dans une cellule fluidique

Domaine technique auquel se rapporte l'invention

La présente invention concerne un système de transfert d'un échantillon fluidique vers une cellule fluidique en vue de l'analyse de cet échantillon et pour le transfert de cet échantillon fluidique hors de la cellule fluidique, après analyse.

L'invention s'applique en particulier aux appareils de mesure d'interactions biologiques et aux biocapteurs.

Arrière-plan technologique

De manière générale, la technique d'analyse d'échantillons fluidiques la plus utilisée est la chromatographie en phase liquide (HPLC) dans laquelle les échantillons fluidiques sont envoyés vers une colonne.

D'autres systèmes d'analyse d'échantillon fluidique sont munis d'une cellule fluidique configurée pour l'analyse d'interactions entre l'échantillon fluidique et des molécules. Dans ces systèmes, on prélève un échantillon fluidique, en général une petite quantité, on transfère l'échantillon fluidique vers une cellule fluidique où est effectuée une analyse, puis on extrait l'échantillon fluidique de la cellule fluidique.

Dans le présent document on entend par échantillon un échantillon fluidique provenant d'une source liquide (par exemple un liquide physiologique) ou d'une préparation en solution, par exemple par dissolution d'un composant dans un solvant.

De préférence, une cellule fluidique est configurée pour permettre une analyse de l'échantillon par une technique analytique optique. Plus particulièrement, on analyse l'interaction entre un échantillon et une surface de la cellule fluidique par des moyens optiques mettant en œuvre des phénomènes optiques évanescents tels que par exemple : la résonance de plasmons de surface ou SPR (Surface Plasmon Résonance), mais aussi d'autres types de plasmons comme les plasmons localisés (LSPR pour Localized Surface Plasmon Résonance) ou les plasmons longue distance (LRSPR pour Long Range Surface Plasmon Résonance), les miroirs résonants, les guides d'ondes ou les ondes de Bloch de surface (BSW).

De façon avantageuse, la cellule fluidique comporte une biopuce ou un biocapteur comprenant une surface fonctionnalisée pour permettre l'interaction et l'analyse simultanée d'un échantillon sur une matrice de sites d'interaction, les différents sites d'interaction étant dédiés à l'interaction avec différentes molécules ou réactifs particuliers.

Dans un biocapteur, le signal qui mesure l'interaction entre un analyte et le biocapteur, est lié à la concentration de l'échantillon à analyser ainsi qu'à la durée de l'interaction.

Ainsi, dans le cas simple d'une interaction entre un ligand L immobilisé sur une biopuce et d'un analyte A en solution pouvant interagir selon une stœchiométrie de un pour un, la réaction chimique s'écrit : où k _ass représente la constante de taux d'association de la réaction en M ^"1 s ^"1 et k _diss la constante de taux de dissociation de la réaction en s ^"1 .

La réponse R(t) du biocapteur à cette réaction peut se traduire selon l'équation suivante:

R( = [ ^A j ^{' /gm} " - (l - e- ^(t "- ^[A ^ ^< )

[A\ + K _D

où R _max représente la réponse de saturation du biocapteur, K _D (=¾ ₈₈ /^ ₈₈ ) la constante de dissociation de la réaction en M, [Λ] la concentration en analyte de l'échantillon et t le temps.

Plus la concentration de l'échantillon est forte et plus le signal mesuré est important, tant que les éléments de reconnaissance de la biopuce ne sont pas saturés. Plus la durée du passage de l'échantillon dans la cellule fluidique est importante, plus la durée de l'interaction est importante et plus le signal mesuré est important, tant que la réaction de reconnaissance n'a pas atteint son équilibre.

On cherche à améliorer la sensibilité d'un système d'analyse de fluide, par exemple pour l'analyse d'échantillons en faible concentration et/ou en faible quantité. Il existe des solutions pour augmenter le temps de passage d'un échantillon dans une cellule fluidique sans augmenter la consommation dudit échantillon.

Une solution consiste à mettre en œuvre un système de recirculation en circuit fermé, la sortie de la cellule fluidique étant connectée à l'entrée de la cellule fluidique. L'avantage d'une recirculation en circuit fermé, est d'éviter la diffusion de l'échantillon quelle que soit la durée de passage de l'échantillon dans la cellule fluidique. Cependant, le volume d'échantillon en recirculation est égal au volume du circuit fermé. Or, pour certains échantillons, le volume disponible peut être très faible et inférieur au volume du circuit fermé. Pour un autre échantillon, il peut être nécessaire de faire circuler en boucle un volume plus important d'un échantillon faiblement concentré afin que le nombre de molécules ayant interagi sur la biopuce reste négligeable devant la quantité totale de cette molécule dans l'échantillon. Ainsi la concentration de l'échantillon reste constante au fur et à mesure du temps de passage dans la cellule fluidique, par élimination du phénomène de déplétion.

Une autre solution utilise un système de va-et-vient, le sens de circulation de l'échantillon dans la cellule fluidique étant inversé périodiquement : la sortie de la cellule fluidique devient périodiquement l'entrée et vice-versa. Le va-et-vient est compatible avec différents volumes d'échantillon, et différentes concentrations d'échantillon.

Par ailleurs, l'échantillon à analyser comporte généralement une solution et des molécules cibles que l'on cherche à détecter via un biocapteur. En général, l'échantillon à analyser est injecté à la suite d'un liquide de référence, de type solution tampon, comme le PBS (Phosphate Buffer Saline) ou le HBS (HEPES Buffer Solution, avec HEPES pour acide 4- (2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique), ne contenant pas de molécules cibles. Durant le transfert de l'échantillon vers la cellule fluidique, l'échantillon a tendance à se diluer par diffusion au contact de la solution tampon, ce qui diminue sa concentration moyenne et donc la réponse du biocapteur.

Des techniques sont couramment utilisées pour limiter la diffusion d'un échantillon lors de son transfert vers une cellule fluidique. En particulier, il est connu de placer de part et d'autre de l'échantillon une bulle de fluide, généralement de l'air, non miscible ni avec l'échantillon ni avec la solution circulant avant et après l'échantillon. L'échantillon se trouve ainsi intercalé ou encadré entre une bulle d'air en amont et une bulle d'air en aval de la cellule fluidique. Chaque bulle d'air sépare l'échantillon d'un liquide de référence qui circule dans la cellule fluidique avant et après le passage de l'échantillon.

Ainsi, le document de brevet JP2006-242912 décrit un système de transfert fluidique capable de fournir une longue durée de réaction, même pour une faible quantité d'échantillon. En particulier, JP2006-242912 décrit un système fluidique configuré pour une recirculation de l'échantillon en circuit fermé, la sortie de la cellule fluidique étant reliée à l'entrée au moyen d'une vanne. Dans une autre variante, JP2006-242912 décrit un système fluidique configuré pour générer un va-et-vient de l'échantillon dans la cellule fluidique. Dans ces deux configurations, il est aussi prévu de séparer l'échantillon à analyser d'une solution tampon à l'aide d'une bulle d'air, afin d'éviter tout mélange entre l'échantillon et la solution tampon. Dans ces dispositifs, les bulles d'air circulent à l'intérieur d'un passage en forme de canal et servent par exemple à déclencher l'inversion du sens de circulation dans un mouvement de va-et-vient.

Dans la cellule fluidique, l'échantillon est analysé au moyen d'une technique analytique optique basée, de façon non exhaustive, sur des phénomènes optiques évanescents comme par exemple la SPR, mais aussi d'autres types de plasmons comme les plasmons localisés (LSPR) ou les plasmons longue distance (LRSPR), les miroirs résonants, ou les ondes de Bloch de surface (BSW).

Dans le document JP2006-242912, qui se réfère au document de brevet JP3294605 pour la structure de l'équipement de mesure SPR, la cellule d'analyse fluidique a une forme de canal, qui présente un rapport de forme, défini comme le rapport entre la largeur et la hauteur, proche de 1 , la largeur étant prise dans le plan de la surface d'interaction, ou surface fonctionnalisée, de la cellule fluidique et suivant la direction transversale de la cellule fluidique et la hauteur de la cellule fluidique étant prise suivant une direction transversale au plan de la surface d'interaction de la cellule fluidique. Ce canal peut être assimilable à un tube. Or un canal n'est pas adapté pour contenir une biopuce. Dans ce document, le système fluidique est utilisé aussi bien pour la fonctionnalisation du canal, c'est-à-dire l'immobilisation des molécules sondes de reconnaissance, que pour l'injection de l'échantillon destiné à être éventuellement reconnu par les molécules sondes. L'arrivée d'une bulle d'air dans un canal ne pose pas de problème car cette bulle remplit la totalité de la section du canal et le liquide de référence pousse cette bulle vers la sortie. De plus, la fonctionnalisation du canal étant réalisée via le système fluidique, permet une fonctionnalisation homogène de tout le canal et donc une hydrophobicité et/ou hydrophilicité constante. Il n'y a donc aucune zone susceptible de piéger une bulle dans ce canal.

Cependant, une cellule fluidique est configurée pour permettre d'immobiliser plusieurs, voire plusieurs dizaines, voire plusieurs centaines de ligands ou éléments de reconnaissance ou sondes différents. A cet effet, la cellule d'analyse fluidique a généralement une forme élargie et présente un facteur de forme très supérieur à 1 , avec par exemple une largeur de plusieurs millimètres et une hauteur de plusieurs dizaines de microns. Ce type de cellule d'analyse fluidique de section élargie est couramment utilisé dans les appareils permettant d'imager une biopuce composée d'une matrice de plots (microarray), chaque plot pouvant contenir une molécule sonde différente immobilisée sur ladite puce.

A titre d'exemple, le document de brevet US 201 1 1 /0052446_A1 décrit différentes cellules fluidiques couplées à des moyens d'injection et d'extraction de fluides.

Dans la suite de ce document, nous désignons par canal une cellule d'analyse fluidique ayant un facteur de forme ~1 et par cellule fluidique uniquement les cellules d'analyse fluidique de facteur de forme »1 .

Dans le cas de l'utilisation d'une cellule fluidique, le fluide (liquide ou gaz) en circulation va passer au dessus de la biopuce et donc être en contact avec, selon les endroits de la biopuce, la chimie de surface ou l'une ou l'autre des différentes molécules sondes immobilisées. Ces différents composés chimiques et/ou biologiques immobilisés sur la surface présentent différentes hydrophobicités. Se forme ainsi une direction privilégiée de passage d'une bulle d'air dans la cellule fluidique. Des zones susceptibles de piéger une partie de la bulle d'air dans la cellule fluidique peuvent aussi se former.

Par exemple, le brevet WO2012/045325 décrit un système de mesure SPR (Surface Plasmon Résonance) et plus particulièrement la mise en place d'un va et vient dans le système fluidique pour augmenter le temps de réaction sans augmenter la consommation en réactifs. WO2012/045325 mentionne que pour faire ce va-et-vient, il est primordial de séparer la solution tampon et l'échantillon par un fluide d'indice de réfraction très différent comme un liquide non miscible ou un gaz comme de l'air. Cette séparation empêche que tampon et échantillon se mélangent par diffusion. Selon ce document WO2012/045325, le passage d'une bulle d'air dans la cellule fluidique est utilisé pour déclencher le début et la fin de la mesure de l'échantillon par détection d'un brusque décalage de résonance induit par le brusque saut d'indice de réfraction entre le milieu liquide et la bulle d'air.

Or, une bulle d'air est susceptible d'adhérer à la surface sensible d'un capteur dans une cellule fluidique et de modifier ses propriétés de surface, en particulier lorsqu'une couche hydrophobe est déposé sur le capteur (voir Handbook of Surface Plasmon Résonance, chapitre 3.3.1 page 46).

Il est connu d'utiliser un dégazeur en ligne pour éviter la formation de bulles, par dégazage de l'échantillon ou de solution tampon dans la cellule fluidique. Il apparaît donc tout aussi important d'éviter qu'une bulle d'air utilisée pour séparer l'échantillon de la solution tampon ne soit piégée à l'intérieur d'une cellule fluidique.

Ainsi, le document de brevet WO03/025547 décrit un système et une méthode permettant d'analyser un échantillon par résonance de plasmons de surface dans une cellule microfluidique, et propose des capillaires et des zones pour piéger une bulle d'air séparant l'échantillon de la solution tampon avant que la bulle d'air rentre dans la cellule fluidique. Plus précisément, le dispositif comporte un circuit fluidique pour amener l'échantillon en solution vers au moins une chambre de réaction pour interagir avec un ou plusieurs réactifs. Le circuit fluidique comporte une ou plusieurs évents pour éliminer les bulles d'air de la cellule fluidique ou du circuit fluidique en amont de la cellule fluidique.

Toutefois, ce dispositif ne permet de faire circuler l'échantillon que dans une direction, et ne permet pas d'effectuer des allers-retours de l'échantillon dans la chambre d'analyse de la cellule fluidique.

Il existe donc un besoin d'un système et d'une méthode permettant d'augmenter la durée d'interaction d'un échantillon fluidique dans une cellule fluidique, tout en évitant la diffusion entre l'échantillon fluidique et un fluide de circulation, tel qu'une solution tampon, et tout en évitant de modifier la surface d'interaction de la cellule fluidique du fait du passage et/ou du piégeage d'une bulle d'air dans la cellule fluidique.

La présente invention se propose donc de résoudre le problème d'augmenter le temps de passage d'un échantillon dans une cellule fluidique, en particulier ayant un facteur de forme très supérieur à 1 , compatible avec différents volumes d'échantillon, sans en augmenter la consommation, et tout en limitant au maximum la diffusion de l'échantillon vers d'autres liquides, tel qu'une solution tampon, pendant le passage de cet échantillon dans le circuit fluidique, et tout en évitant de modifier une surface d'interaction de la cellule fluidique lors du passage d'un fluide de séparation, par exemple une bulle d'air, dans la cellule fluidique.

Objet de l'invention

La présente invention a pour but de remédier aux inconvénients des systèmes antérieurs et propose plus précisément un système de transfert d'un échantillon fluidique dans une cellule fluidique, le système fluidique comportant une cellule fluidique ayant une première entrée-sortie disposée en amont de ladite cellule fluidique et une deuxième entrée-sortie disposée en aval de ladite cellule fluidique, un premier circuit fluidique relié à ladite première entrée-sortie et un deuxième circuit fluidique relié à ladite deuxième entrée-sortie, des premiers moyens d'injection reliés au premier circuit fluidique, lesdits premiers moyens d'injection étant configurés pour injecter en série dans le premier circuit fluidique : une solution tampon, un premier volume de fluide de séparation suivi d'un échantillon fluidique puis d'un deuxième volume de fluide de séparation et d'une autre solution tampon, et des moyens de circulation configurés pour faire circuler ledit échantillon fluidique intercalé entre le premier volume de fluide de séparation et le deuxième volume de fluide de séparation dans le premier circuit fluidique en direction de la première entrée-sortie de la cellule fluidique.

Selon l'invention, le système comporte des premiers moyens d'évacuation disposés sur le premier circuit fluidique à proximité de la première entrée-sortie, lesdits premiers moyens d'évacuation étant configurés pour extraire, en amont de la cellule fluidique, ledit premier volume de fluide de séparation et, respectivement, ledit deuxième volume de fluide de séparation, des deuxièmes moyens d'injection disposés sur le deuxième circuit fluidique à proximité de la deuxième entrée-sortie, lesdits deuxièmes moyens d'injection étant configurés pour injecter, en aval de la cellule fluidique, un troisième volume de fluide de séparation entre ladite solution tampon et l'échantillon fluidique et, respectivement, un quatrième volume de fluide de séparation entre l'échantillon fluidique et ladite autre solution tampon, et des moyens de circulation bidirectionnels configurés pour faire circuler l'échantillon fluidique suivant une première direction de circulation allant de ladite première entrée-sortie vers ladite deuxième entrée-sortie ou suivant une deuxième direction de circulation allant de ladite deuxième entrée- sortie vers ladite première entrée-sortie sans passage du premier, deuxième, troisième ou quatrième volume de fluide de séparation dans ladite cellule fluidique.

Le système de l'invention, intégré de part et d'autre de la cellule fluidique, permet de transférer un échantillon fluidique, d'évacuer la première bulle de séparation précédant l'échantillon avant son entrée dans la cellule fluidique et de réinjecter une nouvelle bulle de séparation juste après la sortie de l'échantillon en aval de la cellule fluidique.

Ce système peut être utilisé de la même façon pour ôter et réinjecter la deuxième bulle d'air suivant l'échantillon. Ainsi, chaque extrémité de l'échantillon n'est en contact avec la solution tampon que pendant la durée d'une traversée du circuit fluidique entre les premiers moyens d'évacuation et les deuxièmes moyens d'injection d'une bulle de séparation, et ce quelle que soit la longueur du circuit fluidique en amont de la cellule fluidique et quelle que soit la durée totale de passage d'échantillon dans la cellule fluidique.

La durée de contact entre l'échantillon et la solution tampon et la diffusion induite sont d'autant plus courtes que les premiers moyens d'évacuation et les deuxièmes moyens d'injection sont situés au plus près de la cellule fluidique. Néanmoins, cette durée reste légèrement supérieure à la durée de traversée de l'échantillon à travers la cellule fluidique.

Le système et le procédé de l'invention permettent une circulation en va-et-vient de l'échantillon dans la cellule fluidique pendant le temps nécessaire à l'interaction avec une surface sensible d'un capteur, tout en introduisant une diffusion et donc une dilution de l'échantillon minimales.

De façon avantageuse, le système comporte un dispositif d'analyse optique couplé à la cellule fluidique et configuré pour permettre une analyse optique, par exemple de type SPR, ou LSPR..., de l'échantillon dans la cellule fluidique, ou d'une interaction entre l'échantillon et la surface sensible d'un capteur. Selon un premier mode de réalisation, les premiers moyens d'évacuation comprennent une première vanne ayant au moins un premier port d'entrée-sortie relié fluidiquement à la première entrée-sortie de la cellule fluidique, un deuxième port d'entrée-sortie relié fluidiquement aux premiers moyens d'injection, et un troisième port d'entrée-sortie, ladite première vanne ayant au moins un premier état, dans lequel le premier port d'entrée-sortie de la première vanne est relié au deuxième port d'entrée-sortie de la première vanne et un deuxième état, dans lequel le deuxième port d'entrée-sortie de la première vanne est relié au troisième port d'entrée-sortie de la première vanne.

Selon un aspect particulier du premier mode de réalisation, les deuxièmes moyens d'injection de fluide de séparation comprennent une deuxième vanne ayant au moins un premier port d'entrée-sortie relié fluidiquement à la deuxième entrée-sortie de la cellule fluidique, un deuxième port d'entrée-sortie et un troisième port d'entrée-sortie relié fluidiquement à une source de fluide de séparation, ladite deuxième vanne ayant au moins un premier état, dans lequel le premier port d'entrée-sortie de la deuxième vanne est relié au deuxième port d'entrée-sortie de la deuxième vanne et un deuxième état, dans lequel le deuxième port d'entrée-sortie de la deuxième vanne est relié au troisième port d'entrée-sortie de la deuxième vanne.

Selon un deuxième mode de réalisation, les premiers moyens d'évacuation du fluide de séparation et les deuxièmes moyens d'injection de fluide de séparation comprennent une vanne ayant au moins un premier port d'entrée-sortie relié fluidiquement à la première entrée- sortie de la cellule fluidique, un deuxième port d'entrée-sortie relié fluidiquement à la deuxième entrée-sortie de la cellule fluidique, un troisième port d'entrée-sortie relié aux premiers moyens d'injection, un quatrième port d'entrée-sortie relié fluidiquement à une source de fluide de séparation, un cinquième port d'entrée-sortie et un sixième port d'entrée-sortie, lesdits cinquième et sixième ports d'entrée-sortie étant de préférence reliés fluidiquement à un dispositif d'évacuation ou de récupération, ladite vanne ayant au moins un premier état dans lequel le premier port d'entrée-sortie est relié au troisième port d'entrée-sortie et dans lequel le deuxième port d'entrée-sortie est relié au sixième port d'entrée-sortie, ladite vanne ayant au moins un deuxième état dans lequel le troisième port d'entrée-sortie est relié au cinquième port d'entrée-sortie et/ou dans lequel le quatrième port d'entrée-sortie est relié au sixième port d'entrée-sortie.

Selon une première variante du système de l'invention, le système comprend un détecteur disposé sur le premier circuit fluidique entre les premiers moyens d'injection et les premiers moyens d'évacuation du fluide de séparation, le détecteur étant configuré pour détecter le premier volume de fluide de séparation et/ou le deuxième volume de fluide de séparation.

De façon avantageuse, le détecteur est configuré pour déclencher un signal de détection du premier fluide de séparation, respectivement du deuxième fluide de séparation, et comprenant en outre un compteur configuré pour calculer, à partir du signal de détection du premier fluide de séparation, respectivement du deuxième fluide de séparation, un signal de déclenchement des deuxièmes moyens d'injection pour injecter le troisième volume de fluide de séparation entre ladite solution tampon et l'échantillon fluidique, respectivement, le quatrième volume de fluide de séparation entre l'échantillon fluidique et ladite autre solution tampon.

Selon un aspect particulier de l'invention, le troisième volume de fluide de séparation étant un volume d'air, les deuxièmes moyens d'injection de fluide de séparation comprennent une pompe à air de préférence reliée à un filtre à air, le troisième et le quatrième volume de fluide de séparation étant un volume d'air.

Selon un aspect particulier et avantageux de l'invention, la cellule fluidique a un rapport entre largeur et hauteur de la cellule d'analyse fluidique ou rapport de forme supérieur au rapport de forme du premier et respectivement du deuxième circuit fluidique.

De façon particulièrement avantageuse, la cellule fluidique comporte une biopuce configurée pour l'analyse de l'échantillon fluidique en au moins un site d'analyse, et de préférence en une matrice de sites d'analyse, l'analyse étant de préférence une analyse optique, par exemple de type à résonance de plasmons de surface (SPR), à résonance de plasmons de surface localisés (LSPR), à miroirs résonants, à ondes de Bloch de surface (BSW), à guides d'onde intégrés ou encore à microcavités résonantes (WGM).

Selon un aspect particulier et avantageux de l'invention, le système comporte des moyens de synchronisation configurés pour synchroniser le fonctionnement des premiers moyens d'évacuation du fluide de séparation, des deuxièmes moyens d'injection de fluide de séparation et des moyens de circulation bidirectionnels.

Avantageusement, le système fluidique comporte en outre un réservoir configuré pour recevoir le ou les fluides provenant de la deuxième entrée-sortie de la cellule fluidique.

L'invention concerne aussi un procédé de transfert d'un échantillon fluidique dans un système fluidique, le procédé comportant les étapes suivantes :

- injection en série dans un premier circuit fluidique d'une solution tampon suivi d'un premier volume de fluide de séparation, d'un échantillon fluidique, puis d'un deuxième volume de fluide de séparation et d'une autre solution tampon,

- circulation de l'échantillon fluidique intercalé entre le premier volume de fluide de séparation et le deuxième volume de fluide de séparation dans le premier circuit fluidique en direction de la première entrée-sortie de la cellule fluidique,

- évacuation, à proximité de la première entrée-sortie, du premier volume de fluide de séparation, en amont de la cellule fluidique,

- passage de la solution tampon suivi de l'échantillon fluidique dans la cellule fluidique ; - injection, à proximité de la deuxième entrée-sortie, d'un troisième volume de fluide de séparation entre ladite solution tampon et l'échantillon fluidique en aval de la cellule fluidique, et

- mise en circulation bidirectionnelle de l'échantillon fluidique intercalé entre le deuxième volume de fluide de séparation et le troisième volume de fluide de séparation, suivant une première direction de circulation allant de ladite première entrée-sortie vers ladite deuxième entrée-sortie et/ou suivant une deuxième direction de circulation allant de ladite deuxième entrée-sortie vers ladite première entrée-sortie sans passage du deuxième ou du troisième volume de fluide de séparation dans ladite cellule fluidique ;

- évacuation, à proximité de la première entrée-sortie, du deuxième volume de fluide de séparation, en amont de la cellule fluidique,

- passage de l'échantillon fluidique dans la cellule fluidique suivi de l'autre solution tampon à travers la cellule fluidique de la première entrée-sortie vers la deuxième entrée-sortie ;

- injection, à proximité de la deuxième entrée-sortie, d'un quatrième volume de fluide de séparation entre l'échantillon fluidique et l'autre solution tampon en aval de la cellule fluidique.

Selon un aspect particulier et avantageux, le procédé de transfert d'un échantillon fluidique dans un système fluidique, comprend en outre les étapes suivantes :

- Détection, en amont de la cellule fluidique, du premier volume de fluide de séparation;

- Déclenchement, à partir du signal de détection du premier volume de fluide de séparation, d'un compteur configuré pour calculer un signal de déclenchement des deuxièmes moyens d'injection de manière à injecter le troisième volume de fluide de séparation entre ladite solution tampon et l'échantillon fluidique en aval de la cellule fluidique.

Selon un autre aspect particulier et avantageux, le procédé de transfert d'un échantillon fluidique dans un système fluidique, comprend en outre les étapes suivantes :

- Détection, en amont de la cellule fluidique, du deuxième volume de fluide de séparation;

- Déclenchement, à partir du signal de détection du deuxième volume de fluide de séparation, d'un compteur configuré pour calculer un signal de déclenchement des deuxièmes moyens d'injection de manière à injecter le quatrième volume de fluide de séparation entre l'échantillon fluidique et ladite autre solution tampon en aval de la cellule fluidique.

La présente invention concerne également les caractéristiques qui ressortiront au cours de la description qui va suivre et qui devront être considérées isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles.

Cette description donnée à titre d'exemple non limitatif fera mieux comprendre comment l'invention peut être réalisée en référence aux dessins annexés sur lesquels : - les figures 1 A-1 F représentent schématiquement les principale étapes d'un exemple de procédé de transfert selon l'invention ;

- la figure 2 illustre un exemple de simulation numérique de cinétique d'interaction d'un échantillon avec un élément de reconnaissance immobilisé sur la puce et dirigé contre un des constituants de l'échantillon ;

- les figures 3A-3C représentent schématiquement un système de transfert d'un échantillon fluidique selon un premier mode de réalisation de l'invention ;

- les figures 4A-4B représentent schématiquement un système de transfert d'un échantillon fluidique selon un deuxième mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 5 représente schématiquement une première variante d'un système de transfert d'un échantillon fluidique selon le premier mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 6 représente schématiquement une première variante d'un système de transfert d'un échantillon fluidique selon le deuxième mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 7 représente schématiquement une deuxième variante d'un système de transfert d'un échantillon fluidique selon le premier mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 8 représente schématiquement une deuxième variante d'un système de transfert d'un échantillon fluidique selon le deuxième mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 9 représente schématiquement une troisième variante d'un système de transfert d'un échantillon fluidique selon le premier mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 10 représente schématiquement une troisième variante d'un système de transfert d'un échantillon fluidique selon le deuxième mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 1 1 représente schématiquement un système complet de transfert d'un échantillon fluidique selon un mode de réalisation de l'invention.

Les figures 1 A-1 F illustrent schématiquement le principe d'un système selon un mode de réalisation de l'invention et les principales étapes du procédé de transfert.

Systèmes et procédés

Sur les figures 1 A-1 F, on a représenté une cellule fluidique 10 destinée à recevoir un échantillon sous forme liquide ou dispersé en solution que l'on souhaite analyser. Les figures 1 - A à 1 -F représentent schématiquement une cellule fluidique 10 en vue de dessus. Dans le plan des figures 1 -A à 1 -F, cette cellule fluidique 10 a une forme générale hexagonale, ou carrée, ou rectangulaire, ou autre. Dans un plan transverse au plan des figures 1 -A à 1 -F, la cellule fluidique 10 a une section de forme rectangulaire et allongée. La cellule fluidique 10 comporte une première entrée-sortie 1 disposée en amont de la cellule fluidique 10 et une deuxième entrée-sortie 2 disposée en aval de ladite cellule fluidique 10. Les deux entrées-sorties 1 ,2 sont par exemple disposées aux sommets opposés d'un hexagone. La première entrée-sortie 1 est reliée fluidiquement à un premier circuit fluidique, dont on a représenté deux branches 12 et 13. De même, la deuxième entrée-sortie 2 est reliée fluidiquement à un deuxième circuit fluidique, dont on a représenté deux branches 22 et 23. Les branches 12 et 13 sont par exemple constituées de tubes en métal ou en matériau polymère. La cellule fluidique 10 est en général couplée à un système d'analyse, par exemple d'analyse optique, de type SPR, LSPR, LRSPR ou BSW... De façon avantageuse, la cellule fluidique se présente sous la forme d'une cuvette, adaptée pour recevoir un échantillon fluidique. A titre d'exemple, la cellule fluidique peut être refermée de manière étanche par une interface optique de couplage sur laquelle est incident un faisceau optique, de manière à mesurer les interactions entre ce faisceau optique et l'échantillon fluidique. De façon particulièrement avantageuse, l'interface de couplage optique comporte un biocapteur ou une biopuce sur la surface en contact avec l'échantillon fluidique. Une biopuce comporte en général différentes molécules immobilisées sur une surface et disposées en matrice. Pour permettre d'immobiliser une grande quantité de ligands, ou d'éléments de reconnaissance ou de sondes différents, la cellule fluidique 10 présente préférentiellement un facteur de forme »1 , typiquement avec une largeur de plusieurs millimètres et une hauteur de quelques dizaines de microns.

De manière générale, un système d'injection et de circulation, tel qu'un auto-injecteur, décrit de manière détaillée en lien avec la figure 1 1 , prélève un échantillon fluidique 30 et l'injecte dans une branche 13 du premier circuit fluidique. Le système d'injection et de circulation fait avancer l'échantillon fluidique jusque dans la cellule fluidique où il interagit avec une surface pour être analysé. L'échantillon fluidique 30 est ensuite transféré vers le deuxième circuit fluidique pour être évacué ou collecté. La direction de circulation dans le circuit fluidique est indiquée par une flèche sur les figures 1 A, 1 -B, 1 -C, 1 -E et 1 -F. Pour illustrer une circulation en va-et-vient, on a représenté deux flèches de direction opposées sur la figure 1 -D.

En général, l'auto-injecteur fait d'abord circuler un liquide de référence 35, ou solution tampon, contenant généralement un solvant, comme l'eau, ou de l'eau et des sels, par exemple du PBS ou du HBS, à travers le circuit fluidique 13, 23 et la cellule fluidique 10. Contrairement à l'échantillon fluidique 30 que l'on cherche à analyser via le biocapteur, la solution tampon 35 ne contient pas de molécules cibles. La solution tampon 35 permet de maintenir propre le circuit fluidique 13, 23 et la cellule fluidique 10, et évite toute contamination du biocapteur avant l'entrée de l'échantillon fluidique 30 dans la cellule fluidique 10. Le signal mesuré pendant le passage de la solution tampon 35, avant l'échantillon, sert de signal de référence. Le signal mesuré pendant le passage de la solution tampon 36 après l'échantillon sert à mesurer la dissociation, c'est à dire la vitesse de séparation entre les sondes et les cibles.

Pour éviter une dilution de l'échantillon fluidique 30 dans la solution tampon 35 lors de son transfert vers la cellule fluidique 10, l'auto-injecteur insère, juste avant et juste après l'échantillon fluidique 30, une bulle de fluide de séparation. Le fluide de séparation est sélectionné pour être non miscible ni avec l'échantillon fluidique 30 ni avec la solution tampon. Le fluide de séparation est généralement de l'air ou un gaz inerte comme de l'azote ou de l'argon.

Ainsi, on observe sur la figure 1 -A le passage d'une solution tampon 35 à travers la cellule fluidique 10, de la première entrée-sortie 1 vers la deuxième entrée-sortie 2, en direction de la branche 23 du deuxième circuit fluidique. Une première bulle d'air 31 sépare la solution tampon 35 de l'échantillon 30. La première bulle d'air 31 et l'échantillon fluidique 30 circulent dans la branche 13 du premier circuit fluidique en direction de la première entrée-sortie de la cellule fluidique 10. Une deuxième bulle d'air 32 sépare l'échantillon 30 de la solution tampon 36 injectée à la suite de l'échantillon dans le premier circuit fluidique (voir fig. 1 -C et 1 -D). Ainsi, l'échantillon 30 circule dans la branche 13 du premier circuit fluidique en amont de la cellule fluidique 10, l'échantillon 30 étant intercalé entre la première bulle d'air 31 et la deuxième bulle d'air 32.

Sur la figure 1 -A, la branche 12 du premier circuit fluidique et, respectivement la branche 22, du deuxième circuit fluidique, sont hermétiquement fermées par une vanne 41 , respectivement 42.

L'échantillon 30 précédé de la première bulle d'air 31 est injecté jusqu'à proximité de la première entrée-sortie 1 de la cellule fluidique 10.

Sur la figure 1 -B, la vanne 41 sur la branche 12 du premier circuit fluidique est ouverte et une vanne 43 ferme hermétiquement le circuit entre la branche 13 et la première entrée- sortie 1 de la cellule fluidique 10. L'auto-injecteur induit une circulation de la première bulle d'air 31 vers la branche 12 du premier circuit fluidique. Dans la cellule fluidique 10, la circulation de la solution tampon 35 est stoppée. Ainsi, la première bulle d'air 31 est évacuée avant d'entrer dans la cellule fluidique 10. En effet une bulle d'air entrant dans la cellule fluidique 10 est susceptible de se fixer et de modifier l'interface de contact entre l'échantillon à analyser 30 et la surface d'interaction, par exemple d'un biocapteur. De plus, il est en général difficile d'évacuer une bulle d'air piégée dans la cellule fluidique 10. Dès que la première bulle d'air 31 est extraite via la branche 12 du premier circuit fluidique, on referme la vanne 41 (voir fig. 1 -C) et on ouvre à nouveau la vanne 43, pour limiter une perte de volume de l'échantillon fluidique 30 à analyser. L'auto-injecteur induit alors une circulation de l'échantillon fluidique 30 vers la cellule fluidique.

Pendant l'injection de l'échantillon fluidique 30 depuis la première entrée-sortie 1 jusque la deuxième entrée-sortie, aucun fluide de séparation ne sépare l'échantillon fluidique 30 de la solution tampon 35 qui a déjà traversé la cellule fluidique. Cependant, cette étape sans fluide de séparation est limitée à la durée d'un passage de l'échantillon dans la cellule 10 et la dilution de l'échantillon qui en résulte est généralement très faible.

Sur la figure 1 -C, la solution tampon 35 est sortie de la cellule fluidique 10 et l'échantillon 30 atteint la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique 10. On ferme une vanne 44 à proximité de la deuxième entrée-sortie 2 et on ouvre une vanne 42 sur une branche 22 du deuxième circuit fluidique. Dans la cellule fluidique 10, la circulation de l'échantillon 30 est stoppée. On insère une nouvelle bulle d'air 33 à l'interface entre l'échantillon 30 et la solution tampon 35. La nouvelle bulle d'air 33 est insérée à l'extérieur de la cellule fluidique 10. Le système d'injection induit une circulation de la nouvelle bulle d'air 33 et de la solution tampon 35 vers la branche 23 du deuxième circuit fluidique. Une deuxième bulle d'air 32 sépare l'échantillon 30 d'un autre fluide de séparation 36, qui est généralement de même nature que le premier fluide de séparation 35. La deuxième bulle d'air 32 et l'autre fluide de séparation 36 sont situés sur la branche 13 du premier circuit fluidique en amont de la première entrée-sortie 1 de la cellule fluidique 10.

Ainsi, on obtient, sur la figure 1 -D, un échantillon fluidique 30 qui remplit la cellule fluidique 10, l'échantillon fluidique 30 étant intercalé entre deux bulles d'air 33, 32 le séparant de la solution tampon 35, 36, sans qu'aucune bulle d'air n'ait été injectée dans la cellule fluidique 10. Une bulle d'air 32 est située sur la branche 13 du premier circuit fluidique en amont de la première entrée-sortie 1 de la cellule fluidique 10. Et une autre bulle d'air 33 est située sur la branche 23 du deuxième circuit fluidique en aval de la première entrée-sortie 1 de la cellule fluidique 10. De façon avantageuse, l'auto-injecteur induit une circulation bidirectionnelle alternée, autrement dit une circulation en va-et-vient, de l'échantillon 30 dans la cellule fluidique 10, les deux bulles d'air 32, 33 qui encadrent l'échantillon restant en dehors de la cellule fluidique 10.

De préférence, l'échantillon fluidique 30 a un volume supérieur au volume intérieur de la cellule fluidique 10. Le volume de l'échantillon fluidique est déterminé de manière à ce que le déplacement de l'échantillon induit par un mouvement de va-et-vient soit interrompu avant l'entrée de la bulle d'air 32 via la première entrée-sortie 1 et avant l'entrée de la bulle d'air 33 via la deuxième entrée-sortie 2.

La circulation en va-et-vient permet d'augmenter la durée d'interaction et la probabilité d'interaction entre l'échantillon fluidique 30 et la surface d'un biocapteur dans la cellule fluidique.

Pendant la circulation en va-et-vient, l'échantillon est séparé de la solution tampon 35, 36 à ses deux extrémités, ce qui permet d'éviter toute dilution de l'échantillon pendant le va-et- vient.

Les figures 1 -E et 1 -F illustrent l'extraction de l'échantillon 30 hors de la cellule fluidique 10. L'auto-injecteur induit une circulation de l'échantillon 30 de la première entrée-sortie 1 vers la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique 10. Lorsque la bulle d'air 32, qui sépare l'échantillon de la solution tampon 36 dans le premier circuit fluidique, approche de la première entrée-sortie 1 de la cellule fluidique 10, on ferme la vanne 43 et on ouvre la vanne 41 vers la branche 12. L'auto-injecteur pousse ainsi la bulle d'air 32 vers la branche 12 du premier circuit fluidique. Ainsi, la bulle d'air 32 est évacuée avant d'entrer dans la cellule fluidique 10. Dans la cellule fluidique 10, la circulation de l'échantillon 30 est stoppée.

Dès que la bulle d'air 32 est extraite via la branche 12 du premier circuit fluidique, on referme la vanne 41 et on ouvre la vanne 43. L'auto-injecteur induit de nouveau une circulation de l'échantillon fluidique 30 et de la solution tampon 36 à travers la cellule fluidique 10 de l'entrée-sortie 1 vers l'entrée-sortie 2.

Pendant l'extraction de l'échantillon fluidique 30 hors de la cellule fluidique, après évacuation de la bulle d'air 32, aucun fluide de séparation ne sépare l'échantillon fluidique 30 de la solution tampon 36. Cependant, cette étape est limitée à la durée d'un passage de l'échantillon dans la cellule 10 et la dilution de l'échantillon qui en résulte est généralement très faible.

Sur la figure 1 -F, l'échantillon 30 est extrait de la cellule fluidique 10 et la solution tampon 36 atteint la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique 10. On ferme la vanne 44 à proximité de la deuxième entrée-sortie 2 et on ouvre la vanne 42 sur la branche 22 du deuxième circuit fluidique. Dans la cellule fluidique 10, la circulation de la solution tampon 36 est stoppée. On insère une nouvelle bulle d'air 34 à l'interface entre l'échantillon 30 et la solution tampon 36. Ainsi, une bulle d'air 34 sépare l'échantillon 30 du fluide de séparation 36, cette nouvelle bulle d'air 34 étant insérée à l'extérieur de la cellule fluidique 10. Le système d'injection induit une circulation de la nouvelle bulle d'air 34 et de l'échantillon 30 vers la branche 23 du deuxième circuit fluidique. La bulle d'air 34 est injectée sur la branche 23 du deuxième circuit fluidique en aval de la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique 10. Sur le deuxième circuit fluidique, l'échantillon 30 circule donc de nouveau encadré par deux bulles d'air 33, 34. L'échantillon 30 peut ensuite être collecté pour d'autres analyses, sans avoir subi de dilution importante dans la solution tampon 35 ou 36.

Ainsi, au cours des étapes 1 -A à 1 -F aucune des bulles de séparation 31 , 32, 33, 34 n'a été injectée dans la cellule fluidique 30. Néanmoins, pendant toute la durée de l'étape de circulation en va-et-vient, le système et le procédé permettent une circulation en va-et-vient de l'échantillon 30 dans la cellule fluidique, l'échantillon restant séparé de la solution tampon 35, 36 par une bulle d'air 32, 33 disposée respectivement à chacune de ses extrémités, comme illustré sur la figure 1 -D.

Dans un exemple d'application, l'opérateur ne dispose que de 500 μ\- d'un échantillon biologique comprenant une molécule cible à une concentration de 500 pM. Un biocapteur est fonctionnalisé avec une molécule de reconnaissance présentant une affinité Kd=50nM avec la molécule cible (k _a =1 -10 ⁴ M ^" s ^"1 et k _d =5-10 ^"4 s ^"1 ). La cinétique d'interaction selon un modèle stœchiométrique simple 1 :1 suit en général une courbe telle qu'indiquée sur la figure 2, avec une phase croissante en fonction du temps jusqu'à atteindre l'équilibre. La phase décroissante de la courbe sur la figure 2 correspond à la phase de dissociation : après que la fin de l'échantillon est passée dans la cellule fluidique (ici à t=9000s), la solution tampon 36 circule à nouveau dans la cellule fluidique. La concentration en analyte passe donc à 0, ce qui déplace l'équilibre. Les molécules reconnues vont donc progressivement se détacher à un rythme plus ou moins soutenu.

Dans un système où la circulation de l'échantillon dans la cellule fluidique est unidirectionnelle, et pour un débit de circulation de 100μΙ_Ληίη, la durée d'interaction de l'échantillon est alors limitée à 300 s au maximum, ce qui ne permet pas d'atteindre l'équilibre de la réaction, mais seulement environ 10 % de la valeur maximum sur la figure 2.

Au contraire, avec le même échantillon et le système et le procédé de l'invention, une circulation bidirectionnelle de l'échantillon pendant une quinzaine de va-et-vient dans la cellule fluidique permet d'atteindre une durée totale d'interaction de 2h30, et l'équilibre de la réaction. On obtient ainsi une réponse finale 10 fois plus importante qu'avec un système fluidique dans lequel la circulation est monodirectionnelle, bien que la quantité totale d'échantillon disponible soit extrêmement limitée. Pendant les 15 va-et-vient, l'échantillon reste séparé de la solution tampon, ce qui évite toute dilution de l'échantillon pendant ces nombreux va-et-vient.

Le système et le procédé décrits en lien avec les figures 1 -A à 1 -F peuvent être entièrement automatisés.

Les figures 3A-3C représentent un système de transfert d'un échantillon fluidique selon un premier mode de réalisation de l'invention.

Le système des figures 3A-3C comporte un auto-injecteur 80, une cellule fluidique 10, une pompe à air 91 munie d'un filtre à air 90. La première entrée-sortie 1 de la cellule fluidique 10 est reliée à une première branche 1 1 du premier circuit fluidique. La deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique 10 est reliée à une première branche 21 du deuxième circuit fluidique. Une première vanne 50 est disposée sur le premier circuit fluidique à proximité de la première entrée-sortie 1 . Avantageusement, la première vanne 50 comporte au moins une entrée 52 et deux sorties 51 , 53. L'entrée 52 de la première vanne 50 est reliée par une branche 13 à l'auto- injecteur 80. La sortie 51 de la première vanne 50 est reliée par la branche 1 1 à la première entrée-sortie 1 de la cellule fluidique 10. La sortie 53 de la première vanne 50 est reliée par une branche 12 à un récipient 81 , qui sert par exemple de collecteur de déchets. Une deuxième vanne 60 est disposée sur le deuxième circuit fluidique à proximité de la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique. Avantageusement, la deuxième vanne 60 comporte au moins deux entrées 61 , 63 et une sortie 62. L'entrée 61 de la deuxième vanne 60 est reliée par une branche 21 à la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique 10. L'entrée 63 de la deuxième vanne 60 est reliée par la branche 22 à la pompe à air 91 . La sortie 62 de la deuxième vanne 60 est reliée par une branche 23 à un récipient 93, qui sert par exemple de collecteur pour récupérer l'échantillon après analyse ou de poubelle.

Sur la figure 3-A, l'entrée 52 et la sortie 51 de la première vanne 50 sont reliées fluidiquement. La sortie 53 de la première vanne 50 n'est pas reliée à l'entrée 52, si bien que la branche 12 est isolée du premier circuit fluidique. Sur le deuxième circuit fluidique, l'entrée 61 et la sortie 62 de la deuxième vanne 60 sont reliées fluidiquement. L'entrée 63 de la deuxième vanne 60 n'est pas reliée à la sortie 62, si bien que la branche 22 est isolée du deuxième circuit fluidique. L'auto-injecteur 80 permet d'injecter de façon automatisée dans la branche 13 du premier circuit fluidique un échantillon encadré de deux bulles d'air. L'auto-injecteur 80 peut ensuite faire circuler l'échantillon entre deux bulles d'air dans la direction allant de l'auto- injecteur 80 vers le récipient 93 ou dans la direction opposée.

La figure 3-A permet d'illustrer l'étape d'injection de l'échantillon dans la cellule fluidique, ou l'étape de va-et-vient de l'échantillon dans la cellule fluidique, ou encore l'étape d'extraction de l'échantillon hors de la cellule fluidique après analyse. Sur la figure 3-B, on a commuté la première vanne 50, la deuxième vanne étant dans la même position que sur la figure 3-A. Sur le premier circuit fluidique, l'entrée 52 et la sortie 53 de la première vanne 50 sont reliées fluidiquement. La sortie 51 de la première vanne 50 n'est pas reliée à l'entrée 52, si bien que la branche 1 1 est isolée du premier circuit fluidique. L'auto- injecteur 80 dirige le fluide via les branches 13 et 12 vers le récipient 81 .

La figure 3-B représente la configuration d'un système pour extraire une bulle d'air juste avant que cette bulle entre dans la cellule fluidique par la première entrée-sortie 1 . La figure 3- B illustre l'étape d'extraction d'une bulle d'air 31 qui précède l'échantillon à analyser, juste avant que l'échantillon 30 entre dans la cellule fluidique. La figure 3-B illustre aussi l'étape d'extraction d'une bulle d'air 32 qui suit l'échantillon, lors de l'étape d'extraction de l'échantillon hors de la cellule fluidique.

Sur la figure 3-C, on a commuté la première vanne 50 et deuxième vanne 60 par rapport à la figure 3-B. La première vanne 50 est dans la même position que sur la figure 3-A. Sur le deuxième circuit fluidique, l'entrée 63 et la sortie 62 de la deuxième vanne 60 sont reliées fluidiquement. L'entrée 61 de la deuxième vanne 60 n'est pas reliée à la sortie 62, si bien que la branche 21 est isolée du deuxième circuit fluidique. La pompe à air 91 induit une circulation fluidique via les branches 22 et 23 vers le récipient 93.

La figure 3-C représente la configuration d'un système pour insérer une bulle d'air juste après la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique. La figure 3-C illustre l'étape d'injection d'une bulle d'air 33 qui précède l'échantillon à analyser, lorsque l'échantillon 30 est dans la cellule fluidique 10. La figure 3-C illustre aussi l'étape d'injection d'une bulle d'air 34 qui suit l'échantillon, juste après l'étape d'extraction de l'échantillon hors de la cellule fluidique.

Un procédé de transfert d'un échantillon fluidique dans un système selon le premier mode de réalisation comporte les étapes suivantes :

a) l'autoinjecteur 80 prélève une bulle d'air 32,

b) l'autoinjecteur 80 prélève l'échantillon 30,

c) l'autoinjecteur 80 prélève une autre bulle d'air 31 ,

d) l'autoinjecteur 80 injecte dans le premier circuit fluidique l'échantillon 30 intercalé entre les deux bulles d'air 31 , 32, par exemple dans l'ordre 31 -30-32,

f) l'autoinjecteur met en mouvement les fluides dans le premier circuit fluidique vers la cellule fluidique 10 et en direction du récipient 93,

e) commutation de la première vanne 50 d'évacuation des bulles vers le récipient 81 ,, juste avant l'arrivée de la première bulle 31 au niveau de la première vanne 50,

f) évacuation de la première bulle 31 vers le récipient 81 , de préférence avec une marge de sécurité, en incluant un peu de solution tampon 35 située juste avant la première bulle 31 , la première bulle 31 et un faible volume d'échantillon 30 juste après la première bulle 31 ,

g) commutation de la première vanne 50 d'évacuation des bulles vers la cellule fluidique

10,

h) arrivée du début de l'échantillon 30 dans la cellule fluidique 10, i) commutation de la deuxième vanne 60 de réinjection des bulles, juste avant l'arrivée du début de l'échantillon 30 au niveau de cette deuxième vanne 60, qui passe alors de l'entrée cellule fluidique 10 à l'entrée pompe à air 91 ,

j) mise en marche de la pompe à air 91 pour générer une bulle d'air 33 et injection de cette bulle d'air 33 dans le deuxième circuit fluidique entre la deuxième vanne 60 et le récipient 93.

k) basculement de la deuxième vanne 60 de réinjection des bulles vers la deuxième entrée-sortie de la cellule fluidique 10 pour que l'échantillon 30 soit précédé de la bulle 33,

I) inversion du sens de circulation des fluides dans le circuit fluidique juste avant l'arrivée de la deuxième bulle 32 au niveau de la première vanne 50 d'évacuation des bulles, l'échantillon 30 circulant dans le sens du récipient 93 vers la cellule fluidique 10 et l'autoinjecteur 80 ;

m) inversion du sens de circulation des fluides dans le circuit fluidique, juste avant l'arrivée de la bulle 33 au niveau de la deuxième vanne 60 de réinjection des bulles, l'échantillon 30 circule alors dans le sens de l'autoinjecteur 80 vers la cellule fluidique 10 et le récipient 93 ;

n) répétition des deux étapes précédentes un nombre de fois suffisant pour atteindre la durée d'interaction requise, c'est-à-dire de nombre de passages de l'échantillon dans la cellule fluidique,

o) commutation de la première vanne 50 d'évacuation des bulles, juste avant l'arrivée de la deuxième bulle 32 au niveau de la première vanne 50 vers la poubelle 81 ,

p) évacuation vers la poubelle 81 de la deuxième bulle 32, de préférence avec une marge de sécurité, en incluant un faible volume d'échantillon 30 juste avant la bulle 32, la bulle

32 et un peu de solution tampon 36 situé juste après la bulle 32,

q) commutation de la première vanne 50 d'évacuation des bulles vers la cellule fluidique

10,

r) fin du passage de l'échantillon 30 dans la cellule fluidique 10,

s) commutation de la deuxième vanne 60 de réinjection des bulles, juste avant l'arrivée de la fin de l'échantillon 30 au niveau de cette vanne 60, qui passe alors de la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique 10 à l'entrée pompe à air 91 ,

t) mise en marche de la pompe à air 91 pour générer une bulle d'air 34 et l'introduire dans le deuxième circuit fluidique entre la vanne 60 de génération des bulles et le récipient 93, u) basculement de la deuxième vanne 60 de réinjection des bulles vers la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique 10 pour que l'échantillon 30 soit suivi de la bulle 34.

En variante, l'étape j) est remplacée par l'étape suivante :

j') mise en marche de la pompe à air 91 pour injecter de l'air dans le circuit fluidique entre la deuxième vanne 60 de génération des bulles et le récipient 93, ce qui équivaut à la génération d'une bulle 33. Les figures 4A-4B représentent un système de transfert d'un échantillon fluidique selon un deuxième mode de réalisation de l'invention. Les mêmes éléments sont indiqués par les mêmes signes de référence que sur les figures 3A-3C. La première vanne 50 et la deuxième vanne 60 sont ici remplacées par une seule vanne 70 ayant six entrée-sorties 71 , 72, 73, 74, 75, 76. L'entrée-sortie 71 est reliée fluidiquement par une branche 1 1 à la première entrée- sortie 1 de la cellule fluidique 10 ; l'entrée-sortie 72 est reliée fluidiquement par une branche 21 à la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique 10 ; l'entrée-sortie 73 est reliée fluidiquement par une branche 13 à l'auto-injecteur 80 ; l'entrée-sortie 75 est reliée fluidiquement par une branche 12 à un récipient collecteur 81 ; l'entrée-sortie 74 est reliée fluidiquement par une branche 23 à un autre récipient collecteur 93 ; l'entrée-sortie 76 est reliée fluidiquement par une branche 22 à une pompe à air 91 et un filtre à air 90.

La vanne 70 est de préférence une vanne à deux états de fonctionnement.

La figure 4-A illustre la configuration du système de transfert d'un échantillon fluidique, la vanne 70 étant dans un premier état. Dans le premier état, l'entrée-sortie 73 est reliée fluidiquement à l'entrée-sortie 71 . Ainsi, le fluide en provenance de l'autoinjecteur 80, connecté sur l'entrée-sortie 73, peut être dirigé vers l'entrée 1 de la cellule fluidique 10 connectée sur l'entrée-sortie 71 . D'autre part, dans le premier état, l'entrée-sortie 72 est reliée fluidiquement à l'entrée-sortie 74. Ainsi, le fluide en provenance de la cellule fluidique 10, connecté sur la sortie 2 de la cellule fluidique 10, peut être dirigé vers le récipient collecteur 93 connecté sur l'entrée- sortie 74. La figure 4A représente le circuit fluidique dans son état principal, ou premier état, pendant le passage de l'échantillon dans la cellule fluidique 10. Dans ce premier état, l'autoinjecteur 80 peut soit pousser l'échantillon vers le récipient 93 le long du chemin formé par : la branche 13, l'entrée-sortie 73, l'entrée-sortie 71 , la branche 1 1 , l'entrée-sortie 1 , la cellule fluidique 10, l'entrée-sortie 2, la branche 21 , l'entrée-sortie 72, l'entrée-sortie 74 et la branche 23. Dans ce premier état, l'autoinjecteur 80 peut aussi aspirer l'échantillon selon le chemin inverse. L'auto-injecteur 80 peut donc impulser une circulation de l'échantillon fluidique en aller et retour, autrement dit en va-et-vient.

Les entrées-sorties 75 et 76 de la vanne V3 étant connectées, il est possible d'envoyer de l'air vers le récipient 81 le long du chemin allant du filtre à air 90, via la pompe 91 , la branche 22, puis à l'entrée-sortie 76, l'entrée-sortie 75, la branche 12, jusqu'au récipient 81 . Cet envoi d'air directement vers le récipient 81 ne constitue pas une étape de la méthode de l'invention. Dans le premier état de la vanne 70, il est préférable d'éteindre la pompe à air 91 .

En résumé, la figure 4-A illustre le fonctionnement du système selon le deuxième mode de réalisation, lors de l'étape d'injection de l'échantillon dans la cellule fluidique, lors de l'étape d'expulsion de l'échantillon hors de la cellule fluidique, ou lors d'une circulation en va-et-vient de l'échantillon dans la cellule fluidique.

La figure 4-B illustre la configuration du système de transfert d'un échantillon fluidique, la vanne 70 étant dans un deuxième état. Dans le deuxième état, l'entrée-sortie 73 est reliée fluidiquement à l'entrée-sortie 75. Dans le deuxième état, le fluide en provenance de l'autoinjecteur 80 peut être dirigé vers le récipient collecteur 81 connecté sur l'entrée-sortie 75 (fig. 4-B). Ainsi, une bulle d'air 31 , ou 32, en provenance de l'autoinjecteur 80, connecté sur l'entrée-sortie 73, peut être dirigée vers le récipient collecteur 81 connecté sur l'entrée-sortie 75. D'autre part, dans le deuxième état, l'entrée-sortie 74 est reliée fluidiquement à l'entrée- sortie 76. Ainsi, une bulle d'air 33, ou 34, en provenance de la pompe à air 91 , connectée sur l'entrée-sortie 76, peut être dirigée vers la branche 23 du circuit fluidique connectée sur l'entrée-sortie 74. La figure 4-B illustre le fonctionnement du système selon le deuxième mode de réalisation, lors de l'étape d'extraction d'une bulle d'air, en amont de la cellule fluidique ou lors de l'étape d'injection d'une bulle d'air 33, ou 34, en aval de la cellule fluidique.

La figure 4B représente le circuit fluidique dans un deuxième état qui permet la manipulation des bulles autour de la cellule fluidique 10. Dans ce deuxième état, si nous voulons évacuer une bulle d'air (31 ou 32) en amont de la cellule fluidique 10, l'autoinjecteur 80 peut pousser le fluide et en particulier une bulle d'air en direction du récipient 81 le long du chemin allant de la branche 13, à l'entrée-sortie 73, l'entrée-sortie 75, la branche 12, vers le récipient 81 , pendant que la pompe à air 91 est stoppée pour ne pas injecter d'autre bulle d'air de façon non désirée. Par contre, si nous voulons réinjecter une bulle d'air (33 ou 34) en aval de la cellule fluidique 10, la pompe à air 91 peut alors être mise en marche. La pompe à air 91 aspire de l'air via le filtre 90 et pousse l'air aspiré vers le récipient 93 le long du chemin allant de la branche 22, à l'entrée-sortie 76, l'entrée-sortie 74, et la branche 23, en direction du récipient 93, pendant que l'autoinjecteur 80 cesse de pousser les fluides pour éviter de les envoyer directement vers le récipient 81 sans passer par la cellule fluidique 10.

Le deuxième mode de réalisation présente l'avantage d'utiliser une seule vanne au lieu de deux vannes et donc d'être plus compact et moins coûteux.

Ainsi, dans le deuxième mode de réalisation, la vanne 70 étant dans le deuxième état, l'entrée-sortie 71 est reliée fluidiquement à l'entrée-sortie 72. Dans une variante, en insérant une pompe supplémentaire sur la branche 1 1 ou 21 , on peut faire circuler l'échantillon dans la cellule fluidique en circuit fermé, de la première entrée-sortie 1 de la cellule fluidique à la deuxième entrée-sortie 2 de la cellule fluidique en passant par les branches 1 1 et 12 et les entrée-sorties 71 , 72 de la vanne 70. Des moyens additionnels de circulation fluidique sont disposés de manière à permettre d'impulser un mouvement de circulation unidirectionnel ou bidirectionnel à l'échantillon 30 dans cette boucle de recirculation.

La figure 5 représente une première variante du premier mode de réalisation de l'invention. Les mêmes éléments sont indiqués par les mêmes signes de référence que sur la figure 3. Le système de la figure 5 comporte en outre un détecteur de bulles 82 disposé sur la branche 13 entre l'autoinjecteur 80 et l'entrée-sortie 52 de la première vanne 50 et de préférence à proximité de l'entrée-sortie 52. L'autoinjecteur 80 injecte sur la branche 13 du circuit fluidique un échantillon 30 intercalé entre une première bulle d'air 31 et une deuxième bulle d'air 32. Lorsque le détecteur 82 détecte la première bulle 31 , qui arrive au niveau du détecteur 82 avant l'échantillon 30, le détecteur 82 déclenche un signal d'évacuation de la première bulle 31 . Un système de contrôle fait commuter la première vanne 50 suite au signal de d'évacuation. Selon un aspect de l'invention, le délai de commutation de la première vanne 50 est déterminé par le quotient entre d'une part le volume du circuit fluidique compris entre le détecteur 82 et l'entrée-sortie 52 de la vanne 50 et d'autre part le débit de circulation du fluide dans le circuit fluidique.

L'homme du métier utilisera un détecteur de bulles disponible dans le commerce, par exemple de type détecteur à ultrasons ou un détecteur optique.

Lorsque le détecteur 82 détecte la deuxième bulle 32, située après l'échantillon, le détecteur 82 déclenche un signal de détection d'une deuxième bulle. Ce signal peut être utilisé pour déclencher soit l'évacuation de la deuxième bulle 32, de manière analogue à la première bulle, soit un changement de direction de circulation pendant la durée du va-et-vient.

De façon avantageuse, la détection de la première bulle 31 déclenche un compteur temporel. Un calculateur permet de calculer, en fonction du volume de la cellule fluidique et du débit de ciculation du fluide dans la cellule et/ou en fonction d'une mesure expérimentale, l'instant auquel une troisième bulle d'air 33 est réinjectée en aval de la cellule fluidique. Cette troisième bulle d'air 33 sert à séparer l'échantillon fluidique 30 de la solution tampon 35 qui a déjà traversé la cellule fluidique. Ainsi, un compteur et/ou un calculateur déclenche l'instant de réinjection de la troisième bulle d'air 33.

De manière analogue, la détection de la deuxième bulle 32 déclenche un compteur temporel, qui permet de calculer l'instant auquel une autre bulle d'air 34 est réinjectée en aval de la cellule fluidique, cette autre bulle d'air 34 étant située à l'interface entre l'échantillon 30 et la solution tampon 36, après le passage complet de l'échantillon fluidique 30 à travers la cellule fluidique 30. Ainsi, un compteur et/ou un calculateur déclenche l'instant de réinjection de la quatrième bulle d'air 34.

Selon les différentes variantes, l'instant de réinjection de la bulle 33, respectivement 34, en sortie de la cellule fluidique dépend du volume de l'échantillon fluidique, du volume de bulle injectée et/ou extraite, du sens de circulation dans la cellule fluidique et/ou du nombre d'aller- retours dans la cellule. La figure 6 représente une première variante du deuxième mode de réalisation de l'invention. Les mêmes éléments sont indiqués par les mêmes signes de référence que sur la figure 4A-4B. Le système de la figure 6 comporte en outre un détecteur de bulles 82 disposé sur la branche 13 entre l'autoinjecteur 80 et l'entrée-sortie 73 de la vanne 70 et de préférence à proximité de l'entrée-sortie 73.

L'autoinjecteur 80 injecte sur la branche 13 du circuit fluidique un échantillon 30 intercalé entre une première bulle d'air 31 et une deuxième bulle d'air 32. Lorsque le détecteur 82 détecte la première bulle 31 , qui arrive au niveau du détecteur 82 avant l'échantillon 30, le détecteur 82 déclenche un signal d'évacuation de la première bulle 31 . Un système de contrôle fait commuter la vanne 70 du premier état vers le deuxième état, suite au signal d'évacuation de la première bulle 31 . Avantageusement, le délai de commutation de la vanne 70 est déterminé par le quotient entre d'une part le volume du circuit fluidique compris entre le détecteur 82 et l'entrée-sortie 73 de la vanne 70 et d'autre part le débit de circulation du fluide dans le circuit fluidique.

Lorsque le détecteur 82 détecte la deuxième bulle 32, située après l'échantillon, le détecteur 82 déclenche un signal de détection d'une deuxième bulle. Ce signal peut être utilisé pour déclencher soit l'évacuation de la deuxième bulle 32, de manière analogue à l'évacuation de la première bulle, soit un changement de direction de circulation pendant la durée du va-et- vient.

La figure 7 illustre une deuxième variante d'un système de transfert d'un échantillon fluidique selon le premier mode de réalisation de l'invention. Les mêmes éléments sont indiqués par les mêmes signes de référence que sur la figure 3A-3C. Le système de la figure 7 comporte en outre deux vannes supplémentaires 26, 27 disposées respectivement sur des bifurcations 24, 25 de la branche 23 reliée à l'entrée-sortie 62 de la deuxième vanne 60. Les vannes supplémentaires 26, 27 permettent d'orienter sélectivement l'échantillon analysé soit vers un récipient 94, par exemple un tube de récupération, soit vers un autre récipient 95, qui sert par exemple de collecte de déchets ou de poubelle. Dans un état où on souhaite éliminer l'échantillon analysé, la vanne 26 est fermée et la vanne 27 est ouverte, de manière à orienter l'échantillon fluidique de l'entrée-sortie 62 de la vanne 60 vers la branche 25, via la vanne 27 et donc vers le récipient poubelle 95. Dans l'état où on souhaite récupérer l'échantillon analysé, la vanne 26 est ouverte et la vanne 27 fermée, de manière à orienter l'échantillon fluidique de l'entrée-sortie 62 de la vanne 60 vers la branche 24, via la vanne 26 et donc vers le récipient

94, par exemple un tube de récupération.

La figure 8 représente une deuxième variante d'un système de transfert d'un échantillon fluidique selon le deuxième mode de réalisation de l'invention. Les mêmes éléments sont indiqués par les mêmes signes de référence que sur la figure 4A-4B. Le système de la figure 8 comporte en outre deux vannes supplémentaires 26, 27 disposées respectivement sur des bifurcations 24, 25 de la branche 23 reliée à l'entrée-sortie 71 de la vanne 70. Les vannes supplémentaires 26, 27 permettent d'orienter sélectivement l'échantillon analysé soit vers un récipient 94, par exemple un tube de récupération, soit vers un autre récipient 95, qui sert par exemple de poubelle. Dans un état où on souhaite éliminer l'échantillon analysé, la vanne 26 est fermée et la vanne 27 est ouverte, de manière à orienter l'échantillon fluidique de l'entrée- sortie 74 de la vanne 70 vers la branche 25, via la vanne 27 et donc vers le récipient poubelle

95. Dans l'état où on souhaite récupérer l'échantillon analysé, la vanne 26 est ouverte et la vanne 27 fermée, de manière à orienter l'échantillon fluidique de l'entrée-sortie 74 de la vanne 70 vers la branche 24, via la vanne 26 et donc vers le récipient 94, par exemple un tube de récupération.

La figure 9 représente schématiquement une troisième variante d'un système de transfert d'un échantillon fluidique selon le premier mode de réalisation de l'invention, qui combine la première et la deuxième variante. Les mêmes éléments sont indiqués par les mêmes signes de référence que sur les figures 3A-3C, 5 et 7. Le fonctionnement des différents éléments est analogue à celui décrit en lien avec les figures 3A-3C, 5 et 7.

La figure 10 représente schématiquement une troisième variante d'un système de transfert d'un échantillon fluidique selon le deuxième mode de réalisation de l'invention, qui combine la première et la deuxième variante. Les mêmes éléments sont indiqués par les mêmes signes de référence que sur les figures 4A-4B, 6 et 8. Le fonctionnement des différents éléments est analogue à celui décrit en lien avec les figures 4A-4B, 6 et 8.

La figure 1 1 représente schématiquement un système complet de transfert d'un échantillon fluidique selon un mode de réalisation de l'invention. Un autoinjecteur 80 comprend une microplaque source 89 comportant des puits, chaque puits contenant un échantillon à analyser. Une aiguille 83 peut être déplacée face à chacun des puits de la microplaque 89. Une vanne d'injection 84 à deux états, reliée à une boucle 85, et une pompe 86 permettent de prélever les échantillons dans la microplaque 89. Une autre pompe 87 permet de faire circuler en continu les fluides dans le circuit fluidique de détection. Le circuit fluidique de détection comporte la cellule fluidique 10, et deux vannes 28, 29 qui permettent de sélectionner soit un réservoir de solution tampon 98 soit un récipient-poubelle 81 . L'autoinjecteur 80 présente deux états principaux en fonction de la position de la vanne 84, qui est soit en position de chargement d'un échantillon dans le circuit fluidique (telle qu'illustrée sur la figure 1 1 ), soit en position d'injection de l'échantillon vers la cellule fluidique 10 (non représentée).

Dans l'état chargement, la pompe 86 aspire via l'aiguille 83 suivant le chemin partant de l'aiguille 83, vanne 84, boucle 85, vanne 84, en direction du récipient 81 . Premièrement, la pompe 86 aspire une bulle d'air de volume défini lorsque l'aiguille 83 est positionnée en dehors de la microplaque 89, puis un volume prédéfini d'échantillon lorsque l'aiguille 83 est positionnée dans un puits de la microplaque 89 et, enfin, de nouveau une bulle d'air. Pendant ce temps, dans l'état chargement, la pompe 87 aspire en continu une solution tampon en provenance du réservoir 98, la vanne 28 étant ouverte et la vanne 29 fermée. La pompe 87 fait circuler la solution tampon vers la cellule fluidique 10.

Dans l'état injection, pendant les allers de l'injection, la pompe 87 peut aspirer le fluide tampon de circulation en provenance du réservoir 98, la vanne 28 étant ouverte et la vanne 29 fermée. La pompe 87 pousse le fluide tampon à travers la boucle 85 qui contient l'échantillon encadré par les bulles, vers la cellule fluidique 10 selon le chemin 98, 28, 87, 84, 85, 84, branche 13, vanne 50, branche 1 1 , entrée-sortie 1 . L'échantillon arrive ainsi progressivement vers la cellule fluidique 10. Pendant les retours de l'injection, la pompe 87 peut aspirer les fluides en provenance de la cellule fluidique 10 et les pousser vers le récipient poubelle 81 , la vanne 28 étant fermée et la vanne 29 ouverte, selon le chemin branche 23, vanne 60, branche 12, entrée-sortie 2, cellule fluidique 10, entrée-sortie 1 , branche 1 1 , vanne 50, branche 13, vanne 84, boucle 85, vanne 84 en direction du récipient poubelle 81 . L'échantillon revient donc progressivement en arrière. L'alternance de ces aller et retours pendant l'état injection permet de réaliser le va-et-vient. Pendant ce temps, la pompe 86 est arrêtée. Le système et le procédé de l'invention peuvent être implémentés sur des systèmes d'analyse fluidiques déjà existants. L'adaptation d'un système d'analyse n'implique que des modifications mineures.