System zur zweidimensionalen (2D) Gelelektrophorese

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein System zur zweidimensionalen Gelelektrophorese, wobei in mindestens einer Dimension der Elektrophorese das funktionelle Kernstück dieser im wesentlichen aus dem Material Corian gebildet ist. Bevorzugt ist weiterhin in der ersten Dimension mindestens eine Elektrode beweglich ausgestaltet, so dass diese der unterschiedlichen Gellänge angepasst werden kann.

Die Elektrophorese im Stand der Technik wird als leistungsfähiges und schonendes Verfahren z.B. zur Trennung von Proteinen oder Aminosäuren aber auch von ganzen Zellen eingesetzt. Dabei wird die unterschiedliche Ablenkung geladener Partikel im elektrischen Feld ausgenutzt, um einen Trenneffekt zu erzielen. Das Maß der Ablenkung wird in erster Linie von der Stärke des Feldes zwischen zwei Elektroden und der elektrischen Mobilität der zu trennenden Teilchen beeinflusst. Die Stärke der Mobilität ist dabei von unterschiedlichen Größen abhängig, wie z.B. die Ladung und Größe der Partikel, die abgetrennt werden sollen, als auch der pH-Wert, die Viskosität und lonenstärke der Pufferlösung. Traditionelle eindimensionale Metho- den der Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) können höchstens ca. 100 Proteine in einer Probe an auftrennen und sind aus diesem Grunde ungeeignet für die Analyse komplexer Proteingemische, wie sie beispielsweise bei Zellextrakten auftreten.

Die zweidimensionale Elektrophorese ist die derzeit leistungsfähigste Technik, um komplexe Proteingemische aufzutrennen. Hierbei werden die Proteine nach zwei unterschiedlichen Parametern, den isoelektrischen Punkten (pl in der ersten Dimension) und der elektrophoretischen Beweglichkeit (in der zweiten Dimension) aufgetrennt. Die Anwendungen der 2D-Elektrophorese sind sehr unterschiedlich. So wer-

den beispielsweise Proteinmuster in verschiedenen Organismen und Zelltypen analysiert. Es werden Reinheiten von Proteinfraktionen überprüft, sowie isoelektrische Punkte, Molekulargewichte von Untereinheiten und die Anzahl von Isoformen ermittelt. Das zwei-dimensionale Gelelektrophoresesystem, das die beste Auflösung für die Trennung komplexer Proteingemische ergibt, kombiniert die Technik der isoelektrischen Fokussierung (IEF) in Anwesenheit von Harnstoff und einem neutralen Detergenz in der ersten Dimension mit der Plattengelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen unter Verwendung von Natrium-Dodecylsulfat (SDS) in der zweiten Dimension (O'Farrell, P. H. (1975) J. Biol. Chem. 250, 4007-4021). Das Trennsystem bedient sich zweier unabhängiger Proteineigenschaften: die eine ist die Ladung, die durch den isoelektrischen Punkt (pl) reflektiert wird, die andere ist das Molekulargewicht, welches die Mobilität der SDS-Proteinkomplexe in Polyacry- lamidgelen bestimmt. O'Farrell zeigte zum ersten Mal das große Potential dieser Technik und war in der Lage, mehr als 1.000 Polypeptide in zellulären Extrakten aufzulösen. Allerdings werden basische Proteine in einem IEF/SDS-System, in dem Trägerampholyte verwendet wurden, nicht gut getrennt, da sie im allgemeinen nur schlecht in das IEF-GeI einwandern. Auch wenn mehr basische Ampholyte eingesetzt werden, ist die Ausdehnung des pH-Gradienten im basischen Bereich nur gering, weil auf Grund der Kathodendrift der tatsächliche Gradient pH 7.5 nicht we- sentlich übersteigt. Außerdem produzieren die wenigen basischen Proteine, die unter diesen Bedingungen in das IEF-GeI eintreten, immer Streifen. Dieses Problem kann jedoch umgangen werden, indem in der ersten Dimension die non equilibrium pH gradient electrophoresis (NEPHGE), wie von O'Farrell beschrieben, Anwendung findet.

Der Hauptunterschied zwischen NEPHGE und IEF besteht darin, dass die Proben im ersten Fall auf der sauren Seite des Gels aufgetragen werden und dass das (Volt x Zeit)-Produkt kleiner ist als bei der IEF. Unter solchen Bedingungen erreicht der pH Gradient nicht das volle Gleichgewicht. Als Resultat werden die Proteine nicht vollkommen an ihrem isoelektrischen Punkt fokussiert wie bei der IEF. Trotzdem werden die meisten Proteine auch in NEPHGE Gelen entsprechend ihrer Ladungsunterschiede getrennt.

Die bekannten Systeme zur zwei-dimensionalen Elektrophorese weisen mehrere Nachteile auf: die erste Dimension ist im Hinblick auf die Sicherheit vor den hohen

verwendeten Stromspannungen nicht ausreichend gesichert, weiterhin sind viele Systeme für die unterschiedlichen Gellängen erforderlich, außerdem sind die Apparate für die zweite Dimension nicht einfach zu handhaben, sie sind z.B. nicht stapelbar, daher sehr platzintensiv und verbrauchen viel Chemikalien.

Die Erfindung löst dieses Problem durch ein System gemäß den Ansprüchen.

In dem erfindungsgemäßen System zur zweidimensionalen Gelelektrophorese ist mindestens ein funktionelles Kernstück im wesentlichen aus dem Material Corian gebildet. Das funktionelle Kernstück kann beispielsweise die Platte sein, auf der das Gel in der zweiten Dimension positioniert ist. In dem Material Corian können Boh- rungen eingebracht sein, die das Kühlsystem darstellen. Hierdurch kann das System kompakter ausgestaltet werden. Insbesondere die Apparate für die zweite Dimension sind horizontal stapelbar und verbrauchen weniger Chemikalien.

Das System besteht aus mindestens zwei Komponenten jeweils für die erste und die zweite Dimension der Elektrophorese, wobei die erste Dimension eine Elektrode umfasst, die auf die unterschiedliche Länge der Gele angepasst werden kann, und wobei die erste Dimension mit einem aus Plexiglas gestalteten Ummantelungskör- per umfassend mindestens eine Tür mit einem Schließkontakt für einen Stromkreislauf umgeben ist und wobei die zweite Dimension der Gelektrophorese im wesentlichen aus dem Material Corian gestaltet ist. Ein solches System hat den Vorteil, dass mit dem öffnen der Tür oder der Türen der Stromkreislauf unterbrochen und mit dem Schließen der Türen geschlossen wird. Es kann z.B. eine Unterbrechung des Stromkreislaufes durch einen Kontakt an der Tür mit einem korrespondieren Kontakt am Boden der Apparatur für die erste Dimension vorgesehen sein.

Bevorzugt ist , dass das Material Corian Glacier White ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist mindestens eine Elektrode in der ersten Dimension auf einem beweglichen Schlitten an einem Kontaktarm positioniert.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Corian zur Herstellung eines Systems einer Gelelektrophorese, insbesondere zur Herstellung von funktionellen Korn-

- A -

ponenten. Dies Material hat den Vorteil, dass es zu bearbeiten ist, ausfrässbar ist und daher gestaltbar ist, z.B. zur Integrierung von Hohlräumen und Kanälen, die wiederum beispielsweise - aber nicht ausschließlich - zum Zwecke der Kühlung einsetzbar sind. Vergleichbare Systeme verwenden in der Regel Glas, was bekannt- lieh nicht bearbeitbar ist.

Bei den erwähnten zwei Komponenten zur Durchführung der Elektrophorese in der ersten und zweiten Dimension handelt es sich um separate Elektrophoreseeinheiten. Erfindungsgemäß ist daher auch eine Elektrophoreseeinheit zur Durchführung der ersten Dimension einer zweidimensionalen Gelelektrophorese Gegenstand der Erfindung, umfassend eine Elektrode, die auf die unterschiedliche Länge der Gele angepasst werden kann, und wobei die erste Dimension mit einem aus Plexiglas gestalteten Ummantelungskörper umfassend mindestens eine Tür mit einem Schließkontakt für einen Stromkreislauf umgeben ist.

Eine weitere Elektrophoreseeinheit zur Durchführung der zweiten Dimension einer zweidimensionalen Gelelektrophorese ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung, wobei diese im wesentlichen aus dem Material Corian gestaltet ist. Durch die flache Ausgestaltung mit ggf. integrierter Kühlung ist sie horizontal stapelbar und damit sehr platzsparend, was insbesondere bei beengten Laborverhältnissen von Vorteil ist. Auch ist der Chemikalienverbrauch stark reduziert.

Im folgenden soll die Erfindung an Hand eines Beispiels erläutert werden, ohne auf dieses beschränkt zu sein.

Die Abbildungen zeigen

Fig. 1 Apparat für erste Dimension mit Plexiglas-Gehäuse

Fig. 2 Kontaktarm (erste Dimension)

Fig. 3 Elektrophorseeinheit

Fig. 4 Vorderansicht zweite Dimension

Fig. 5 Rückansicht zweite Dimension (geöffnet)

Fig. 6 Rückansicht zweite Dimension (geschlossen)

Fig. 7 Seitenansicht zweite Dimension.

Figur 1 zeigt einen Apparat / Elektrophoresekammer (1 ) zur Durchführung der ers- ten Dimension der Gelelektrophorese. Der Apparat (1) zur Durchführung der Gelelektrophorese in erster Dimension weist insbesondere eine Ummantelung (3), bevorzugt aus Plexiglas, auf. Diese Ummantelung (3) des Apparates (1) ist bevorzugt so ausgestaltet, dass sie zwei Türen (5) aufweist. Das öffnen der Türen (5) über die Griffe (7) trennt einen Kontakt an der Tür (nicht dargestellt) mit einem korrespondie- renden Kontakt (nicht dargestellt) am Fuß (9) des Apparates (1). Wenn die Tür (5) geöffnet ist, wird daher ein Stromkreis geöffnet bzw. - wenn die Türen (5) geschlossen sind oder werden - geschlossen.

Die Figur 1 zeigt auch zwei Elektroden (11) des Apparats (1), wobei die Elektrode (13) an einem Schlitten (15) angebracht ist, der an einem Kontaktarm (17) nach oben oder unten vertikal verfahren werden kann. Der Kontaktarm (15) und die Elektrode (13) können je nach Größe des Gels eingerichtet werden, so dass verschieden große Gele mit ein und derselben Apparatur (1) verwendbar sind.

Figur 2 zeigt die Apparatur (1) ohne eine Ummantelung (3). Das Fehlen der Ummantelung (3) zeigt die Ausgestaltung des Schlittens (15), an dem die obere Elekt- rode (13) angebracht ist. Die Zapfen (19) dienen der besseren Positionierung der Elektrophoreseeinheit - wie sie in Figur 3 dargestellt ist - dergestalt, dass die Kontakte der Elektrophoreseeinheit und die untere Elektrode (12) so in Kontakt gebracht werden können, dass der Stromkreislauf dann geschlossen ist, sobald die obere Elektrode (13) mit der oberen Kontaktstelle verbunden ist und die Türen (5) ge- schlössen werden.

Figur 3 zeigt die oben genannte Elektrophoreseeinheit mit der oberen Kontaktstelle (19) sowie der unteren Kontaktstelle (21). Durch Auffüllen der Elektrophoreseeinheit mit Gel oder Pufferlösungen wird eine leitfähige Annordung geschaffen, in der durch das Anlegen eines Stromes Biomoleküle separiert werden können. Die Elektropho-

reseeinheit (18) kann in den Apparat (1) hineingestellt werden, um elektrophoreti- sche Trennung in der ersten Dimension vorzunehmen.

Weitere Auftrennungen der Biomoleküle erfolgen vorteilhafterweise in der zweiten Dimension, wie sie oben erläutert wurde.

Die Figur 4 zeigt eine Vorrichtung (23) zur Durchführung der zweiten Dimension von vorne. Das funktionelle Kernstück (25) der Vorrichtung (23) ist aus Corian hergestellt.

Die Figur 5 zeigt die geöffnete Hinteransicht der Vorrichtung (23). In dem funktionellem Kernstück (25) ist die Kühlung (27) eingebracht. Die Kühlung (27) ist als ein Kühlsystem (29) ausgebildet. Das Kühlsystem (29) ist herstellbar durch die innerliche Gestaltung des Materials Corian. Dass heißt, das Kühlsystem muss nicht als separates System an die Vorrichtung (23) angebracht werden, sondern ist ein Bestandteil von ihr. Hierdurch ist die Vorrichtung (23) sehr einfach zu handhaben, sie ist horizontal stapelbar und verbraucht wesentlich weniger Chemikalien als her- kömmliche Vorrichtungen.

Die Figur 6 zeigt eine geschlossene Rückansicht der Vorrichtung (23). In dieser Figur ist die flache Ausgestaltung der Vorrichtung (23) gut erkennbar. Das funktionelle Kernstück (25) ist so ausgestaltet, dass es sehr flach ist und sehr wenig Raum einnimmt. Die Behälter (29) für die Lösungen sind direkt an dem die Kühlung (27) bein- haltenden funktionellen Kernstück (25) der Vorrichtung (23) angebracht.

Die Figur 7 zeigt eine Seitenansicht der Vorrichtung (23). In dieser Darstellung sind die Zu- und Abflüsse für Pufferlösungen und Kühlmittel gut erkennbar, die jedoch nicht den Kern der Erfindung widerspiegeln und daher nicht weiter erläutert werden müssen, zumal sie dem Fachmann auf dem Gebiet der Elektrophoresetechnik be- kannt sind.

Bezugszeichenliste

D Apparat für erste Dimension

3) Ummantelung, bevorzugt aus Plexiglas

5) Türen

7) Griffe

9) Fuß

11) Elektrode

12) Untere Elektrode

13) Obere Elektrode

15) Schlitten

17) Kontaktarm

18) Elektrophoreseeinheit

19) Obere Kontaktstelle

21) Untere Kontaktstelle

23) Vorrichtung für zweite Dimension

25) Funktionelles Kernstück

27) Kühlung

29) Behälter