Los sulfitos son aditivos alimentarios con propiedades antioxidantes y antimicrobianas que se utilizan en la industria alimentaria para mejorar la calidad, la apariencia y extender la vida útil de los alimentos y bebidas. En los crustáceos, los sulfitos se aplican después de la cosecha y durante todo el proceso de producción para evitar la melanosis. La adición de sulfitos inhibe la formación de manchas negras causadas por la oxidación enzimática de los monofenoles a melanina. La melanosis no tiene incidencia en el sabor de los crustáceos y no es perjudicial para los consumidores. Sin embargo, dichas manchas pueden afectar drásticamente la aceptabilidad del consumidor de los productos y disminuir significativamente su valor de mercado. La legislación comunitaria sobre aditivos alimentarios se basa en el principio de que sólo los aditivos que están autorizados explícitamente se pueden utilizar. La mayoría de los aditivos alimentarios sólo se pueden usar en cantidades limitadas en determinados productos alimenticios y se enumeran en el Reglamento N° 1129/2011 , que modifica la CE n° 1333/2008. Este Reglamento enumera los aditivos alimentarios con niveles máximos permitidos diferentes de quantum satis. Para crustáceos y cefalópodos frescos y congelados la concentración máxima de sulfito (E220-E228) admitida es de 150 mg/kg.

Por otra parte, la Comisión del Codex Alimentarius nombra a los sulfitos como alérgenos prioritarios e indica que el control de la utilización de sulfito es importante para proteger a los consumidores sensibles al sulfito. En alimentos y bebidas, el sulfito se encuentra unido reversiblemente en forma de aducios con compuestos carbonilo e hidroxisulfonados. Estos aducios son estables a bajo e intermedio pH y se disocian completamente a sulfito libre por encima de pH 9. A las formas libre y reversible de sulfito unido se las refiere como sulfito total. Tanto en forma libre como total, ambos son de interés para la industria alimentaria. Un punto crítico de control en el procesamiento de crustáceos se establece para garantizar que el producto final no contiene una excesiva concentración de sulfito. Los límites críticos deben establecerse en todo el proceso para asegurar que el producto final cumple con los límites regulatorios y la supervisión periódica de la eficacia del tratamiento y los controles deben ser requeridos. Por lo tanto, la monitorización de sulfito debe ser una parte integral de un programa de la Firma de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP).

El HACCP necesita ser rápido y conveniente para ser aplicado diariamente, pero los métodos actuales para la determinación de sulfito son complicados, consumen mucho tiempo y son subjetivos.

Dichos métodos tales como tiras de prueba, métodos enzimáticos o métodos basados en la valoración tienen grandes limitaciones, falsos positivos, y poca reproducibilidad y exactitud.

El método Monier-Williams optimizado (AOAC 962.16) ha sido ampliamente utilizado para determinar la concentración de sulfitos totales en los productos alimenticios. Sin embargo, este método conlleva mucho tiempo de análisis, mano de obra, requiere personal técnico y muestra falsos positivos.

Por lo tanto, uno de los grandes retos de la industria de los crustáceos es lograr un sistema altamente sensible, rápido y portátil para la determinación de sulfito en crustáceos a fin de evitar que los productos contaminados lleguen al mercado. Los biosensores enzimáticos son soluciones adecuadas que se aplicarán para la determinación de los sulfitos en los alimentos, más concretamente en los crustáceos, como herramientas de costo simples, precisas, y rápidas.

OBJETO DE LA INVENCIÓN El objeto del invento es un sistema para medir sulfito en muestras alimentarias, de forma simple y rápida mediante la utilización de un biosensor amperométrico enzimático. Dicho sistema es bi-enzimático compuesto por dos enzimas: sulfito oxidasa humana (EC 1.3.8.1) y peroxidasa, con simple retención física sobre una base conductora, de una alícuota liquida de estas enzimas mediante una membrana de diálisis junto con un mediador químico. También es objeto del invento el biosensor enzimático, para la determinación de sulfito en muestras alimentarias.

También es objeto del invento el método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor.

También es objeto del invento el uso del sistema descrito, para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias. Particularmente, las muestras alimentarias son crustáceos.

También es objeto del invento el dispositivo de medida resultante, que ha demostrado satisfactoria selectividad y estabilidad al sulfito como sustrato en matrices tales como los crustáceos. Hoy en día no existe un biosensor comercial de sulfito aplicado a la industria agroalimentaria y ninguna enzima comercial está disponible.

El sistema objeto del invento ofrece unos resultados tanto o más fiables que el método de referencia (Monier-Williams) hoy utilizado, pero con unas características/particularidades ventajosas respecto a él que se reflejan de forma resumida en la siguiente tabla:

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para comprender mejor el objeto de la invención, se representa en las figuras adjuntas una forma preferente de realización, susceptible de cambios accesorios que no desvirtúen su fundamento. En este caso:

La figura 1 representa el esquema de reacción para la determinación de sulfito. La figura 2 representa la curva de calibrado para ver el rango de respuesta del biosensor al sulfito. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención preconiza un sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; un método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y el uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias.

Particularmente, las muestras alimentarias son crustáceos.

El biosensor utilizado es un biosensor amperométrico que comprende un sistema bi- enzimático; que está compuesto por dos enzimas: sulfito oxidasa humana (EC 1.3.8.1) y peroxidasa. El citado biosensor amperométrico se compone de un sustrato, un electrodo de trabajo, un contra-electrodo y un electrodo de referencia. Preferiblemente, el biosensor se compone de un electrodo de trabajo de oro, un contra-electrodo de acero inoxidable y de un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata (Ag/AgCI).

Las enzimas se depositan en la superficie del electrodo de trabajo con simple retención física. Antes de depositarlas, sobre la superficie del electrodo de trabajo se deposita el mediador químico que puede comprender mediadores tales como Azul de Metileno, Azul de Meldola, Tetratiafulvaleno, Ferricianuro y Ferroceno, disueltos en solventes orgánicos tales como isopropanol, propanol, metanol y cloroformo. Preferiblemente, el mediador químico es Ferroceno disuelto en isopropanol. El método objeto del invento comprende las fases de a) aplicación de una muestra al biosensor amperométrico; b) cambio de corriente eléctrica al entrar en contacto con el analito a detectar; y c) medir amperométricamente dicha corriente eléctrica en soluciones con agitación continua, utilizando un potencial constante. Antes de depositar las enzimas en el electrodo de trabajo, éstas se disuelven en un tampón carbonato/bicarbonato y/o CAPS y/o CAPSO 0,1 M en un rango de pHs de 8,0-11 , 1 , siendo el pH óptimo de 10. Para dicha preparación, se trabaja con relaciones sulfito oxidasa: peroxidasa de 1 : 1 , 1 :2, 1 :3 y 1 :4 en términos de unidades enzimáticas, siendo la relación óptima 1 :3. A su vez, dicha combinación bi-enzimática comprende una solución de secado compuesta por trehalosa y/o glutamato sódico en el rango de 10-40%, siendo el valor óptimo del 30%.

Las enzimas depositadas sobre el electrodo de trabajo, se recubren mediante una membrana permeable u osmótica como las usadas en diálisis, previamente hidratada, con un peso molecular nominal límite en el rango de 5-50 kilodaltons (kDa), siendo el óptimo 6-10 kDa.

Posteriormente, para su uso, el biosensor se hidrata en la solución de medida que corresponde al tampón carbonato/bicarbonato 0, 1 M en un rango de pHs de 8,0-11 , 1 , siendo el pH óptimo de 10.

El esquema biocatalítico para la determinación del sulfito en crustáceos sería el siguiente: A pH 10 todo el dióxido de azufre presente en la muestra (tanto el libre como el combinado) está en forma de S0 ₃ ^" (forma sulfito).

La enzima sulfito oxidasa media en la oxidación del sulfito a sulfato generando peróxido de hidrogeno en presencia de oxigeno. La subsecuente reducción catalítica del peróxido generado mediante la peroxidasa (HRP), es la medida indirecta del sulfito oxidado. El ferroceno se usa como mediador químico para esta última reacción enzimática, por tanto, la señal amperométrica que se usa para la lectura de este esquema de reacciones corresponde a la reducción de dicho mediador, tal y como se indica en la figura 1 , que representa un esquema de reacción para la determinación de sulfito.

El nivel de sulfito en una muestra se determina aplicando la muestra al biosensor y midiendo la señal de corriente a un potencial que se encuentra en el rango de 0 a 50 mV. Preferentemente, el voltaje de la corriente eléctrica utilizada para la determinación de sulfito es aproximadamente 0 mV.

El pH para la determinación de sulfito se encuentra en el rango de 8,0 a 11 ,1. Preferentemente, el pH para la determinación de sulfito es aproximadamente 10,0. Dicho biosensor en conjunto con una cubeta de medida y un agitador es a lo que denominamos celda electroquímica que consta de los siguientes elementos:

- Electrodo de trabajo;

- Contraelectrodo;

- Electrodo de referencia; - Cubeta me medida; y

- Agitador

El biosensor tiene un rango de respuesta de 50-300 ppm de sulfito; y además la respuesta lineal es total en dicho rango, tal y como se muestra en la figura 2, que representa el rango de respuesta del biosensor (curva de calibrado de 50 a 300 mg/kg). De esta manera, se cubre el rango marcado por el Reglamento N° 1129/2011 , que enumera los aditivos alimentarios con niveles máximos permitidos para crustáceos y cefalópodos frescos y congelados; siendo dicho valor 150 ppm.

Se construye una recta de calibrado de 5 puntos (sin incluir el blanco), y de 3 réplicas para cada concentración. Se evalúa la linealidad comprobando el coeficiente de regresión r2 y el Factor Respuesta/Concentración.

Una vez comprobada la linealidad en el rango de 50 a 300 mg/kg, se estudia si las calibraciones rutinarias realizadas por el biosensor (2 puntos) son lo suficientemente estables para garantizar la exactitud y precisión durante la vida útil del biosensor. Para ello se realizaron 23 calibraciones con 5 biosensores distintos, de modo que se comprobó la estabilidad de la pendiente (m), del coeficiente de regresión lineal (r ² ). Los criterios de aceptación propuestos son los siguientes:

- El % RSD de la pendiente no excederá del 15 %

- Ninguna recta tendrá un r*< 0,995 (R < 0,99) Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

PENDIENTE PUNTO DE CORTE

BIOSENSOR r ² (m) (b)

Biosensor 1 0,9986 -268451 ,72 -9,19

Biosensor 1 0,9998 -216795,02 -2,08

Biosensor 1 0,9997 -212064,04 -3,3

Biosensor 1 0,9997 -213370,52 -3,38

Biosensor 1 0,9999 -216305,44 -1 ,96

Biosensor 2 0,9999 -252625,28 -1 ,21

Biosensor 2 0,9997 -238793,58 -3,21

Biosensor 2 0,9997 -260319,96 -3,89

Biosensor 2 0,9999 -160476,95 -0,16

Biosensor 2 0,9998 -162145,8 1 ,92

Biosensor 3 0,9994 -158693,02 -3,36 Biosensor 3 0,9998 -199188,24 -2,5

Biosensor 3 0,9999 -200175,32 -1 ,59

Biosensor 3 0,9987 -207896,84 -6,96

Biosensor 3 0,9994 -175763,08 3,96

Biosensor 4 0,9999 -165459,56 0,9

Biosensor 4 0,9999 -241312,66 -0,55

Biosensor 4 0,9999 -224968,14 1 ,14

Biosensor 4 0,9999 -225537,96 -0,47

Biosensor 5 0,9998 -254172,28 -2,75

Biosensor 5 0,9998 -240394,24 -3,07

Biosensor 5 0,9992 -226618,6 -5,68

Biosensor 5 0,9989 -217246,88 -6,48

MEDIA 0,9996 -214729,35 -2,34

SD 0,0004 32738,83 3

RSD (%) 0,04 15 -

MÁXIMO 0,9999 -158693,02 3,96

MÍNIMO 0,9986 -268451 ,72 -9,19

El método se considera preciso en todo el rango de trabajo, desde 50 a 300 mg/kg y en las matrices objeto de ensayo (langostino crudo y cocido), de acuerdo a los criterios de RSD HORWITZ

Durante la vida útil del biosensor, la estabilidad de las rectas de calibrado se considera adecuada.

La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia aceptado. Dicha exactitud se obtiene mediante el estudio de recuperaciones, en todo el rango de trabajo, desde 50 hasta 300 mg/kg, de modo que en cada nivel de concentración se analizan las dos matrices de estudio (langostino crudo y cocido). Se considera el método de buena exactitud si la recuperación media en todos los niveles de concentración, cumple los criterios establecidos por AOAC. La siguiente tabla muestra los resultados:

LANGOSTINO CRUDO 4

300 96 90-107 SI

LANGOSTINO COCIDO 4

El método se considera exacto en todo el rango de concentración, desde 50 a 300 mg/kg, en las matrices objeto de ensayo (langostino crudo y cocido), de acuerdo a los intervalos de recuperación aceptables establecidos porAOAC.

Por otra parte, se determina el grado de concordancia entre resultados de ensayos independientes obtenidos en condiciones predeterminadas. Dicha precisión se suele expresar como imprecisión mediante el cálculo de desviaciones estándar relativas y/o el cociente Horrat. Para obtener la máxima imprecisión se ha considerado en todos los niveles de concentración, la máxima variabilidad de matrices (especies, productos frescos y elaborados, ... ), medidas a lo largo de la vida del biosensor, etc. La siguiente tabla muestra los resultados:

Monier-Williams Intervalo de incertidumbre

Muestra Biosensor Aceptación modificado Monier-Williams modificado

1 180,9 214 166-262 Sí

2 195,5 224 176-272 Sí

3 216 236 184-288 Sí

4 104,76 115 90-140 Sí

5 112,06 128 100- 156 Sí

6 137,06 127 99-155 Sí

7 131 ,5 117 92-142 Sí

8 183,82 194 150-238 Sí

9 81 96 74-118 Sí

10 68 81 62-100 Sí

11 156 165 130-200 Sí

12 155 190 146-234 Sí

13 97 121 96-146 Sí

14 121 143 112-171 Sí

15 120 131 103-159 Sí

16 226 222 174-270 Sí

17 181 241 189-293 No

18 96 122 94-150 Sí

19 155 176 137-215 Sí

20 117 163 128-198 No

21 127 162 127-197 Sí

22 165,96 202 158-246 Sí

23 124,16 154 119-189 Sí

24 117,16 130 102-158 Sí 25 107 135 107-163 Sí

26 60,28 55 42-68 Sí

27 75,28 67 51-83 Sí

28 75, 18 92 73-111 Sí

29 294,8 337 265-409 Sí

30 86, 12 84 65-103 Sí

31 58, 16 63 50-76 Sí

32 61 ,02 75 59-91 Sí

33 88,02 102 80-124 Sí

34 22,34 21 16-26 Sí

35 41 ,58 46 35-57 Sí

36 76, 1 84 65-103 Sí

37 132,2 166 131-201 Sí

38 172,54 206 162-250 Sí

39 70,6 90 71-109 Sí

40 72,52 84 65-103 Sí

41 65,26 75 59-91 Sí

42 64,6 78 62-94 Sí

43 79,84 88 69-107 Sí

44 70 64 51-77 Sí

El método se considera preciso en todo el rango de trabajo, desde 50 a 300 mg/kg y en las matrices objeto de ensayo (langostino crudo y cocido), de acuerdo a los criterios de RSD HORWITZ.

Para asegurar que los resultados obtenidos son adecuados se realizó un estudio comparativo con el método modificado Monier Williams para determinación de sulfitos en muestras en las que se encuentren presentes otros compuestos volátiles de azufre. Se basa en la transformación de los sulfitos en S0 ₂ . El S0 ₂ es oxidado a H ₂ S0 ₄ que finalmente es valorado con una disolución estandarizada de NaOH. El método modificado Monier Wlliams está basado en el método de la AOAC, Sulfurous Acid (Total) in Food, Optimized Monier-Williams Method. 990.28, pp29, 1995. Este método se emplea con frecuencia en el control oficial de sulfitos en alimentos.

Para ello se analizaron un total de 44 muestras de langostinos cocidos y crudos tanto por el método de Monier-Wlliams modificado como por el método objeto del invento. Los resultados obtenidos se muestran en la anterior tabla. El estudio comparativo con el método modificado de Monier-Wlliams, muestra un valor de fiabilidad del 95%.

Por último, se determina la vida útil del biosensor en relación a su almacenamiento y número de medidas que puede soportar. Para ello, se testan una serie de biosensores con 0, 15, 30, 60 y 90 días de secado almacenados a 3-8°C, e hidratados a día 1 , 7 y 15 tras su secado, Los resultados se muestran en la siguiente tabla:

T0

H1 H7 H15

lote Biosensor 1 Biosensor 1 Biosensor 1 calibración R = 0,9996 R = 0,9999 R = 0,9999

n° de medidas cumuladas 110 105 108

T15

H1 H7 H15

lote Biosensor 2 Biosensor 2 Biosensor 2 calibración R=0,9999 R=0,9999 R=0,9998

n° de medidas cumuladas 107 110 104

T30

H1 H7 H15

lote Biosensor 3 Biosensor 3 Biosensor 3 calibración R = 0, 9999 R=0,9999 R= 0,9998

n° de medidas cumuladas 104 110 120

T60

H1 H7 H15

lote Biosensor 4 Biosensor 4 Biosensor 4 calibración R=0,9993 R=0,9999 R=0,9993

n° de medidas cumuladas 105 105 110

T90

H1 H7 H15

lote Biosensor 2 Biosensor 2 Biosensor 2 calibración R=0,9999 R=0,9999 R=0,9999

n° de medidas cumuladas 115 105 108 siendo:

T0= 0 días de almacenamiento en seco

T15= 15 días de almacenamiento en seco

T30= 30 días de almacenamiento en seco

T60= 60 días de almacenamiento en seco

T90= 90 días de almacenamiento en seco

H1 = 1 día hidratado

H7= 7 días hidratado

H15= 15 días hidratado

Los biosensores son capaces de aguantar un mínimo de 100 medidas en cualquiera de las condiciones anteriormente mencionadas mostrando una perfecta calibración.

EJEMPLOS DE REALIZACION PREFERENTE Para una mejor comprensión de la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos, descritos en detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1. Determinación se sulfito total en gamba cruda Limpiar y desechar el caparazón, el cefalotórax y otras partes no comestibles del exoesqueleto y tracto digestivo visible. A continuación, homogeneizar la muestra con ayuda de una picadora. Pesar 2 gr del homogeneizado y mezclarlo con 18 mi de solución de extracción (tampón 0,1 M CAPS pH 9,5). Agitar vigorosamente 30 segundos y aplicar ultrasonidos de alta intensidad durante 20 minutos con pulsos de 20 segundos y una amplitud del 60%; dejar atemperar antes de procede al análisis.

Añadir 1 mL del homogeneizado a la celda electroquímica con 10 mL de tampón 0, 1 M CAPS pH 9,5, con agitación constante y comenzar la medida amperométrica en el biosensor a un potencial de 0 mV.

Ejemplo 2. Determinación se sulfito total en langostino cocido Limpiar y desechar el caparazón, el cefalotórax y otras partes no comestibles del exoesqueleto y tracto digestivo visible. A continuación, homogeneizar la muestra con ayuda de una picadora. Pesar 5 gr del homogeneizado y mezclarlo con 40 mi de solución de extracción (tampón 0,1 M CAPSO pH 10,0). Agitar vigorosamente 30 segundos y aplicar ultrasonidos de baja intensidad durante 30 minutos a 45°C; dejar atemperar antes de procede al análisis. Añadir 1 mL del homogeneizado a la celda electroquímica con 10 mL de tampón 0, 1 M CAPSO pH 10,0, con agitación constante y comenzar la medida amperométrica en el biosensor a un potencial de 0 mV.

Ejemplo 3. Determinación se sulfito total en langostino crudo

Limpiar y desechar el caparazón, el cefalotórax y otras partes no comestibles del exoesqueleto y tracto digestivo visible. A continuación, homogeneizar la muestra con ayuda de una picadora. Pesar 2 gr del homogeneizado y mezclarlo con 10 mi de solución de extracción (tampón 0,1 M carbonato/bicarbonato pH 10,0). Agitar vigorosamente 30 segundos y aplicar ultrasonidos de baja intensidad durante 20 minutos a 40°C; dejar atemperar antes de procede al análisis. Para eliminar las trazas de muestra en suspensión, se procederá a filtrar/centrifugar la muestra antes de inyectarla en el equipo. Añadir 1 mL del homogeneizado a la celda electroquímica con 10 mL de tampón 0,1 M carbonato/bicarbonato pH 10,0, con agitación constante y comenzar la medida amperométrica en el biosensor a un potencial de 0 mV.