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Title:
SYSTEM FOR THE DETECTION OF PHOTOSYNTHETIC AND NON-PHOTOSYNTHETIC MICROORGANISMS IN BIOLOGICAL SAMPLES BY MEANS OF CONTROLLED PHOTOSTIMULATION
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2017/198240
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to the branch of microbiology and food hygiene and comprises a system for the quick evaluation of the state of microbiological contamination of different biological samples based on the combined use of photostimulation and detection of the microorganisms (photosynthetic and non-photosynthetic) present in a liquid culture medium. In the case of photostimulation (430 nm <λ < 480 nm and 1 μW< p < 5 μW) of a biological sample in a liquid medium, the changes in turbidity and/or bioimpedance caused in the culture medium by said growth are registered, which permits the quick detection of the presence of bacteria in biological samples based on the analysis of the culture, facilitating the evaluation of the microbiological quality of same. In addition, it is useful for determining the antibiogram based on isolated colonies or positive samples obtained directly from the sources containing same.

Inventors:
RAMÍREZ FRÓMETA NARDO (CU)
REGUEIRO GÓMEZ ÁNGEL (CU)
LAMOTHE NUVIOLA CARLOS ABEL (CU)
RIVERÓN RODRÍGUEZ ELIER (CU)
MORENO BARRIOS CARMEN YAMILÉ (CU)
CONTRERAS ALARCÓN ORESTES ROLANDO (CU)
Application Number:
PCT/CU2017/050004
Publication Date:
November 23, 2017
Filing Date:
May 18, 2017
Export Citation:
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Assignee:
CENTRO NAC DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CU)
International Classes:
C12Q1/04; C12Q1/06; G01N21/53; G01N21/59
Domestic Patent References:
WO2010132955A12010-11-25
WO2007070452A12007-06-21
WO2012101459A22012-08-02
WO2010097687A12010-09-02
WO2013074911A12013-05-23
WO2014072934A12014-05-15
Foreign References:
US20040009572A12004-01-15
CN103212161A2013-07-24
US20050256554A12005-11-17
US20100099132A12010-04-22
US20130190843A12013-07-25
Other References:
O TIPHLOVA ET AL: "Action of low-intensity laser radiation on Escherichia coli.", CRITICAL REVIEWS IN BIOMEDICAL ENGINEERING., vol. 18, no. 6, 1 January 1991 (1991-01-01), pages 387 - 412, XP055405725
MASUDA, S: "Light Detection and Signal Transduction in the BLUF Photoreceptors", PLANT CELL PHYSIOL., vol. 54, no. 2, 2013, pages 171 - 179
JUNG, A: "Structure of a bacterial BLUF photoreceptor: Insights into blue light-mediated signal transduction", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 102, no. 35, 2005, pages 12350 - 12355
HORST, M.: "Photoreceptor proteins star actors of modern times: a review of the functional dynamics in the structure of representative members of six different photoreceptor families", ACC. CHEM. RES, vol. 37, no. 1, 2004, pages 13 - 20
MASUDA, S: "AppA is a blue light photoreceptor that antirepresses photosynthesis gene expression in Rhodobacter sphaeroides", CELL, vol. 110, no. 5, 2002, pages 613 - 623
BRAATSCH, S: "Responses of the Rhodobacter sphaeroides Transcriptome to Blue Light under Semiaerobic Conditions", J. BACTERIOL, vol. 186, no. 22, 2004, pages 7726 - 7735
KARU, T: "Primary and Secondary Mechanisms of Action of Visible to Near-IR Radiation on Cells", JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY B: BIOLOGY, vol. 49, no. 1, 1999, pages 1 - 17, XP028735364, DOI: doi:10.1016/S1011-1344(98)00219-X
KUSHIBIKI, T: "Chondrogenic mRNA expression in prechondrogenic cells after blue laser irradiation", J PHOTOCHEM PHOTOBIOL B., vol. 98, no. 3, 2010, pages 211 - 215, XP026943744, DOI: doi:10.1016/j.jphotobiol.2010.01.008
PEREIRA, M: "Influence of 670 nm Low-Level Laser Therapy on Mast Cells and Vascular Response of Cutaneous Injuries", JOURNAL OF PHOTOCHEM. & PHOTOBIOLOGY B: BIOLOGY, vol. 98, no. 3, 2010, pages 188 - 192, XP026943740, DOI: doi:10.1016/j.jphotobiol.2009.12.005
TIPHLOVA, O; KARU, T: "Action of low-intensity laser radiation on Escherichia coli", CRIT REV BIOMED ENG., vol. 18, no. 6, 1991, pages 387 - 412
Attorney, Agent or Firm:
FORMOSO MIERES, Alianna (CU)
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Claims:
SISTEMA PARA LA DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS FOTOSINTETICOS Y NO FOTOSINTETICOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS POR FOTOESTIMULACION CONTROLADA

REIVINDICACIONES:

1 . Sistema para la estimulación de microorganismos fotosintéticos y no fotosintéticos caracterizado por una tarjeta electrónica que comprende un generador de señales de estímulo y referencia formado por (5 y 6), un convertidor V/l discreto (7), dispositivo emisor de luz de estado sólido LED (8), las celdas de medición (9), un multiplexor analógico (12) y una etapa de procesamiento análogo-digital (13, 14 y 15) de la señal a la salida del fotodetector (1 1 ), que incluye un demodulador (14), filtro paso bajo con fc=2 Hz (15), y un convertidor A/D (16) en la unidad central de procesamiento y control: UCPC (1 ).

2. Sistema para la estimulación de microorganismos fotosintéticos y no fotosintéticos según la reivindicación 1 caracterizado por el empleo de una celda para mediciones turbidimétricas compuesta por un dispositivo emisor óptico de estado sólido LED (8), un portamuestras (9), y además un foto- detector (1 1 ) que mide el grado de turbidez existente en la muestra (10).

3. Sistema según la reivindicación 2 caracterizado por un dispositivo emisor de luz de estado sólido LED (8) que emite señal correspondiente a una longitud de onda comprendida entre 430 nm y 480 nm.

4. Sistema según la reivindicación 2 caracterizado por la generación de la intensidad del estímulo óptico comprendido entre 1 y 5 μW.

5. Sistema según la reivindicación 2 caracterizado por el empleo de una frecuencia de estimulación sinusoidal comprendida entre 1 y 1000 Hz.

6. Sistema según la reivindicación 1 caracterizado por un canal de medición de bioimpedancia donde una muestra de alta densidad óptica (19) se acopla al arreglo de celdas impedanciométricas (17) a través de electrodos (18) conectados a un medidor de impedancia (20) controlado por la unidad de UCPC (1 ) a través de un bus l2C (21 ).

Description:
SISTEMA PARA LA DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS Y NO FOTOSINTÉTICOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS POR FOTOESTIMULACIÓN CONTROLADA DESCRIPCIÓN

Esta invención constituye un sistema (dispositivo y procedimiento) para la evaluación rápida del estado de contaminación microbiológica de diferentes muestras biológicas, a partir del uso de estímulos ópticos (430 nm < λ < 480 nm y 1 μ\Λ < p < 5 μ\Λ/), que incrementan la velocidad de crecimiento de los microorganismos fotosintéticos y no fotosintéticos presentes en un medio de cultivo líquido facilitando su rápida detección. Normalmente se emplea la fotoestimulación para inhibir o contener el crecimiento bacteriano (Photostimulation method and photostimulation device, CN 103212161 A; LED multiplex source and method of use of for sterilization, bioactivation and therapy, US 20050256554 A1 ), o para estimular especies bacterianas fotosensibles o con marcadores fluorescentes. Sin embargo, no existe reporte de dispositivos que permitan por fotoestimulación, un aumento en la velocidad de crecimiento de las bacterias típicas durante la detección de infecciones clínicas.

En el invento se aplica una señal luminosa proveniente de un LED emisor, que permite la estimulación del crecimiento de las especies bacterianas, y simultáneamente, a través de la medición de turbidez o bioimpedancia del cultivo se posibilita la detección de las bacterias.

El empleo de estímulos ópticos adecuados pueden incrementar la actividad de muchas especies a partir de la respuesta de sus proteínas foto-receptoras [Masuda, S (2013), "Light Detection and Signal Transduction in the BLUF Photoreceptors", Plant Cell Physiol. 54 (2): 171 -179].

El intervalo de estimulación óptica con 430 nm < λ < 480 nm, permite activar en especial las proteínas del dominio BLUF encontradas en el árbol filogenético de bacterias y eucariotas fotosintéticas, las cuales facilitan la regulación de las actividades biológicas a nivel celular [Jung, A (2005), "Structure of a bacterial BLUF photoreceptor: Insights into blue light-mediated signal transduction", Proc Nati Acad Sci U S A 102 (35): 12350-12355]. A partir de la excitación ocurren cambios estructurales netos en muchos foto-receptores inducidos [Horst, M. (2004), "Photoreceptor proteins star actors of modern times: a review of the functional dynamics in the structure of representative members of six different photoreceptor families", Acc. Chem. Res 37 (1 ): 13-20], que permiten el entendimiento de cómo los organismos responden a determinados estímulos ópticos [Masuda, S (2002), "AppA is a blue light photoreceptor that antirepresses photosynthesis gene expression in Rhodobacter sphaeroides", Cell 1 10(5): 613-623], [Braatsch, S (2004), "Responses of the Rhodobacter sphaeroides Transcriptome to Blue Light under Semiaerobic Conditions", J. Bacteriol 186 (22): 7726-7735].

El proceso clave de la fotoestimulacion consiste en la absorción de energía óptica por parte de las moléculas celulares. Cuando una muestra es foto-estimulada, moléculas con dobles enlaces conjugados absorben la luz en una cierta longitud de onda en función de su composición química y entran en un estado más energizado. Estas moléculas energizadas y excitadas pueden pasar su energía añadida a otras moléculas cercanas, lo cual induce una serie de procesos bioquímicos, algunos de ellos relacionados con factores de crecimiento y proliferación celular [Karu, T (1999), "Primary and Secondary Mechanisms of Action of Visible to Near-IR Radiation on Cells", Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 49(1 ): 1 -17] [Kushibiki, T (2010), "Chondrogenic mRNA expression in prechondrogenic cells after blue láser irradiation", J Photochem Photobiol B. 98(3): 21 1 -215], [Pereira, M (2010), "Influence of 670 nm Low-Level Láser Therapy on Mast Cells and Vascular Response of Cutaneous Injuries", Journal of Photochem. & Photobiology B: Biology 98(3): 188-192]. La invención US20100099132A1 se refiere a un nuevo método de preparación de los inductores del crecimiento bacteriano basado en el empleo de la luz, caracterizado porque el método comprende cultivar Hafnia spp. en medio mínimo y porque el inductor de crecimiento no es un autoinductor.

El objeto de la invención US20130190843A1 es proporcionar un método de foto- estimulación en la que se configuran LEDs para emitir luz roja o amarilla en un intervalo específico de iluminancia, a fin de estimular la síntesis de colágeno de los fibroblastos y promover la circulación de la sangre; así como acelerar la eliminación células muertas. Además, en el método de foto-estimulación, los LED pueden configurarse para emitir luz azul de determinada intensidad para inhibir o matar a P. acnés o para suprimir o reducir la síntesis de la melanina de los melanocitos.

La invención WO201307491 1 A1 proporciona métodos para la regulación de genes dependiente de la luz utilizando una proteína fotosensible de unión a ADN. La invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia que codifica una proteína de unión a ADN sensible a la luz (LRDP) que comprende: a) un dominio LOV; y b) un dominio de unión a ADN (DBD) y está unido operativamente a un polinucleótido. La invención WO2014072934A1 describe un método para estimular el metabolismo de microorganismos no fototróficos implicados en los procesos biológicos. En ella se reivindica un proceso biológico que comprende una etapa de iluminación con luz azul de los microorganismos no fototróficos para estimular su metabolismo. La aplicación principal de esta invención es el tratamiento de aguas residuales municipales y en procesos biotecnológicos para la bioproducción de moléculas de interés. En esta invención la estimulación con luz azul tuvo en cuenta la intensidad del estímulo pero no se analiza la influencia que tiene la forma de onda ni la frecuencia en la estimulación en el metabolismo celular. Por otra parte no se analiza el efecto de la estimulación en muestras de origen clínico con efectos en el diagnóstico rápido microbiológico [Tiphlova, O and Karu, T (1991 ), "Action of low-intensity láser radiation on Escherichia coli", Crit Rev Biomed Eng. 18(6): 387-412].

El objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema (dispositivo y procedimiento) que permite detectar el crecimiento microbiano tempranamente en muestras biológicas en las cuales se requiera detectar crecimiento de microorganismos mediante la utilización de micromuestras. Dicho sistema se basa en la detección rápida de los cambios turbidimétricos o de bioimpedancia producidos por el crecimiento de microorganismos fotosintéticos y no fotosintéticos presentes en un medio de cultivo líquido estimulado ópticamente (430 nm < λ < 480 nm y 1 μ\Λ < p < 5 μ\Λ/).

La novedad de la presente solución técnica radica en que se presenta un método para el diagnóstico rápido basado en el empleo combinado de estimulación óptica y la medición de turbidez o bioimpedancia en muestras biológicas, materializado a partir del empleo de un nuevo sistema de detección formado por la integración de un hardware y un software especialmente diseñados para este fin.

En la muestra biológica en medio líquido se registran los cambios de turbidez y/o bioimpedancia originados por la estimulación óptica controlada en el medio de cultivo, lo cual permite detectar la presencia de bacterias facilitando el estudio de la calidad microbiológica de las mismas. Además el sistema propuesto es útil para la determinación del antibiograma a partir de colonias aisladas o de muestras positivas que se obtienen directamente de las fuentes que las contienen.

Adicionalmente, y entre otras aplicaciones, la presente invención permite obtener el esquema de sensibilidad a los antibióticos de microorganismos ya bien a partir de colonias aisladas previamente o de muestras positivas biológicas, en este último caso ahorrándose el tiempo requerido para los procesos de aislamiento y purificación. En el caso particular de las infecciones del tracto urinario, la presente invención permite a partir de muestras directas de orina, discriminar muestras positivas de las negativas, estén contaminadas o no con otro germen. Con el sistema de la presente invención, resultados basados en 350 muestras examinadas han mostrado un 100% de correspondencia con el conteo total de células viables en medio CLED, método empleado convencionalmente para la detección de la infección del sistema urinario. Con el empleo de la invención, se logra la obtención de información útil relativa al diagnóstico clínico microbiológico en muy corto tiempo, la cual puede ser utilizada en pacientes para evitar el uso inadecuado de antibióticos, el desarrollo de la resistencia microbiana, largas estadías hospitalarias y desenlaces fatales en infecciones graves. El sistema propuesto se caracteriza por su rapidez, ya que permite la determinación de la infección urinaria en menos de una hora, y a partir de muestras positivas ofrece resultados confiables del antibiograma en un tiempo inferior a dos horas. Igualmente es un sistema altamente preciso que permite corroborar los resultados obtenidos tantas veces como se estime. Desde el punto de vista social es de gran importancia, ya que para aquellas personas hospitalizadas posibilita el suministro de antibióticos de forma racional y oportuna, evitando prolongadas estadías hospitalarias. Igualmente, desde el punto de vista ecológico tiene gran impacto ya que evitar el uso inadecuado de antibióticos y limita al mismo tiempo el desarrollo de la resistencia bacteriana.

En la actualidad los sistemas automatizados se han convertido en el pilar del diagnóstico para infecciones y entre los sistemas comerciales más utilizados se encuentra: SYSMEX, el cual constituye un método de referencia para la detección de bacterias y sepsis. En el caso de los cultivos positivos la bacteria presente debe ser identificada antes de comenzar el suministro de antibióticos, utilizando varios métodos, desde los test bioquímicos convencionales hasta los análisis de ADN basados en PCR, que demoran de 3 a 24 horas adicionales.

La presente invención describe un nuevo sistema de medición (Fig. 1 ) que permite estimular ópticamente el crecimiento de los microorganismos fotosintéticos y no fotosintéticos presentes en un medio de cultivo líquido, lo cual es utilizado como un método de detección rápida que disminuye los tiempos de análisis de las muestras. La invención propuesta comprende un dispositivo formado por una tarjeta electrónica con dos canales de medición: uno con un arreglo de celdas para mediciones turbidimétricas (Fig. 2) en muestras con mediana o baja densidad óptica, y otro con un arreglo de celdas para medición impedanciométrica con electrodos para muestras de alta densidad óptica, y una interfaz común de control {software) asociada (Fig. 3) para ambos canales. La tarjeta electrónica está estructurada con un diseño modular con funciones y objetivos específicos para cada módulo: La Unidad Central de Procesamiento y Control, UCPC (1 ) se encarga de generar y sincronizar todas las acciones de control sobre el resto de los bloques. Los canales de medición de turbidez y bioimpedancia son útiles para la adquisición y acondicionamiento de las variables adquiridas, el módulo de comunicación (2) establece la comunicación entre el procesador de la UCPC y el ordenador personal (3) a través de comandos; y la fuente de alimentación (4) tiene la función de suministrar la energía a todos los dispositivos y bloques del diseño.

Además dicha tarjeta electrónica está asociada a una herramienta de programa {software) instalada en un ordenador personal para la lectura y almacenamiento automático de los datos de las mediciones vía USB (módulo de comunicación), que garantiza la adecuada selección de parámetros durante el proceso de caracterización de la detección de microorganismos en las muestras biológicas. La aplicación desarrollada permite a través de tres ventanas de trabajo la programación de los parámetros de estimulación de las muestras bajo estudio, garantizando además el adecuado almacenamiento y revisión de los datos adquiridos cuando sea solicitado por el usuario (Fig. 3).

El sistema de medición consta de un generador de la señal de estímulo (5) y referencia (6); además de un conversor tensión-corriente (7) que suministra el estímulo óptico controlado (Onda sinusoidal, 430 nm < λ < 480 nm, 1 μ\Λ/ < p < 5 μ\Λ/) a un arreglo de cinco LEDs (8) ubicados adecuadamente en el portamuestras (9), y que son los encargados de transmitir la señal para estimular las muestras (10) que se desean analizar. La señal generada también es utilizada como referencia sincrónica para el proceso de demodulación de la señal recibida desde los receptores (foto-detectores). En el caso de las celdas para mediciones turbidimétricas el estímulo óptico que logra atravesar la muestra se recepciona con ayuda de un circuito integrado opto-electrónico (1 1 ), el cual contiene un fotodiodo (fotodetector) y un amplificador de transimpedancia monolítico. La señal a la salida de los fotodetectores se selecciona con un multiplexor (12) y es transmitida a una sección de acondicionamiento (13), pasando a un bloque de demodulación sincrónica (14), de filtrado (15) y de conversión (16), empleándose una estructura de amplificador de enganche para la sincronización del proceso de demodulación.

En el diseño propuesto se ha adicionado un canal para mediciones impedanciométricas a partir de una celda, empleando un arreglo de electrodos bipolares de acero inoxidable (17) con longitud de 10 cm y diámetro de 1 mm, y un convertidor de impedancia de alta precisión AD5933 (18) que combina un generador de frecuencia interno con un conversor digital-analógico. El generador permite excitar con una frecuencia conocida a la muestra biológica en este caso de alta densidad óptica (19). La señal obtenida desde la muestra que se analiza es adquirida por el conversor analógico-digital interno del AD5933 y es procesada aplicándose la Transformada Discreta de Fourier (TDF) por el procesador digital interno (PDS). El algoritmo aplicado retorna un valor real e imaginario de la impedancia medida, el cual es transferido mediante un protocolo de comunicación (21 ) hacia la UCPC y de esta al ordenador personal (3) para su representación gráfica en la interfaz desarrollada.

Otra aplicación fundamental de esta invención está orientada hacia la determinación del antibiograma de la muestra (susceptibilidad de los microorganismos a los antibióticos), lo cual se logra en un período de tiempo inferior a las 2 horas, auxiliándose de un juego diagnóstico diseñado para estos propósitos. El medio de cultivo empleado para seguir el crecimiento microbiano es el medio Mueller-Hinton Broth OXOID modificado, PH de 7.4 ± 0.2 y estéril, el cual incluye adicionalmente un polímero. El juego diagnóstico para la detección del antibiograma de la muestra a analizar se caracteriza por el empleo de discos de antibióticos que se encuentran disponibles comercialmente y que pueden utilizarse conformando esquemas que pueden variarse atendiendo a cualquier necesidad.

Por otra parte, el sistema propuesto permite enfrentar las interferencias generadas por la contaminación de las muestras; así como por la infección causada por más de un germen. La interferencia de la contaminación ha sido resuelta ajustando la señal en magnitud y tiempo para la detección de los niveles infestantes aceptados internacionalmente (>100,000 UFC/ml), propiciando la exclusión de las muestras contaminadas no infestadas por contar éstas generalmente con niveles bacterianos inferiores a 1 ,000 UFC/ml, lo que permite la detección de muestras contaminadas solamente cuando además éstas están infestadas. En este caso particular, teniendo en cuenta que generalmente las especies contaminantes atendiendo al Gram son saprofitas, en su mayoría sensibles a todos los antibióticos, es evidente que las cepas contaminantes no deben interferir en la detección del esquema de resistencia de las cepas infestantes. Estas constituyen igualmente características distintivas de la presente invención.

Con relación a las infecciones producidas por más de 1 germen, en la práctica se pueden presentar dos situaciones particulares. En la primera, puede existir el predominio de uno de los gérmenes infestantes debido a una mayor velocidad específica de crecimiento transcurrido el tiempo mínimo de incubación, en cuyo caso el antibiograma sería válido. En la segunda, los gérmenes crecen simultáneamente, en cuyo caso el antibiograma podría mostrar uno o varios antibióticos efectivos para ambos gérmenes, o se podría presentar un esquema de resistencia absoluta por complementación, en cuya situación sólo podría indicarse la prueba con otros antibióticos no incluidos en el test, o pasar posteriormente a los necesarios procedimientos de aislamiento y purificación para este caso. Este conjunto de análisis y soluciones inmediatas para cada situación particular, sólo se posibilita por la aplicación del concepto de lecturas sobre muestras directas, con alto nivel de interferencia, a tiempo corto y fijo, aspectos que caracterizan y distinguen el sistema de la presente invención.

Ejemplos de realización

A continuación se presentan varios ejemplos relacionados con la determinación de las características de la invención:

Ejemplo 1 : Influencia de la longitud de onda y la intensidad luminosa en la estimulación óptica del crecimiento bacteriano

Cepa: El experimento se realizó con una cepa de Escherichia coli ATCC 25923.

Inoculo: Se preparó una suspensión de Escherichia coli ATCC 25923 con una concentración inicial de 10 4 UFC/ml en medio de cultivo DKD.

Condiciones de Cultivo

El cultivo se realizó a 37°C durante 18 h con ayuda de una incubadora Memmert modelo INE 700. La suspensión de Escherichia coli fue estimulada con longitud de onda azul de baja intensidad de forma continua, con diferentes intensidades luminosas (1 , 8; 7 y 1 1 cd respectivamente) y de igual forma con longitud de onda roja con intensidades de 7, 1 1 y 21 cd. Se registraron las curvas de crecimiento por turbidez del microorganismo utilizándose un tiempo entre mediciones de 5 minutos. La concentración inicial de la suspensión fue corroborada por el conteo de colonias en placa. Resultados

Cada curva representada en la figura 4 es el promedio de 10 ensayos y en todos los casos, se comprobó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov que los resultados experimentales no tenían una distribución normal (P < 0,0001 ) y se aplicó el test de Dunn para comparar múltiples muestras (test de Kruskal-Wallis). En los resultados se corroboró la existencia de diferencias estadísticamente significativas con un nivel de confianza del 95 % (P < 0,05).

Cuando se estimula con longitud de onda azul (λ = 470 nm) se observa un comportamiento diferente que el obtenido al estimular con longitud de onda roja. En este caso se aprecia que el crecimiento de Escheríchia coli es proporcional al aumento de la intensidad luminosa. Este efecto no sólo influye en la duración de la fase exponencial sino que también disminuye la duración de la fase de latencia, y por tanto contribuye a la disminución del tiempo de detección.

En la figura 5 se observa que en las condiciones experimentales estudiadas; el nivel de estimulación del crecimiento microbiano al concluir la fase exponencial es mayor cuando se emplea una longitud de onda azul de baja intensidad correspondiente a λ= 470 nm en comparación con la longitud de onda roja (λ = 625 nm).

Ejemplo 2: Influencia de la frecuencia de la señal de estímulo en la estimulación óptica del crecimiento bacteriano

Cepa: El experimento se realizó con una cepa de Escheríchia coli ATCC 25923.

Inoculo: Se preparó una suspensión de Escheríchia coli ATCC 25923 con una concentración inicial de 10 4 UFC/ml en medio de cultivo DKD. Condiciones de Cultivo

El cultivo se realizó a 37°C durante 18 h con ayuda de una incubadora Memmert modelo INE 700. La suspensión de Escheríchia coli fue estimulada con longitud de onda azul de baja intensidad de forma continua, con una intensidad luminosa de 1 1 cd. Se realizó un barrido en frecuencias de la señal de estímulo desde 10 Hz hasta 10 kHz. Se registraron las curvas de crecimiento por turbidez del microorganismo utilizándose un tiempo entre mediciones de 5 minutos. La concentración inicial de la suspensión fue corroborada por el conteo de colonias en placa. Resultados

La figura 6 muestra el comportamiento para las diferentes frecuencias de estimulación analizadas. Cada curva representada es el promedio de cinco ensayos. El intervalo de frecuencias que muestra un mayor nivel de estimulación dentro de las condiciones experimentales evaluadas fue el comprendido entre 10 Hz y 1000 Hz. En general, en este intervalo se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas en el tiempo de detección (aproximadamente 40% del tiempo promedio respecto al resto de las frecuencias empleadas).

Ejemplo 3: Influencia de la intensidad de la señal de estímulo en la estimulación óptica del crecimiento bacteriano

Cepa: El experimento se realizó con una cepa de Escherichia coli ATCC 25923.

Inoculo: Se preparó una suspensión de Escherichia coli ATCC 25923 con una concentración inicial de 10 4 UFC/ml en medio de cultivo DKD.

Condiciones de Cultivo

El cultivo se realizó a 37°C durante 18 h con ayuda de una incubadora Memmert modelo INE 700. La suspensión de Escherichia coli fue estimulada con longitud de onda azul de baja ntensidad de forma continua, con una intensidad luminosa de 1 1 cd, y una frecuencia de estimulación determinada (10 Hz hasta 10 kHz). Bajo estas condiciones se realizó un barrido en corriente desde 2,5 mA hasta 20 mA (corriente máxima de estimulación), aumentando la intensidad luminosa aplicada a la muestra.

Resultados

La figura 7 muestra el comportamiento microbiano para las diferentes intensidades de corriente analizadas donde cada curva representada es el promedio de 5 ensayos. En ella se puede observar que el crecimiento de Escherichia coli es proporcional al aumento de la intensidad del estímulo. El valor de la intensidad de corriente además de incidir de forma significativa en el porciento de estimulación del crecimiento, también repercute en la duración de la fase de latencia, asociándose a una disminución del tiempo de detección. Ejemplo 4: Análisis del crecimiento de microorganismos con y sin estimulación óptica

Cepas: Se utilizaron cepas clínicas previamente aisladas en medio Agar sangre.

Inoculo: Se prepararon varias suspensiones con las diferentes cepas clínicas a distintas concentraciones iniciales (desde 10 2 hasta 10 6 UFC/ml en medio DKD).

Condiciones de Cultivo

El cultivo se realizó a 37°C durante 18 h con ayuda de una incubadora Memmert modelo INE 700. La suspensiones de microorganismos fueron separadas en dos grupos, un grupo de crecimiento natural (curvas de trazo intermitente) y el otro grupo con estimulación continua (λ= 470 nm, e intensidad de 12 mA, curvas de trazo continuo).

Resultados

En la figura 8 se aprecia que para cualquier concentración, las muestras estimuladas (trazo continuo) acortan su fase de latencia y por tanto su tiempo de detección con respecto a las muestras tomadas como referencia sin estimulación óptica (curvas con trazos intermitentes), lo cual representa para la concentración de 10 6 UFC/ml un promedio de 18,75% de disminución del tiempo de detección. Este porciento va disminuyendo en la medida que se reduce la concentración de la muestra. Sin embargo la diferencia más notable entre ambos grupos de curvas se observa en la duración de la fase exponencial de las muestras estimuladas; siendo mayor el porcentaje de estimulación del crecimiento (~ 256%) respecto a las muestras no estimuladas. Los resultados obtenidos (Fig. 9) para otros microorganismos como Stafilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., Klebsiella Neumoniae y Proteus spp., tuvieron la misma tendencia.

Ejemplo 5: Influencia de la estimulación óptica controlada en la detección de microorganismos en muestras de urocultivo clínico: resultados de estudios clínicos realizados en Cuba

Un total de 350 muestras de orina fueron analizadas para detectar la presencia de un número significativo de uropatogenos empleando el sistema de la presente invención, y comparando los resultados con el método de referencia CLED (método semi- cuantitativo de cultivo en placa de Clarigde). Del total analizado, 90 muestras fueron positivas por el método de referencia CLED y 90 lo fueron empleando el presente sistema, aunque tan sólo en 20 minutos, es decir, mientras que el método CLED da los resultados entre las 24 y 48 horas después de la inoculación del medio de cultivo, el presente sistema fue 100% efectivo en detectar las muestras positivas en tan sólo 20 minutos después de la inoculación de la muestra. De las 260 muestras negativas encontradas por CLED, el presente sistema fue capaz de detectar igual número de muestras negativas, igualmente en un período de 20 minutos para una tasa de efectividad de 100%. La correspondencia general del presente sistema con respecto al método tradicional CLED fue de un 100%.

Se pudo apreciar que el efecto de estimulación óptica continua para una λ=470 nm, afecta el crecimiento de forma similar a todos los microorganismos ensayados, evidenciando la existencia de estructuras fisiológicas blanco similares, que responden a este tipo de estimulación. Un importante número de microorganismos fueron aislados de las muestras positivas, como por ejemplo: E. coli, enterococcus spp, klebsiella spp, klebsiella neumoniae, klebsiella ozaenae, Bacilos no termentadores, pseudomonas aeruginosa, citrobacter freundii, aeromonas, proteus rettgeri y proteus mirabilis. El mayor porcentaje de las infecciones detectadas (78%) estuvo relacionado con la presencia de E. coli como microorganismo patógeno principal.

En la evaluación práctica con muestras de orina, el tiempo de detección obtenido para cepas de E.coli con concentración de 10 5 UFC/ml en medio DKD fue inferior a los 20 minutos. Consideramos que el efecto de la fotoestimulación sobre el tiempo de duplicación de la cepa E. coli, cuando se utiliza la colonia aislada en medio de cultivo, en comparación con los resultados que se obtienen a partir de muestras directas, puede deberse a la existencia de factores en la orina o componentes específicos del sitio de infección que se relacionan con los fotoreceptores, cuantitativa o cualitativamente. Igualmente puede deberse a la pérdida de estas cualidades estimulantes del crecimiento en la cepa aislada al ser cultivada en un medio sintético, donde no se encuentran los mismos componentes del medio natural del sitio de la infección, que favorecen su desarrollo. Ejemplo 6: Diagnóstico rápido de la susceptibilidad antimicrobiana (antibiograma)

Procedimiento:

Para preparar las diferentes concentraciones de E.coli se partió del siguiente procedimiento: Preparar una concentración de 0.5 en la escala McFarland de E.coli utilizando el medio de cultivo DKD y luego estimular la solución durante 1 hora (garantiza que está en la fase exponencial del crecimiento). Luego preparar las concentraciones iniciales de trabajo (10 8 , 10 7 y 10 6 UFC/ml). Para realizar la cinética de crecimiento en tiras para antibiograma (ATB) se toman 200 μΙ de cada concentración. Para realizar el análisis de susceptibilidad se colocó en el pocilio de la tira para ATB, un disco antibiótico de ácido nalidixico (30 mg) más 200 μΙ de la concentración de trabajo deseada.

Condiciones de Cultivo

El cultivo se realizó a 37°C durante 2 h con ayuda de una incubadora Memmert modelo INE 700. El cultivo de E.coli fue estimulado de forma continua con longitud de onda azul de intensidad luminosa 1 1 cd, en un intervalo de frecuencias de estimulación comprendido entre 1 Hz y 5000 Hz.

Resultados

La figura 10 muestra el registro temporal de la difusión de varios discos antibióticos (ácido nalidixico, cefepime y clindamicina) en el medio de cultivo DKD. Se observa que la detección es nula (se superponen todas las curvas), es decir, la difusión del disco antibiótico en el medio DKD; así como el medio DKD solo, no introducen interferencias en el sistema de medición. Este comportamiento garantiza que cualquier variación detectada en una curva de crecimiento mediante este sistema se deberá únicamente al crecimiento del patógeno de interés.

En la figura 1 1 se observa el efecto que introduce un disco de ácido nalidixico en la curva de crecimiento de E. coli (para 200 μΙ de una concentración de 10 8 UFC/ml). Se puede apreciar el efecto inhibidor del ácido nalidixico sobre el crecimiento de E.coli, el cual se hace notable a partir de los 30 minutos de iniciado el registro, tiempo que coincide con la total difusión del disco antibiótico en el cultivo de E.coli. En el caso de las concentraciones 10 7 y 10 6 UFC/ml la carga de antibiótico es suficiente para inhibir completamente el crecimiento del microorganismo durante el tiempo de registro analizado (Figs.12 y 13). Relación de figuras

La figura 1 representa el diagrama en bloques de la invención. (Dibujos)

La figura 2 muestra una imagen del arreglo de celdas para mediciones turbidimétricas con las muestras bajo estudio en el interior de la incubadora MEMMERT.

La figura 3 muestra una imagen de la aplicación desarrollada para la configuración de los parámetros de estimulación, almacenamiento y revisión de los datos adquiridos de las muestras bajo estudio.

La figura 4 representa el comportamiento del crecimiento de E. coli al ser estimulada con longitud de onda azul de varias intensidades luminosas,

La figura 5 representa el efecto de estimulación óptica con longitud de onda azul y longitud de onda roja a intensidad de 1 1 cd.

La figura 6 representa la respuesta del crecimiento bacteriano ante diferentes frecuencias de estimulación óptica con longitud de onda azul e intensidad de 1 1 cd. La figura 7 representa la influencia de la intensidad de la señal de estímulo en la curva de crecimiento de E. coli cuando se estimula con longitud de onda azul.

La figura 8 muestra las curvas de crecimiento de E. coli obtenidas durante el estudio del efecto de fotoestimulación con longitud de onda azul para diferentes concentraciones (desde 1 0 2 hasta 10 6 UFC/ml).

La figura 9 muestra el tiempo de respuesta de varios microorganismos ante la estimulación óptica con longitud de onda azul.

La figura 10 representa el registro temporal de la difusión de varios discos antibióticos (ácido nalidíxico, cefepime y clindamicina) en el medio de cultivo DKD con empleo de estimulación óptica.

La figura 1 1 muestra el efecto que introduce un disco de ácido nalidíxico en la curva de crecimiento de E. coli (para 200 μΙ de una concentración inicial de 10 8 UFC/ml) con empleo de estimulación óptica.

La figura 12 muestra el efecto que introduce un disco de ácido nalidíxico en la curva de crecimiento de E. coli (para 200 μΙ de una concentración inicial de 10 7 UFC/ml) con empleo de estimulación óptica.

La figura 13 muestra el efecto que introduce un disco de ácido nalidíxico en la curva de crecimiento de E. coli (para 200 μΙ de una concentración inicial de 10 6 UFC/ml) con empleo de estimulación óptica

Figura 2. Imagen del arreglo de celdas para mediciones turbidimétricas con las muestras bajo estudio el interior de una incubadora MEMMERT.

Figura 3. Aplicación desarrollada para la configuración de los parámetros de estimulación óptica, almacenamiento y revisión de los datos adquiridos de las muestras bajo estudio.

Figura 4. Comportamiento del crecimiento de E. colia\ ser estimulada con longitud de onda azul de varias intensidades luminosas.

Figura 5. Efecto de fotoestimulación con longitud de onda azul y longitud de onda roja a intensidad de 11 cd.

Figura 6. Respuesta del crecimiento bacteriano ante diferentes frecuencias de estimulación (λ = 470 nm.)

Figura 7. Influencia de la intensidad de la señal de estímulo en la curva de crecimiento de E. coli cuando se estimula con longitud de onda azul.

Figura 8. Curvas de crecimiento de E. coli obtenidas durante el estudio del efecto de estimulación óptica con longitud de onda azul para diferentes concentraciones (desde 10 6 hasta 10 2 UFC/ml).

Figura 9. Comparación del tiempo de respuesta de varios microorganismos ante la estimulación óptica con longitud de onda azul de baja intensidad (11 cd).

Figura 11. Efecto que introduce un disco de ácido nalidíxico en la curva de crecimiento de E. coli (para

200 μΙ de una concentración inicial de 10 8 UFC/ml).

Figura 12. Efecto que introduce un disco de ácido nalidíxico en la curva de crecimiento de E. coli (para

200 μΙ de una concentración inicial de 10 7 UFC/ml).

Figura 13. Efecto que introduce un disco de ácido nalidíxico en la curva de crecimiento de E. coli (para

200 μΙ de una concentración inicial de 10 6 UFC/ml).