Synthetische, statistische Thymuspeptid-Kombination und deren Verwendung als immunologisch und/oder endokrinologisch wirkendes Präparat Die Erfindung betrifft eine synthetische, statistische Thymuspeptid-Kombination und deren Verwendung als immunologisch und/oder endokrinologisch wirkendes Präparat.

Aus einer zunehmenden Zahl wissenschaftlicher Veröffentlichungen wird deutlich, da es eine Kommunikation mittels niedermolekularer Signalstoffe zwischen dem Gehirn, den Organen des Immunsystems (Knochenmark, Thymus, Lympfknoten, Milz, Darmschleimhaut, Lungenepitel und Körperhaut) und dem endokrinen System der hormonalen Steuerung gibt. Aus Thymusgewebe wurden niedermole- kulare Eiwei stoffe, sogenannte Signalpeptide identifiziert, die sowohl auf neuro- naler Ebene als Neurotransmitter fungieren, als auch auf immunologischer Ebene als Differenzierungsfaktoren.

Es lie sich in Tierexperimenten nachweisen, da niedermolekulare Signalpeptide die Differenzierungskaskade in T- und B-Lymphozyten aus pluripotenten Stamm- zellen induzieren können, wenn derartige Peptidwirkstoffe subcutan dem Orga- nismus zugeführt werden. Darüber hinaus ist ermittelt worden, da derartige Si- gnalmoleküle, deren Zusammensetzung proteinischen Elementen der Thymus- drüse entspricht, den Organismus vor opportunistischen Infektionen schützen können, wenn dieser z.B. durch Röntgenstrahlen, Krebs-Chemotherapie oder eine latente Virusinfektion vorgeschädigt ist. Begleitet werden derartige Vorschädigun- gen des regulatorischen Gleichgewichts des Organismus' durch hormonale Stö- rungen, die sich hauptsächlich durch veränderte Fertilität, geistige und körperliche Leistungsminderung, Schlafstörungen und Appetitlosigkeit ausdrücken. Darüber hinaus fällt beim Menschen eine verminderte Schutzfunktion der Haut sowie der Qualität des Haar- und Nagelwuchses auf.

Erfahrungsheilkundlich wird diesem Syndrom seit langem dadurch begegnet, da Organextraktpräparate als Arzneimittel oder Nahrungszusatzstoffe verwendet werden. Derartige Präparate aus tierischem Thymusgewebe, insbesondere Kalbsthymus, haben eine breite Verwendung gefunden, wenn auch bisher an sol- chen Präparaten ein molekular definiertes Wirkprinzip nicht beschrieben worden ist. Positive Daten aus einer Reihe von biologischen Studien in vivo mit solchen Thymuspräparaten erlauben den Schlu , da Inhaltsstoffe des Thymusgewebe synergistische Effekte sowohl auf das neuronale wie auch das Immunsystem ausüben. Allerdings trat in den vergangenen fünf Jahren das Risiko der Kontami- nation solcher tierischen Organextrakt-Präparate mit Prion-Proteinen in den Vor- dergrund, denen angelastet wird, die Symptome des BSE (Bovine Spongiforme Encephalopathie, "Rinderwahnsinn") zu übertragen.

Demzufolge liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein immuno- logisch und/oder endokrinologisch wirkendes Präparat bereitzustellen, das einer- seits die positiven Erfahrungen mit Thymuspeptid-Kombinationen fortzuschreiben erlaubt, andererseits aber das BSE-Risiko gänzlich ausschlie t. Des weiteren soll eine synthetische, statistische Thymuspetid-Kombination und deren Verwendung als immunologisch und/oder endokrinologisch wirkendes Präparat mit entspre- chenden Vorteilen angegeben werden.

Die voranstehende Aufgabe wird erfindungsgemä durch die Merkmale des An- spruches 1 gelöst. Danach enthält ein immunologisch und/oder endokrinologisch wirkendes Präparat als Wirkstoff kurzkettige Peptide mit einem für Thymusgewebe charakteristisch gewichteten Mengenverhältnis und Muster an Aminosäuren.

Der abhängige Patentanspruch 2 bezieht sich auf eine ganz bestimmte Herstel- lung, nämlich schrittweise Aneinanderreihung von einzelnen, chemisch geeignet derivatisierten Aminosäuren zu kurzkettigen Peptiden und Freisetzung dieser synthetischen Peptide aus ihrer N-terminal und an Seitenfunktionen derivatisierten Form unter Aufrechterhaltung des für Thymusgewebe charakteristisch gewichteten Mengenverhältnisses und Musters an Aminosäuren.

Patentanspruch 3 ist nebengeordnet und betrifft die Verwendung von syntheti- sierten kurzkettigen Peptiden mit einem für Thymusgewebe charakteristisch ge- wichteten Mengenverhältnis und Muster an Aminosäuren mit immunologisch und/oder endokrinologisch wirksamen Eigenschaften, und zwar von synthetische, statistische Thymuspeptid-Kombinationen enthaltenden Präparaten. Die weiter abhängigen Patentansprüche 4 bis 8 beziehen sich auf ganz besondere Verwen- dungen, nämlich bei Immunschwäche und Immundefekten, bei hormonalen Stö- rungen, als Baustoff für Haut, Haare und Nägel, im kosmetischen Bereich und schlie lich im Bereich der Nahrungsergänzungsmittel.

Ausgehend von Thymusprotein-Partialhydrolysaten, Eiwei gemischen aus kurz- kettigen Thymuspeptiden und -Aminosäuren, die durch enzymatische oder/und chemische Partialhydrolyse von Thymusgewebe entstehen, wurden derartige Kombinationen chromatographisch und aminosäureanalytisch dahingehend aufge- klärt, da solche Partialhydrolysate aus kurzkettigen Peptiden bestehen, mit einem für Thymusgewebe charakteristischen Mengenverhältnis und Muster an Amino- säuren. Bringt man derartige Aminosäuren in chemisch geeignet derivatisierter Form miteinander zur Reaktion, wobei das für Thymusgewebe charakteristische Mengenverhältnis der Aminosäuren aufrecht erhalten wird, befreit derartige syn- thetische Kombinationen von ihren N-terminalen Schutzgruppen und kuppelt er- neut und wiederholt mit derartig gewichteten Kombinationen aus Aminosäuren, die für Thymusgewebe charakteristisch sind, so entstehen synthetische, statistische Thymuspeptid-Kombinationen unter vollständigem Ausschlu des Prion-Protein- Risikos.

Die Erfindung offenbart somit relativ einfache Wege zur gezielten Herstellung von immunologisch und endokrinologisch wirksamen Präparaten mit erstmals standar- disierbarer Präparatwirkung.

Derartige Thymuspeptid-Kombinationen lassen sich in pharmazeutisch reprodu- zierbarer Weise steril produzieren, so da auf diese Weise ein Präparat entsteht, das je nach Anzahl der wiederholten, statistischen Syntheseoperationen aus einer Familie von Thymus-Signalpeptiden besteht, charakteristisch für Neurotransmitter und immunologisch aktive Signalmoleküle. Anhand analytischer Untersuchungen im Vergleich zu Partialhydrolysegemischen aus natürlichem Thymusgewebe konnte gezeigt werden, da die synthetischen-statistischen Thymuspeptid-Kombi- nationen ihrer Zusammensetzung nach dem Naturpräparat innerhalb der Fehler- grenze der angewendeten analytischen Methoden vergleichbar sind. Daraus folgt, da die erfindungsgemä e Aufgabe, das BSE-Risiko durch Synthese einer Thy- muspeptid-Kombination zu beseitigen, erfüllt werden konnte.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, da das erfindungsgemä e synthe- tische Präparat im biologischen Test an Human-Lymphozyten überlegene Aktivität bezüglich der mitogenen Kostimulation (Induktion der Zellvermehrung) im Ver- gleich zu einem marktüblichen Thymus-Partialhydrolysepräparat aufweist.

Es ist weiterhin überraschend, da das synthetische Präparat Bestandteile der extrazellulären Matrix zu binden vermag, Eigenschaft, die bisher nur Skleropro- teinen zuzuschreiben war.

Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1: Die erfindungsgemä e statistische Thymuspeptid-Kombinationen wurde im Test- system der Mitogenen Kostimulation im Vergleich zu einem marktüblichen Thy- mus-Partialhydrolysepräparat auf Bioaktivität hin untersucht. Getestet wurden Endkonzentrationen von 100, 50 und 25ng/ml.

Bei zwei Spendern (KFG und WH) zeigte die statistische Thymuspeptid-Kombina- tion eine statisch signifikant höhere Bioaktivität als ein marktübliches Thymus-Par- tialhydrolysepräparat. Während für ein marktübliches Thymus-Partialhydroly- sepräparat bei der hohen Konzentration von 100,ug/ml eine Inhibition der Zellpro- liferation beobachtet wurde, führte die statistische Thymuspeptid-Kombination zu einer dosisabhängigen Steigerung der Proliferation von humanen Lymphozyten.

Humane periphere Blutlymphozyten wurden aus zwei Blutspenden isoliert, und die Proiiferationsrate dieser Zellen nach suboptimaler Vorstimulation (0,5,ltg/ml Phyto- hämagglutinin, PHA) unter der Wirkung verschiedener Konzentrationen von einem marktüblichen Thymus-Partialhydrolysepräparat und der statistischen Thy- muspeptid-Kombination im Vergleich zu der Positivkontrolle REFO1 (Thymosin Fraktion 5) gemessen.

Me technisch wurde die Proliferationsrate nach folgendem Verfahren ermittelt: Bei der wirkstoffabhängigen Induktion der T-Zellproliferation wird die DNA-Syn- these zum Zweck der Zellteilung angeregt, daher kann über den Einbau eines ra- dioaktiven DNA-Bausteins (3H-Thymidin) die T-Zellvermehrung anhand einge- bauter Radioaktivität gemessen werden.

Die Figuren 1 und 2 zeigen Ergebnisse aus der Stimulation der Blutlymphozyten der Spenderin KFG und des Spenders WH aufgeführt. Die Versuchsdaten sind auf das Resultat des Kontrollansatzes nach Zusatz von Phytohämagglutinin (Kontr. + Phytohämagglutinin) zu beziehen. Die Positivkontrolle Referenzthymuspräparat wurde in einer Konzentration von 100»g/ml im Test eingesetzt; ein marktübliches Thymus-Partialhydrolysepräparat und die statistische Thymuspeptid-Kombination wurden in den drei Konzentrationen 100, 50 und 25,rg/ml getestet.

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse für die Spenderin KFG. Die Positivkontrolle Refe- renzthymuspräparat führte zu einer sehr deutlichen Steigerung der Proliferations- rate. Für ein marktübliches Thymus-Partialhydrolysepräparat dagegen konnte eine dosisabhängige Inhibition beobachtet werden; erst bei der niedrigsten Konzentra- tion von 25,ng/ml wurde der Wert des Kontrollansatzes erreicht. Unter der Wirkung der statistischen Thymuspeptid-Kombination lag die Zellproliferationsrate bei den drei getesteten Konzentrationen statistisch signifikant höher als im Kontrollansatz.

Vergleichbare Ergebnisse zeigten sich mit Lymphozyten des Spenders WH gemä Fig. 2. Wiederum ergab die Positivkontrolle Referenzthymuspräparat eine starke Zunahme der Proliferation von humanen Lymphozyten. Ein marktübliches Thy- mus-Partialhydrolysepräparat führte in den Konzentrationen von 50 und 25/tg/ml zu einer geringen Erhöhung der Zellproliferationrate, nicht dagegen in der hohen Konzentration von 100uglml. Dagegen konnte für die statistische Thymuspeptid- Kombination SP/01/211096 eine deutliche und dosisabhängige Steigerung der DNA-Syntheserate beobachtet werden.

Ziel dieser Untersuchungen gemä Beispiel 1 war die vergleichende Testung der syntetisch-statistischen Thymuspeptid-Kombination mit einem marktüblichen Thy- mus-Partialhydrolysepräparat im Testsystem der Mitogenen Kostimulation. Unter- sucht werden sollte die Fähigkeit der Prüfsubstanz zur Steigerung der Zellprolife- rationsrate von humanen Blutlymphozyten.

Für die statistische Thymuspeptid-Kombination konnte bei zwei Spendern eine deutlich höhere Bioaktivität im Vergleich zu marktüblichem Thymus-Partialhydro- lysepräparat festgestelit werden. Beim Spender WH ergab sich zudem eine do- sisabhängige Erhöhung der DNA-Syntheserate. Überraschenderweise führte der Zusatz von einem marktüblichen Thymus-Partialhydrolysepräparat zu den Zellkul- turansätzen eher zu einer Inhibition der Zellproliferation. Nur bei niedrigen Kon- zentrationen von 50 bzw. 25/ag/ml lag die Zellproliferationsrate beim Spender WH geringfügig über dem Wert des Kontrollansatzes.

Beispiel 2: Das nachfolgende Beispiel bezieht sich auf die Stimulation der Blutlymphozyten des Spenders DB. Die Versuchsdaten sind unter Bezugnahme auf die Figuren 3 und 4 auf das Resultat des Kontrollansatzes nach Zusatz von Phytohämagglutin in PHA zu beziehen. Als Positivkontrolle diente Thymosin-Fraktion Nr. 5 (TF5) in zwei Konzentrationen (3. und 4. Kolonne von links). Zum Vergleich wurde auch in gleicher Konzentration ein marktübliches Thymus-Partialhydrolysat eingesetzt (5. und 6. Kolonne). Als Kontrolle wurde PHA alleine eingesetzt.

Die synthetisch-statistische Thymuspeptid-Kombination weist in der mitrogenen Kostimulation bei suboptimaler Stimulation der Blutzeilen mit PHA von 0,05/lag sowohl bei einer Dosierung des beanspruchten Syntheseproduktes von 100 ,ag/Zelikulturansatz als auch bei 0,4rg/Zellkulturansatz eine überraschend ausge- prägte Aktivität auf.

Bei geringer Vorstimulation der Blutzellen mit PHA, 0,025rg/Ansatz sind die Wir- kungen der erfindungsgemä en synthetisch-statistischen Thymuspeptid-Kombina- tion ebenfalls deutlich zu erkennen, wenn auch nicht so ausgeprägt wie bei einer höheren Vorstimulation der Blutzellen mit 0,05/ag PHA/Ansatz.

Letztendlich liegt hier eine typische in vitro, zweiphasige Aktivität vor, die im Be- reich von 100,g/ml und 0,4,bg/ml jeweils ein Maximum zeigt, und jeweils besser als das Vergleichspräparat dienende marktübliche Thymus-Partialhydrolysat.

Diese zweiphasige Aktivität ist jedenfalls ein Beleg für den breiten Umfang der immunologischen in vitro Aktivität, wobei das hohe Ma an Aktivität bei der extrem niedrigen Konzentration von 0,4»g/ml zweifelsohne überrascht und aufgrund der wirklich sehr niedrigen Konzentration von gro em wirtschaftlichem Interesse ist.

Die analytischen Daten der synthetisch-statistischen Thymuspeptid-Kombination ergeben sich wie folgt: Certificate of Analysis Data sheet Synth. statistic Thymic Peptides Specifications # SP/01/21 1096 Specified Found Description: yellowish powder yellowish powder Residual solvents (GC): Water < 10%<10% < 10%<10% 9%+0.5%9%je.5% 9%+0.5%9%je.5% DMF < 0,1 %<0,1 % < 0,1 %<0,1 % n.d. *<200ppm***<2OOppm** *<200ppm***<2OOppm** Methanol <0,1% 130 ppm <130ppm Toluol <0,1 % n.d. <40ppm Ethylisopropylamin < 0,1 % n.d. <200ppm Essigsäureethylester < 0,1 % n.d. <20ppm Acetate: <3%13 % <3%13 % 1.6%+0,2%1.6%+02% 1.6%+0,2%1.6%+02% Inorganic salt: <0.5 % < 0.2 % Specific rotation: -30.0° + 5"5 5"5 -30.2° + 0.2° (20"C(20°C (20"C(20°C c=0.2; H2O) Free Amino Acid Content: GKL01 + 5 % complies (,(%, (,(%, w/w) Total Amino Acid Composition: GKL01 +5 % complies (%, w/w) Peptide Content: 50 % + 5 % complies