Da Krebs eine Erkrankung ist, die heute aus verschiedensten Gründen (z. B. Älterwerden der Bevölkerung, negative Umwelteinflüsse usw.) schon ein Drittel der Bevölkerung von Industriestaaten betrifft und noch mit einer weiteren Zunahme der Erkrankungen zu rechnen ist, gibt es Bemühungen Stoffe herauszufinden, welche frühzeitig angewendet, einen Schutz vor dem Entstehen von Krebs geben (Krebsprophylaxe). Es gibt deshalb eine ausgedehnte Forschungsrichtung, die sich mit der Identifikation neuer chemopräventiver Agentien beschäftigt, um den dringenden Bedarf der Krebsverhütung zu decken.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Identifikation neuer chemopräventiver Agentien, die einfach und nebenwirkungsfrei anzuwenden sind.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Gegenstände der Patentansprüche.

Von den Erfindern wurde bereits früher gefunden, daß Lunularsäure (2-Hydroxy-6- [2- (4-hydroxy- phenyl)] ethylbenzoesäure) und Lunularin, die aus Leberblümchen, welche zur Kategorie der Moose gehören, isoliert werden können, eine chemopräventive Wirkung haben.

Lunularsäure : R = COOH Lunularin : R = H Jetzt wurde weiter herausgefunden, daß bestimmte Derivate der Lunularsäure eine noch weit über Lunularsäure und Lunularin hinausgehende positive Wirkung haben und selbst in geringen Dosen noch gegen Stoffwechselprozesse schützen, die für eine Krebsentstehung verantwortlich gemacht werden können.

Gegenstand der Erfindung sind daher Verbindungen der allgemeinen Formel (I), (II), (III) oder (IV) worin X ein beliebiger mono-oder polycyclischer (Hetero) Arylrest, der ggf. substituiert ist, ist. Beispiele hierfür sind ein carbocyclischer, monocyclischer Rest, beispielsweise die Phenylgruppe, ein heterocyclischer, monocyclischer Rest, beispielsweise die Gruppen Thienyl, Thiophenyl, Furyl, Furanyl, Pyranyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Pyridinyl, Pyrrolidinyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazolonyl, Pyridazinyl, Purinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Indolyl, Furazannyl, Pyrrolinyl, Imidazolinyl, Pyrazolinyl, Thiazolinyl, Triazolyl, Tetrazolyl, sowie die Positionsisomeren des oder der Heteroatome, die diese Gruppen umfassen können, ein Rest bestehend aus carbocyclischen kondensierten Ringen, beispielsweise die Naphthylgruppe oder die Phenanthrenylgruppe, ein Rest bestehend aus kondensierten heterocyclischen Ringen, beispielsweise Benzofuranyl, Benzothienyl, Benzimidazolyl, Benzothiazolyl, Naphtho [2, 3- b] thienyl, Thianthrenyl, Isobenzofuranyl, Chromenyl, Xanthenyl, Phenoxathiinyl, Indolizinyl, Isoindolyl, 3H- Indolyl, Indolyl, Indazolyl, Purinyl, Chinolizinyl, Isochinolyl, Chinolyl, Phthalzinyl, Naphthyridinyl, Chinoxalinyl, Chinazolinyl, Chinolinyl, Pteridinyl, Carbazolyl, ß-Carbolinyl, Cinnolinyl, Acridinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl, Phenoxazinyl, Indolinyl, Isoindolinyl, Imidazopyridyl, Imidazopyridmidinyl oder auch die kondensierten polycyclischen Systeme bestehend aus heterocyclischen Monozyklen, wie beispielsweise vorstehend definiert, wie beispielsweise Thionaphthenyl, Furo [2, 3- b] pyrrol oder Thieno [2, 3-b] furan, und insbesondere die Phenyl-, Furylgruppen, wie 2-Furyl, Imidazolyl, wie 2- Imidazolyl, Pyridyl, wie 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, Pyrimidinyl, wie Pyridmid-2-yl, Thiazolyl, wie Thiazol-2-yl, Thiazolinyl, wie Thiazolin-2-yl, Triazolyl, wie Triazolyl-2- yl, Tetrazolyl, wie Tetrazol-2-yl, Benzimidazolyl, wie Benzimidazol-2-yl, Benzothiazolyl-, Benzothiazol-2-yl, Purinyl, wie Purin-7-yl, oder Chinolyl, wie 4-Chinolyl.

In den obigen Formeln können R1 und R2 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, einen geraden oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, einen geraden oder verzweigten Alkenylrest mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen, einen mono-oder polyzyklischen Alkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoff- atomen, einen mono-oder polyzyklischen Alkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen, oder einen mono-oder polyzyklischen aromatischen Rest bedeuten, wobei diese Reste gegebenenfalls durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein können. R1 und R2 können gleich oder verschieden sein.

Es kann für R1 und/oder R2 jeder beliebige gerade oder verzweigte Cl30-Alkylrest verwendet werden. Beispiele hierfür sind Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, n-Butyl-, n-Hexyl-, 2-Methylpentyl-, 2, 3- Dimethylbutyl-, n-Heptyl-, 2-Methylhexyl-, 2, 2-Dimethylpentyl- , 3, 3-Dimethylpentyl-, 3-Ethylpentyl-, n-Octyl-, 2, 2- Dimethylhexyl-, 3, 3-Dimethylhexyl-, 3-Methyl-3- ethylpentylgruppen. Bevorzugt sind wegen der besseren Löslichkeit kurze Alkylketten, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Isopropyl-. Bevorzugt sind R1 und R2 gerade Cll4-Alkylreste oder C314-Cycloalkylreste. Besonders bevorzugt stehen R1 und R2 für H, CH3 oder CH3CH2.

Es kann für Ri und/oder R2 jeder beliebige gerade oder verzweigte C23o-Alkenylrest verwendet werden. Beispiele hierfür sind Vinyl-, Propenyl-, Isopropenyl-, Allyl-, 2-Methylallyl-, Butenyl-oder Isobutenyl-, Hexenyl-oder Isohexenyl-, heptenyl-oder Isoheptenyl-, Octenyl-oder Isooctenylgruppen.

Bevorzugt sind Vinyl-, Propenyl-und Isopropenyl-.

So kann R1 und/oder R2 jeder beliebige Cycloalkylrest sein.

Beispiele hierfür sind eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-oder Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, Cxclooctyl-, Cyclononyl-oder Cyclodecylgruppen. Bevorzugt sind Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-und Cyclohexyl-.

Der für R1 und/oder R2 verwendbare Cycloalkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen kann jeder beliebige Cycloalkenylrest sein. Beispiele hierfür sind eine Cyclobutenyl-, Cyclopentenyl-oder Cyclohexenyl-, Cycloheptenyl-, Cxclooctenyl-, Cyclononenyl-oder Cyclodecenylgruppen. Bevor- zugt sind Cyclobutenyl-, Cyclopentenyl-oder Cyclohexenyl.

Beispiele für polyzyklische Alkyl-bzw. Alkenylreste umfassen Norbornan, Adamantan oder Benzvalen.

Vorzugsweise vorhandene Substituenten der verschiedenen vorstehend angegebenen Reste X, R1 und/oder R2 sowie des Grundgerüsts als Substituent R3 können aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden : Halogen : Fluor, Chlor, Brom, Iod, Amino, Alkylamino, Dimethylamino oder Ethylamino, Dialkylamino, wie Dimethylamino, Diethylamino, Methylethylamino, wobei jeder dieser Dialkylaminoreste gegebenenfalls in Oxidform vorliegt, Aminoalkyl, wie Aminomethyl oder Aminoethyl, Dialkylaminoalkyl, wie Dimethylaminomethyl oder- ethyl, Dialkylaminoalkyloxy, wie Dimethylaminoethyloxy, Hydroxyl, freie, veresterte Carboxylgruppe, wie Alkoxycarbonyl, beispielsweise Methoxycarbonyl oder Ethoxycarbonyl, oder in ein Salz, beispielsweise durch ein Natrium- oder Kaliumatom überführt, Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert.- Butyl, gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogen- atom (e) substituiert, beispielsweise durch Fluor, wie Trifluormethyl, Oxo, Cyano, Nitro, Formyl, Acyl, wie Acetyl, Propionyl, Butyryl, Benzoyl, Acyloxy, wie Acetoxy oder ein Rest der Formel : -O-CO-(CH2) nCO2H, worin n = 1 bis 5, Alkoxy, wie Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, Isopropyloxy, Butyloxy, Alkylthio, wie Methylthio, Ethylthio, Propylthio, Iso- propylthio, Butylthio, Carbamoyl, Alkenyl, wie Vinyl, Propenyl, Alkinyl, wie Ethinyl, Propinyl und Aryl, wie Phenyl, Furyl, Thienyl.

Als Beispiele für derartige substituierte Reste können ein durch ein oder mehrere Halogenatom (e) substituierter Alkyl- rest, wie die Trifluormethyl-, Trifluorbutyl-, Pentafluorpro- pyl-, Pentafluorbutyl-, Pentafluorpentyl-, Heptafluorbutyl- oder Nonafluorbutylgruppe oder 2-Chlorethyl-genannt werden.

Verbindungen der obigen Formeln (I), (II), (III) und (IV) werden im weiteren mit dem Begriff"Lunularsäurederivate" beschrieben.

Bevorzugte Verbindungen sind : In den Tabellen 3 und 4 sind eine Reihe weiterer bevorzugter Verbindungen aufgelistet.

Erfindungsgemäß ganz bevorzugte Verbindungen sind : Vorzugsweise werden die Verbindungen der obigen Formeln (I) und (II) gemäß dem in Fig. 1 gezeigten Syntheseschema hergestellt. Verbindungen der obigen Formeln (III) und (IV) sind analog den Vorschriften in Cullmann et al., Z.

Naturforsch. 54c, S. 147-150 (1999) und Cullmann et al., Phytochemistry, Vol. 45, Nr. 6, S. 1235-1247 (1997) herstellbar.

Die vorstehend genannten erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich zur Prävention von Krebserkrankungen aller Art, indem sie einerseits bestimmte Stoffwechselprozesse hemmen, bei denen Stoffe entstehen, die die Krebsentstehung fördern, und andererseits bestimmte Stoffwechselprozesse fördern, die beispielsweise karzinogene Substanzen abfangen. Die Modulation von Enzymen, die bei der metabolischen Aktivierung und Freisetzung von Carcinogenen beteiligt sind, ist einer der am besten untersuchten Mechanismen für chemoprotektive Agentien.

Phase 1-Enzyme (Cytochrome P450) aktivieren Xenobiotika durch das Einfügen von funktionellen Gruppen, die diese Verbindungen besser wasserlöslich machen. Obwohl diese Funktionalisierung über Phase 1-Enzyme für die komplette Detoxifizierung von Substanzen notwendig ist, kann die Induktion von Phase 1- Enzymen das Risiko erhöhen, Carcinogene zu produzieren, die mit DNA reagieren können und Carcinogenese initiieren. Phase 2-Enzyme konjugieren die aktivierten Verbindungen an endogene Liganden, wie Glutathion oder Glucuron-, Essig-oder Schwefelsäure, wodurch die Freisetzung der Verbindungen in Form dieser Konjugate vermehrt wird. Allgemein stellt die Inhibierung von Phase 1-Enzymen gleichzeitig mit der Induktion von Phase 2 Enzymen eine logische Strategie bei der Chemoprävention dar, was besonders vorteilhaft in frühen Stadien der Carcinogenese ist. Um Modulatoren des Arzneimittel-Metabolismus zu identifizieren und damit eine Aussage über chemopräventive Agentien zu erhalten, werden beispielsweise die inhibitorischen Effekte auf die Phase 1 CyplA Aktivität und auf die Induktion der Phase 2 NAD (P) H : Chinonreduktase (QR) Aktivität bestimmt. Dazu werden beispielsweise ß-Naphthoflavon-induzierte Rattenhepatomzellen als Quelle von CyplA verwendet. Die zeitabhängige Dealkylierung von 3-Cyano-7-ethoxycumarin (CEC) zu 3-Cyano-7- hydroxycumarin kann fluorometrisch in 96-Loch-Platten verfolgt werden (Crespi et al., Anal. Biochem. (1997), 248 (1) : 188- 190). Die Induktion von QR-Aktivität als Modell-Phase 2-Enzym wird beispielsweise colorimetrisch in kultivierten Hepa lclc7- Zellen gemessen. Dazu wird die NADPH-abhängige Menadiol- vermittelte Reduktion von MTT (3- (4, 5-dimethylthiazo-2-yl)- 2, 5-diphenyltetrazoliumbromid) in blaues Formazan untersucht (Prochaska et al., Anal. Biochem.-1988, 169 (2) : 328-336).

Stoffe mit chemopräventiven Eigenschaften zeichnen sich somit durch manigfaltige Wirkungsmechanismen aus : (1) gewünschter Fremdstoff-Metabolismus (z. B. gemessen als Induktion von NAD (P) H-Chinonreduktase und Hemmung von CyplA), (2) entzündungshemmende Mechanismen (z. B. gemessen als Hemmung der Induktion von iNOS und Hemmung von COX-1), (3) antioxidative Mechanismen verbunden mit Radikalfängereigenschaften (z. B. gemessen mittels Reaktion mit Diphenylpikrylradikalen) und (4) anti-Tumor promovierende und anti-proliferative Eigenschaften (z. B. gemessen als Hemmung der Phorbolester-vermittelten Induktion der Ornithin-Decarboxylase oder gemessen anhand des Maus-Brustdrüsenmodells) Die Verbindungen der obigen Formeln sind gut verträglich und können im Rahmen eines Arzneimittels zur Prävention von Krebserkrankungen verabreicht werden.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, z. B. oral, parenteral, kutan, subkutan, intravenös, intramuskulär oder rektal. Bevorzugt ist die nicht-invasive, d. h. orale, kutane oder rektale, Verabreichung. Das Arzneimittel wird einem Patienten über einen vom Arzt zu bestimmenden Zeitraum oder wird stetig über lange Zeiträume verabreicht. Das Arzneimittel kann sowohl Menschen als auch Säugern verabreicht werden. Das Arzneimittel bietet sich auch an als Unterstützungsmedikation vor, während oder nach einer Tumortherapie (Operation, Bestrahlung und/oder Chemotherapie) an.

Die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindung wird vom Arzt anhand der patientenspezifischen Parameter wie z. B. Alter, Gewicht, Geschlecht, Schwere der Erkrankung, etc. bestimmt.

Entsprechend der Art der Verabreichung wird das Arzneimittel in geeigneter Weise formuliert, z. B. in Form von einfachen oder dragierten Tabletten, Hart-oder Weichgelatinekapseln, Pulver zur Rekonstitution vor Gebrauch, Granulaten, Suppositorien, Ovula, Injektionspräparaten, Infusionslösungen, Pomaden, Cremes, Gels, Mikrosphären, Implantaten, die nach üblichen galenischen Verfahren hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gegebenenfalls zu- sammen mit weiteren Wirkstoffen und mit in pharmazeutischen Zusammensetzungen üblichen Exzipientien formuliert werden, z. B. je nach herzustellendem Präparat Talk, Gummi arabicum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige und nichtwäßrige Träger, Fettkörper mit tierischem oder pflanzli- chem Ursprung, Paraffinderivate, Glykole (insbesondere Polyethylenglykol), verschiedene Weichmacher, Dispergiermittel oder Emulgatoren, Konservierungsstoffe.

Zur Herstellung flüssiger Präparate können Additive wie Natri- umchloridlösung, Ethanol, Sorbit, Glycerin, Olivenöl, Mande- löl, Propylenglycol oder Ethylenglycol verwendet werden.

Es können auch Infusions-oder Injektionslösungen hergestellt werden. Diese sind bevorzugt wäßrige Lösungen oder Suspensio- nen, wobei es möglich ist, diese vor Gebrauch herzustellen, beispielsweise aus lyophilisierten Präparaten, die den Wirk- stoff alleine oder zusammen mit einem Träger, wie Mannit, Lactose, Glucose, Albumin und dergleichen, enthalten. Die gebrauchsfertigen Lösungen werden sterilisiert und gegebenen- falls mit Hilfsmitteln vermischt, beispielsweise mit Konser- vierungsstoffen, Stabilisatoren, Emulgatoren, Lösungsvermitt- lern, Puffern und/oder Salzen zur Regulierung des osmotischen Drucks. Die Sterilisierung kann durch Sterilfiltration durch Filter mit einer kleinen Porengröße erzielt werden, wonach die Zusammensetzung gegebenenfalls lyophilisiert werden kann. Geringe Mengen an Antibiotika können auch zugesetzt werden, um die Beibehaltung der Sterilität zu unterstützen.

Vorteilhaft ist die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Arzneimittels in einer Dosis-Einheits-Form zur Verabreichung an einen Säuger.

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel bzw. pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge des aktiven Inhaltsstoffs (erfindungsgemäße Verbindung der obigen Formeln) zusammen mit organischen oder anorganischen inerten festen oder flüssigen pharmazeutisch verträglichen Trägern bzw. Verdünnungsmitteln, die für die beabsichtigte Verabreichung geeignet sind, und die mit den aktiven Inhaltsstoffen nicht nachteilig wechselwirken, enthalten.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die erfindungsgemäße Verbindung mit einem pharmazeu- tisch verträglichen Träger vermischt wird.

Unter den erfindungsgemäßen Medikamenten können insbesondere die im experimentellen Teil beschriebenen Verbindungen und ganz besonders die Verbindungen, bei denen in der obigen Formel (I) oder (II) R1 und/oder R2, die gleich oder verschieden sein können, eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-oder Isoproylgruppe ist, genannt werden.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel bzw. pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen als Wirkstoff mindestens einen wie vorstehend definierten Wirkstoff. Gegebenenfalls können noch weitere pharmazeutische Wirkstoffe in die Zusammensetzung aufgenommen werden, wie z. B.

-Antioxidantien [z. B. red. Gluthathion, N- Acetylcystein, natürliche Polyphenole wie Grüntee- (Epigallcate-chingallat und andere Catechine) oder Rotweinbestandteile (Resveratrol), Anthocyanidine, Flavonoide, Procyanidine], -Vitamine [z. B. hochdosiertes Vitamin C, Vitamin E, Vitamin A, Vitamin D], -Mineralstoffe [z. B. Magnesium, Zink, Calcium], -Spurenelemente [z. B. Selen], -Entzündungshemmer [z. B. Cyclooxygenase 1 oder 2 Hemmer (Nichtsteroidale Entzündungshemmer NSAIDs, wie ASS etc.), Lipoxygenasehemmer oder Hemmstoffe der induzierbaren Stickstoffoxidsynthese], -Hormonmodulatoren [z. B. Antiöstrogene (z. B. Tamoxifen, Genistein) oder Aromatasehemmer], -Angiogenesehemmer [z. B. Genistein], -Modulatoren der Signalübertragung [z. B. Proteinkinase- hemmer (z. B. Curcumin oder Ras-Farnesylierungshemmer, wie Perillylalkohol oder Limonen)], -Proliferationshemmer, -Ornithin-Decarboxylase-Hemmer [z. B. DFMO] -Apoptose-Induktoren -Ballaststoffe (auch als Vorstufen von kurzkettigen Fettsäuren) -Induktoren von Zellproliferationsprozessen [z. B.

Natriumbutyrat] Die Erfindung wird weiter anhand der Figur erläutert : Fig. 1 : Syntheseschema Fig. 2 : Dosis-abhängige Inhibierung der präneoplastischen Läsionsbildung in einem MMOC-Modell durch EC-252 Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Verfahren zur Herstellung von E-6- (co- Styryl) salicylsäuremethylester (EC-9) Zu einer Lösung von Natriummethanolat in Methanol (bereitet durch Auflösen von 9, 20 g (400 mMol) Natrium in 300 ml wasserfreiem Methanol) gibt man 56, 3 g (100 mMol) (3-Acetoxy- 2-methoxycarbonyl) benzyl-triphenyl-phosphoniumbromid (Eicher et al., Synthesis 1988, S. 525) und rührt 30 Min. bei +20°C.

Danach fügt man 10, 6 g (100 mMol) Benzaldehyd (käufliches Produkt frisch destilliert) zu und erhitzt das Reaktionsgemisch 4 Std. unter Rückfluß. Danach kühlt man auf Raumtemperatur ab, neutralsiert durch Zugabe von Eisessig und entfernt das Solvens im Vakuum. Man nimmt den Rückstand in 300 ml Chloroform auf, wäscht zweimal mit je 100 ml Wasser, trocknet die organische Phase über MgSO4, filtriert sie über 200 g Kieselgel (Nachelution mit wenig CHCl3) und entfernt das Solvens im Vakuum. Man erhält ein farbloses Öl, das in ca. 150 ml Petrolether (40-60°C) aufgenommen und bei-30°C (15 h) zur Kristallisation gebracht wird. Man erhält 23, 6 g (93%) farblose Nadeln, E/Z-Gemisch, Smp. 51-52°C. Aus dem E/Z-Gemisch kann durch Erhitzen in Toluol (30 Std. unter Rückfluß) in Gegenwart von Iod (einige mg) das reine E-konfigurierte Produkt quantitativ erhalten werden (Smp. : 56-57°C).

Beispiel 2 Verfahren zur Herstellung von 6- (2- Phenylethyl) salicylsäuremethylester (EC-1) 22, 0 g (86, 3 mMol) des Produkts aus Beispiel 1 werden in 300 ml Essigester gelöst. Man fügt 2, 0 g Palladium auf Aktivkohle (5%) als Katalysator zu und hydriert in einer konventionellen Hydrierapparatur (Fa. Parr) bei 5 bar Wasserstoff-Überdruck.

Nach ca. 4 Std. ist die Wasserstoff-Aufnahme beendet. Man filtriert vom Katalysator ab, entfernt das Solvens im Vakuum, nimmt den Rückstand in Chloroform auf und filtriert die CHC13 -Lösung über 300 g Kieselgel (Nachelution mit wenig CHCl3).

Das Filtrat wird im Vakuum vom Solvens befreit und der Rückstand aus Petrolether (40-60°C) umkristallisiert. Man erhält 19, 9 g (90%) des Produkts, farblose Prismen, Smp. 55- 56°C.

Beispiel 3 Verfahren zur Herstellung von E-1- (5-Bromthienyl)-2- [ (2- ethoxycarbonyl-3-methoxy) phenyl] ethen (EC-252) Zu einer Lösung von Natriummethanolat in Methanol (bereitet durch Auflösen von 0, 30 g (13, 0 mMol) Natrium in 50 ml wasserfreiem Methanol) gibt man 5, 63 g (10, 0 mMol) (2- Ethoxycarbonyl-3-methoxy) benzyl-triphenyl-phosphoniumbromid (Eicher et al., Synthesis 1988, S. 525) und rührt 30 Min. bei +20°C. Danach fügt man 1, 91g (10, 0 mMol) 5-Bromthiophen-2- carbaldehyd (Fa. Acros Organics, Geel, Belgien) zu und rührt das Reaktionsgemisch 24 Std. bei +20°C. Das auskristallisierte Produkt wird abgesaugt und in 50 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird über 50 g Kieselgel filtriert (Nachelution mit wenig CHCl3). Das Solvens wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand [2, 90 g (79%) E/Z-Gemisch] zweimal aus Ethanol umkristallsiert. Man erhält 1, 84 g (50%) des Produkts, gelbliche Nadeln, Smp. 93-94°C.

Beispiel 4 Bestimmung der chemopräventiven Aktivität ausgewählter Lunularsäurederivate Hepalclc7-Zellen (ATCC American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) sät man in einer 96-Lochplatte in einer Dichte von 2 x 104 Zellen/ml (200 Al pro Loch) in a-MEM enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin G-Na, 100 Einheiten/ml Streptomycinsulfat und 250 ng/ml Amphotericin B (Gibco BRL, Grand Island, NY) ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum aus und kultiviert bei 37°C in einer 5% igen CO2-Atmosphäre. Nach einer Präinkubationszeit von 24 Stunden wurde das Medium erneuert, die Testverbindungen gelöst in 10% DMSO (10 Al, Endkonzentration 0, 5%) zugegeben und die Platten für weitere 48 Stunden inkubiert. Die QR-Aktivität wurde durch Messen der NADPH-abhängigen Menadiol-vermittelten Reduktion von MTT (3- (4, 5-dimethylthiazo-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoliumbromid) zu blauem Formazan gemessen (Prochaska et al., Anal. Biochem.

1988, 169 (2) : 328-336). Die Proteine wurden durch Kristallviolett-Färbung eines identischen Satzes von Platten bestimmt. Die Induktion der QR-Aktivität wurde aus dem Verhältnis der spezifischen Enzymaktiviäten der mit den Verbindungen behandelten Zellen zu einer Lösungsmittelkontrolle berechnet. Die CD-Werte (benötigte Konzentration in AM, um die spezifische Enzymaktivität zu verdoppeln) wurden erzeugt. Die CD-Werte wurden mit den IC50- Werten (halbmaximale inhibitorische Konzentration der Zell- Lebensfähigkeit in yM) ins Verhältnis gesetzt, um den chemopräventiven Index CI zu erhalten. Zusätzliche Tests wurden in einer von Hepa lclc7-Zellen abgeleiteten Mutanten- Zelllinie (BPrcl) unternommen, welche unfähig ist, den Ah Rezeptor-Ligandenkomplex in den Kern zu translocieren.

Für chemopräventiv wirkende Verbindungen ist eine Induktion von QR bei kleinen Konzentrationen wünschenswert.

Tabelle 1 : Induktion von NAD (P) H : Chinonoxidoreduktase (QR) durch ausgewählte Bibenzyle (alle Daten in MM)<BR> <BR> <BR> Hepalclc7 BPrcl CD/CQ IC50 CI CD A 51, 4/n. d > 93, 5 > 1, 8 n. I B 20, 4/n. d. > 50 2, 5 n. I EC-1 0, 22/6, 8 31, 3 171 n. I EC-252 0, 06/0, 24 7, 8 129 n. I EC-9 0, 03/0, 16 7, 2 223 n. I CD/CQ = Konzentration, um die spezifische Aktiviät von QR zu verdoppeln/zu vervierfachen IC50 = halbmaximale inhibitorische Konzentration CI = Chemopräventiver Index ; Verhältnis von IC50 und CD n. d. = nicht bestimmt n. I. keine Induktion A = Lunularin (Kontrolle) B = Lunularsäure (Kontrolle) Nachfolgend wurde die Dosis-abhängige Induktion von CyplA- Aktivität in kultivierten Hepalclc7 bestimmt. Die Hepalclc7- Zellen wurden analog wie oben beschrieben für 24 Stunden mit 0, 5 AM ß-Naphthoflavon, einem klassischen bifunktionellen Induktor von Arzneimittel-metabolisierenden Enzymen, behandelt. Zum Vergleich des induzierenden Potentials wurden die für die 10-fache Anhebung der CyplA-Aktivitat erforderlichen Konzentrationen ermittelt. Da die Induktion von CyplA zu der Aktivierung von Procarcinogenen führen kann, wurde weiter das Potential, um CyplA-Aktivität zu inhibieren, getestet. Diese Untersuchungen wurden an Lysaten von ß- Naphthoflavon-induzierten H4IIE Rattenhepatoma-Zellen und CEC als Substrat gemacht. H4IIE-Zellen (ATCC American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) werden dazu in 10 cm Zellkulturplatten mit einer Dichte von 1x106 Zellen in 10 ml MEME-Medium mit den gleichen Zusätzen, wie vorstehend für das a-MEM-Medium angegeben, ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C, 5% CO2 Atmosphäre kultiviert. Danach wird das Medium erneuert und die Zellen für 38 Std. mit 10 AM ß-Naphthoflavon zur Induktion von CyplA induziert. Anschließend werden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, durch Abschaben in 1 ml 200 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7, 4 mit 10 mM MgCl2 (Puffer 1) geerntet und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur Aktivitätsbestimmung wird das Zellhomogenat bei Raumtemperatur aufgetaut, zur Lyse durch eine Kanüle Nr. 20 gedrückt und mit Puffer 1 auf 10 ml verdünnt. 90 Al dieser Lösung (ca. 5-25 Ag Protein) werden in 96-Lochplatten zu einer Mischung aus 10y1 der Testsubstanz in DMSO und 100 Al Reaktionsgemisch (2-fach konzentriert) enthaltend 2, 6 mM NADP, 6, 6 mM Glucose-6- Phospaht, 10 AM 3-Cyano-7-Ethoxycumarin (CEC) und 0, 5 Einheiten Glucose-6-phosphatdehydrogenase gegeben. Der Ansatz wird kurz gemischt. Die Kinetik der zeitabhängigen Dealkylierung von CEC wird 45 Min. lang bei 37°C im Mikrotiterplattenfluorimeter mit einer Anregungswellenlänge von 409 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm aufgenommen (vgl. Crespi et al., Anal. Biochem. (1997), 248 (1), S. 188-190).

Die Induktion der CyplA-Aktivität ist als negativ zu bewerten, da diese Aktivität zu einer Aktivierung von Karzinogenen führen kann. Für chemopräventiv wirkende Verbindungen ist deshalb eine geringe Induktion von CyplA wünschenswert (am besten gar keine CyplA-Induktion) sowie eine Hemmung von CyplA bei kleinen Konzentrationen. Tabelle 2 : Modulation von CyplA-Aktivität durch ausgewählte Bibenzyle (alle Daten in AM) CvplA-Induktion CvtlA-Inhibieruncr C10-fach IC50 A > 93, 5 3, 7 B 8, 0 8, 3 EC-1 2, 1 0, 99 EC-252 0, 225 0, 11 EC-9 < 0, 13 0, 08 C10-fach Konzentration resultierend in einer 10-fachen Induktion der CyplA-Aktivität IC50 : Halbmaximale inhibitorische Konzentration A : Lunularin (Kontrolle) B : Lunularsäure (Kontrolle) Desweiteren wurden alle Verbindungen der Tabelle 3 analog wie vorstehend beschrieben hinsichtlich der QR-und CyplA- Aktivität getestet. Die Auswertung ergab, daß einige der getesteten Verbindungen bessere Eigenschaften haben als andere. Verbindungen mit Werten, die diese als gute Chemopräventiva qualifizieren, sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

Desweiteren wurden die Verbindungen der Tabelle 3 hinsichtlich der Hemmung der Lipopolysaccharid-induzierten Expression der iNOS in Maus-Makrophagen getestet (NO2). Die Inhibition der Lipopolysaccharid (LPS)-vermittelten iNOS-Induktion in Maus Raw 246. 7-Makrophagen wurde mittels der Griess-Reaktion (Ding et al., J. Immunol. (1988), 141 (7), S. 2407-2412) bestimmt.

Dazu wurden Maus-Makrophagen in DMEM-Medium enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin G-Na, 100 Einheiten/ml Streptomycinsulfat und 250 ng/ml Amphotericin B ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum bei 37°C in einer 5% CO2-Atmosphäre kultiviert. Die Zellen wurden mit einer Dichte von lx 105 Zellen/Loch in DMEM in 96-Lochplatten kultiviert. Nach einer Präinkubationszeit von 24 Stunden wurde das Medium durch 170 Al serumfreies DMEM ersetzt. Die Testverbindungen (10 1 in 10% DMSO, 8 serielle 2-fach Verdünnungen, Endkonzentrations- bereich 0, 8 bis 50 yM) wurden hinzugefügt. iNOS wurde durch Zusatz von 20 Al LPS-Lösung (500 ng/ml in serumfreiem DMEM) induziert. Nach 24 Stunden wurde die iNOS-Aktivität über die Quantitierung der Nitritlevel in 100 Al Zellkulturüberständen gemäß der Griess-Reaktion bestimmt und mit einer Nitrit- Standardkurve verglichen. Um die zytotoxischen Effekte der Testverbindungen zu bestimmen, wurde das restliche Zellkulturmedium entfernt und die Zellen wurden bei 4°C für 30 Minuten mit 50 ßl eiskalter 10%-iger wässriger Trichloressigsäure-Lösung fixiert, fünfmal mit Wasser gewaschen und kurz getrocknet. Die Zellzahlen wurden durch Sulforhodamin B-Färbung bestimmt (Skehan et al., J. Natl.

Cancer Inst. (1990), 82 (13), S. 1107-1112). Im allgemeinen wurden die Verbindungen in nicht-toxischen Konzentrationen getestet (Zellanfärbung > 50% der LPS-behandelten Kontrollzellen).

Für chemopräventiv wirkende Verbindungen ist eine Hemmung der Induktion der iNOS bei kleinen Konzentrationen wünschenswert.

Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Desweiteren wurden die Verbindungen der Tabelle 3 auf ihre antioxidativen Eigenschaften hin getestet. Dafür wurde das vermeintliche Potential der erfindungsgemäßen Verbindungen zum Abfangen von Diphenyl-picryl-hydrazyl-Radikalen (DPPH) ausgewählt. Dies erfolgte durch photometrisches Verfolgen der Reaktion mit 1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) freien Radikalen in einem Mikroplatten-Format bei 515 nm (van Amsterdam et al., Free Radical Biol. Med. (1992), 12, S. 183- 187). Dazu wurden die in DMSO gelösten Testverbindungen mit einer Lösung von 100 AM DPPH in Ethanol für 30 Minuten bei 37°C behandelt. Das Radikalfänger-Potential wurde mit einer Lösungsmittel-Kontrolle (0% Radikalfängereigenschaften) und Ascorbinsäure (250 M Endkonzentration, 100% Radikalfängereigenschaften) verglichen. Die halbmaximale Radikalfängerkonzentration SCso wurde generiert, die in einem Endkonzentrationsbereich von 2-250 AM gewonnen wurden. Hier ist eine Hemmung von DPPH bei kleinen Konzentrationen der Testverbindungen erwünscht. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 4 gezeigt.

Ein weiterer Parameter, um die antioxidativen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen zu ermitteln, ist die Ermittlung der Hemmung des Phorbolester-vermittelten Superoxidbursts in differenzierten HL-60 Zellen. Die Inhibierung der Tetradecanoylphorbolacetat (TPA)-induzierten Superoxid-Radikalbildung in menschlichen HL-60 promyelocytischen Leukämiezellen, die zu Granulocyten differenziert waren, wurde durch photometrische Bestimmung der Cytochrom c-Reduktion bestimmt (Takeuchi et al., Cancer Res.

(1994), 54 (22), S. 5837-5840, Pick und Mizel, J. Immunol.

Meth. (1981), 46 (2), S. 211-226). Dazu wurden HL-60 Zellen bei einer Dichte von 2 x 105 Zellen/ml mit 1, 3% DMSO in RPMI 1640 Medium enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin G-Na und 100 Einheiten/ml Streptomycinsulfat ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum bei 37°C in einer 5% CO2 Atmosphäre für vier Tage behandelt, um die terminale Differenzierung zu Granulocyten zu induzieren. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit"Hanks balanced salt solution"enthaltend 30 mM HEPES, pH 7, 8 gewaschen und auf eine Dichte von 2 x 106/ml eingestellt. 2 x 105 Zellen/Loch (100, ul) werden mit den Testverbindungen (25 yl, in 10% DMSO) für 5 Minuten vor der Zugabe von 75 Al Cytochrom c-Lösung in HHBSS (5 mg/ml, 1, 25 mg/ml Endkonzentration) präinkubiert. 25, ul Superoxid- Dismutase (600 U/ml in HHBS, 12 U/Loch Endkonzentration) wurden als Positivkontrolle verwendet, alle anderen Löcher erhielten 25 Al HHBSS. Die Superoxidanion-Radikal-Bildung wurde durch Zugabe von 25 1ll TPA (O, 55 mg/ml in HHBSS, 55 ng/ml Endkonzentration) gestartet. Die Platten wurden leicht geschüttelt. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37°C wurde die Reaktion durch Kaltstellen der Platten auf Eis für 15 Minuten gestoppt. Danach wurden die Platten zentrifugiert und die Cytochrom c Reduktion im Überstand wurde bei 550 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegerätes (Spectramax 340, Molecular Devices) bestimmt. Das Zellpellet wurde zweimal mit PBS gewaschen und die Zellwachstumsfähigkeit wurde fluorometrisch durch enzymatische Hydrolyse des fluorogenen Esterase-Substrats Calcein AM (250 nM in PBS, 100 pl/Loch) bei 37°C in einem Cytofluor 4000 Mikroplattenfluoreszenzlesegeräts (PE Applied Biosystems, Anregung 485 nm, Emission 620 nm) bestimmt. Unter Verwendung dieser Methode konnten unspezifische Effekte von reduzierenden Testverbindungen vermieden werden. Die Reaktion war linear für mindestens 30 Minuten. ICso-Werte (halbmaximale inhibitorische Konzentration von TPA-induzierter Superoxid-Entstehung) wurden generiert. Hier ist eine Inhibierung der Entstehung von Superoxid-Radikalen bei kleinen Konzentrationen der Testverbindungen erwünscht. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 4 gezeigt.

Desweiteren wurden die Verbindungen der Tabelle 3 auf die TPA- induzierte ODC (Ornithin-Decarboxylase)-Aktivität in kultivierten Maus 308-Zellen untersucht. Die Kultivierung der Maus 308-Zellen, die Behandlung der Zellen mit den in seriellen Verdünnungen in DMSO (0, 5% DMSO-Endkonzentration) zugefügten Testverbindungen und die Bestimmung der ODC- Aktivität wurde durchgeführt wie in Gerhäuser et al., Nat. Med. (1995), 1 (3), S. 260-266 beschrieben. Der Proteingehalt der Zellysate unter Verwendung von Rinderserumalbumin as Standard wurde gemäß Bradford (Analyt. Biochem. (1976), 72 (1- 2), S. 248-254) gemessen und verwendet, um die ODC-spezifische Aktivität (pmol 14CO2/mg Protein/Std.) zu berechnen. ICso- Werte (halbmaximale inhibitorische Konzentration von TPA- induzierter ODC-Aktivität in yg/ml) wurden berechnet. Hier ist eine Inhibierung der Induktion von ODC bei kleinen Konzentrationen der Testverbindungen erwünscht. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 4 gezeigt.

Die Verbindungen der Tabelle 3 wurden auch auf eine inhibitorische Wirkung auf die Cyclooxygenase (COX)-Aktivität getestet (Jang et al., Science (1997), 275, S. 218-220 ; Van der Ouderaa et al., Meth. Enzymol. (1982), 86, S. 60-68). Die COX-Aktivität wurde bei 37°C unter Aufzeichnen des Sauerstoff- Verbrauchs während der Umwandlung von Arachidonsäure in Prostaglandine in einer 1, 0 ml Inkubationszelle einer Sauerstoff-Elektroden-Einheit (Hansatech DW, basierend auf einer 02-Elektrode vom Clark-Typ) gemessen. Das Reaktionsgemisch enthaltend 0, 1 M Natrium/Kaliumphosphatpuffer, pH 7, 4, 1 mM Hydrochinon, 0, 01 mM Hemin und ungefähr 0, 2 U COX-1 in 100 Al Mikrosomen- Fraktion erhalten aus Hammelsamenblasen als Ausgangsquelle für COX-1 (spezifische Aktivität 0, 2-1 U/mg Protein) wurde mit 10 y1 DMSO (Negativkontrolle) oder Testsubstanzlösung (10 mM in DMSO) für 90 Sek. inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 y1 50 mM Arachidonsäure in Ethanol (100 AtM Endkonzentration) gestartet und der Sauerstoffverbrauch wurde für 20 Sek. aufgezeichnet. Für die Berechnung wurde die Rate des 02-Verbrauchs mit der DMSO-Kontrolle (100 % Aktivität) verglichen. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 4 gezeigt.

Beispiel 5 : Nachweis der chemopräventiven Aktivität erfindungsgemäßer Verbindungen im Maus-Brustdrüsenmodell (MMOC) Mit diesem Modell können Testverbindungen daraufhin getestet werden, ob sie die Entstehung Carcinogen-induzierter präneoplastischer Läsionen in Maus-Brustdrüsen-Organkultur hemmen. Dies ist ein wichtiger Hinweis auf eine chemopräventive Wirkung im Tiermodell.

Ein Nachteil von in-vitro Untersuchungen ist, daß die glatte Übertragbarkeit auf die in-vivo Situation oft nicht gegeben ist. Es wurde jedoch jetzt ein Organkulturmodell entwickelt, das als Klammer zwischen Kurzzeit-in vitro-Versuchen und Langzeit-in vivo-Carcinogenesemodellen dienen kann. Dies ist das Maus-Brustdrüsenmodell (mouse mammary glands, MMOC ; Mehta et al., Carcinogenesis 1995, 16 (2), S. 399-404). Dieses System kombiniert die Vorteile eines in-vitro-Modells (Einfachheit, Handhabbarkeit, Dauer) mit den komplexen zellulären, metabolischen und Entwicklungsbedingungen in einem Organismus.

3 bis 4 Wochen alte jungfräuliche weibliche BALB/c Mäuse wurden durch tägliche subkutane Injektionen mit 1 Ag Östradiol 17ß und 1 mg Progesteron für 9 Tage vorbereitet. Am Tag 10 werden die Tiere durch zervikale Dislokation getötet und das thorikale Brustdrüsenpaar entnommen, das auf ein Seidengewebe gelegt wird. Diese Gewebepräparationen wurden 10 Tage in serumfreiem Waymouth MB752/I-Medium (5 Düsen/5 ml Medium/Platte) inkubiert. Das Medium ist ergänzt mit 2 mM Glutamin, Antibiotika (Penicillin und Streptomycin, jeweils 100 Einheiten/ml Lösung) und wachstumsfördernden Hormonen, 5 Ag Insulin, 5 Ag Prolaktin, 1 jug Aldosteron und 1 Ag Hydrocortison pro ml Medium. Das Carcinogen DMBA (2 ug/ml) wird dem Medium für 24 Stunden zwischen den Tagen 3 und 4 zugesetzt. Dieses Zeitinterval stellt den Zeitraum der DNA- Synthese dar. Kontrollplatten wurden mit DMSO (DMBA- Lösungsmittel) behandelt. Nach 10 Tagen Inkubation wurden die Drüsen für weitere 14 in einem Medium gehalten, das nur Insulin (5 yg/ml) enthielt. Während der gesamten Kulturdauer wurden die Drüsen bei 37°C in einer 5% CO2 Atmosphäre gehalten.

Die erfindungsgemäße Verbindungen-EC-252 (Testagenz) wurde in verschiedenen Konzentration zu dem Medium für die Tage 0-10 gegeben (10-15 Drüsen pro Konzentration). Carcinogen- behandelte Drüsen ohne Testagenz dienten als Positivkontrolle.

Am Ende des Experiments nach 24 Tagen wurden die Drüsen in 10% Formalin fixiert, mit Alauncarmin gefärbt und morphokologisch das Vorhandensein von Drüsenläsionen untersucht. Das Auftreten (Inzidenz) von gebildeten Läsionen (Prozentsatz der Drüsen mit Läsionen bezüglich der Gesamtanzahl der Drüsen pro Gruppe) in der mit EC-252 behandelten Gruppe wird mit den Läsionen in der nur mit DMBA-behandelten Gruppe (unbehandelte Gruppe = DMBA- Kontrolle) verglichen und daraus der Prozentsatz der Inhibierung berechnet. Das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt.

Desweiteren wurden ausgewählte Verbindungen der Tabelle 3 analog wie vorstehend beschrieben im Maus-Brustdrusenmodell getestet. Die Auswertung ergab, daß einige der getesteten Verbindungen bessere Eigenschaften haben als andere.

Verbindungen mit Werten, die diese als gute Chemopräventiva qualifizieren, sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

Weitere Ergebnisse der getesteten Verbindungen sind Tabelle 5 zu entnehmen.

Beispiel 6 : Nachweis der östrogenen bzw. antiöstrogenen Effekte der erfindungsgemäßen Verbindungen in der Ishikawa humanen Endometriumkrebs-Zelllinie Die Messung der Förderung von alkalischer Phosphatase (AP)- Aktivität in der Ishikawa humanen Endometrium-Adenocarcinoma- Zellinie (Department of Biochemistry, University of Montreal) erlaubt die Abschätzung der instrinsischen östrogenen Aktivität der Testverbindungen gemäß Tabelle 3. Anti-östrogene Effekte wurden durch Co-Behandlung mit ß-Östradiol und Inhibitoren bestimmt. Die Zellkulturbedingungen waren gemäß Littlefield et al., Endocrinology (1990), 127 (6), S. 2757- 2762.

Die Ishikawa-Zellen wurden routinemäßig in a-MEM Medium enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin G-Na, 100 Einheiten/ml Streptomycinsulfat und 250 ng/ml Amphotericin B ergänzt mit 10% Aktivkohle-gereinigtem fötalem Kälberserum bei 37°C in einer 5% CO2-Atmosphäre gehalten. Einen Tag vor Start des Experiments wurde das Medium in ein Östrogen-und Phenolrot- freies D-MEM/F-12-Gemisch (1 : 1) enthaltend L-Glutamat und Pyridoxin-HCl (Fa. Gibco BRL) ergänzt mit 100 Einheiten/ml Penicillin G-Na, 100 Einheiten/ml Streptomycinsulfat und 250 ng/ml Amphotericin B und 5% Aktivkohle-gereinigtem fötalem Kälberserum gewechselt. Für die Bestimmung der östrogenen/anti-östrogenen Aktivität wurden die Zellen mit 0, 25% Phenolrot-freiem Trypsin/EDTA trypsiniert und durch eine Injektionsnadel Nr. 18 gepreßt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Diese wurde in einer 96-Loch Mikroplatte in einer Dichte von 2 x 104/Loch in 200 Itl EFM plattiert. Nach einer Vorinkubationsphase von 24 Stunden wurde das Medium durch 170 Al frisches EFM ersetzt. Die Testverbindungen gemäß Tabelle 3 (10 Al in 10% DMSO, Endkonzentrationsbereich 0, 8-50 yM), 10 Al 10% DMSO (als Negativkontrolle, Endkonzentration 0, 5%) oder 10 yl Tamoxifen (in 10% DMSO, Endkonzentration 0, 5 yM, als positives Antiöstrogen) und entweder 20 Al EFM (für östrogene Aktivität) oder 20 lil 50 nM ß-Östradiol in EFM (für anti- östrogene Aktivität) wurden auf ein Endvolumen von 200 Al zu den Platten hinzugefügt. Die Platten wurden bei 37°C in einer feuchten 5% CO2-Atmosphäre für 72 Stunden inkubiert. Um die Wirkungen der Testverbindungen auf die Zellproliferation zu bestimmen, wurde die Zellwachstumsfähigkeit durch Calcein AM Hydrolyse fluorometrisch bestimmt. Dazu wurden die Platten dreimal mit PBS (vorgewärmt auf 37°C) gewaschen und 100 Al 250 nM Calcein AM in vorgewärmtem PBS wurde zu jedem Loch hinzugefügt. Die Fluoreszenz wurde für 10 Minuten bei 37°C in einem Cytofluor 4000 Mikroplatten-Fluoreszenzlesegerät (PE Applied Biosystems, Anregung 485 nm, Emission 620 nm) gemessen. Die Calceinlösung wurde sofort entfernt und 50 yl/Loch 0, 5% Triton X in PBS wurde hinzugefügt. Die Platten wurden über Nacht bei-80°C aufbewahrt. Um die AP-Aktivität zu bestimmen, wurden die Platten bei 37°C innerhalb von 2 Minuten aufgetaut und 100 yl/Loch 15 AM 4-Methyl-Umbelliferylphosphat (MUP) in 1 M Diethanolaminpuffer, pH 9, 8 enthaltend 0, 24 mM MgCl2 wurden hinzugefügt. Die Platten wurden 5 Minuten auf einem Mikroplattenschüttler geschüttelt. Die Dephosphorylierung von MUP zu dem fluorescenten 4-Methyl-7- hydroxy-coumarin (4-Methylumbelliferon) wurden für 45 Minuten bei 37°C (Anregung 360 nm, Emission 460 nm) beobachtet. Die AP- Aktivität und das Zellwachstum wurden aus den Raten der Produktbildung (in Fluoreszenzeinheiten/min) bestimmt. Das Verhältnis beider Raten wurde als ein Maß der relativen spezifischen AP-Aktivität berechnet. Die relative Vergrößerung der AP-Aktivität, die indikativ für eine östrogene Aktivität ist, wurde durch Vergleich mit einer DMSO- Lösungsmittelkontrolle berechnet. Für die Kalkulation der anti-östrogenen Wirkung wurden die Ergebnisse als Prozentsätze im Vergleich zu einer mit DMSO und ß-Östradiol behandelten Kontrollprobe ausgedrückt. Tamoxifen wurden als Positivkontrollsubstanz verwendet und produzierte eine Inhibition von > 50% bei einer Testkonzentration von 0, 5 AM.

Testverbindungen mit Werten, die diese als gute Chemopräventiva qualifizieren, sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 3 Name Struktur Molekulargewicht Ei 1 256. 30 i COOCH3 OH Et 2 30435 I I I COOGH3 \ OH C2oH1603 Ei 7 304. 35 I I COOCH3 OH C2oH1603 Ei 9 254. 3 i OH i w I COOCH3 OH CieHi403 Ei 10 Br 333. 2 I I coocH, OH () CH3 Tabelle 3 (Forts.) Ei 2 1 280 zu '0 OH I COOCH OH Ei 15 OH 302 -1 -I i v''OH COOC2HS OH Ei 21 276. 4 Ei 21 COOCH OH C, 7H : 403 Ei 26e,. H,. o, 3T8 Ei26 C"H"O, 318 z tCOOCH, coocH, I aucA OCH vahand. Ei 33 286. 3 Cco°cX 'COOCH OCH3 C, 7H, 804 Ei 36B 272. 3 F, 11 i . o 9COOC2Hso OCH3 Ei 37 288. 36 zu COOCH OCH3 ClSH1403S Ei 39 255 i N tCOOCH, OH OH Ei 249 ci N 323. 5 /s C02Et " CO : Et OCH3 Ei 251 c 358 _ N AsXCI COVET OCH3 Ei 252 366. 9 OCH, Covet OCH, Ei 253 ci N Et 3945 eut CEC COVET OCH., Ei 254 442 lu s . OCH Ei 255 N 272 zon N H COVET OCH3 Ei 256 N 514 /, \\ 'CEC COt " OCH3 Ei 257 ocH, 483 0 I I i i N NCx2HCI 2 HCI NEZ Ei 260ocH, 483 0 I I i I N Ei261 t 694 zou Xi 1 GH, iO'th EI 262 OCH, 483 x 2 HCI I'N 'x 2 HC 410 Ei 263 OCH3 410.< C S w N I N Ei 264 699. 6 N I (D o i o Ei 265 ocH, 583 w I I 2 hui i i 'I HCI Ei 266 ocil. 510 i i i i Ei 267ocM, 793. 8 0 LYS Iw Lr "3 e- 10 ON AU Ei 268 « H, 542 i i r HO Ei 273 aH. 483 CH3 Ei 274693 n'i Ex 275 300 Ex 275 300 '1 OC, OCH COACH3 OOH3 Ex 276 298 y OCH3 i COZCHJ NHCH OCH Ei 277 298 '1 NU ( / w I NHCH3 C02CH OCH3 Ei 278 H3C/Ph 361. N i I COZCH3 OCH3 Ei 279 (Gemisch) H3C CH3 299/313 N/ CL3 COACHS Ha Ei 280 H, C 384 N N-pu Ci CI C02CH3 OCH3-421 Ei 281 H, c 421 N N-Ph Cul CL C02CH3 OCH3 Ei 282 H, c 396. 5 N ci, N-0 CI COOCH2CH3 COOCH2CH3 Ei 283 H3c 382. 5 N /I \ 9COOCH3CI OCH3 Ei 284-", 419 w i/. N co, cH, a ocH vn Ha Ei 285 H, c 419 N Nach cri CUL CL C02CH3 OCH3 Ei 286 N-N N /v _N OC3 Oh 'COZCH3 _ OCH3 35 N-N Ei 287 pu /W'N I I COzCHz Ph OCH3 E/Z-Gemisch 335 _N 335 Ei 288 N i /WON RU Oh 'COOCH3 OCH3 293 Ex 289 T N COZCH3 N Oh OCH3 Ei 2980302 ARZT h" 'N i I N'O COOCH3 H OCH Ei 2990304 JAZZ N'-'O H Nô H COOCH OCH Ei 300 N N v _ oc3 OCH OCHs 306. 5 Ei 301 N7-I HC I N ' COOCH OCHj Ei 302 N zu oc3 OCHj COZCH3 OCH3 Ei 303 Cl, CH3 349. 5 i'I NCH O COACH3 OCH., Ei 304 N-N 341 C NU COZCH3 LOCH3 Ei 305 4 i43 /fuzz \ COOCH3 OCH -/ Ei 306 Ph N 369. 5 zon cri O CI r cocHs OCH3 Ei 307CH, 406 Ph NEZ i w w I O COOCH 0 Ei 308CH, 408 Ph NY NH' 0 ICI O COZCH OCH3 Ei 324 292 cool i COOH OH Ei 325 pH 274 OH i OH COOH OH Ei 326 308 0 -I w _o COOCH3 OCH3 Et 327 310 OCHj 0 zozo COOCH3 OCH3 Ei 328 c, Hs 409. 5 H N, CH2 0 0 0 t o COOCH : X Ei 329 457. 5 "Z 0 i, O \ COOCH3 NCZHs OCH3 <2Hs Ei 330 459. 5 0 0 0 I I COOCH, C2Hs OCH3 Ei 331 353. 2 S ber ""COOCHj COOCH3 OCH3 Ei 33)-339. 2 S s Br COOH OCH3 Ei 333 308. 8 OC3 s cul OC, COACH3 Ei 334 387. 7 OH Ei 335 ci OH Oh Ei 335 408. 9 H, ccoo Sci COOCH OOCCH., Ei 336 324. T- Ho S CI COOCZHS OH Ei 337--B'I 482 HO s ci Br 2HIS OH Ei] 001-i Ei 1002-OH _ ho I HO OH coopt OH COACH3 I coocH, OCH3 j e OH J Ei 1003 453 3 Act i W S covet OAc Ei 1004 369. 2 Ho'-ber Ycooet COOCH trans-Fortn E1 1$ 50030 H, ccoo I COpC=HS OOCCH, C,. H) O. S Ei 1006 40023 / Vs I coocH, OCH3 CIS"13103S Ei 1007 416. 23 1 iCOOs s CoOCHs ysHmIOS Ei 1008 416. 27 I Zizi w CO OH O-CzHS Ei 1009 369. 27 I "-C O C Oh ; Br s Ei 1010 458. 31 -0 S I C r0 \O--CpHs cI, 0-cl3 0 C18Hl9104S 0 C, Hn) OS Ei 1011 411. s r 0 0- C2HS C-CH, I/ C1eHteBrO4S Ei 1012 294. 35 'I /v v v COOCH3 OCH3 C1gH1s03 Ei 1013 38 I I COOCH OCHz C1sH2203 Ei 1014 280. 32 I i COOCH3 OCH, C1eH1s0 Ei 1015 284. 35 I I coocH, OCH CeHzog OH 328. 32 OH- H3COOG i i COACH, OH CH ; 0 Ex 1017 270. 32 'COOL OC Ci7Hn, 03 Ei 1018 284. 35. coots OCH3 CrgH2003 Ei 1019 298. 38 ' ; : : (C OCHj OCH C19H22°3 Ei 1020 270. 32 I i i COOCH3 OCH3 CtHl803 Ei 1-021-OH 31 OU "Z i I COOCZHS OH C17Fh6O4 Ei 1022 268. 31 I i COOCH3 OCH3 C17H, 603 Ei 1023. 286. 32 COACH3 r COOGH3 oCH, Cl7H1r°4 Ei 1024326. 34 OH COOCH 0. COOCzHs O fiCCHs C1sH1s0s Ei 1025 OH 270. 28 OH COOCH3 OH OH C16H404 Ei 1026 272. 30 OH i COOCH COACH3 Ei 1027 OH ou y I I coos 314. 33 Ei 1028 OH COCCH3 If o COOCH O jC--CH CISHSOS O Ei 1029 310. 79 I s ci COOCHs OCHj CHi : C) 0, S Ei 1030 35839 OCH LOOCH3 /I..,. COOCH OCH3 C2oH22C*6 Ei 1031 E Z Gemisch (ca. 2 : 3) 353. 23 s Br i \ s Br COOCH3 OCH3 Ci5Hl3BrO3S Ei 1032 256. 25 OH cool COOCH OH OU isH2a Ei 1033 326. 34 OH i i COOCzHs O C-CH, 0 C1gH1sOs Ei 1034 354. 4 o z 0 COOC2HS 0, _ , C-CH3 0 c H O Ei 1035 426. 42 If O-C-CH3 O-C-CH3 ' --0 COOCH COOC=HS OooCCH3 C23H22O Ei 1036 0 312. 32 zoo COOCH OH OH CHXsÒs Ei 1037 OH 300. 31 OH I COOCH i -oH I COOCH ou 0-c-CH3 if o-C--cH, I i w -CH O COOCH OCH, CH0, Tabelle 4 Namen QR CYP 1A1 Cyp. Ind. NO2 DPPH Antiox. CDVCQ (µM) C50 (µM) C1 IC50 µM) five fold ind. IC50 tox. IC50- Hem. (µM) IC50 Tox [µM] IC50(µM) %Herm. EC-1 = Ei-1 0. 22l6. B MW : 31.25 171 <1. 22 <0. 04 41. 000-50 >50 >390. 6 EC-9 = Ei-9 <0. 4/0. 74 >50 >125 0, 087 <0 04 >5 >50 >50 >250 Ei-15 n. l. 42, 90 n. d. 0, 500 25. 30 >50 Ei-37 1. 75/7. 8 44, 50 25 0, 727 1. 34 >5 34, 3 >50 >250 EC-252 = Ei-252 0. 06/0 24 7. 75 (st ?) 129 0, 082 <0. 4 >5 >50 >50 >250 Ei-260 (x2HC1) 6. 30 5, 55 n. d. 0, 058 n. l. >5 1, 9 22,. 90 >250 Ei-300 n. 1. >50 n. d. 0. 934 9, 10 >50 >50 >50 >250 Ei-302 n.l. >50 >50 d. >5 >5 34, 90 >50 >50 >50 >250 Ei-325 n. l. >50 n. d. >5 36, 70 >50 >50 >50 >250 Ei-331 <0. 4/<0. 4 11, 00 28 0, 292 <0. 4 >50 >50 >50 >250 Tabelle 4 (Forts. quer) Name Antiox. ODC COX-1 MMOC ISHIKAW IC50 (µM) IC50 (µM) %Hem. IC50 (µM)+1-SD Conc. %Inh. +E IC50 -E CD @@@ IC50 EC-1 Ei-1 4,8 2 EC-9 = Ei-9 >100 31 1 40 5. 5 n. l. >50 Ei-15 >100 94 Ei-37 >100 32 EC-252 = Ei-252 >100 >10 18 DR 0-60 2. 8 n. l. >50 Ei-260 (x2HC1) 15, 4 3, 4 10 Ei-300 >100 >10 5 Ei-302 >100 >10 2 Ei-325 >100 >10 87 34 4 Ei-331 >100 >10 13 Tabelle 4 (Forts. quer) Namen QR CYP 1A1 Cyp Ind. N02 DPPH Antiox. Antiox. COtCQ WK j SC60 JM], CK 11 bi < £S lot 1zs ~=o5D r],." x « rw z, Ei-1001 14, 10 19. 00 1 1> < < +1l i lvi Ei-1004 O. OS/0. 93 15, 20 190 0, 300 <0. 4 >50 >50 >50 >250 >100 Ei-1009 0. 043/0. 229 0, 43 10 0, 050, n nA 30 Ei-1021 6. 20 25, 70 4 0, 003 0, 48 >5 37, 4 >50 202, 00 26, 80 Ex-1022 <0. 4 29. 10 73 0, 059 0, 13 >5 >50 >50 >250 0% >100 Ei-1024 Ei-1024 44. 70 75 0, 005 <<0. 04 >5 >50 >50 >250 22, 60 Ei-1026 Ei-1026 45, 00 47, 80 1 0, 390 n. l. >50 >50 >50 >250 71% 65, 4 Ei-1027 n.). >50 n. d. >5 n. l. >50 >50 >50 >250 6% >100 n. l. Ei-1034 <0. 4 >50 125 < j S >50 zS0 >250 51% 30, 4 Ei-1035 n. l. 7, 30 n. d. 0, 023 n. l. >5 24. 9 34, 10 >250 26% >100 Ei-1037 n i. 8, 20 n. d. 0, 057 n. l. >5 15. 5 >50 >250 0% >100 Tabelle 4 (Forts. quer) COX-1 MMOC ISHIKAW Namen oc Namen ooc t cox-i MMOC tsmKAw Ei-1001 Ei-1001 7, 6 C1 : 96 4 1 1 0 Ei-1004 >10 C1 : 64 39 3 1 50 Ei-1009 >10 35 Ei-1021 Et-1022 Eis ex-1024 Ei-1024 ex-1026 Ei-1026 4, 0 39 Ei-1027 >10 9 Ex-1034 ex-1034 Ex-1035 ex-1035 Ex-1037 >10 44) 8. 7 r.). 38. 8 8. 7 I. 38. 8 Ei-1037 >10 44 Zur Tabelle 4 (Alle Angaben in NM bzw. %) : FREMDSTOFF-METABOLISMUS Gewünscht : Induktion von QR bei kleinen Konzentrationen, Hemmung von CypIA bei kleinen Konzentrationen, keine Induktion von CyplA.

QR steht für Induktion der NAD (P) H : Chinon Reduktase in Hepelclc7 Maus Hepatomzellen CD = Konzentration die eine Verdopplung der spezifischen Aktivität der QR bewirkt.

IC50= halbmaximale Hemmkonzentration der Zellviabilität CI = chemopräventiver Index (IC50/CD) n. I. no Induction : Keine Induktion n. d. not determined : nicht bestimmt st. : Hinweis auf Cytostatische Wirkung ? CypIA = Hemmung der CypIA Enzymaktivität unter Verwendung von 3-Cyano-7-ethoxycoumarin.

Als Enzymquelle wurden ß-Naphthoftavon induzierte H4IIE Ratten Hepatomzellen verwendet.

IC50= halbmaximale Hemmkonzentration <BR> <BR> <BR> <BR> Cyp1A Ind. = Induktion der Cyp1A Enzymaktivität in Hepelclc7 Maus Hepatomzellen<BR> <BR> <BR> <BR> Dieser Effekt ist negativ zu bewerten, kann zu einer Aktivierung von Karzinogene führen! Wird aus<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> mechanistischen Gründen mitbestimmt.<BR> <BR> <BR> <P>Fünffache Induktion = Konzentration die eine Verfünffachung der spezifischen Aktivität von CypIA bewirkt.

ICso= halbmaximale Hemmkonzentration der Zellviabilität ENTZÜNDUNGSHEMMENDE MECHANISMEN Gewünscht : Hemmung der Induktion der iNOS bei kleinen Konzentrationen, Hemmung von Cox-1 bei kleinen Konzentrationen <BR> <BR> <BR> <BR> NO2 : Hemmung der LPS-induzierten Expression der iNOS in Maus Makrophagen<BR> <BR> <BR> <BR> IC50 Hem. = halbmaximale Hemmung der Nitrit (NO) Produktion IC50 Tox. = Halbmaximale Hemmung des Zellwachstums CI s. o. n. d. not determined : nicht bestimmt Cox-1 : Hemmung der Cyclooxygenase 1 Aktivität % Hemm. : Prozentuale Hemmung bei einer Testkonzentration von 100µM IC50= halbmaximale Hemmkonzentration ANTI-OXIDATIVE MECHANISMEN LJND RADIKALFANGEREIGENSCHAFTEN Gewünscht : Hemmung bei kleinen Konzentrationen DPPH : Reaktion mit Diphenylpikrylradikalen IC50= halbmaximale Hemmkonzentration NXO : Abfangen von Superoxidradikal Anionen im Xanthin/Xanthinoxidase System.

IC50= halbmaximale Hemmkonzentration Antiox : Hemmung des Phorbolester-vermittelten Superoxidbursts in differenzierten HL-60 Zellen Nachweis über Reduktion von Cytochrom c.

% Hemm. : Prozentuale Hemmung bei einer Testkonzentration von I 00IM IC50= halbmaximale Hemmkonzentration ANTI-TUMOR PROMOVIERENDE UND ANTI-PROLIFERATIVE EIGENSCHAFTEN : Gewünscht : Hemmung der Induktion von ODC bei kleinen Konzentrationen, Hemmung der DNA Polymerase et bei kleinen Konzentrationen, anti-östrogene Eigenschaften bei kleinen Konzentrationen, keine östrogenen Eigenschaften, Hemmung der Entstehung von Läsionen im MMOC bei kleinen Konzentrationen ODC : Hemmung der Phorbolester-vermittelten Induktion der Ornithin Decarboxylase in Maus Keratinozyten (Zellinie Nr. 308) IC50= halbmaximale Hemmkonzentration a-Poly : Hemmung der humanen DNA Polymerase a % Hemm. : Prozentuale Hemmung bei einer Testkonzentration von 500 bzw. l 0011M IC50= halbmaximale Hemmkonzentration Ishikawa : östrogene (-E) bzw. antiöstrogene (+E) Effekte in der Ishikawa humanen Endometriumkrebs Zellinie (+E) IC50= halbmaximale Hemmkonzentration für ant-iöstrogene Effekte (-E) C5 = Konzentration die eine Verfünffachung der spezifischen Aktivität der alkalischen Phosphatase bewirkt (Maß für östrogene Aktivität) tox ICso : Halbmaximale Hemmung des Zellwachstums n. I. no Induction : keine Induktion Nur für eine Auswahl bestimmt (siehe Tabelle Auswahl) MMOC : Maus mammary organ culture Hemmung der Entstehung Carcinogen-induzierter prä-neoplastischer Läsionen in Maus Brustdrüsen Organkultur TT'ichtiger Hinweis auf chemoprdventive Wirkung ini Tiermodell Konz. : Testkonzentration in uM % Inh. : Prozentuale Hemmung im Vergleich zur DMBA-Kontrolle TABELLE 5 Inhibierung von DMBA-induzierten präneoptastischen Läsionen in Maus-Brustdrüsen- Organkultur Behandlungsgruppe Konzentration (µM) %-Inzidenz Inhibierung (normalisiert auf die DMBA-Kontrolle DMBA Keine 81 (13/16) n. d. Ei-9 1 50/4/8 40 DMBA Keine 72 (13/18) n. d. Ei-15 1 80 (8/10) 0 55(6/11) 25 DMBA Keine 71 (12/17) n. d. Ei-252 10 20 (2/10) 72 1 30 (3/10) 58 0. 1 44 (4/9) 38 0. 01 556/11) 23 0. 001 100 9/9) 0 DMBA Keine 71 (12/17) n. d. 1 58 (7/12) 17 10 20(2/10 72 DMBA Keine 66 (12/18) n. d. EI-1001 1 88 (8/9) 0 EI-1004 1 33 3/9 50 n. d. nicht bestimmt Resveratrol diente als interne Positivkontrolle in allen Experimenten. Bei einer Konzentration von 5llM inhibiert Resveratrol 52, 4 ~ 7, 4 % der DMBA-indzierten praneoplastischen Läsionen