АКТИВНОСТЬЮ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биохимии, конкретнее, к биологически активным пептидам, обладающим стресспротекторной активностью, которые могут найти применение в медицине и фармакологии.

Предшествующий уровень техники

Стресс (от английского strеss - напряжение) - это одна из общих неспецифических нервно-гуморальных реакций организма на действие "чрезвычайных" раздражителей (стрессоров), которая в основном определяется деятельностью гипоталамуса, гипофиза и коры надпочечников (Sеlуе H. Тhе рhуsiоlоgу апd раthоlоgу оf ехроsurе tо strеss. Мопtrеаl, 1950; Sеlуе H. Тhе strеss оf lifе. N. Y., 1956). Биологический смысл и назначение стресса - повысить общую сопротивляемость, неспецифическую устойчивость живой системы по отношению к действующему стимулу и другим стрессорам. Клинически стресс проявляется в виде общего адаптационного синдрома. Общий адаптационный синдром, как и всякая реакция, имеет свои закономерности развития и состоит из трех стадий: 1) реакция тревоги, 2) стадия резистентности, 3) стадия истощения.

Стрессоры - внешние или внутренние воздействия, приводящие к возникновению стрессовых состояний. К ним могут относиться сильные физические и психические травмы, кровопотеря, мышечные нагрузки, инфекции. Действие стрессоров приводит к увеличению секреции гипоталамического кортикотропин- рилизинг-гормона, который, по воротной системе сосудов, поступает в переднюю долю гипофиза и стимулирует здесь секрецию адренокортикотропного гормона (кортикотропина, АКТГ). Кортикотропин выделяется в кровь, достигает коры надпочечников и стимулирует образование в ее клетках глюкокортикоидов. В результате происходит централизация кровообращения: повышенное поступление крови в мышцы и уменьшение кровоснабжения периферических тканей (Сhаrmапdаri E., Тsigоs С, Сhrоusоs G. Епdосгiпоlоgу оf thе strеss rеsропsе. // Аппu. Rеv. Рhуsiоl. - 2005. - V.67. - P.259-84). Избыточное выделение гормонов надпочечников, вызванное продолжительным или чрезмерно интенсивным действием стрессора может привести к патологическим процессам (некрозам, подавлению воспалительных реакций, которые являются важным биологически барьером, ограничивающим распространение инфекции в организме т.д.) и развитию болезни адаптации (Sеrеs J., Stапсikоvа M., Svik К. еt аl. Еffесts оf сhгопiс fооd rеstгiсtiоп stгеss апd сhгопiс рsусhоlоgiсаl stгеss on thе dеvеlорmепt оf аdjuvапt аrthritis iп mаlе lопg еvепs гаts. // Ann N Y Асаd Sсi. - 2002. - V. 966. - P.315-9). Когда организм ослаблен или стрессорное воздействие оказывается чрезвычайно сильным, адаптационные возможности организма снижаются.

Многие исследователи возлагают большие надежды на возможность коррекции ответа организма на стрессор с помощью экзогенных антиоксидантных препаратов, которые препятствуют развитию патологических процессов, инициированных стресс-факторами (Тегао Т., Мizuki Т., Оhji T. еt аl. Апtidергеssапt еffесt оf lithium iп раtiепts with sуstеmiс luрus еrуthеmаtоsus апd сеrеbгаl iпfаrсtiоп, trеаtеd with соrtiсоstеrоid. // Br J Рsусhiаtгу. - 1994. - V. 164. - P.109- 11). Поэтому разработка новых эффективных и безопасных средств, способных повышать устойчивость организма к стрессору - это важная и актуальная задача современной биохимии и фармакологии.

В настоящее время биологически активные пептиды, производные природных пептидных гормонов, рассматривают как потенциальные лекарственные средства нового класса. Такие качества пептидов, как быстрая реакция организма на их введение, практически полное отсутствие токсичности, а также тот факт, что продуктами деградации пептидов являются аминокислоты, все больше привлекают внимание фармакологов и клиницистов во всем мире. В связи с тем, что эндогенные пептидные гормоны осуществляют несколько функций в организме, применение их в качестве лекарственных препаратов затруднительно. Поэтому основной задачей при конструировании новых лекарственных средств на базе природных пептидов является синтез селективно действующих аналогов с узким спектром действия, устойчивых к ферментативному расщеплению.

К сожалению, в данной области защиты организма от стрессора препаратов на основе пептидов мало. Необходимо расширение ассортимента безопасных и эффективных лекарственных средств, чтобы удовлетворить потребности всех групп населения, в том числе беременных и кормящих женщин, детей младшего возраста, водителей.

Известен препарат под торговым названием семакс (Метионил-глутамил- гистидил-фенилаланил-пролил-гли� �ил-пролин NH ₂ -Met ¹ -Gln ² -His ³ -Phe ⁴ -Pгo ⁵ -Gly ⁶ - Pгo ⁷ -OH) - синтетический аналог фрагмента кортикотропина 4-10 (А.с. СССР N° 939440, кл. С 07Cl 03/52, опублик. 30.06.1982), обладающий выраженными антигипоксическими свойствами, свойством корригировать изменения в системе биогенных аминов (серотонина в стволе мозга и селезенке, адреналина и норадреналина в надпочечниках) в постреанимационном периоде после геморрагического шока (Ваstrikоvа N. А., Shеstаkоvа S.V., Апtопоvа S.V., еt аl. Тhе biоgепiс аmiпе сопtепt оf rаt tissuеs iп thе роst rеsusсitаtiоп регiоd fоllоwiпg hеmогrhаgiс shосk апd thе еffесt оf thе рrерагаtiоп sеmах. // Раtоl. Fiziоl. Еksр. Тег. - 1999. - Jf- 3. - P.19-22). В условиях нервно-психического утомления семакс облегчает концентрацию внимания, улучшает операторскую деятельность, способствует сохранению и ускоряет восстановление умственной работоспособности. Семакс улучшает адаптацию организма к гипоксии, церебральной ишемии, наркозу и другим повреждающим последствиям (Ашмарин И.П., Левицкая H.Г., Каменский А. А., Мясоедов H. А. Семакс - новое лекарственное средство для коррекции кровообращения мозга, гипоксических состояний и повышения умственной трудоспособности. // Фарматека. - 1997. - N° 4. - С. 32-33).

Однако, действие этого препарата в условиях гипобарической гипоксии, холодового и теплового воздействия не изучено. Кроме того, для получения этого пептида требуется дорогой синтез.

Известен пептид глутамил-аспартил-глицин общей формулы

Gly ³ -OH, обладающий стресспротекторным действием (патент РФ 2304444, опубл. 20.08.2007). Применение пептида при внутримышечном или интраназальном введении позволяет регулировать уровень биогенных аминов в коре головного мозга и крови, влияя на экспрессию гена с-fоs в различных структурах головного мозга и снижая активность энкефалиназ в крови, осуществляя таким образом стресспротекторное действие.

Однако стресспротекторную активность пептида глутамил-аспартил-глицин исследовали только на модели эмоционального стресса «oткpытoe пoлe» и осмотического стресса. Действие этого пептида в условиях гипобарической гипоксии или геморарргического шока, теплового и холодового стресса неизвестно. Известны кортикотропинподобные циклопептиды I и II, имеющие следующую аминокислотную последовательность: Cyclo(Gly -Lуs -VaI -Lеu -Lуs -

Lуs -Аrg -Аrg )n, где n=2-3, обладающие стресспротекторной активностью (патент

РФ N° 2330860, опубл. 10.08.2008). Однако эти пептиды требуют сложного и

5 дорогого синтеза.

Известен наиболее близкий к заявленному изобретению пептид иммунокортин NНг-Vаl'-Lуs^Lуs^Рrо^Glу^SеΛSеΛVаl^Lуs ⁹ - VaI ¹⁰ OH, (Мitiп Y.V., Nаvоlоtskауа Е.V. еt аl. Sупthеsis апd рrореrtiеs оf thе рерtidеs соrrеsропdiпg tо thе АСТН-likе sеquепсе оf human immunoglobulin Gl Iпt. // J. Рерtidе Ргоtеiп Rеs. - 10 1993. - V. 41 - P. 517-521). Однократная внутримышечная инъекция иммунокортина крысам в дозе 10 мкг/кг приводит к снижению содержания кортикостерона в надпочечниках и крови в 2 раза через lчас и в 3 раза через 24 часа после введения. При этом, действие иммунокортина на клетки коры надпочечников осуществляется через рецептор кортикотропина (Nаvоlоtskауа, Е.V. еt аl. Sупthеtiс рерtidе 15 immuпосоrtiп stimulаtеs thе рrоduсtiоп оf 11-oxycoгticosteгoides bу rаt аdrепаl соrtех thrоugh ACTH гесерtоrs. // Rеgulаtоrу Рерtidеs. - 2004. - V. 119. - P. 99-104). Однако для получения этого пептида требуется дорогой синтез.

Раскрытие изобретения

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в 20 расширении ассортимента эффективных средств, повышающих устойчивость организма к стрессовому воздействию, и получаемых простым синтезом.

Поставленная задача решается тем, что предложен синтетический пептид, проявляющий стресспротекторную активность и имеющий формулу:

Ri-Lys ^! -Arg ² -Pro ³ -R ₂ последовательности 1 [SEQ ID NO: 1] или Ri-Lуs^Аrg ² - 25 Arg ³ -Pro ⁴ -R ₂ последовательности 2 [SEQ ID NO: 2], где Ri = NH ₂ или CH ₃ CO, R ₂ = ОН или NH ₂ , при этом пептид может иметь следующую структуру:

- пептид I или CH ₃ CO -Lys'-Arg ² -Pro ³ - NH ₂ - пептид II, а также NH ₂ -Lys ¹ -Arg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -OH - пептид III, или CH ₃ CO-Lys ¹ -Arg ² -Arg ³ -Pro ⁴ - NH ₂ - пептид IV.

30 Сущность изобретения заключается в том, что экспериментальным путем было установлено, что заявляемые пептиды, имеющие простую структуру, что облегчает их получение химическим путем, способны нормализовать содержание кортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс при таких формах стресса, как геморрагический шок и гипобарическая гипоксия. Примеры осуществления изобретения.

Пример 1. Химический синтез пептида NH ₂ -Lys ¹ -Arg ² -Pro ³ -OH.

Химический синтез пептида NH ₂ -LyS ¹ -Aгg ² -Pro -ОН осуществляли методом твердофазного синтеза пептидов с последовательным наращиванием пептидной цепи (Sсhпоlzег M, Аlеwооd P, Jопеs А, Аlеwооd D, Kent SBH. In sitи пеutrаlizаtiоп iп Вос-сhеmistгу sоlid рhаsе рерtidе sупthеsis. Rарid, high уiеld аssеmblу оf diffiсult sеquепсеs. // Iпt. J. Рерtidе Ргоtеiп Rеs. - 1992. - V. 40. - P. 180-193). Защищенный пептид получали по методике iп sitи на соответствующих амино-ацил полимерах с емкостью 0,7ммoль/г, используя синтезатор Аррliеd Вiоsуstеms 430A. В качестве постоянных защитных групп использовали мeзитилeн-2-cyльфoнильнyю (для аргинина) и 2-xлopбeнзилoкcикapбoнильнyю (для лизина). Трет- бутилоксикарбонильную группировку использовали в качестве временной защиты альфа аминогрупп. На стадии промежуточного деблокирования, ее удаляли 25% раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене. Удаление боковых защитных группировок и отщепление пептида от полимера проводили под действием безводного фтористого водорода в присутствии jи-крезола.

Пептид NH ₂ -LyS '-Arg ² -Pro ³ -OH очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой хроматографии (использовали хроматограф Gilsоп, Франция, колонку Рrер. Nоvа-Раk HR С 18, 49 х 300мм, зернистость 6 мкм). Полученный пептид охарактеризовывали данными аналитической ОФ ВЭЖХ (обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии) (использовали хроматограф Gilsоп, Франция, колонку DеltаРаk С 18 100A°, 3,9 х 150 мм, 5 мкм, скорость потока составляла lмл/мин., в качестве элюента использовали 0,1% трифторуксусную кислоту, использовали градиент ацетонитрила 20-50%), аминокислотного анализа (гидролиз 6N HCl, 24 часа, 11O ⁰ C; аминокислотный анализатор LKB 4151 Аlрhа Рlus, Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр Vоуаgеr-DЕ ВiоSресtrоmеtrу Wоrkstаtiоп, Рег Sереtivе Вiоsуstеms, США).

N-концевое ацетилирование Lуs пептида CH ₃ CO-Lys ¹ -Arg ² -Pгo ³ -NH ₂ проводили следующим образом: 0,5 г хорошо промытого и высушенного пептидилполимера помещали в силанизированную колбу, добавляли 20 мл 50% раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене и выдерживали при перемешивании 40 мин. Пептидилполимер отфильтровывали, промывали хлористым метиленом (3x10 мл), 5% диизопропилкарбодиимидом в хлористом метилене (2x10 мл), хлористым метиленом (2><10 мл), диметилформамидом (2x10 мл), добавляли N- ацетилмидазол (20 экв.) в 3 мл диметилформамида. Выдерживали 2 часа, периодически встряхивая. Отмывали полимер в той же последовательности, как и после деблокирования и снова повторяли конденсацию N-ацетилмидазолом. Удаляли реагенты, отмывали пептидилполимер и высушивали в вакууме.

Амидирование С-концевой аминокислоты Рго пептида CH ₃ CO-LyS ¹ -Аrg - Рrо -NH ₂ осуществляли с использованием остатка амидной смолы Riпk (Вос-fогm, 0.45 мМ Вос/г, Аррliеd Вiоsуstеms, Fоstег сitу, USA). Для этого с амидного остатка удаляли защитную группировку (как описано выше), затем присоединяли

соответствующую С-концевую Вое -Рrо-ОВzl (2x3 экв.), суспензию перемешивали при комнатной температуре до окончания реакции. Повторное связывание со второй парой было растянуто до окончания реакции конденсации, реакцию прекращали добавлением диметиламинопиридина (0.1 экв.) на 20-ой минуте. Пример 2. Химический синтез пептида NH ₂ -Lys ¹ -Arg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -OH.

Все стадии химического синтеза и очистки пептида NH ₂ -LyS '-Аrg ² - Arg ³ -Pгo ⁴ - OH проводили, как описано выше (см. пример 1), включая защиту концевых групп пептида (CH ₃ CO-LyS ¹ -Aгg ² -Aгg ³ -Pгo ⁴ -NH ₂ ), за исключением того, что стадии наращивания цепи производили до завершения синтеза требуемого пептида.

Пример 3. Определение аминокислотного состава пептидов NНг-Lуs ¹ -

СНзСО-Lуs'-Аrg^Аrg^РпИ-NНг.

Для определения аминокислотного состава пептидов использовали аминокислотный анализатор 4151 Аlрhа Рlus Вiосhгоm (LKB, Швеция) и интегратор 2220 Rесогdiпg Iпtеgrаtог Вгоmmа (LKB, Швеция).

Для приготовления гидролизата взвешивали 1 мг исследуемого образца пептида, помещали его в ампулу, прибавляли 1 мл 6N HCl и запаивали. Ампулу выдерживали в термостате при 110°C в течение 22 часов. Затем ампулу вскрывали, содержимое переносили в круглодонную колбу и упаривали на роторном испарителе. Остаток растворяли в 0,5 мл стартового буфера, рН 2,2. Объем запускаемого образца составлял 10-50 мкл. Аминокислотный состав рассчитывали при сравнении хроматограмм образца и стандартной калибровочной смеси аминокислот. Структуру очищенного вещества подтверждали масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получали на МАLDI-времяпролетном масс-спектрометре Vоуаgеr-DЕ ВiоSресtгоmеtrу Wоrkstаtiоп (Реr Sереtivе Вiоsуstеms, США) с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы использовали α-циaнo-4-гидpoкcикopичнyю кислоту (10 мг/мл) в 50%-нoм (v/v) ацетонитриле, содержащем 0,1%-нyю (v/v) трифторуксусную кислоту. Для калибровки прибора использовали стандартную смесь пептидов с диапазоном 700- 3500 Да (Вrukеr Dаltопik, Германия).

Было установлено, что аминокислотный состав пептидов NH ₂ -LyS ¹ -Aгg ² -Pro ³ - ОН, СНзСО-Lуs'-Агg^РпΛNНг и NH ₂ -LyS '-Аrg^Аrg^РгсΛОН, CH ₃ CO-LyS '-Агg ² - Arg ³ -Pгo ⁴ -NH ₂ соответствует теоретическому. Основные характеристики

синтезированных пептидов приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Содержание примесей в синтетических препаратах не превышало 4%.

Пример 4. Изучение связывания пептидов NH ₂ -Lys ¹ -Arg ² -Pro ³ -OH,

CH ₃ CO-LyS ¹ Ar ₈ ² Pr ₀ ³ NH ₂ и NH ₂ -LyS ¹ Ar ₈ ² Ar ₈ ³ PrO ⁴ OH, CH ₃ CO-LyS ¹ Ar ₈ ² -

Arg ³ -Pro -NH ₂ .c мембранами коры надпочечников крысы для установления механизма действия этих пептидов с помощью метода радиолигандного анализа. Для оценки способности пептидов NH ₂ -LyS *- Arg ² -Pro ³ -OH, CH ₃ CO-Lys'-Arg ² - Pгo ³ -NH ₂ и Ш ₂ -Lys ¹ -Arg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -OH, CH ₃ CO-LyS '-Аrg^Аrg^РпЛМЪ: связываться с рецептором кортикотропина мембран коры надпочечников крысы, была изучена активность каждого пептида в тесте ингибирования связывания 5 [ H]кopтикoтpoпинa (11-24) с мембранами коры надпочечников крыс. Согласно данным Капас и соавт. (Караs S., Саmmаs F.M., Нiпsоп J.P., еt аll. Аgопist апd гесерtог biпdiпg рrореrtiеs оf аdrепосоrtiсоtrорiп рерtidеs usiпg thе сlопеd mоusе аdrепосоrtiсоtгорiп гесерtог ехрrеssеd iп а stаblу transfected HeLa сеll liпе. // Епdосriпоlоgу. - 1996. - V. 137. - P. 3291-3294), кopтикoтpoпин( 11-24) активно

10 ингибирует связывание ¹²⁵ I-мeчeнoгo кортикотропина с клонированным рецептором гормона АКТГ (MC2-R-мeлaнoкopтинoвым рецептором подтипа 2), но не вызывает достоверных изменений внутриклеточной концентрации 3 ',5 '-циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), т.е. фрагмент 11-24 является антагонистом рецептора кортикотропина.

15 Для получения [ ³ H]кopтикoтpoпинa (11-24) использовали реакцию высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) (Zоlоtаrеv Y.A., Dаdауап A.K., Восhагоv E. V., еt аll. Nеw dеvеlорmепt iп thе tritium lаbеlliпg оf рерtidеs апd рrоtеiпs usiпg sоlid саtаlуtiс isоtорiс ехсhапgе with sрillоvеr- tritium. // Аmiпо Асids. - 2003. - V. 24. - P. 325-33). Включение трития в пептид

20 рассчитывали с использованием жидкостного сцинтилляционного счета. Удельная активность [ ³ H]кopтикoтpoпинa (11-24) после очистки составляла 22 Ки/ммоль.

Мембраны из коры надпочечников крыс выделяли по методике (DaI Fагrа С,. Zsurgеr, N., Viпсепt, J-P., еt аll. Biпdiпg оf а рuге 1251-moпoiodoleptiп апаlоg tо mоusе tissuеs: а dеvеlорmепtаl studу. // Рерtidеs. - 2000. - V. 21. - P. 577-587). Концентрацию

25 белка определяли с помощью метода Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (Lоwrу О. H., Rоsеbbгоugh NJ. , Fаrr О. L., еt аll. Ргоtеiп mеаsurеmепt with thе Fоliп рhепоl геаgепt. // J. Вiоl. Сhеm. - 1951. - V. 193. - P. 265- 275).

Реакцию связывания [ ³ H] кортикотропина (11-24) с мембранами проводили в

30 50 мМ Тris-НСl-буферном растворе, рН 7,5, по следующей схеме: во все стеклянные силиконизированные пробирки вносили 100 мкл меченого пептида [ ³ H]кopтикoтpoпинa (11-24), концентрации 10 нМ. В три контрольные пробирки вносили 100 мкл буфера. В опытные пробирки добавляли 100 мкл немеченого пептида, разведенного в буфере в концентрации 10 ^"12 , 10 ^"u , 10 ^"I0 ,10 ^"9 , 10 ^"8 , 10 ^"7 , 10 ^"6 M по три повтора для каждой концентрации. В качестве немеченых пептидов использовали CH ₃ CO-LyS ¹ -Aгg ² -Aгg ³ -Pro ⁴ -NH ₂ , NH ₂ -LyS '-Аrg^Аrg^РпЛоН и NH ₂ - Lys'-Aгg ² -Pro ³ -OH, CH ₃ CO-Lys ¹ -Aгg ² -Pro ³ -NH ₂ . После внесения немеченноrо пептида в пробирку добавляли 800 мкл свежеприготовленной суспензии мембран (0,2 мг белка/мл). Все пробирки инкубировали при 4°C в течение 1 ч. По окончании инкубации реакционную смесь фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/С («Whatman», Англия). Фильтры трижды промывали по 5 мл ледяного физиологического раствора. Радиоактивность на фильтрах подсчитывали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика LS 5801 («Beckman», США). Контрольные показатели принимали за общее связывание, а опытные за неспецифическое связывание. Величину специфического связывания [ ³ H]кopтикoтpoпинa (11-24) с мембранами определяли по разности между его общим и неспецифическим связыванием и выражали в молях на 1 мг белка.

Константу ингибирования (K ₁ ) определяли по формуле K ₁ = [I]so/(1 + [L]ZK _d ), где [L] - молярная концентрация [ ³ H]кopтикoтpoпинa (11-24); K _d - равновесная константа диссоциации комплекса [ ³ H]кopтикoтpoпин (11-24) - рецептор; [I] ₅₀ - концентрация немеченого пептида, вызывающая 50%-нoe ингибирование специфического связывания меченого пептида (Сhепg, Y.C., Рrusоff, W. Моusе аsсitеs sаrсоmа 180 thуmidуlаtе kiпаsе. Gепегаl ргорегtiеs, kiпеtiс апаlуsis, and inhibition studiеs. // Вiосhеmistrу. - 1973. - V. 12. - P. 2612-9). Величину [I] ₅₀ определяли графически на основании кривой ингибирования (график зависимости % ингибирования от молярной концентрации ингибитора).

Значение K _& определяли предварительно. Реакцию связывания [ ³ H]кopтикoтpoпинa (11-24) с мембранами проводили в 50 мМ Тris-НСl-буферном растворе, рН 7,5, по следующей схеме: в стеклянные силиконизированные пробирки вносили 100 мкл [ ³ H]кopтикoтpoпинa (11-24) в концентрации 10 ^"10 , 10 ^'9 , 10 ^"8 , 10 ^"7 M, по шесть повторов для каждой концентрации (три контрольных пробирки и три опытных). В контрольные пробирки вносили 100 мкл буфера (эти данные будут приняты за общее связывание), в опытные - 10 ^"3 M раствора немеченого пептида кортикотропина (11-24) в буфере (эти данные будут приняты за неспецифическое связывание) и 800 мкл свежеприготовленной суспензии мембран (0,2 мг белка/мл). Пробирки инкубировали при 4°C в течение 1 ч. По окончании инкубации реакционную смесь фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/С («Whatman», Англия). Фильтры трижды промывали 5 мл ледяного физиологического раствора. Радиоактивность на фильтрах подсчитывали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика LS 5801 («Beckman», США). Величину специфического связывания [ ³ H]кopτикoτpoпинa (11-24) с мембранами определяли по разности между его общим и неспецифическим связыванием и выражали в молях на 1 мг белка. Для определения параметров специфического связывания меченого пептида с мембранами (равновесной константы диссоциации K _d и B _max - максимальной связывающей способности в расчете на 1 мг белка) строили графики зависимости отношения молярных концентраций связанного (В) и свободного (F) меченого пептида от молярной концентрации связанного меченого пептида (В) (Сhапg K-J., Jасоbs S., Сuаtrесаsаs P. Quапtitаtivе аsресts оf hоrmопе-rесерtоr iпtеrасtiопs оf high аffiпitу. Еffесt оf rесерtог сопсепtгаtiоп апd mеаsurеmепt оf dissосiаtiоп сопstапts оf lаbеlеd апd uпlаbеlеd hоrmопеs. // Вiосhim. Вiорhуs. Асtа. - 1975. - V. 406. - P. 294-303). Неспецифическое связывание [ ³ H]кopтикoтpoпинa (11- 24) в этих условиях составляло 15,3 ± 2,2 % от величины его общего связывания. Анализ специфического связывания [ ³ H]кopтикoтpoпинa (11-24) с мембранами коры надпочечников крысы в координатах Скэтчарда показал, что меченый пептид взаимодействует с одним типом рецепторов кортикотропина, K _d 1,9 ± 0,1 нМ.

Параллельно в качестве потенциальных ингибиторов связывания меченого кортикотропина (11-24) были протестированы немеченые кортикотропин (4-10), соматостатин, β-эндорфин, [Met ⁵ ]энкeфaлин. Результаты экспериментов, представленные в таблице 2, показывают, что пептиды CH ₃ CO-LyS '-Aгg ² -Aгg ³ -Pro ⁴ - NH ₂ , NH ₂ -Lys ¹ -Arg ² -Arg ³ -Pгo ⁴ -OH и NH ₂ -LyS '-Arg ² -Pro ³ -OH, CH ₃ CO-LyS '-Arg ² -Pro ³ - NH ₂ способны с высоким сродством связываться с рецептором кортикотропина на мембранах коры надпочечников крысы: K ₁ составила 2,1 2,0 и 2,4 2,3 нМ для пептидов CH ₃ CO-Lys'-Aгg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -NH ₂ , NH ₂ -LyS ¹ -Aгg ² -Aгg ³ -Pгo ⁴ -OH и NH ₂ -LyS ¹ - Arg ² -Pгo ³ -OH, CH ₃ CO-LyS -Aгg ² -Pгo ³ -NH ₂ соответственно. Для сравнения приведены данные фрагмента кортикотропина 11-24, который ответственен за связывание гормона с рецептором. Таблица 2

* Приведены данные ± SEM (стандартная ошибка среднего) двух независимых экспериментов. Пример 5. Определение влияния AKTГ(l-24) и пептидов NНг-Lуs'-Аrg ² -

Arg ³ -Pro ⁴ -OH и NH ₂ -Lys ¹ -Arg ² -Pro ³ -OH, на аденилатциклазную активность в мембранах коры надпочечников крысы.

Активность аденилатциклазы определяли с помощью α[ ³² P]ATФ по известному методу (Sаltаrеlli D, Fisсhеr S, Gacon G. Моdulаtiоп оf аdепуlаtе сусlаsе bу guапiпе пuсlеоtidеs апd Кirstеп sаrсоmа viгus mеdiаtеd trапsfоrmаtiоп. // Вiосhеm.

Вiорhуs. Rеs. Соmmuп. - 1985. - V. 127. - P. 318-325).

Состав среды для проведения реакции: 40 мМ Трис-НСl, рН 7,4, содержащий 50 мкМ АТФ, 4 мМ цАМФ, 12 мМ фосфоенолпируват, пируваткиназу (2 мкг/мл).

20 мкл суспезии мембран (50-100 мкг белка) вносили в стеклянные силиконизированные конические пробирки, находящиеся в ледяной бане, добавляли α[ ³² P]ATФ (200000-500000 имп/мин) в 30 мкл среды и 50 мкл пептида NH ₂ -LyS ¹ - Aгg ² -Pгo ³ -OH (опыт 1), или NH ₂ -LyS ¹ -Arg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -OH (опыт 2), взятых в концентрации 0,1, 1,0, 10,0, 100,0 и 1000,0 нМ, или такой же объем буфера (контроль). Опытные и контрольные пробирки переносили в термостат и выдерживали при 34°C в течение 45 мин. Реакцию останавливали добавлением 0,5 M HCl. После этого пробирки помещали в кипящую водяную баню на 15 мин, а затем переносили в ледяную баню и добавляли в каждую по 100 мкл 1,5 M имидазола. Содержимое каждой пробирки пропускали через отдельную колонку с 1 см ³ Al ₂ O ₃ по Брокману II (Sigmа-Аldriсh, США) и промывали 5мл дистиллированной воды. Активность фермента определяли по убыли субстрата и выражали в нмоль цАМФ, образовавшегося за 10 мин, на 1 мг белка мембран коры надпочечников.

Данные о влиянии AKTF(I -24), пептидов NH ₂ -LyS ¹ -Arg ² -Aгg ³ -Pro ⁴ -OH и NH ₂ -LyS -Aгg ² -Pгo ³ -OH на аденилатциклазную активность в мембранах коры надпочечников крысы представлены в таблице 3. Результаты показывают, что пептиды NH ₂ -LyS ¹ -Aгg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -OH и NH ₂ -Lys ¹ -Aгg ² -Pгo ³ -OH в концентрации 0,1 - 1000 нМ не влияют на активность фермента, в то время как AKTF(I -24) подавляет ее.

Таблица 3

В таблице приведены данные трех независимых экспериментов ± SEM.

1 ¹ J "X

Пример 6. Определение влияния пептидов СНзСО-Lуs -Аrg -Рrо -NH ₂ и CHзCO-Lys ^! -Arg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -NH ₂ на уровень кортикостероидов и катехоламинов в крови и надпочечниках на моделях острой геморрагии и гипобарической гипоксии у крыс iп vivо.

В экспериментах использовали половозрелых самцов крыс линии Wistаr массой 180-200 г по 10 крыс в контрольной и каждой из опытных групп.

Моделью острой геморрагии служила 1 -часовая артериальная гипотензия. Для её создания у наркотизированных нембуталом в дозе 40 мг/кг крыс через катетер в хвостовой артерии производили взятие крови до достижения среднего артериального давления 40 мм ртутного столба. До начала кровопотери животным внутривенно вводили гепарин (0,5 мл, 50 ЕД/мл) для предотвращения свертывания крови во время проведения длительного эксперимента.

По истечении времени гипотензии крыс реанимировали путем внутриартериального введения взятой крови. Сразу после восполнения кровопотери проводили внутривенную инфузию одного из исследуемых пептидов CH ₃ CO-LyS ¹ - Arg ² -Pгo ³ -NH ₂ (в дозе 1 или 10 мкг/кг/мин в течение 10 мин) или CH ₃ CO-LyS -Аrg - Arg ³ -Pгo ⁴ -NH ₂ (в дозе 1 или 10 мкг/кг/мин в течение 10 мин) или аналогичного объема (0,8 мл) физиологического раствора (ФР) через яремную вену (контроль 1, ФР).

Поскольку, как правило, регуляторные пептиды имеют каскадный механизм действия, и их влияние может сказываться через длительное время после введения, декапитацию животных и взятие материала для биохимических исследований проводили на 1-е и 7-е сутки. Контрольной группе животных проводили полную операцию без геморрагического шока. Значения биохимических показателей в этой (контрольной) группе принимали за 100%.

Для создания условий развития острой гипобарической гипоксии, крыс (половозрелых самцов линии Wistаг массой 180-200 г по 10 животных в контрольной и каждой из опытных групп) помещали в барокамеру с давлением 154 мм ртутного столба, соответствующем атмосферному давлению на высоте 11500 м от уровня моря, и выдерживали в этих условиях до принятия ими бокового положения. Каждый из исследуемых пептидов CH ₃ CO-LyS ¹ -Аrg -Рго -NH ₂ или CH ₃ CO-LyS '-Аrg - Aгg ³ -Pro ⁴ -NH ₂ вводили крысам одной опытной группы интраназально в дозе 0,1 или 1 мкг/кг массы тела животного, причем каждую дозу вводили за 1 и 24 часа до "подъёма". Параллельно крысам контрольной группы вводили физиологический раствор (ФР) (контроль 1, ФР). Декапитацию животных и взятие материала для биохимических исследований проводили на 1-е и 7-е сутки после "подъема". Значения биохимических показателей в контрольной группе (без шока) принимали за 100%.

Содержание глюкокортикоидов (11-oкcикopтикocтepoидoв) в надпочечниках и крови определяли по методу (Nаvоlоtskауа, E.V., Vапiпа, V. L, Zоlоtаrеv, еt аl. Sупthеtiс рерtidе immшiосоrtiп stimulаtеs thе ргоduсtiоп оf 11 -охусоrtiсоstеrоidеs bу гаt аdrепаl согtех thrоugh ACTH гесерtоrs. // Rеgulаtоrу Рерtidеs. - 2004. - V. 119. - P. 99- 104), принцип которого основан на способности 11-oкcикopтикocтepoидoв флуоресцировать после их обработки смесью серной кислоты и этилового спирта (3:1, по объёму).

Гормоны из ткани надпочечников экстрагировали с помощью хлороформа. Содержание флуоресцирующих продуктов измеряли на флуориметре "Нitасhi 850" (Япония) при λ (длине волны) 530 нм (λ возбуждающего света = 470 нм). Количество 11-oкcикopтикocтepoидoв определяли по калибровочной кривой и выражали в микрограммах на 1 г ткани. Для статистической обработки результатов использовали t-критерий Стьюдента.

Содержание катехоламинов в надпочечниках определяли по методу (Меtсаlf,

G. А rарid mеthоd fоr thе simultaneous determination оf погаdrепаliпе, dораmiпе апd 5HT iп smаll sаmрlеs оf bгаiп tissuе. // Апаl. Вiосhеm. - 1974. - V. 57. - P. 316-320).

Экстракцию катехоламинов из ткани надпочечников проводили последовательной обработкой гомогената ткани надпочечников кислым я-бутанолом и смесью и-гептана и воды (4,5:1, по объёму). Затем к водной фазе добавляли 2 M ацетат натрия, содержащего 0,2% ЭДТА и алюминий по Брокману I (Sigmа-Аldriсh, США). После центрифугирования (5 мин при 200Og) сорбент промывали водой, переносили в 0,5 M фосфатный буфер, рН 6,0, содержащий 0,75% ЭДТА, и помещали на 15 минут в шейкер для элюирования катехоламинов, а затем снова центрифугировали.

Флуоресцирующие продукты катехоламинов получали с помощью тригидроксиин дольной реакции (Сhапg CC. А sепsitivе mеthоd fоr sресtrорhоtоfluоrоmеtгiс аssау оf саtесhоlаmiпеs. // Iпt. J. Nеurорhагmасоl. - 1961. - V. 3. - P. 643-649).

Измерение флуоресценции проводили на флуориметре "Нitасhi 850" (Япония) для адреналина при λ = 500 нм и возбуждающем свете с λ = 410 нм и для норадреналина при λ = 485 и λ = 385 нм соответственно. Количество адреналина и норадреналина определяли по калибровочной кривой и выражали в микрограммах на 1 г гомогенизированной ткани надпочечников.

Достоверность различий экспериментальных данных между контролем и опытом оценивали по t-критерию Стьюдента.

В таблицах 4 и 5 представлены данные о влиянии пептидов CH ₃ CO-LyS '-Агg ² - Рrо -NH ₂ и CH ₃ CO-LyS -Агg -Aгg ³ -Pro ⁴ -NH ₂ на содержание 11-oкcикopтикocтepoидoв и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс в на 1-е и 7-е сутки постреанимационного периода после геморрагического шока.

Как видно из этих таблиц, через 1 сутки после геморрагического шока уровень 11-oкcикopтикocтepoидoв в надпочечниках и плазме контрольной группы 1 (шок + ФР) животных возрастал на 59 и 48% соответственно. Через 7 суток содержание 11-oкcикopтикocтepoидoв в надпочечниках и плазме снижалось, оставаясь выше контрольного уровня (без шока) на 19 %, и 31 % соответственно.

Введение пептидов CH ₃ CO-LyS '-Aгg ² -Pro ³ -NH ₂ и CH ₃ CO-Lys ¹ -Arg ² -Aгg ³ -Pro ⁴ - NH ₂ в дозе 1 мкг/кг приводило к уменьшению содержания 11-oкcикopтикocтepoидoв в надпочечниках и плазме как через 1, так и через 7 суток, увеличение дозы этих пептидов до 10 мкг/кг сопровождалось снижением уровня гормонов во всех изученных случаях до контрольных значений (без шока).

Как видно из таблиц 4 и 5, через 1 сутки после геморрагического шока концентрация адреналина и норадреналина в надпочечниках снижалась по сравнению с контрольным уровнем (без шока) на 38% и 22% соответственно. Через 7 суток после шока эти показатели были близки к контрольным значениям (без шока).

Напротив, через 1 час после геморрагического шока содержание адреналина в плазме возрастало на 79%, а через 7 суток превышало контрольный уровень (без шока) на 24%. Резкое снижение содержания адреналина в надпочечниках через 1 час после шока и одновременный рост его в плазме свидетельствует об увеличении секреции гормона из надпочечников в кровь. Каждый из исследуемых пептидов в дозах 1 и 10 мкг/кг предотвращал данный эффект: содержание адреналина в надпочечниках и плазме через 1 и 7 суток после геморрагического шока было близко к контролю (без шока).

Таким образом, пептиды СНэСО-Lуs'-Аrg^Рrо^NНг и CH ₃ CO-Lys'-Arg ² -Arg ³ - Pro ⁴ -NH ₂ в дозах 1 и 10 мкг /кг оказывают значительное корригирующее действие на содержание 11-oкcикopтикocтepoидoв и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс, подвергнутых геморрагическому шоку.

В таблице 6 приведены результаты исследования влияния пептидов CH ₃ CO-

Lys'-Arg ² -Pro ³ -NH ₂ и CH ₃ CO-Lys'-Arg ² -Arg ³ -Pгo ⁴ -NH ₂ на содержание 11- оксикортикостероидов и адреналина в надпочечниках и плазме крови крыс в на 1-е и 7-е сутки после гипобарической гипоксии. Видно, что характер изменений содержания гормонов в надпочечниках и плазме после "подъема" был таким же, как и в случае геморрагического шока. Интраназалыюе введение пептидов CH ₃ CO-LyS ¹ - Arg ² -Pгo ³ -NH ₂ и CH ₃ CO-Lys ¹ -Arg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -NH ₂ в дозах 0,1 и 1 мкг/кг за 1 и 24 часа до "подъёма" нормализовало содержание 11-oкcикopтикocтepoидoв и адреналина в надпочечниках и плазме крови крыс, подвергнутых гипоксии.

Таким образом, синтетические пептиды CH ₃ CO-LyS ¹ -Aгg ² -Pro ³ -NH ₂ и CH ₃ CO-

Lys ¹ -Aгg ² -Aгg ³ -Pгo ⁴ -NH ₂ оказывают корригирующее действие на уровень 11- оксикортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс при таких формах стресса, как геморрагический шок и гипобарическая гипоксия.

1 7 4

Пример 7. Определение влияния пептидов NH ₂ -LyS -Аrg -Рrо -ОН и NH ₂ -

Lys ¹ -Arg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -OH на уровень кортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и содержание свободного гистамина и активности диаминоксидазы в сердечной мышце на моделях холодового и теплового шока у крыс iп vivо.

Для экспериментов брали половозрелых самцов линии Wistаr массой 180-200 г по 10 животных в контрольной и каждой из опытных групп.

Для создания модели холодового шока крыс опытных групп выдерживали в состоянии свободного плавания в кювете с водой при температуре 4°C в течение 3 минут.

Для теплового воздействия животных опытных групп помещали в вентилируемую термокамеру при температуре 40°C на 1 час. Растворы исследуемых пептидов NH ₂ -LyS ¹ -Arg ² -Pro ³ -OH (в дозе 10 или 20 мкг/животное) или NH ₂ -LyS ¹ - Arg ² -Aгg ³ -Pro ⁴ -OH (в дозе 10 или 20 мкг/животное) или физиологический раствор (контроль 1) вводили интраназально три раза за 3, 2 и 1 сутки до шока. В контрольной группе животных термическому воздействию не подвергали. Значения биохимических показателей в контрольной группе принимали за 100%.

Содержание глюкокортикоидов (11-oкcикopтикocтepoидoв, КС) и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс определяли, как описано выше (пример 6).

Содержание свободного гистамина в сердечной мышце крыс определяли по методу (Rоmbеrg A.L., Hakanson R. А simрlifiеd ргосеdurе fог thе fluоrоmеtгiс dеtегmiпаtiоп оf histаmiпе iп rаt stоmасh. // Аgепts Асtiопs. - 1984. - V. 14. - P. 195- 199), а активность фермента диаминоксидазы (ДАО) - по методу (Lеуtоп G.В. А simple routine method for mono and diamine охidаsе еstimаtiоп iп humап sеrum. // Раthоlоgу. - 1981. - V. 13. - P. 327-333).

Для экстракции гистамина ткань надпочечников гомогенизировали в 0,4 N хлорной кислоте, гомогенат центрифугировали. К 4 мл надосадочной жидкости 5 добавляли смесь 0,5 мл 5 N NaOH и 10 мл w-бутанола, содержащую 1,5 г NaCl. Затем после 5-минутного встряхивания смесь центрифугировали и из водной фазы, содержащей гистамин, отбирали аликвоту (2 мл) для проведения реакции конденсации с о-фталевым альдегидом (1%-ный раствор в метаноле, 4 мин).

Флуоресценцию 11-oкcикopтикocтepoидoв измеряли на флуориметре "Нitасhi

10 850" (Япония) при λ = 450 нм и возбуждающем свете с λ = 365 нм. Количество гистамина определяли по калибровочной кривой и выражали в микрограммах на 1 г ткани. Активность диаминоксидазы ДАО оценивали по убыванию субстрата (гистамина) и выражали в мкг гистамина за 1 час в 1 г ткани.

При статистической обработке результатов достоверность различий между

15 опытом и контролем оценивали по t-критерию Стьюдента.

В таблицах 7 и 8 представлены данные о влиянии пептидов NH ₂ -LyS '-Агg ² - Pгo ³ -OH и NH ₂ -LyS '-Aгg ² -Arg ³ -Pгo ⁴ -OH на содержание 11-oкcикopтикocтepoидoв (КС) и катехоламинов (адреналина и норадреналина) в надпочечниках и плазме крови крыс после холодового и теплового шока.

20 Видно, что как холодовое, так и тепловое воздействие приводило к значительному увеличению (в 2,5 - 3 раза) содержания КС и адреналина в надпочечниках и плазме крови крыс (ФР, контроль 1). Исследуемые пептиды NH ₂ - Lys ¹ -Arg ² -Pro ³ -OH или NH ₂ -LyS '-Aгg ² -Aгg ³ -Pro ⁴ -OH отменяли (доза 20 мкг/животное троекратно) или значительно снижали (доза 10 мкг/животное троекратно) резкое

25 возрастание содержания КС и катехоламинов в надпочечниках и плазме, вызванное температурным воздействием.

В таблице 9 приведены данные о влиянии пептидов NH ₂ -LyS ¹ -Aгg ² -Pгo ³ -OH и NH ₂ -LyS '-Arg ² -Aгg ³ -Pro ⁴ -OH на активность диаминоксидазы (ДАО) и содержание свободного гистамина в миокарде крыс после холодового и теплового шока.

30 Видно, что у крыс, подвергнутых холодовому шоку, активность фермента

ДАО резко снижалась (до 36 % от контрольного уровня без шока), а у крыс, подвергнутых тепловому шоку, напротив, значительно возрастала (на 70 %). В то же время, содержание свободного гистамина незначительно возрастало как при холодовом, так и при тепловом шоке (на 16 и 21 % соответственно). Троекратное интраназальное введение любого из исследуемых пептидов (NH ₂ -LyS '-Aгg ² -Pro ³ -OH в дозах 10 или 20 мкг/животное или NH ₂ -Lys ¹ -Arg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -OH в дозах 10 или 20 мкг/животное) крысам за трое, двое и одни сутки до шока предотвращало резкие изменения активности ДАО и нормализовало содержание свободного гистамина в сердечной мышце.

Таким образом, троекратное интраназальное введение пептидов NH ₂ -LyS ¹ - Arg ² -Pro ³ -OH или NH ₂ -Lys'-Aгg ² -Arg ³ -Pгo ⁴ -OH крысам в дозах 10 или 20 мкг/животное за трое, двое и одни сутки до холодового или теплового шока предотвращает резкое возрастание уровня 11-oкcикopтикocтepoидoв и катехоламинов в надпочечниках и плазме, а также устраняет изменения содержания свободного гистамина и активности диаминоксидазы в миокарде, вызванные температурным воздействием. Наиболее эффективное действие пептиды NH ₂ -LyS ¹ - Aгg ² -Pгo ³ -OH и NH ₂ -LyS ¹ -Aгg ² -Aгg ³ -Pro ⁴ -OH демонстрировали в дозе 10 мкг/животное.

Промышленная применимость

Приведенные примеры конкретного выполнения подтверждают, что заявляемые пептиды CH ₃ CO-Lys'-Aгg ² -Aгg ³ -Pгo ⁴ -NH ₂ , NH ₂ -LyS ¹ -Arg ² -Arg ³ -Pгo ⁴ -OH и NH ₂ -Lys ¹ -Arg ² -Pro ³ -OH, CH ₃ CO-LyS ¹ -Arg ² -Pro ³ -NH ₂ состоят из 3-х и 4-х аминокислотных остатков, что упрощает и значительно удешевляет их получение химическим синтезом. Кроме того, защищенные С- и N-концевые участки пептидов продлевают время жизни пептидов в активной среде, т.к. делают их более устойчивыми к действию протеаз. Продукты распада пептидов - аминокислоты, которые легко усваиваются организмом и используются для биохимических реакций. Действие этих пептидов осуществляется через рецепторы адренокортикотропного гормона, ответственного за реакцию организма на стрессовое воздействие.

Пептиды способны нормализовать содержание кортикостероидов и катехоламинов в надпочечниках и плазме крови крыс при таких формах стресса, как геморрагический шок и гипобарическая гипоксия, тепловой и холодовой шок.

По сравнению с известными, предлагаемые пептиды способны поддерживать на стационарном уровне систему гистамин - ДАО в миокарде крыс. Троекратное интраназальное введение пептидов CH ₃ CO-LyS '-Arg ² -Aгg ³ -Pгo ⁴ -NH ₂ , NH ₂ -LyS '-Аrg ² - Aгg ³ -Pгo ⁴ -OH и NH ₂ -Lys ¹ -Arg ² -Pro ³ -OH, CH ₃ CO-Lys ¹ -Arg ² -Pro ³ -NH ₂ крысам в дозах 10 или 20 мкг/животное за трое, двое и одни сутки до холодового или теплового шока предотвращает резкое возрастание уровня 11-oкcикopтикocтepoидoв и катехоламинов в надпочечниках и плазме, а также устраняет изменения содержания свободного гистамина и активности диаминоксидазы в миокарде, вызванные температурным воздействием. Это свойство пептидов позволяет уберечь сердечнососудистую систему организма от перегрузок.

Интраназальный способ введения предложенных пептидов удобен и практичен, так как позволяет человеку вводить препарат самому (ребенку, водителю, беременной женщине, человеку с ограниченными возможностями) в любое удобное время и в любом месте.

Таким образом, техническим результатом предлагаемого изобретения является высокая стресспротекторная активность предложенных пептидов, что позволяет рассматривать их в качестве основы для создания безопасных лекарственных средств, повышающих устойчивость организма к различным стрессовым воздействиям, таким как холодовому, тепловому, гипоксии, геморрагии.

Совершенно очевидно любому специалисту в области фармакологии, что на основе предложенного изобретения легко может быть создана фармацевтическая композиция, обладающая стресспротекторным действием, и содержащая в качестве активного начала эффективное количество пептида Ri-Lys'-Aгg ² -Arg ³ -Pro ⁴ -R _2; или Ri-Lys'-Arg ² -Pгo ³ -R ₂ , где Ri = NH ₂ или CH ₃ CO и R ₂ = ОН или NH ₂ , или смесь этих пептидов в любом сочетании и соотношении и фармацевтически приемлемый носитель. Очевидно также, что в качестве носителя может быть использовано любое фармацевтически приемлемое вещество, не вступающее в реакцию с аминокислотами и не разрушающее их.

Предложенное изобретение позволяет обеспечить возможность профилактики и/или лечения функциональных или стрессиндуцированных нарушений, возникающих при экстремальных воздействиях. Для чего, как показали наши описанные выше эксперименты, достаточно вводить пациенту предложенные пептиды или их смесь в любом сочетании и соотношении в дозе 0,1-20 мкг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. Наиболее оптимальное введение предложенных пептидов - интраназальное.

Таблица 5.

ФР - физиологический раствор + шок (контроль 1); KRRP - CH ₃ CO-LyS -Arg -Aгg - Pгo ⁴ -NH ₂ ; KRP - СНзСО-Lуs'-Агgf-РкΛNНг; *P < 0.02, **P < 0.001. Таблица 6.

ФР - физиологический раствор + шок (контроль 1); KRRP - CH ₃ CO-LyS '-Arg ² -Arg ³ - Pгo ⁴ -NH ₂ ; KRP - CH ₃ CO-LyS '-Arg ² -Pro ³ -NH ₂ ; *P < 0.02, **P < 0.001.

Таблица 7.

ФР - физиологический раствор + шок (контроль 1); KRRP - NH ₂ -LyS -Aгg -Arg -Pгo - OH; KRP - NНг-Lуs'-Аrg^РпΛоН; *P < 0.02. Таблица 8.

ФР - физиологический раствор + шок (контроль 1); KRRP - NH ₂ -LyS -Агg -Аrg -Рго - ОН; KRP - NНз-Lуs'-Аrg^Рrо -ОН; *P < 0.02.

Таблица 9.

ФР - физиологический раствор + шок (контроль 1); KRRP - NH ₂ -LyS -Аrg -Агg -Рго -

ОН; KRP - NH ₂ -LyS -Аг —g _Λ 2 - TР _J- го„3 -ОН; *P < 0.02.