/1 avec un gradient jusqu'à 10/1 ) pour conduire au composé 5 (1.029 g, 84%) sous forme d'un solide blanc.

C ₃₄ H ₃ 6θ ₆ (M = 540.66 g/mol).

RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ) δ 2.53 (d, 1 H, OH-1 , J _1-OH = 4.8 Hz), 2.64 (s, 1 H, OH-2), 3.42-3.51 (m, 3H, H3, H1 , H5), 3.83 (dd, 1 H, H6, J _6-5 = 9.6 Hz,

J _1-6 = 9.6 Hz), 3.97 (dd, 1 H, H4, J _3-4 = 9.6 Hz, J _4-5 = 9.6 Hz), 4.17 (dd, 1 H,

H2, J _2-3 = 2.8 Hz, J _2-1 = 2.8 Hz), 4.65-4.96 (m, 8H, 4 CH ₂ Ph), 7.25-7.4 (m,

20 H, 4x5 CH _Ar ).

RMN ¹³ C (100 MHz, CDCI ₃ ) δ 69.33 (CH, C2), 71.87 (CH, C1 ), 72.84 (CH ₂ , CH ₂ Ph), 75.71 (CH ₂ , CH ₂ Ph), 75.82 (CH ₂ , CH ₂ Ph), 76.07 (CH ₂ ,

CH ₂ Ph), 80.11 (CH, C3), 81.45 (CH, C6), 81.74 (CH, C4), 83.33 (CH, C5), 127.73-128.67- (CH, Ph,- a lines), 137.89 (Cq, Ph), 138.62 (2Cq, Ph),

138.73 (Cq ₁ Ph).

MS-IS : M calculée 540.25; trouvée : 541.5 [M+H] ⁺ , 558.5 [M+NH ₄ ] ⁺ , 563.5 [M+Na] ⁺ , 579.5 [M+K] ⁺ .

3,4,5,6-Tétra-O-benzyM-O-p-méthoxybenzyl-D-myo-inositoI (composé 6, figure 2a)

SFPIM104

Une suspension de composé 5 (301 mg, 0.557 mmol) et d'oxyde de dibutylétain (139 mg, 0.557 mmol, 1 éq) dans du toluène (5 ml_) est chauffée 18h à 140 ⁰ C sous argon en utilisant un piège de Dean-Stark pour capter l'eau formée. Le milieu est concentré sous vide et le résidu est dissout dans du DMF anhydre contenant du fluorure de césium (CsF) (172 mg, 1.11 mmol) et du chlorure de 4-méthoxybenzyle (76 μl_, 0.557 mmol, 1 éq). La réaction est agitée 7h30 et les solvants sont ensuite évaporés à sec pour laisser un résidu solide blanc qui est partiellement dissout dans de l'acétate d'éthyle (20 mL). Le solide résiduel est retiré par filtration sur verre fritte et le filtrat est évaporé à sec. Le résidu est purifié par colonne chromatogaphique sur gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 7/3) pour conduire au composé 6 (262 mg, 71 %) sous forme d'un solide blanc. C ₄₂ H ₄₄ O ₇ (M = 660.81 g/mol).

RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ) δ 2.43 (s, 1 H, OH), 3.27 et 3.28 (2 dd, 2H, H1 et H3, J _1-6 = J _3-4 = 9.6 Hz, J _1-2 = J _2-3 = 2.8 Hz), 3.36 (dd, 1 H, H5 , J _5-6 = J ₅ -A = 9.2 Hz), 3.69 (s, 3H ₁ CH ₃ ), 3.89 et 3.91 (2 dd, 2H, H4 et H6), 4.09 (dd, 1 H, H2, J _2-3 = J _2-1 = 2.8Hz), 4.53 (s, 2H, CH ₂ Ph), 4.61 (s, 2H, CH ₂ Ph), 4.72- 4.83 (m, 63H, 3 x CH ₂ Ph), 6.74 et 6.76 (2s, 2H, CH _Ar PMB), 7.1-7.3 (m, 23H, CH _Ar ).

RMN ¹³ C (100 MHz, CDCI ₃ ) δ 55.33 (CH ₃ ), 67.59 (CH, C2), 72.44 (CH ₂ ), 72.76 (CH ₂ ), 75.95 (CH ₂ ), 75.98 (2xCH ₂ ), 79.55 et 79.86 (2 CH, C1 et C3), 81.27 et 81.29 (2 CH, C4 et C6), 83.26 (CH, C5), 127.61-129.59 (CH _Ar , 8 unes), 130.10 (Cq), 138.05 (Cq), 138.77 (Cq), 138.83 (Cq), 138.88 (Cq), -_159L-42-(Cq). —

3,4,5,6-Tétra-O-benzyl-1-O-(2,3,4,6-tétra-acetyI-α-D-m annopyranosyl)- D-myo-inositol (composé 7, figure 2a)

SFPIM63

Une solution du compose 6 (457 mg, 0.69 mmol, 1 éq) dans du CH ₂ CI ₂ (10 ml_) est cannulée sous argon sur une solution du composé 1 (845 mg, 2.08 mmol, 3 éq) dans du CH ₂ CI ₂ (10 mL). Le mélange réactionnel est agité en présence de tamis moléculaire 4â pendant 20 min, puis est refroidit à -20 ⁰ C. Le triflate d'argent est ajouté (1.066 g, 4.15 mmol, 6 éq) et le milieu réactionnel est agité en laissant remonter la température à 20 ⁰ C pendant 1 h. La réaction est neutralisée par addition de triethylamine (1 mL), puis diluée avec CH ₂ CI ₂ . La phase organique est lavée avec une solution saturée de NaHCO ₃ (30 mL) puis de NaCI (30 mL) et est séchée sur MgSO ₄ . Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est purifié par colonne chromatogaphique sur gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 3/1 ) pour conduire au composé 7 (309 mg, 21%). C ₄₈ H ₅₄ Oi ₅ (M = 870.96 g/mol). RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ) δ 7.38-7.20 (m, 2OH, CH _Ar ), 5.43 (dd, 1 H, H3', J ₃ L ₂ - = 2.6Hz, J ₃ ^. = 10 Hz), 5.34 (dd, 1 H, H2', J ₂ ^ = 1 Hz), 5.27 (dd, 1 H ₁ H4\ J ₄ ^ _-5 . = 10 Hz), 5.07 (d, 1 H, HT, Ji _-2 ' = 1 Hz), 4.86 (s, 4H, 2 CH ₂ Ph), 4.85, (d, 1 H, CH ₂ Ph, J = 10.8 Hz), 4.80 (d, 1H, CH ₂ Ph, J = 10.8 Hz), 4.75 (d, 1 H, CH ₂ Ph, J = 11.2Hz), 4.68 (d, 1 H, CH ₂ Ph, J = 11.2 Hz), 4.29 (m, 3H, H2, H5', H6A'), 4.03 (m, 2H, H6B\ H4 or H6), 3.95 (dd, 1 H, J _5-4 = J _5-6 = 9.6 Hz), 3.54 (dd, 1 H, H1 or H3, J = 2.8 et 10 Hz), 3.45 (dd, 1 H, H4 or H6), 3.43 (dd, 1 H, H3 or H1 ), 2.08 (s, 3H, CH ₃ Ac), 2.06 (s, 3H, CH ₃ Ac), 2.03 (s, 3H, CH ₃ Ac), 2.00 (s, 3H, CH ₃ Ac).

RMN ¹³ C (100 MHz, CDCI ₃ ) δ 170.74, 169.94, 169.91 , 169.72, 138.68, 138.64, 138.33, 137.87, 128.65-127.75, 99.85 (CT), 83.12, 81.27, 81.07, 80.42, 80.13, 76.28, 76.07, 76.01 , 73.15, 69.64 (C2 ¹ ), 69.54 (C5 ¹ ), 69.20 (C3 ¹ ), 68.92 (C2), 66.65 (C4 ¹ ), 63.16 (C6 ¹ ), 20.86, 20.78. MS-IS : M calculée..870.35; trouvée 888.5 [M+NH ₄ ] ⁺ , 893.5 [M+Na]!,_909.0 [M+K] ⁺ .

3-O-Benzyl-1,2-O-dipaIm»toyl-s/7-glycérol (composé, 8 figure 2a)

SFPIM77

Le chlorhydrate de [(dimethylamino)propyl]carbodiimide (EDCI) (847 mg, 4.42 mmol, 3 éq) et la DMAP (54 mg, 0.44 mmol, 0.3 éq) sont ajoutés, sous atmosphère d'argon, à une solution de 3-O-benzyl-sn-glycerol (268 mg, 1.47 mmol, 1 éq) et d'acide palmitique (943 mg, 3.68 mmol, 2.5 éq) dans du CH ₂ CI ₂ anhydre (20 ml_). Le mélange réactionnel est agité 18h à température ambiante (environ 2O ⁰ C) puis dilué avec du CH ₂ CI ₂ (100 mL). La phase organique est lavée avec une solution d'HCI 1 N (50 mL), de l'eau (50 mL), puis une solution de NaCI saturée (50 mL) et séchée sur MgSO ₄ . Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est purifié par colonne chromatogaphique sur gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 6/1 ) pour conduire au composé 8 (909 mg, 93%) sous forme d'un solide blanc. C ₄₂ H ₇₄ O ₅ (M = 659.06 g/mol). RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ) δ 0.88 (t, 3H, CH ₃ ), 1.25 (b, 48H, 24 CH ₂ ), 1.59 (b, 4H ₁ 2x2H3"), 2.28 (t, 2H, J=7.5Hz), 2.32 (t, 2H, J=7.5Hz), 3.59 (d, 2H ₁ 2H3a), 4.19 (dd, 1 H, H1a _A , JiaA-iaB = 12Hz, J _1A-2a = 6.4Hz), 4.35 (dd, 1 H, H1a _B , Jia _B - _2a = 3.6Hz), 4.53 (AB, 2H, CH ₂ Ph, J = 12.2Hz), 5.24 (m, 1 H, H2a), 7.32 (m, 5H, CH _Ar ). MS-IS : M calculée 658.55; trouvée : 660.0 [M+H] ⁺ , 677.0 [M+NH ₄ ] ⁺ , 682.0 [M+Na] ⁺ .

1,2-O-Dipalmitoyl-sn-glycérol (composé 9, figure 2a)

SFPIM82

Le composé 8 (890 mg, 1.35 mmol) est dissous dans un mélange CH ₂ CI ₂ /Et0H (1/1.5, 25 mL). Un large excès de palladium sur charbon

(Pd/C 10%) est ajouté et la réaction est agitée 4h à température ambiante (environ 20 ⁰ C) sous pression atjnpsphéπque _d'hydrpgène (ballon de baudruche). Le mélange réactionnel est chauffé à 40°C pour une meilleure dissolution du produit attendu puis le catalyseur est retiré par filtration sur membrane millipore. Le solide est rincé 3 fois avec 20 mL de mélange

CH ₂ CI ₂ /Et0H (1/1 ) précédemment chauffé à 40°C. Les solvants résiduels

sont évaporés sous vide pour conduire au composé attendu 9 (757 mg, 99%) sous forme de solide blanc. C ₃₅ H ₆₈ O ₅ (M = 568.93 g/mol).

RMN ¹ H (250 MHz, CDCI ₃ ) δ 0.88 (t, 6H, 2 CH ₃ , J = 6.8 Hz), 1.26 (m, 48H, 24 CH ₂ ), 1.62 (m, 4H, 2H3"), 1.99 (t, 1 H, OH, J = 6.5 Hz), 2.32 (t, 2H, J = 7.7Hz), 2.35 (t, 2H, J = 7.5Hz), 3.73 (dd, 2H, 2H3a, J = 5 et 6.2 Hz), 4.23 (dd, 1 H, H1a _A , JiaA-iaB = 12 Hz, Ji _A -2a = 5.5 Hz), 4.35 (dd, 1 H, H1a _B , Ji _aB - _2a = 4.5Hz), 5.08 (m, 1 H, H2a).

MS -IS : M calculée, 568.51 ; trouvée : 570.0 [M+H] ⁺ , 587.0 [M+NH ₄ ] ⁺ , 592.0 [M+Na] ⁺ .

(S)-2,3-Dipalmitoyloxypropyl benzyl (N,N-diisopropylamino)phos- phoramidite (composé 11, figure 2a)

SFPIM83 Le composé 9 (200 mg, 0.352 mmol), précédemment séché 18h sous vide sur P ₂ O ₅ , est dissout dans du CH ₂ CI ₂ anhydre (15 ml_) et une solution de bis(λ/,λ/-diisopropylamino)benzyloxyphosphine (0.84M, 938 μl_, 0.788 mmol, 2.24 éq) (composé 10) y est ajoutée. Le mélange réactionnel est refroidi à 0 ⁰ C et du 1 H-tétrazoIe solide (32 mg, 0.458 mmol, 1.3 éq) est ajouté. Après 1 h30 d'agitation, le solvant est évaporé sous vide et le résidu est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 9/1 contenant 3% de Et ₃ N) pour conduire au composé 11 (259 mg, 92%) sous forme d'un sirop incolore. C ₄₈ H ₈₈ NO ₆ P (M = 806.21 g/mol). RMN ¹ H (250 MHz, CDCI ₃ ) δ 0.88 (app t, 6H ₁ 2CH ₃ ), 1.16-1.30 (m, 6OH,

24 CH ₂ , 4xCH ₃ isopropyl), 1.60 (m, 4H, 2CH ₂ ), 2.29 (t, 4H, 2CH ₂ , J = 7.5 Hz), 3.55.-3.85. (m, 4H, 2CH isopropyl, 2H3a), 4.17 (ddd, 1 H, H1a _B , JiaB-iaA

= 12 HZ, JiaB-2a = 6.3Hz, J _1aB -P = 3Hz), 4.34 (ddd, 1 H, H1a _A , J-|aA-2a = JIaA-P =

4.5Hz), 4.71 (m, 2H, CH ₂ Ph), 5.19 (m, 1 H, H2a), 7.2-7.4 (m, 5H, 5CH _Ar ).

3,4,5,6-Tétra-O-benzyl-1-O-(2,3,4,6-tétra-O-acetyl-α-D -mannopyra- nosyl)-2-O-[((S)-2,3-dipalmitoyloxypropyl)(benzyl)phosphoryl ]-D-myo- inositol (composé 12, figure 2a)

SFPIM87 Le composé 11 (259 mg, 0.321 mmol, 2.8 éq) et le composé 7 (100 mg, 0.115 mmol) sont coévaporés ensemble avec du toluène anhydre (2 x 10 ml_) puis séchés 30 min sous vide poussé avant d'être dissous, sous atmosphère d'argon, dans du CH ₂ CI ₂ anhydre (12 mL). Du 1 H-tétrazole solide (26 mg, 0.368 mmol, 3.2 éq) est ajouté à 0 ⁰ C puis après 1h30 d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est refroidi à - 40 ⁰ C. Une solution d'acide m-chloroperbenzoique (m-CPBA) (50%, 79 mg, 0.230 mmol, 2 éq) dans du CH ₂ CI ₂ (5 mL) est ajouté goutte à goutte. Après 2h d'agitation en laissant remonter le milieu réactionnel à température ambiante (environ 20 ⁰ C), la réaction est stoppée par addition d'une solution aqueuse à 10% de Na ₂ S ₂ C> ₃ (65 mL) et le mélange est extrait avec du diéthyl éther (Et ₂ O) (130 mL). La phase organique est lavée avec une solution aqueuse à 5% de NaHCθ3 (3 x 65 mL) puis séchée sur MgSO ₄ . Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est purifié par colonne chromatogaphique sur gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 4/1) pour donner une fraction du premier P-stéréoisomère du composé 12 (42 mg), une fraction de mélange d'isomères (23 mg) et une fraction du deuxième isomère du composé 12 (38 mg) (rendement global 56%). C ₉₀ H ₁₂₇ O ₂₂ P (M = 1591.88 g/mol). RMN ¹³ C (100 MHz, CDCI ₃ ) δ 173.36, 172.97, 170.72, 170.15, 169.89, 169.53, 138.36, 138.33, 137.90, 137.30, 136.00 (d), 135.67 (d), 128.82-

172.08, 83.22, 81.12, 80.89, 78.75 (d), 76.11, 76.07, 76.01 , 75.91 , 72.99, 69.90_ 69.a2,_69.39,_69.33_6aJ6L_67.45, 67.39, 65.91 , 65.43, 62.89,

62.28, 34.33, 34.16, 32.06, 29.84, 29.79, 29.65, 29.50, 29.46, 29.28, 29.27, 24.98, 22.82, 20.96, 20.83, 20.74, 14.25.

3,4,5,6-Tétra-O-benzyl-1-O-α-D-mannopyranosyl-2-O-[((S) -2,3- dipalmitoyloxypropyl)(benzyl)phosphoryl]-D-myo-inositol (composé 13, figure 2a)

SFPIM90 Une solution d'hydroxide de sodium à 0.1 M fraîchement préparée (1 ml_, 0.1 mmol, 4 éq) est ajoutée à une solution de composé 12 (40 mg, 0.025 mmol) dans le tétrahydrofurane (THF) (3 mL). Le mélange réactionnel est agité 4h à température ambiante puis il est dilué avec du CH ₂ CI ₂ (10 mL). La phase organique est lavée avec H ₂ O puis séchée sur MgSO ₄ . Le solvant est évaporé pour conduire au composé attendu 13 (36 mg, 100%) Les spectres RMN du produit brut indiquent la présence d'environ 30% de produit encore acétylé.

1-O-α-D-mannopyranosyl-2-O-[((S)-2,3-dipaImitoyloxypropy l) phosphoryl]-D-myo-inositol (composé 14, figure 2a)

SFPIM91

Le composé 13 (36 mg, 0.025 mmol) obtenu ci-dessus est dissous dans un mélange de CHaCVEtOH/acide acétique (4/5/0.5 mL). Un large excès de palladium sur charbon (Pd/C 10%) est ajouté et la réaction est agitée 6h à température ambiante (environ 20°C) sous pression atmosphérique d'hydrogène (ballon de baudruche). Le catalyseur est retiré par filtration sur membrane millipore et rincé 3 fois avec 20 mL de mélange CH ₂ Cl ₂ /EtOH (1/1 ). Les solvants résiduels sont évaporés sous vide et coévaporés avec du toluène pour conduire au composé 14 (25 mg, 100%) sous forme de solide blanc.

2) Préparation des cultures primaires de macrophages :

Des cellules murines de moelle osseuse ont été obtenues à partir de fémurs de lignées de souris sauvages. Les cellules obtenues ont été cultivées (10 ⁶ /ml) pendant 7 jours dans un milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium) complémenté avec 20% de sérum de cheval et

30% de milieu cellulaire conditionné L929 [22]. Trois jours après renouvellement du milieu, la préparation cellulaire comprend une population homogène de macrophages.

3) Stimulation des macrophages de souris sauvages par le LPS en 5 présence et en l'absence d'isomère de PIM isoPIMi-2Ci _fi (SFPIM91)

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris sauvages ont été cultivés sur des plaques de culture 96 puits à raison de 10 ⁵ cellules par puits puis stimulés par du LPS (100 ng/ml, Escherichia. coli, sérotype O111 :B4, SIGMA) avec ou sans PIM analogue (1-10 μg/ml). Toutes les 10 préparations de PIM analogue lyophilisées utilisées sont solubilisées dans du DMSO et additionnées aux cultures à une concentration finale maximale non cytotoxique de 1 %.

Après une stimulation de 24 heures, les surnageants de culture ont été collectés et analysés pour leur contenu en cytokines TNF-α, IL-6, IL- 15 12p40 et KC par ELISA (DUOSET R&D) et pour leur contenu en nitrite par la réaction de Griess.

Les résultats montrent que la forme « isomère » de PIMi isoPIMr 2Ci ₆ (SFPIM91) inhibe fortement la synthèse de TNF-α induite chez les macrophages stimulés au LPS, en comparaison avec les PIM naturels

20 Ac2PIM ₆ et Ac2PIM ₆ , et le PIM ₁ synthétique (SFPIM135) (figure 3). Des résultats similaires ont été obtenus pour le NO. Un test de cytotoxicité MTT réalisé sur les mêmes macrophages en présence des différentes fractions de PIM a permis de montrer l'absence de cytotoxicité des différentes préparations pour les cellules (figure 4). L'expression de l'IL-6 par les

^" 25 macrophages stimulés au LPS en présence ou en absence d'Interféroή γ est aussi inhibée (figure 5). La sécrétion d'IL-12p40 en réponse au LPS est déjà fortement inhibée à des concentration de 1ug/mL de PIM ou d'isoPIM (figure 6). De même, la production de chimiokine KC, impliquée dans le recrutement des cellules inflammatoires comme les neutrophiles, est aussi

fortement réduite en présence de PIMi (SFPIM135) ou plus fortement d' isoPIMi-2Ciβ (SFPIM91) (figure 7).

Dans la mesure où des préparations de PIM2 et de PIMβ ont été identifiées initialement comme étant des stimulateurs de la sécrétion de TNF et d'IL-12p40 par des cultures primaires de macrophages, les préparations d'isomère de PIM ont été testées pour leur capacité à induire une réponse pro-inflammatoire à des concentrations jusqu'à 20 μg/ml. Les résultats obtenus n'ont montré aucune stimulation de la réponse inflammatoire (TNF-α et IL-12p40) des cultures primaires de macrophages induite par les préparations d'isomère de PIM.

4) Activité anti-inflammatoire in vivo des dérivés synthétiques de PIM

Modèle in vivo de détresse respiratoire Les souris C57BL/6 ont reçu le véhicule seul (saline avec 1.25%

DMSO) ou du LPS (1 μg par souris) d'Escherichia coli (serotype O111 :B4; Sigma, St Louis, MO, USA) en l'absence ou en présence de PIMi (SFPIM135) ou d'isoPIM ₁ -2Ci ₆ (SFPIM91 ) (50μg/souris), appliqués par instillation nasale dans un volume de 40 μL sous une anesthésie légère à la kétamine-xylasine.

La résistance des voies respiratoires a été évaluée par la plethysmographie non-invasive sur une période de 3 heures après l'application de LPS. Des souris vigiles ont été placées dans des chambres de plethysmographie (EMKA Technologies, Paris, France). L'augmentation de la pause respiratoire (Penh) en tant que mesure d'inconfort respiratoire a été. enregistrée_et analysée- en. utilisant le logiciel- "Datanalyst Software

(EMKA Technologies, Paris, France) et exprimée en moyenne ± SEM de Penh de n=2-3 souris individuelles par groupe [23].

Lavage bronchoalvéolaire (BAL)

Le fluide BAL est collecté en canulant la trachée et en lavant les poumons quatre fois avec 0.5 mL de PBS froid. Après centrifugation à 400 x g pendant 10 min à 4°C, le surnageant du premier lavage est conservé à -70 ⁰ C pour l'analyse des cytokines. Des pools de culots cellulaires sont comptés au bleu Trypan (Sigma) dans une cellule haematocytométrique. Pour le comptage différentiel, les cellules sont marquées avec Diff-Quik Staining (Merz & Dade AG., Dudingen, Switzerland). Deux fois cent cellules sont comptées.

Détermination des cvtokines

Les concentrations de TNF et de KC ont été évaluées par enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) conformément aux instructions du fabricant (R&D Duoset, Minneapolis, MO).

Résultats

Le TNF est essentiel pour le dysfonctionnement respiratoire aigu induit par le LPS comme cela a été montré chez les souris déficientes en TNF [23]. Afin de déterminer leur activité potentielle in vivo, le PIMi (SFPIM135) et l'isoPIMi-2Ciβ (SFPIM91 ) ont été testés pour leur activité inhibitrice dans un modèle murin d'inflammation pulmonaire aiguë et de détresse respiratoire induites par l'application intranasale de LPS (1 μg/souris).

Les souris C57BL/6 ont reçu une application par voie intranasale de 1 μg de LPS et Penh a été enregistré pour 200 minutes utilisant la plethysmographie non-invasive. Le graphique de la figure 11 représente l'aire sous la courbe (de 70 à 175 min). Les valeurs représentent la moyeϋne_+.SEIvlde_n=2-3- sourjs.par groupe...

Typiquement, les souris recevant une application intranasale de LPS développent une augmentation aiguë de Penh (accroissement de la pause repiratoire ou enhanced respiratory pause), mesure du dysfonctionnement respiratoire, débutant 90 minutes après l'application de LPS (figure 8).

L'addition de PIMi (SFPIM135) cause une réduction partielle dans l'accroissement de Penh induit par le LPS. Cette inhibition est encore plus prononcée après l'addition de l'isoPIM _r 2Ci ₆ (SFPIM91 ) (figure 8).

Le LPS provoque un recrutement des cellules inflammatoires dans les voies respiratoires, mesuré en nombre total de cellules dans le fluide bronchoalvéolaire (BAL) des souris traitées par le LPS. Ici, le nombre de cellules inflammatoire détecté dans le BAL 18 heures après l'application de LPS, est partiellement réduit en présence d'isoPIMi-2Ci ₆ (SFPIM91 ), et moins en présence de Pl Mi (SFPIM 135) (figure 9). Les neutrophiles constituent la plupart des cellules inflammatoires recrutées après exposition au LPS . Les macrophages sont essentiellement inchangés. Dans cette première expérience une réduction du nombre des neutrophiles jusqu'à 50 ou 70 % est observée dans 2 souris sur 3 ayant reçu le PIMi (SFPIM135) ou l'isoPIM-ι-2C ₁₆ (SFPIM91 ), respectivement. Le recrutement des neutrophile dépend de différents facteurs dont la chimiokine KC, même s'il n'est pas dépendant de manière critique du TNF [23]. Dans la figure 10, les souris traitées sont sacrifiées 24 heures après l'application intranasale de 1 μg de LPS et le fluide bronchoalvéolaire est analysé pour déterminer le contenu en chimiokine KC. La sécrétion de KC dans l'espace broncho-alvéolaire est fortement diminuée par la co- administration de PIMi (SFPIM135) ou d'isoPIM _r 2Ci ₆ (SFPIM91 ) (figure 10). De même, le relargage de TNF dans l'espace broncho-alvéolaire est diminuée par la co-administration de PIMi (SFPIM135) ou plus fortement par l'isoPIMi-2C-i6 (SFPIM91 ) (figure 11). Les valeurs représentent la moyenne + SEM de n=3 souris par groupe, d'une expérience représentative de 3 expériences indépendantes.

Des expériences complémentaires indiquent que l'isoPIMi-2Ci ₆ (SFPIM91 ) cause une diminution d'expression de plusieurs autres cytokines et chimiokines inflammatoires dans les poumons exposés aux endotoxines.

Dans ces expérience l'isoPIMi-2Ci ₆ (SFPIM91 ) cause une inhibition marquée de l'inflammation pulmonaire et de la résistance des voies respiratoires en réponse aux endotoxines locales.

EXEMPLE 2 :

1) Synthèse du composé 25 (ISoPIMI-C ₁₆ CIa) (Figure 2b)

Per-O-méthoxyacétyl-D-mannopyranose (composé 15, figure 2b)

SFPIM-93 Le chlorure de méthoxyacétyle (660 μl, 7.22 mmol, 6.5 éq) est ajouté goutte à goutte à une solution de D-Mannose (200 mg, 1.11 mmol) dans de la pyridine (6 ml) à température ambiante (environ 20 ⁰ C) et le mélange est agité 18h. Les solvants sont évaporés et le résidu est dilué dans de l'acétate d'éthyle (30 mL). La solution est ensuite lavée avec une solution aqueuse de HCI 1 N (10 mL), puis une solution de NaCI saturée (10 mL) et séchée sur sulfate de magnésium (MgSO ₄ ). Les solvants sont évaporés et une purification par colonne chromatographique sur gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 2/1 puis 1/1) conduit au composé 15 pur (518 mg, 86%) sous forme d'un sirop jaune. C ₂₁ H ₃₂ O- _I6 (M = 540.47 g/mol).

RMN ¹ H (250 MHz, CDCI ₃ ) δ 3.41 (s, 6H), 3.45 (s, 3H), 3.49 (s, 6H), 3.85- 4.26 (m, 14H), 5.25-5.53 (m, 3H), 6.21 (s, 1 H) ;

RMN ¹³ C (62.9 MHz, CDCI ₃ ) δ 59.34, 59.42, 59.50, 61.83, 65.50, 68.35, 68.82, 69.14, 69.26, 69.37, 70.44, 90.49, 167.61 , 169.08, 169.22, 169.33, 169.90.

MS IS : M calculée 540.17; trouvée : 558.5 [M+NH ₄ ] ⁺ 7 563.5 ^" [M+Na] ⁺ r 579.5 [M+K] ⁺ .

2,3,4,6-Tétra-O-méthoxyacétyl-D-mannopyranose (composé 16, figure 2b)

SFPIM-114

De l'acétate d'hydrazine (500 mg, 5.48 mml, 1.6 éq) est ajouté à une solution du composé 15 (1.850 g, 3.4 mmol) dans du diméthyl formamide (DMF) (15 ml_) précédemment refroidie à -20 ⁰ C. Après 1h d'agitation à - 20 ⁰ C, le mélange est dilué avec de l'acétate d'éthyle (150 ml_), puis lavé avec une solution de NaCI saturée (5 x 50 ml_), séché sur MgSO ₄ et concentré sous vide pour donner le composé 16 (1.331 g, 83%) sous forme d'un sirop jaune. C ₁₈ H ₂₈ O ₁₄ (M = 468.42 g/mol). RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ) δ 3.34 (s, 3H ₁ ), 3.35 (s, 3H), 3.39 (s, 3H), 3.41 (s, 3H)(4 OMe), 3.87 (AB, 2H, CH ₂ OMe), 3.95 (s, 2H ₁ CH ₂ OMe), 4.02 (s, 2H, CH ₂ OMe), 4.08 (AB, 2H, CH ₂ OMe), 4.2-4.35 (m, 3H, H5', H6'A, H6'B), 5.19 (d, 1 H, H1 ', J _1-2 = 1.8 Hz), 5.27 (t, 1 H, H4 ¹ , J _4-3 = 10 Hz), 5.3 (dd, 1 H, H2', J _2-3 = 3.2 Hz), 5.49 (dd, 1 H, H3'). RMN ¹³ C (100 MHz, CDCI ₃ ) ô 59.45 (CH ₃ ), 59.48 (CH ₃ ), 59.50 (CH ₃ ), 62.62 (C6 ¹ ), 66.53 (CH ₂ , C4'), 68.00 (CH, C5'), 69.29 (CH, C3'), 69.34 (CH ₂ ), 69.4 1(CH ₂ ), 69.49 (CH ₂ ), 69.52 (CH ₂ ), 70.50 (CH, C2'), 91.98 (CH, CV).

2,3,4,6-Tétra-O-méthoxyacetyl-1-O-trichloroacétimidoyl -α-D-manno- pyranose (composé 17, figure 2b)

SFPIM-125

Du trichloroacétonitrile (1.28 ml_, 12.80 mmol, 12 éq) est ajouté à un mélange de composé 16 (500 mg, 1.067 mmol) et de 1 ,8- diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène (DBU) (45 μl_, 0.299 mmol, 0.28 éq) dans du dichlorométhane (CH ₂ CI ₂ ) anhydre (10 mL) à température ambiante (20°C) sous une atmosphère d'argon. Après 10 min d'agitation, le mélange réactionnel est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice

(éther de pétrole/acétate d'éthyle 1/2 contenant 0.2% de triéthylamine (Et ₃ N)) et conduit ainsi au composé 17 (479 mg, 73%) sous forme d'un sirop jaune.

C ₂₀ H ₂₈ Oi ₄ NCI ₃ (M = 614.81 g/mol).

RMN ¹ H (250 MHz, CDCI ₃ ) δ 3.41 (s, 3H, CH ₃ ), 3.42 (s, 3H, CH ₃ ), 3.45 (s, 3H, CH ₃ ), 3.50 (s, 3H, CH ₃ ), 3.95 (dd, 2H, CH ₂ OMe), 4.03 (s, 2H, CH ₂ OMe), 4.08 (s, 2H, CH ₂ OMe), 4.19 (dd, 2H, CH ₂ OMe), 4.22-4.33 (m, 2H, H5',H6'A), 4.40 (dd, 1 H ₁ J = 5.3 et 13.3 Hz, H6'B), 5.45 (t, 1 H, J = 9.8 Hz, H4'), 5.55 (dd, 1 H, J = 5.2 et 10.0 Hz, H3'), 5.59 (dd, 1H, H2'), 6.32 (d, 1 H, J = 1.5 Hz, H1 '), 8.84 (s, 1 H, NH).

3,4,5,6-Tétra-O-benzyl-1-O-(2,3,4,6-tetra-méthoxyacetyl -α-D- mannopyranosyl)-D-myo-inositol (composé 18, figure 2b)

SFPIM-207

Le composé accepteur 6 (940 mg, 1.42 mmol, 1 éq) et le composé donneur 17 (1.16 g, 1.89 mmol, 1.3 éq) sont rassemblés dans un même ballon et sont placés sous vide, sur P ₂ Os pendant 18h. Le mélange est ensuite placé sous argon et du tamis 4â y est ajouté. Le ballon est laissé sous flux d'argon pendant 10 min, puis du CH ₂ CI ₂ anhydre (7 mL) est ajouté. Après 30 min supplémentaires d'agitation sous argon, le milieu réactionnel est refroidi à 0 ⁰ C et le TMSOTf (68 μL, 0.38 mmol) est ajouté goutte à goutte. Après 5 min d'agitation à O ⁰ C et 1h à température ambiante (environ 20 ⁰ C) sous atmosphère d'argon, le mélange réactionnel est refroidit à 0 ⁰ C et la réaction est stoppée par addition de Et ₃ N (1 ml). Le tamis est filtré sur verre fritte, les solvants sont évaporés sous vide et le résidu est purifié par colonne chromatogaphique sur gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 1/1) pour conduire au composé 18 (296 mg, 21 %). (On isole également une fraction de 350 mg du composé 18 en mélange avec l'isomère initialement attendu ayant perdu le PMB mais glycosylé en positfonr2 de l'inσsitσi): — — - — ^' — -

C ₅₂ H ₆₂ O ₁₉ (M = 991.06 g/mol).

RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ) δ 2.89 (m, 1 H, OH), 3.34 (s, 3H, CH ₃ ), 3.41 (s, 3H, CH ₃ ), 3.42 (s, 3H, CH ₃ ), 3.44 (s, 3H, CH ₃ ), 3.41-3.48 (m, 2H, 2CH _in s), 3.45 (dd, 1 H, CH _ins , J = 2.4, 6.0 Hz), 3.86-4.16 (m, 8H, 4CH ₂ OMe), 4.15

(dd, 1 H, H6'A, J ₆ Ά-5- = 2.4 J ₆ Ά-6Ή = 12 Hz), 4.29 (br s, 1 H, H2), 4.34 (dd, 1 H, H6'B, J ₆₈ -S = 4.8 Hz), 4.43 (ddd, 1 H, H5'), 4.65-4.91 (m, 8H, 4CH ₂ Ph), 5.07 (d, 1 H, M ¹ , àv-z = 2 Hz), 5.31 (t, 1 H, H4", J*. ₃ - = J ₄ ^ = 10.0 Hz), 5.41 (dd, 1 H, H2\ J ₂ --3' = 3.2 Hz), 5.56 (dd, 1 H, H3'), 7.15-7.4 (m, 2OH, 4x5CH _Ar ).

RMN ¹³ C (62.9 MHz, CDCI ₃ ) δ 59.42, 59.48, 59.52, 63.12 (C6 ¹ ), 66.65 (4 ¹ ), 68.83 (C5 ¹ ), 69.26 (C2), 69.38 (C3 ¹ ), 69.46 (2CH ₂ OMe), 69.49 (CH ₂ OMe), 69.74 (CH ₂ OMe), 69.87 (C2 ¹ ), 73.17 (CH ₂ Ph), 76.0(CH ₂ Ph), 76.03(CH ₂ Ph), 76.28(CH ₂ Ph), 80.27, 80.31 , 81.15, 81.53 et 83.12 (CHm ₈ ), 99.47 (C1 ¹ ), 127.69-128.62 (11 pics, CH _A r), 137.88, 138.26, 138.57, 138.63, 169.25 (CO) ₁ 169.31 (CO), 169.49 (CO), 169.86 (CO).

S-O-BenzyM-O-octadécanoyl-sn-glycerol (composé 19, figure 2b)

SFPIM1 La (diméthylamino)pyridine (DMAP) (5.6 mg, 0.05 mmol, 0.1 éq) puis le dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (190 mg, 0.92 mmol, 2 éq) sont ajoutés à une solution, précédemment refroidie à 0 ⁰ C, d'acide stéarique (130 mg, 0.46 mmol) et de 3-O-benzyI-sn-glycerol (100 mg, 0.55 mmol, 1.2 éq) dans du dichlorométhane anhydre (CH ₂ CI ₂ ) (5 ml_). Le mélange réactionnel est agité 1h à 0 ⁰ C puis 18h à température ambiante (environ 20 ⁰ C) puis est filtré sur cotton afin de retirer une partie de la dicyclohéxylurée formée. Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est purifié par colonne chromatogaphique sur gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 6/1 ) pour conduire au composé 19 (129 mg, 63%) sous forme d'un solide blanc.

C ₂₈ H ₄₈ O ₄ (M = 448.69 g/mol) RMN ¹ H (250 MHz, CDCI ₃ ) δ 0.88 (t, 3H, CH ₃ , J = 6.5 Hz), 1.25 (b, 28H,

14CH ₂ ), 1.60 (m, 2H, 2H3"), 2.31 (t, 2H, 2H2", J = 7.5 Hz), 2.64 (d, 1 H, OH, J = 3.5 Hz), 3.48 (dd, 1 H, H3a _A , J _3aA -3aB = 9.75Hz, J _3aA-2a = 6 Hz), 3.55 (dd, 1 H, H3a _B , J _3a B-2a = 4.5 Hz), 4.02 (m, 1 H, H2a), 4.12 (dd, 1 H, H1a _A , Ji _aA -2a ~

4.8 Hz), 4.19 (dd, 1 H, H1 a _B , JiaB-iaA = 11.5Hz, J _1aB -2a 5 Hz), 4.55 (s, 2H, CH ₂ Ph), 7.33 (m, 5H, CH _Ar ).

RMN ¹³ C (62.9 MHz, CDCi ₃ ) δ 14.22 (CH ₃ ), 22.19 (CH ₂ ), 25.00 (CH ₂ , C3"), 29.23, 29.36, 29.46, 29.66, 29.71 , 29.76, 29.80 (7 CH ₂ ), 32.02 (CH ₂ ), 34.24 (CH ₂ , C2"), 65.43 (CH ₂ , C1a), 68.80 (CH, C2a), 71.00 (CH ₂ , C3a), 73.58 (CH ₂ Ph), 127.82 (CH _Ar ), 127.94 (CH _Ar ), 128.54 (CH _A r), 137.77 (Cq _Ar ), 174.01 (Cq, C1").

MS-IS : calculée 448.36; trouvée : 449.5 [M+Hf, 466.5 [M+NH ₄ ] ⁺ , 471.5 [M+Na] ⁺ .

3-O-Benzyl-2-O-hexadecanoyl-1-O-octadécanoyl-sn-glycerol

(composé 20, figure 2b)

SFPIM34

Le chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-(dimethylamino)propylcarbodiimide (EDCI) (662 mg, 3.45 mmol, 2.5 éq) et la DMAP (34 mg, 0.28 mmol, 0.2 éq) sont ajoutés à une solution du composé 19 (620 mg, 1.38 mmol) et d'acide palmitique (708 mg, 2.76 mmol, 2 éq) dans du CH ₂ CI ₂ anhydre (25 ml_). Le mélange réactionnel est agité 18h à température ambiante (environ 20 ⁰ C) puis dilué avec CH ₂ CI ₂ (100 mL). La phase organique est lavée avec une solution d'HCI 1 N (40 mL), de l'eau (40 mL), puis une solution de NaCI saturée (40 mL) et séchée sur MgSO ₄ . Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est purifié par colonne chromatogaphique sur gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 25/1 puis 20/1) pour conduire au composé 20 (899 mg, 95%) sous forme d'un solide blanc. C ₄₄ H ₇₈ O ₅ (M = 687.11 g/mol)

RMN ¹ H (250 MHz, CDCI ₃ ) δ 0.88 (t, 3H, CH ₃ , J = 6.5 Hz), 1.26 (m, 52H, 26CH ₂ )_ 1.60_(m,âH_2ld3 ^I _f 2H3:)_2.27_ (t,.2H, J.=_7.5. Hz) et.2.31 (t_2H, J- .

= 7.5 Hz)(2H2' et 2H2"), 3.59 (d, 2H, 2H3a, J = 5 Hz), 4.19 (dd, 1 H, H1a _A , Jia _A -iaB = 11.75 Hz, J _1A-2a = 6.3 Hz), 4.35 (dd, 1 H, H1a _B , Ji _aB - ₂ a = 3.8 Hz), 4.53 (AB, 2H, CH ₂ Ph, J = 12.2Hz), 5.24 (quint, 1 H, H2a), 7.32 (m, 5H, CH _Ar ).

RMN (100 MHz, CDCI ₃ ) δ 14.23 (CH ₃ ), 22.82 (CH ₂ ), 25.01 et 25.08 (2CH ₂ , C3', C3"), 29.22-29.83 (CH ₂ , 8 lines), 32.06 (CH ₂ ), 34.23 et 34.44 (2CH ₂ ), 62.16 (CH2, C1a), 68.38 (CH ₂ , C3a), 70.12 (CH, C2a), 73.42 (CH ₂ Ph), 127.72 (CHAγ), 127.87 (CH _Ar ), 128.51 (CH _Ar ), 137.83 (CqAr), 173.16 (Cq, CO), 173.45 (Cq, CO).

SM-IS M calculée : 686.58; trouvée : 687.5 [M+H]\ 704.5 [M+NH ₄ ] ⁺ , 709.5 [M+Na] ⁺ .

2-O-Hexadecanoyl-1-O-octadécanoyl-sn-glycerol (composé 21, figure 2b)

SFPIM29

Le composé 20 (250 mg, 0.36 mmol) est dissous dans un mélange CH ₂ CI ₂ /Et0H (1/2.5, 14 ml_). Un large excès de palladium sur charbon (Pd/C 10%) est ajouté et la réaction est agitée 4 h à température ambiante (environ 20 ⁰ C) sous pression atmosphérique d'hydrogène (ballon de baudruche). Le mélange réactionnel est chauffé à 30 ⁰ C pour une meilleure dissolution du produit attendu et le catalyseur est retiré par filtration sur membrane millipore. Il est rincé 3 fois avec 20 mL de mélange CH ₂ CI ₂ /Et0H (1/1) précédemment chauffé à 30°C. Le solvants résiduels sont évaporés sous vide pour conduire au composé 21 (215 mg, 99%) attendu sous forme de solide blanc. C ₃₇ H ₇₂ O ₅ (M = 596.98 g/mol).

RMN ¹ H (250 MHz, CDCI ₃ ) δ 0.88 (t, 6H, 2CH ₃ ), 1.26 (m, 52H, 26CH ₂ ), 1.62 (m, 4H), 1.99 (s très large, 1 H, OH), 2.32 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 2.34 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 3.73 (d, 2H, 2H3a, J = 5 Hz), 4.23 (dd, 1H, H1a _A> JiaA-iaB = 11.75 Hz, J _1A-2 a = 5.75 Hz), 4.35 (dd, 1 H, H1a _B , Ji _aB - ₂ a = 4.5 Hz), 5.08(quinU-lH JH2a^L≡A5JHz>

RMN ¹³ C (62.9 MHz, CDCI ₃ ) δ 14.27 (CH ₃ ), 22.84 (CH ₂ ), 25.04 et 25.09 (2CH ₂ ), 29.25-29.85 (CH ₂ , 8 lines), 32.08 (CH ₂ ), 34.26 et 34.44 (2CH ₂ ), 61.68, 62.16, 72.25, 173.57 (Cq, CO), 173.93 (Cq, CO).

(S)-2-O-Hexadecanoyloxy-1-O-octadécanoyloxypropyl benzyl (N, N- diisopropylamino)phosphoramidite (composé 22, figure 2b)

SFPIM47

Du 1H-tetrazole solide (11 mg, 0.151 mmol, 0.6 éq) et le composé 21 (150 mg, 0.251 mmol) sont séparément séchés sous vide sur P ₂ O5 pendant 1 h avant d'être rassemblés et dissous dans le CH ₂ CI ₂ anhydre (2 mL). La solution stock de composé 10 (0.84M, 358 μl_, 0.301 mmol, 1.2 éq) est ajoutée et après 30 min d'agitation à température ambiante (environ 20 ⁰ C), le mélange réactionnel est dilué avec du CH ₂ CI ₂ (50 mL), refroidi à O ⁰ C et la phase organique est lavée avec une solution saturée de NaHCθ ₃ à 0 ⁰ C (10 mL), puis séchée sur MgSO ₄ . Le solvant est évaporé et une purification rapide sur colonne chromatographique de gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 6/1 contenant 1% Et ₃ N) permet d'obtenir le composé attendu 22 (100 mg, 48%) sous forme d'une huile incolore. C ₅₀ H ₉₂ NO ₆ P (M = 834.27 g/mol).

RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ) δ 0.88 (t, 6H, 2CH ₃ ), 1.18 (d, 6H, CH ₃ isopropyl), 1.19 (d, 6H, CH ₃ isopropyl), 1.25 (m, 52H, 26 CH ₂ ), 1.60 (m, 4H, 2CH ₂ ), 2.29 (2t, 4H, 2CH ₂ ),3.56-3.9 (2 m, 4H, 2CHMe ₂ , 2H3a), 4.17 (ddd, 1 H, H1a _B , J = 4.8, 6.4 et 12 Hz), 4.34 (ddd, 1 H, H1a _A , J = 4, 8 et 12 Hz), 4.65 et 4.66 (2 dd, 1 H, POCH _A Ph, J _A ,B = 12.4 Hz, J _A ,p = 8.4 Hz), 4.732 et 4.735 (2 dd, 1 H, POCH ₈ Ph, J _A , _B = 12.4 Hz, J _A , _P = 8.4 Hz), 5.19 (m, 1 H, H2a), 7.3-7.4 (m, 5H, 5CH _Ar ). 3 ¹ P NMR (162 MHz, CDCI ₃ ) δ 148.70, 148.80.

3,4,5,6-Tétra-O-benzyI-1 -O-(2,3 ,4,6-tetra-O-methoxyacetyl-α-D- mannopyranosyl)-2-O-[((S)-2-O-hexadecanoyl-3-O-octadécanoyI - propyI)(benzyl)phosphoryl)-D-myo-inositol (composé 23, figure 2b) _

SFPIM214

Le composé 22 (290 mg, 0.348 mmol, 3 éq) et le composé 18 (115 mg, 0.116 mmol) sont coévaporés ensemble avec du toluène anhydre (2 x

10 mL) puis séchés 30 min sous vide poussé avant d'être dissous, sous

atmosphère d'argon, dans du CH ₂ CI ₂ anhydre (8 ml_). Le 1 H-tetrazole solide (41 mg, 0.58 mmol, 5 éq) est ajouté à 0 ⁰ C puis après 1 h30 d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est refroidi à - 4O ⁰ C. Une solution d'acide m-chloroperbenzoique (m-CPBA) (50%, 120 mg, 0.348 mmol, 3éq) dans le CH ₂ CI ₂ (8 mL) est ajoutée goutte à goutte. Après 2h d'agitation en laissant remonter le milieu réactionnel à température ambiante (environ 20 ⁰ C), la réaction est stoppée par addition d'une solution aqueuse à 10% de Na ₂ S ₂ O ₃ (50 mL) et le mélange est extrait avec du diéthyl éther (Et ₂ O) (100 mL). La phase organique est lavée avec une solution aqueuse à 5% de NaHCO ₃ (3 x 50 mL) puis séchée sur MgSO ₄ . Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est purifié par colonne chromatogaphique sur gel de silice (éther de pétrole/acétate d'éthyle 2/1 avec un gradient jusqu'à 1/1 ) pour donner une fraction d'un premier P-stéréoisomère du composé 23 (55 mg) et une fraction de mélange d'isomères (76 mg contenant environ 30% du premier isomère) (rendement global 65%). C ₉₆ Hi ₃₉ O ₂₆ P (M = 1740.14 g/mol).

SM-IS m/z M calculée : 1738.92; trouvée : 1740.5 [M+H] ⁺ , 1763.5 [M+Na] ⁺ . HRMS calculée pour [M+H] ⁺ : C ₉₆ Hi ₄₀ O ₂₆ P : 1739.9370 ; trouvée : 1739.9386.

3,4,5,6-Tétra-O-benzyl-1-O-α-D-mannopyranosyl-2-O-[((S) -2-O- hexadecanoyl-3-O-octadécanoyl-propyl)(benzyl)phosphoryl)-D- myo- inositol (composé 24, figure 2b) SFPI M218

Le composé 23 (129 mg, 0.074 mmol) est dissout dans un mélange de CHCI ₃ /MeOH (4/1 , 1 mL). Le mélange réactionnel est refroidi à O ⁰ C et de la t-butylamine (160 μL) y est ajoutée. Après 10 min d'agitation à 0°C puis 1 h en laissant le milieu réactionnel remonter à température ambiante, les solvants sont évaporés sous vide poussé à température ambiante (environ 20 ⁰ C) et le résidu est purifié par deux colonnes chromatogaphique successives sur gel de silice (CH ₂ CI ₂ /Me0H 20/1 ) avec une grande

quantité de silice pour donner le composé attendu 24 (67 mg, 63%) sous forme d'un solide blanc homogène (RMN : présence des deux P*- stéréoisomères).

C ₈₄ H ₁₂₃ O ₁₈ P (M = 1415.85 g/mol).

HRMS calculée pour [M+H] ⁺ : C ₈₄ H ₁₂₄ O ₁₈ P : 1451.8525 ; trouvée :

1451.8521.

1-O-α-D-Mannopyranosyl-2-O-[((S)-2-O-hexadecanoyl-3-O-oc ta- décanoylpropyl)phosphoryl]-D-myo-inositol (composé 25, figure 2b)

SFPIM219

Le composé 24 (63 mg, 0.043 mmol) est dissous dans un mélange de CH ₂ CI ₂ /EtOH (0.6/1 , 16 ml_). Un large excès de palladium sur charbon (Pd/C 10%) est ajouté et la réaction est agitée 18h à température ambiante (environ 20 ⁰ C) sous pression atmosphérique d'hydrogène (ballon de baudruche). Le catalyseur est retiré par filtration sur membrane millipore et rincé 3 fois avec un mélange CH ₂ CI ₂ /Et0H (1/1 ) (20 ml). Les solvants résiduels sont évaporés sous vide pour conduire au composé 25 (43 mg, 100%) sous forme de solide blanc très homogène (RMN). C ₄₉ H ₉₃ O ₁₈ P (M = 1001.25 g/mol).

RMN ¹ H (400 MHz, CD ₃ OD/CDCI ₃ 0.7/0.3 ml_) δ 0.88 (t, 6H, 2CH ₃ ), 1.26 (m, 52H, 26 CH ₂ ), 1.60 (m, 4H), 2.32 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.35 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 3.22 (t, 1 H, H5, J _4-5 = J ₅ - ₆ = 8.8Hz), 3.52 (br d, 1 H, H3), 3.55 (t, 1 H, H4\ J ₄ L ₅ . = 10.0 Hz), 3.56 (t, 1 H, H4, J _4-3 = 8.8 Hz), 3.66 (m, 1 H, H1 ), 3.67- 3.72 (m, 2H, H6, H6'A), 3.81 (dd, 1 H, H3', J ₃ ' _-4 ' = 9.4, J ₃ ^ = 3.2 Hz), 3.83 (m, 1 H, H5'), 3.89 (dd, 1 H, H6'B , J ₆ ^ = 2, J ₆ B-6'A = 11 -6 Hz), 3.97 (dd, 1 H, H2', J _2- r = 1.6 Hz), 4.16-4.23 (m, 3H, H3aA et 2H1a), 4.42 (dd, 1 H ₁ H3aB, J ₃ a _B - ₂ a = 3.2, J _3a B-3a _A = 12 Hz), 4.75 (ddd, 1 H, H2, J _2-3 - 10, J _2-1 = 2.2 Hz), ^' 5.16 (d, 1 H, HT, J = 1.2 Hz), 5.26 (m, 1 H, H2a). RMN ¹³ C (100 MHz, CD ₃ OD/CDCI ₃ 0.7/0.3 mL) δ 14.40 (CH ₃ ), 23.43, 25.67, 25.70, 29.90, 29.93, 30.15, 30.16, 30.33, 30.36, 30.44, 30.46,

30.48, 32.74, 34.75, 34.88, 62.83 (C6 ¹ ), 63.23 (C3a), 65.87 (d, C1a), 68.77 (C4 ¹ ), 70.89 (d, C2a), 71.48 (C3 et C2'), 73.58 (C4), 73.96 (C6), 74.70 (C5 ¹ ), 75.79 (C5), 76.37 (d, C1 ), 81.37 (d, C1), 102.95 (C1 ¹ ), 174.43 (CO), 174.81 (CO). 3 ¹ P NMR (162 MHz, CD ₃ OD/CDCI ₃ 0.7/0.3 mL ) δ -1.71 ppm.

HRMS calculée pour [M+H] ⁺ : C ₄₉ H ₉₄ Oi ₈ P : 1001.6178 ; trouvée : 1001.6172.

2) Stimulation des macrophages de souris sauvages par le LPS en présence d'isomère de P)Mi isoPIMi-CifiCia (SFPIM219)

Un nouvel isomère de PIM, l'isoPIMiCi ₆ Ci ₈ (SFPIM219) a été testé pour son activité inhibitrice sur les macrophages stimulés par du LPS (figure 12).

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris sauvages ont été cultivés sur des plaques de culture 96 puits à raison de 10 ⁵ cellules par puits puis stimulés par du LPS (100 ng/ml, Escherichia. coli, sérotype O111 :B4, SIGMA) avec l'ISOPIM ₁ CI ₆ CI ₈ (SFPIM219) (1-10 μg/ml) ou un contrôle DMSO. La préparation de SFPIM219 lyophilisée utilisée est solubilisée dans du DMSO et additionnée aux cultures à une concentration finale maximale non cytotoxique de 1 %.

Après une stimulation de 24 heures, les surnageants de culture ont été collectés et analysés pour leur contenu en cytokines TNF-α ou IL-12 p40 par ELISA (R&D Duoset, Minneapolis, MO). Les résultats correspondent à la moyenne +SD de n=2 souris par génotype.

L'isoPIMiCi ₆ Cis (SFPIM219) inhibe fortement la sécrétion de TNF

(figure 12). Un test de cytotoxicité MTT réalisé sur les mêmes macrophages incubés en présence d'isoPIMiC-i ₆ Ci ₈ (SFPIM219) a permis de montrer son absence de cytotoxicité sur les macrophages (figure 13).

La sécrétion d'IL-12p40 en réponse au LPS est déjà fortement inhibée à des concentration de 1ug/mL d'isoPIMiCi ₆ Ci ₈ (SFPIM219) (figure 14).

EXEMPLES 3 et 4 :

1) Exemple 3 : Synthèse du composé 36 de la figure 2c ou PIM-2- mimNCOCF ₃ SFPIM324-t2

Exemple 4 : Synthèse du composé 37 de la figure 2c ou PIM- 2mimNH SFPIM324-t 8

3-O-Benzyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidène-α-D-glucofuranos e (composé 26, figure 2c)

SFPIM311 A une solution de 1,2:5,6-di-O-isopropylidène-α-D-glucofuranose commerciale (13.5 g ; 52 mmol) dans du THF anhydre (100 mL) est ajouté à 0 ⁰ C, sous atmosphère d'azote, l'hydrure de sodium (sous la forme d'une dispersion à 60% dans de l'huile minérale) (2.5 g ; 62 mmol ; 1.2 éq.). Le mélange est agité 20 minutes à O ⁰ C. Après addition à température ambiante (environ 20 ⁰ C) d'iodure de tétrabutylammonium (149 mg ; 0.4 mmol ; 0.008 éq.), le bromure de benzyle (9 mL ; 76 mmol ; 1.3 éq.) est ajouté goutte à goutte. Le milieu est chauffé à reflux pendant 2h, puis du méthanol (10 mL) est ajouté lentement. Le mélange est dilué avec du dichlorométhane (100 m L) et de l'eau (40 mL). La phase- aqueuse est extraite 3 fois au dichlorométhane (50 mL). Les phases organiques sont rassemblées, séchées et concentrées sous vide. Le produit brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (cyclohexane/Et ₂ O 4/1 + 0.4% de Et ₃ N) pour donner le composé 26 sous la forme d'une huile jaune.

Ci ₉ H ₂₆ O ₆ (M = 350,42 g/mol).

RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ): δ 1.31 (s, 3H, CH ₃ ), 1.37 (s, 3H, CH ₃ ), 1.43 (s, 3H, CH ₃ ), 1.49 (s, 3H, CH ₃ ), 4.00 (d, 1 H, H6A, J _6A-5 = 5.6, J _6A-6B = 8.4Hz), 4.02 (d, 1 H, H3, J _4-3 = 3.0 Hz), 4.11 (d, 1 H ₁ H6B, J _68-5 = 6.0 Hz), 4.15 (d, 1 H, H4, J _4-5 = 7.6Hz), 4.37 (m, 1 H, H5), 4.58 (d, 1 H, H2, J ₂ -i = 3.6Hz), 4.66 (AB, 2H, CH ₂ Ph), 5.90 (d, 1 H, H1 ), 7.27.35 (m, 5H, CHar). RMN ¹³ C (101 MHz, CDCI ₃ ): δ 25.57 (CH ₃ ), 26.37 (CH ₃ ), 26.92 (CH ₃ ), 26.97 (CH ₃ ), 67.53 (C6 ¹ ), 72.50 (CH ₂ Ph), 72.65 (C5 ¹ ), 81.45 (C4'), 81.83 (C3 ¹ ), 82.79 (C2 ¹ ), 105.42 (C1 ¹ ), 109.10 (Cq), 111.90 (Cq), 127.77, 127.96, 128.52, 137.77.

SM-IS m/z M calculée : 350.17; trouvée 351.0 [M+H] ⁺ , 373.0 [M+Na] ⁺ .

3-O-Benzyl-1,2-O-isopropylidène-α-D-xylo-pentodialdo-1, 4-furanose (composé 27 figure 2c) SFPIM268A

Le composé 27 est synthétisé selon [25]. Une solution de 26 (1.03 g ; 2.9 mmol) dans un mélange acide acétique-eau (21/9 ml_) est agitée à 45°C pendant 2 heures. Le mélange réactionnel est ensuite refroidie à 0 ⁰ C, et une solution de périodate de sodium (692 mg ; 3.23 mmol ; 1.1 éq.) dans l'eau (7 mL) est ajoutée. Le milieu est agité à température ambiante (environ 2O ⁰ C) pendant environ 18h. Du dichlorométhane (15 mL) est ajouté et la phase aqueuse est extraite 3 fois au dichlorométhane (15 mL). Les phases organiques sont rassemblées, puis lavées 2 fois à l'eau (20 mL), séchées sur MgSO ₄ et concentrées sous vide. Le résidu est coévaporé 2 fois avec du toluène. L'aldéhyde 27 est utilisé sans purification dans l'étape suivante.

RMN ¹ H (250 MHz, CDCI ₃ ): δ 1.33 (s, 3H, CH ₃ ), 1.47 (s, 3H ₁ CH ₃ ), 4.33 (d, 1 H, H3, J _3-1 = 3.7 Hz), 4.54 (AB, 2H, CH ₂ Ph), 4.61 (dd, 1 H, H4, J _4-5 = 1.5, J _4-3 = 3.7 Hz), 4.64 (d, 1 H, H2, J _2-I = 3.7 Hz), 6.12 (d, 1 H, H1 ), 7.1-7.4 (m, 5H, CHar), 9.67 (d, 1 H, H5, J _5-4 = 1.8Hz).

3-O-Benzyl-xylo-pentodialdo-1,4-furanose (composé 28, figure 2c)

SFPIM268

A une solution de 27 (2.9 mmol) dans un mélange dioxane/eau (10/4 mL) est ajoutée de la résine Dowex 50WX8 (3.4 g). Le milieu est agité doucement 18h à 75°C. La résine est filtrée sur verre fritte et rincée avec un mélange dioxane/eau. Les solvants sont évaporés sous pression réduite. Le résidu est coévaporé plusieurs fois avec du toluène jusqu'à obtenir le produit 28 sous la forme d'une mousse orange-rouge. Il est utilisé sans purification dans l'étape suivante.

W-Benzyl-3-O-benzyl-1,5-dideoxy-1,5-îmino-xyIitol (composé 29, figure

2c)

SFPIM272

A une solution de 28 (700 mg, 2.9 mmol) précédemment séché sur P ₂ O ₅ une nuit, dans du méthanol anhydre (50 mL), est ajouté sous atmosphère d'azote le cyanoborohydrure de sodium (554 mg, 2.67 mmol, 3 éq.). Le mélange est agité en présence de tamis moléculaire 3A pendant 10 minutes. Le milieu est refroidi à -78 ⁰ C, puis l'acide acétique glacial (332. μL, 5.8 mmol, 2 éq.) et la benzylamine (292 μL, 2.67 mmol, 0.9 éq.) sont ajoutés. Après retour à température ambiante (environ 20 ⁰ C), le milieu est agité 18h, puis filtré sur célite. La célite est rincée avec de l'acétate d'éthyle (3 x 10 mL). Les solvants sont évaporés sous pression réduite. Le résidu est repris dans l'acétate d'éthyle (60 mL) et lavé avec une solution saturée de NaHCθ ₃ (20 mL), puis 2 fois avec de l'eau (20 mL). La phase organique est séchée, puis concentrée sous vide pour donner le composé 29 sous la forme d'un solide blanc homogène. Le composé peut éventuellement être recristallisé dans l'acétate d'éthyle. Ci ₉ H ₂₃ O ₃ N (M = 313.40 g/mol). RMN ¹ H (250 MHz, CDCI ₃ ): δ 2.24 (dd, 2H ₁ HIaA ₁ H5a'A, J _1aA-2a = JsaA-4a = 8, JiaA-iaB = JSaA-Sa _B = 11 Hz), 2.45 (m, 2H, OH), 2.85 (dd, 2H, H1aB, H5aB,

JiaB-2a = JδaB-ta = 3.5 Hz), 2.25 (app t, 1 H, H3a, J2a-3a = J3a-4a = 7 Hz), 3.55

(s, 2H, CH ₂ Ph), 3.77 (ddd, 2H, H4a, H2a), 4.76 (s, 2H, CH ₂ Ph), 7.20-7.40

(m, 10H, 2x5 CHar).

RMN ¹³ C (101 MHz, CDCI ₃ ): δ 57.12 (C1a, C5a), 62.20 (CH ₂ Ph NBn),

69.91 (C2a, C4a), 73.98 (CH ₂ Ph OBn), 84.30 (C3a, signal de faible intensité), 127.39-129.14 (9 pics, CHar), 137.86 (Cqar), 138.68 (Cqar).

SM-IS m/z M calculée : 313.17; trouvée 314.0 [M+H] ⁺ , 336.0 [M+Naf.

3-O-Benzyl-1,5-dideoxy-1,5-imino-xylitol (composé 30, figure 2c) SFPIM314

Le composé 29 (300 mg ; 0.957 mmol) est dissout dans EtOH (10 ml_). Un excès de d'hydroxyde de palladium sur charbon 20% est ajouté et le milieu réactionnel est agité à température ambiante (environ 20 ⁰ C) sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 2Oh. De l'hydroxyde de palladium sur charbon 20% est à nouveau ajouté et la réaction est poursuivie 18 h supplémentaires. Le milieu réactionnel est filtré sur membranes de millipores, le catalyseur est rincé à I ¹ EtOH (2x10 mL). Le filtrat est évaporé sous pression réduite pour conduire au composé 30 (172 mg, on observe environ 35% de produit O-débenzylé). Ci ₂ H ₁₇ NO ₃ (M = 223,27 g/mol)

RMN ¹ H (400 MHz, CD ₃ OD): (contient 35% de composé O-débenzylé référencé ^* ) δ ^* 2.38 (dd, -0.4H, ^* H1aA, ^* H5aA, Ji _aA-2a = J ₅ aA-4a = 10.1 , J-iaA-

1aB = J5aA-5aB = 12.6 Hz), 2.45 (dd, ~1.7H, H1aA, H5aA, J _1aA -2a = J ₅ aA-4a =

9.7, J _1aA-1aB = J ₅₃ A-SaB = 12.8Hz), 2.85 (dd, 2H, H1aB, H5aB, Ji _aB - _2a = J ₅ aB-4a = 4.3 Hz, + composé *), 3,21 (app t, 1 H, ^* H3a, H3a, J _2a-3a = J4a-3a = 8.3 Hz),

*3.39 - 3.41 (2 dd, -0.4H, ^* H4a, *H2a), 3.55 - 3.57 (2 dd, -1.7H, H4a,

H2a), 4.85 (s, CH ₂ Ph), 7.20-7.40 (m, 5H, CHar). RMN_ϋC (-101 MHz, CD ₃ OD): δ ^* 51.39 ( ^* C1a, ^* C5a), 51.47 (C1a, C5a),

71.92 (C2a, C4a), ^* 72.45 ( ^* C2a, ^* C4a), 75.55 (CH ₂ Ph OBn), ^* 79.94 (*C3a), 87.12 (C3a), 127.93-128.98, 129.17 (CHar), 140.36 (Cqar).

SM-IS m/z M calculée : 223.12; trouvée 224.5 [M+H] ⁺ , 246.5 [M+Na] ⁺ .

W«Trifluoroacétamido-3-O-benzyl-1 ,5-didéoxy-1 ,5-imîno-xylitol (composé 31, figure 2c)

SFPIM315

A une solution de composé 30 (172 mg ; 0.77 mmol) dans le dichlorométhane anhydre (5 ml_) sont ajoutés la pyridine (100 μl_ ; 1.31 mmol ; 1.7 éq) et l'anhydride trifluoroacétique (160 μL ; 1.16 mmol ; 1.5 éq). Le milieu réactionnel est agité 18h à température ambiante (environ

20 ⁰ C) puis est dilué dans le dichlorométhane. La phase organique est lavée deux fois avec une solution d'HCI 1 N, une fois avec H ₂ O, séchées sur MgSO ₄ et concentrée sous vide. Le produit brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (Ether de pétrole/acétate d'éthyle 3/1.5) pour donner le produit 31 (110 mg ; 45%).

Ci ₄ Hi ₅ NO ₄ F ₃ (M = 318.28 g/mol)

RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ): δ 3.50 (d, 1 H, H1A ou H5A, J = 13.4Hz), 3.61 (m, 1 H, H3), 3.66-3.78 (m, 3H, H1 ou H5, OH), 3.82 (m, 2H, H2 ou H4,

OH), 3.96 (m, 1 H, H4 ou H2), 4.10 (dd, H1 B ou H5B, J = 4.0, J = 13.6Hz),

4.66 (s, 2H, CH ₂ Ph), 7.25-7.38 (m, 5H, CHar).

RMN ¹³ C (101 MHz, CDCI ₃ ): δ 45.77 (C5 ou C1 ), 48.25 et 48.28 (C1 ou C5 rotamères), 67.80, (C2 ou C4), 67.97 (C4 ou C2), 73.04 (CH ₂ Ph), 76.52 (C3), 1 16.51 (q, CF ₃ , J _C -F = 289 Hz), 127.78, 128.23, 128.72 (3 pics CHar),

137.71 (Car), 157.72 (q, COCF ₃ , J ₀ - _F = 36Hz).

RMN ¹⁹ F (376 MHz, CDCI ₃ ): δ -67.72.

yV-Trifluoroacétamido-3-O-benzyl-2,4 -bis-O-(2,3,4,5-tétra-O- méthoxyacétyl-α-D-mannopyranosyl)-1 ,5-didéoxy-1 ,5-îmino-xylîtol (composé 32, figure 2c) - -SFPIM3-18 —

Une solution de composé 17 (500 mg ; 0.813 mmol ; 2.5 éq) dans le dichlorométhane (2 mL) est canulée sous argon dans une solution de composé 31 (105 mg ; 0.33 mmol) dans le dichlorométhane (5 mL) contenant du tamis moléculaire 4â. Le mélange réactionnel est agité 30

min à température ambiante (environ 20 ⁰ C) et le triméthysilyl trifluorométhanesulfonate (30 μl_ ; 0.163 mmol ; 20% par rapport à l'imidate) est ajouté. Le milieu réactionnel est agité 2h à température ambiante (environ 20 ⁰ C) puis la réaction est stoppée par addition de triéthylamine (0.8 mL) et filtrée sur célite. La célite est rincée au dichlorométhane, le solvant est évaporé à sec et le produit brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (Dichlorométhane/acétone 6/1 ) pour donner le produit 32 (188 mg ; 47%) sous forme d'un sirop incolore. C ₅₀ H ₆₈ NO ₃₀ F ₃ (M = 1220.08 g/mol) Remarque : en RMN, on observe des rotamères dus à la présence du NCOCF ₃ .

RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ): δ 2.92 (dd, 0.5 H, H1aA ou H5aA, J = 9.9, 12.9Hz), 3.06 (dd, 0.5 H, H1aA ou H5aA, J = 10.1 , 12.9Hz), 3.18 (dd, 0.5 H, H1aA ou H5aA, J = 9.8, 13.9Hz), 3.26 (dd, 0.5 H, H1aA ou H5aA, J = 10.3, 13.9Hz), 3.36, 3.38, 3.38, 3.40 3.41 , 3.44, 3.45, 3.48 (8 CH ₃ ), 3.64- 4.22 (m, 25H, 8CH ₂ MAc, 2H5, 1 MaB ou 1 H5aB, 3H6, H3a, H2a, Ma), 4.40 (m, 1 H, H6B), 4.53 (m, 1 H, MaB ou H5aB), 4.80-4.90 (m, 2H, CH2Ph), 4.94 (s, 0.5H, H1 ), 5.05 (s, 0.5H, H1), 5.14 (s, 0.5H, H1 ), 5.17 (s, 0.5H, H1 ), 5.24-5.45 (m, 6H, 2H2, 2H3, 2H4), 7.15-7.40 (m, 5H, CHar). RMN ¹³ C (101 MHz, CDCI ₃ ) : δ 43.44, 45.52, 45.56, 45.85, 47.89, 47.92 (6 pics pour C1a et C5a), 59.32, 59.37, 59.39, 59.41 , 59.44, 59.45, 59.53 (7 CH ₃ ), 61.75, 62.23, 62.58 (3 pics pour les H6), 65.43, 65.56, 65.97, 66.07, 68.49, 68.62, 68.68, 68.94, 69.26, 69.49 (10 pics pour C2, C3, C4, C5), 69.14, 69.22, 69.26, 69.29, 69.39, 69.43, 69.46 (7 pics pour les CH ₂ MAc), 71.17, 72.20, 76.56, 77.08, 81.88, 82.00 (6 pics pour C1a, C2a, C3a), 75.48, 75.57 (2 pics pour CH ₂ Ph), 94.41 , 94.75 (2 pics pour C1), 98.82, 99.07 (2 pics pour C1 ), 116.14 (q, CF ₃ ,. J _c-F =.289Hz), 116.21 (q, CF ₃ , J _C- F = 289Hz), 125.32-129.06 (9 pics pour CHar), 137.09,169.12-170.18 (14 pics pour CO MAc) . RMN ¹⁹ F (376 MHz, CDCI ₃ ): δ -68.79, -68.55.

λ/-TrifIuoroacétamido-2,4-bis-O-(2,3,4,5-tétra-O-méth oxyacétyl-α-D- mannopyranosyl)-1,5-didéoxy-1,5-imino-xylitol (composé 33, figure 2c)

SFPIM319 Le composé 32 (188 mg ; 0.154 mmol) est dissous dans un mélange EtOH/CH ₂ CI ₂ (6/6 ml_). Un excès de palladium sur charbon 10 % est ajouté et le milieu réactionnel est agité à température ambiante (environ 20 ⁰ C) sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 3h. Le milieu réactionnel est filtré sur membrane de millipores, le catalyseur est rincé avec un mélange EtOHZCH ₂ CI ₂ (1/1 ). Le filtrat est évaporé sous pression réduite pour conduire au composé 33 (168 mg ; 97%). C ₄₃ H ₆₂ NO ₃₀ F ₃ (M = 1129.96 g/mol)

Remarque : en RMN, on observe des rotamères dus à la présence du NCOCF ₃ . RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ): δ 2.74 (app t, 0.5 H, H1aA ou H5aA, J = 12.1 Hz), 2.84 (app t, 0.5 H, H1aA ou H5aA, J = 11.6Hz), 3.12 (m, 1 H, H1aA ou H5aA), 3.41 , 3.42, 3.44, 3.45, 3.46, 3.47, 3.48, 3.49 (8 CH ₃ ), 3.59 (m, 3H, H4a, H2a, OH), 3.74 (m, 1 H, H3a), 3.88-4.49 (m, 23H, 8CH ₂ MAc, 2H5, 1 H1aB ou 1 H5aB, 4H6), 4.64 (m, 1 H, H1aB ou H5aB), 4.94 (s, 0.5H ₁ H1 ), 5.01 (s, 0.5H, H1 ), 5.21 (s, 0.5H, H1 ), 5.25 (s, 0.5H, H1), 5.26-5.48 (m, 6H, 2H2, 2H3, 2H4).

RMN ¹³ C (101 MHz, CDCI ₃ ): δ 44.26, 45.61 , 46.01 , 47.69 (4 pics pour C1a et C5a), 59.22-59.43 (7 CH ₃ ), 62.21 , 62.24, 62.58 (3 pics pour les H6), 65.85, 65.90, 65.98, 66.04, 68.57, 68.62, 69.07, 69.13, 69.53 (9 pics pour C2, C3, C4, C5), 69.19, 69.22, 69.33, 69.42, 69.46 (4 CH ₂ MAc), 74.05, 74.78, 75.64, 75.84, 76.54, 77.25 (6 pics pour C1a, C2a, C3a), 95.75, _J98J9a (Z.C)_116..10^q ₁ XF ₃ ,. Jc-F = 289Hz), 116.18 (q, CF ₃ ,. J _C- F = 289HZ),_

155.58 (q, COCF ₃ , J _c-F = 36Hz), 155.62 (q, COCF ₃ , J _C -F = 36Hz), 169.16- 170.18 (13 pics COMAc). RMN 1 ^η 9 ^a F (376 MHz, CDCI ₃ ): δ -68.91 , -68.72.

/V-Trifluoroacétamido-2,4-bis-O-(2,3,4,5-tétra-O-métho xyacétyl-α-D- mannopyranosyl)-(3-O-(((S)-2-O-hexadécanoyloxy-3-O- octadécanoyloxy-propyl)(benzyl)phosphoryl> 1 ,5-didéoxy-1 ,5-imino- D-xylitol (composé 34, figure 2c)

SFPIM322

Une solution à 0.26 M dans le CH ₂ CI ₂ anhydre du composé 22 (861 μl_ ; 0.223 mmol ; 1.5 éq) est ajoutée à une solution de composé 33 (168 mg ; 0.149 mmol) dans le CH ₂ CI ₂ anhydre (8 ml_). Du tamis 3à est ajouté et le milieu réactionnel est agité 30 min à température ambiante sous argon. Une solution commerciale de tétrazole (-0.45 M dans acétonitrile), préalablement séchée sur tamis 3à, est ajoutée à 0 ⁰ C (1.65 ml_ ; 0.743 mmol ; 5 éq) et la réaction est poursuivie sous agitation à température ambiante pendant 2h. Le mélange réactionnel est refroidi à - 40 ⁰ C et une solution d'acide m-chloro-perbenzoïque (m-CPBA) (50%, 154 mg ; 0.447 mmol ; 3 éq) dans le CH ₂ CI ₂ (2 ml_) est ajouté goutte à goutte. Après 2h d'agitation en laissant remonter le milieu réactionnel à température ambiante (environ 20°C), la réaction est arrêtée par addition d'une solution aqueuse à 50% de Na ₂ S ₂ O ₃ (20 mL) et le mélange est extrait avec du diéthyle éther (Et ₂ O) (80 mL). La phase organique est lavée 4 fois avec une solution aqueuse à 50% de Na ₂ S ₂ O ₃ (3 x 20 mL), 1 fois avec une solution saturée de NaHCO ₃ , 1 fois avec H ₂ O, puis séchée sur MgSO ₄ . Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est purifié par colonne chromatographique sur gel de silice (Toluène/acétone 4/1 ) pour donner le composé 34 (104 mg ; 37%) sous forme d'un sirop incolore. C ₈₇ H ₁₃₉ NO ₃₇ F ₃ (M = 1879.03 g/mol) Remarque : les spectres sont difficilement interprétables. En effet, on observe des pics démultipliés à cause des rotamères liés à la présence du NCOCF ₃ , des diastéréoisomères liés à la présence du phosphate benzylé et de la non-équivalence des sucres. On peut ainsi noter 4 pics pour un

seul carbone anomérique. On remarque également 4 pics en RMN du Fluor.

RMN ¹³ C (101 MHz, CDCI ₃ ) : δ 94.47, 94.50, 94.91 , 95.00 (1C1), 98.69, 98.76, 99.18 (2C) (1 C1 ). RMN ³¹ P (162 MHz, CDCI ₃ ) : δ -0.92

RMN ¹⁹ F (376 MHz, CDCI ₃ ): δ -68.68, -68.67, -68.47, -68.44. SM-IS m/z M calculée : 1877.87; trouvée 1901.0 [M+Na] ⁺ .

yV-Trifluoroacétamido-2,4-bis-O-(2,3,4,5-tétra-O-métho xyacétyl-α-D- mannopyranosyl)-(3-O-(((S)-2-O-hexadécanoyloxy-3-O- octadécanoyloxy-propyl)phosphorylj- 1 ,5-didéoxy-1 ,5-imino-D-xylitol (composé 35, figure 2c)

SFPIM323

Le composé 34 (90 mg ; 0.048 mmol) est dissous dans un mélange EtOH/CH ₂ Cl ₂ (6/4 ml_). Un excès de palladium sur charbon 10 % est ajouté et le milieu réactionnel est agité à température ambiante (environ 20 ⁰ C) sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 3h. Le milieu réactionnel est filtré sur membrane de millipores, le catalyseur est rincé avec un mélange EtOH/CH ₂ CI ₂ (1/1 ). Le filtrat est évaporé sous pression réduite pour conduire au composé 35 (82 mg ; 95%). C ₈₀ Hi ₃₃ NO ₃₇ F ₃ P (M = 1788.91 g/mol)

Remarque : les spectres sont difficilement interprétables. En effet, on observe des pics démultipliés à cause des rotamères liés à la présence du NCOCF3 de la non-équivalence des sucres. Cela dit, les diastéréoisomères ont disparu, le phosphate a été déprotégé. On peut encore noter 2 pics pour un seul carbone anomérique. On remarque également 2 pics en RMN du Fluor.

RMN ¹³ C (101 MHz, CDCI ₃ ) : δ 94.54, 94.98 (1C1), 98.65, 99.17 (1C1). RMN ³¹ P (162 MHz, CDCI ₃ ) : δ -1.36, -1.30. RMN ¹⁹ F (376 MHz, CDCI ₃ ): δ -68.66, -68.45.

Exemple 3 : JV-Trifluoroacétamido-2,4-bis-O-(α-D-mannopyranosyl)-(3- O-(((S)-2-O-hexadécanoyloxy-3-O-octadécanoyIoxy- propyl)phosphoιyl)-1,5-didéoxy-1,5-imino-D-xylitol (composé 36, figure 2c) SFPIM324-t2 et

Exemple 4 : 2,4-bis-O-(α-D-mannopyranosyl)-(3-O-(((S)-2-O- hexadécanoyloxy-3-O-octadécanoyloxy-propyl)phosphorylj-1,5 - didéoxy-1 ,5-imino-D-xylitol (composé 37, figure 2c) SFPIM324-t8

Le composé 35 (80 mg ; 0.045 mmol) est dissous dans un mélange de CHCI ₃ /MeOH (0.2/0.8 mL). Le mélange réactionnel est refroidi à 0 ⁰ C et la t- butylamine (164 μL) y est ajoutée. Après 10 min d'agitation à 0 ⁰ C puis 1h30 en laissant le milieu réactionnel remonter à température ambiante (environ 20 ⁰ C), les solvants sont évaporés sous vide poussé à température ambiante et le résidu est purifié par colonne chromatogaphique sur gel de silice (CHCIa/MeOH/H _∑ O 70/40/1 ) pour donner dans les premiers tubes le composé 36 (16 mg ; 32%) et dans les tubes suivant le composé 37 (21 mg ; 48%) sous forme de solides blancs. Composé 36

C56H101NO2 ₁ PF3 (M = 1212.39 g/mol).

Remarque : on observe toujours les rotamères dus à la présence de

NCOCF ₃ , surtout au niveau des H anomériques.

RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ /CD ₃ OD 0.4/0.2 mL): δ 0.89 (t, 6H, 2CH3, J = 6.7Hz), 1.27 (m, 52H), 1.61 (m, 4H) ₁ 2.32 (t, 2H, J = 7.6Hz), 2.34 (t, 2H, J = 7.6Hz), 3.20-4.22 (plusieurs massifs), 4.91 (s, 0.5H ₁ H1), 5.03 (s, 0.5H, - - H1 ), 5.12 (s, 0.5H, H1 ), 5.17 (s, 0.5H; HI ), 5.25 (m, 1 H-, H2a ^l )r ^~ RMN ³¹ P (162 MHz, CDCI ₃ /CD ₃ OD 0.4/0.2 mL) : δ 0.161. RMN ¹⁹ F (376 MHz, CDCI ₃ /CD3OD 0.4/0.2 mL): δ -68.34, -67,83. SM-IS (-) m/z M calculée : 1211.66; trouvée 1210.5 [M-H]-.

Composé 37

C ₅₄ H ₁₀₂ NO ₂₀ P (M = 1116.38 g/mol)

Remarque : on n'observe plus les rotamères au niveau des H anomériques. RMN ¹ H (250 MHz, CDCI ₃ /CD ₃ OD/D ₂ O difficilement soluble): δ 0.89 (t, 6H, 2CH3, J = 6.8Hz), 1.27 (m, 52H), 1.60 (m, 4H), 2.31 (t, 2H, J = 7.3Hz), 2.34 (t, 2H, J = 7.3Hz), 3.00-4.5 (plusieurs massifs), 4.93 (s, 1 H ₁ H1 ), 5.08 (s, 1 H, H1 ), 5.23 (m, 1 H, H2a').

RMN ³¹ P (162 MHz, CDCI ₃ /CD ₃ OD/D ₂ O difficilement soluble) : δ 0.670 SM-IS (-) m/z M calculée : 1115.67; trouvée 1116.0 [M+Na] ⁺ .

2) Stimulation des macrophages de souris sauvages par le LPS en présence des composés 36 et 37

Les composés 36 de la figure 2c ou PIM-2-mimNCOCF ₃ (SFPIM324 t2) et 37 de la figure 2c ou PIM-2-mimNH (SFPIM324 t8) ont été testés pour leur activité inhibitrice sur les macrophages stimulés par du LPS (figures 15 à 17).

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris sauvages ont été cultivés sur des plaques de culture 96 puits à raison de 10 ⁵ cellules par puits puis stimulés par du LPS (100 ng/ml, Escherichia. coli, sérotype O111 :B4, SIGMA) avec le PIMi (SFPIM145), TiSoPIM ₁ Ci ₆ Ci ₈ (SFPIM219) ou les composés PIM-2-mimNCOCF ₃ (SFPIM324 t2) et PIM-2-mimNH (SFPIM324 t8) (titrés à 1 , 3, 10, 30 μg/ml) ou des contrôles DMSO. Les préparations de SFPIM145, SFPIM219, SFPIM324 t2 et SFPIM324 t8 lyophilisées utilisées sont solubilisées dans du DMSO et additionnées aux cultures à .une concentration finale maximale non cytotoxique de 1%.

Après une stimulation de 24 heures, les surnageants de culture ont été collectés et analysés pour leur contenu en cytokines TNF-α ou IL-12 p40 par ELISA (R&D Duoset, Minneapolis, MO). Les résultats correspondent à la moyenne +SD de n=2 souris par génotype.

Le PIM-2-mimNCOCF ₃ (SFPIM324 t2) et l'isoPIMiC ₁₆ Ci ₈ (SFPIM219) inhibent fortement la sécrétion de TNF, alors que le PIMi (SFPIM145) et PIM-2-mimNH (SFPIM324 t8) inhibent moins fortement (figure 15). Un test de viabilité des cellules au MTT réalisé sur les mêmes macrophages indique une certaine cytotoxicité à la plus forte concentration, notamment en présence de PIM-2-mimNH (SFPIM324 t8) (figure 16). La sécrétion d'IL-12p40 en réponse au LPS est pratiquement abolie à des concentrations de 10ug/mL de PIM-2-mimNCOCF ₃ (SFPIM324 t2) et d'isoPIMiCiβCiβ (SFPIM219), alors que le PIM ₁ (SFPIM145) et PIM-2- mimNH (SFPIM324 t8) inhibent partiellement à cette concentration (figure 17).

Listes des références

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