EPITOPES T CD4+ DES ANTIGENES DE LATENCE DE TYPE I et II DU VIRUS EPSTEIN-BARR APTES A ETRE RECONNUS PAR LA MAJORITE DES INDIVIDUS DE LA POPULATION CAUCASIENNE ET LEURS APPLICATIONS. La présente invention est relative à des peptides immunogènes issus des antigènes de latence de type 1 et II d'EBV comprenant au moins un épitope T CD4+ apte à être reconnu par la majorité des individus de la population caucasienne, et à leurs applications diagnostiques et thérapeutiques.

Le virus Epstein-Barr (EBV) est un herpès virus oncogène de tropisme lymphocytaire B, infectant 95 % de la population adulte. Après la primo-infection, généralement asymptomatique chez l'enfant et parfois responsable de la mononucléose infectieuse, notamment chez l'adolescent, l'EBV persiste à l 'état latent dans les lymphocytes B pendant toute la vie de l'individu. Alors que dans la majorité des cas, l'infection par EBV est contrôlée de manière efficace par le système immunitaire (porteurs sains), dans certains cas, elle est associée à différentes pathologies tumorales que l'on peut distinguer par l 'expression des antigènes de latence.

La latence de type I correspond à l 'expression isolée de l'antigène EBNAl . Ce profil d'expression est retrouvé dans les lymphomes de Burkitt de type endémique rencontrés principalement en Afrique et en Nouvelle Guinée (à la différence de la forme sporadique en général non liée à EBV). Ce type de latence se caractérise par la faible reconnaissance des cellules tumorales par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Cette faible capacité de reconnaissance s'explique par : (i) l'absence d'épitopes dérivés d'EBNAl présentés au niveau du CMH de classe I (répétitions ^' de séquences Glycine-Alanine empêchant la dégradation par le protéasome); (ii) la diminution des molécules d'adhésion ; (in) la diminution d'expression des protéines TAP 1 et 2 ; (iv) la faible expression des molécules HLA de classe I (ou HLA I). Les cellules tumorales peuvent néanmoins être reconnues par des lymphocytes T CD4+ cytotoxiques puisqu'elles présentent une expression normale des molécules HLA de classe II (ou HLA II), associée à un processing normal. Dans la latence de type II, on retrouve une expression des antigènes de latence limitée à EBNA l , LMPl et LMP2. Ce type de latence est rencontré dans : - le carcinome indifférencié du naso-pharynx (NPC) observé

principalement en Chine du Sud et en Afrique du Nord.

- 40 a 50% des maladies de Hodgkin. L'association avec EBV est plus fréquente dans les formes à cellularité mixte (50-75%) que dans les formes scléro-nodulaires (15-30%). - certains lymphomes T et NK notamment les lymphomes T/NK naso-sinusiens.

En ce qui concerne la maladie de Hodgkin, on note une expression normale des molécules HLA de classe I et des transporteurs TAP 1 et 2, ainsi qu'une expression importante des molécules HLA de classe U par les cellules de Reed- Steinberg. Toutefois, la latence de type II se caractérise par l'absence d'épitopes immunodominants (EBNA 3A, 3B, 3C). En effet, s'il existe une réponse CTL dirigée contre les protéines LMPl et LMP2, cette dernière reste faible. Il paraît donc intéressant de stimuler cette réponse dans le cadre de protocoles d'immunothérapie.

La latence de type III qui correspond à l 'expression de l'ensemble des protéines de latence (EBNAl, EBNA2, EBNA3A-C, EBNA-LP, LMPl et LMP2), s'observe dans les lymphomes post-transplantation, liés à un état d'immunodépression sévère.

Le contrôle de l'infection latente à EBV par des lymphocytes T spécifiques d'EBV est primordial (Rooney et al., Lancet, 1995, 345, 913; Munz, J. Exp. Med., 2000, 191 , 1649-1660; Leen et al. J. Virol., 2001, 75, 8649-8659). Il est destiné à empêcher une prolifération non contrôlée de cellules infectées par EBV que l'on observe chez les sujets immunodéprimés (syndromes prolifératifs posttransplantation, latence de type III).

De manière schématique, les protéines EBNA3A-C et LMP2 sont les principales cibles des lymphocytes T CD8+ alors que EBNAl et LMPl sont principalement reconnues -voire presque exclusivement pour EBNAl- par des lymphocytes T CD4+. Par conséquent, le contrôle immunitaire des tumeurs associées aux latences de type I et II d'EBV repose en grande partie sur les lymphocytes T CD4+ cytotoxiques capables de reconnaître et de lyser les cellules cibles exprimant des épitopes d'EBNAl et/ou de LMPl, présentés par des molécules HLA II. D'autre part, les lymphocytes T CD4+ sont nécessaires au maintien in vivo d'une réponse cytotoxique médiée par des lymphocytes TCD8+, capables de reconnaître et de lyser

les cellules cibles exprimant des épitopes de LMP2.

Il n'existe pas actuellement de protocole d'immunothérapie des pathologies tumorales associées à une latence de type I ou II, qui soit réellement efficace et facile à mettre en œuvre. En effet, l'immunothérapie cellulaire qui repose sur la préparation de lymphoytes T cytotoxiques polyclonaux obtenus par stimulation in vitro de lymphocytes T avec des lignées lymphoblastoïdes B autologues, transformées par EBV (LCL) est longue à mettre en œuvre (obtention de LCL en 4 à 6 semaines) et peu efficace dans la mesure où le taux d'expansion des lymphocytes T spécifiques d'EBV est faible et nécessite l'ajout d'un cocktail mitogène chez les patients atteints de maladie de Hodgkin ; en outre, aucune rémission complète des rumeurs n'est observée.

Ces observations sont en faveur de l'utilisation de peptides antigéniques spécifiques des antigènes de latence EBNAl, LMPl et LMP2 d'EBV et capables de stimuler une forte réponse T CD4+, en immunothérapie (vaccination ou thérapie cellulaire), pour la prévention et le traitement des pathologies tumorales associées aux latences de type 1 ou de type IL

De tels peptides qui sont reconnus par des cellules T CD4+ spécifiques d'EBV sont également utiles comme réactifs dans un test de diagnostic de l'infection par EBV ou de pathologies tumorales associées, ou bien de suivi du traitement chez l'Homme, reposant sur la détection directe (test de prolifération lymphocytaire) ou indirecte (production d'anticorps, de cytokines...) desdites cellules T CD4+.

L'activation des lymphocytes T CD4+ ou cellules T CD4+ se fait sous l'effet de la présentation de peptides antigéniques par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de type II que portent les cellules présentatrices d'antigène ; chez l'homme, elles sont dénommées molécules HLA II pour Human Leucocyte Antigen type IL Ces peptides antigéniques, appelés épitopes T, résultent de la dégradation protéolytique des antigènes par les cellules présentatrices d'antigène. Ils ont des longueurs variables, généralement de 13 à 25 acides aminés et possèdent une séquence qui les rend capables de se lier aux molécules HLA II. Il est bien connu qu'au même titre que l'antigène natif, un peptide comprenant un épitope T CD4+ est

capable de stimuler in vitro des cellules T CD4+ qui lui sont spécifiques ou de les recruter in vivo. Il est donc suffisant pour induire une réponse T CD4+.

Toutefois, un des problèmes majeurs qui limite l'utilisation de ces peptides comme antigène est l'identification des épitopes T CD4+, étant donné que leur séquence varie d'un individu à l'autre en raison du polymorphisme des molécules HLA II. En effet, les molécules HLA II sont des hétérodimères constitués d'une chaîne alpha (α) et d'une chaîne béta (β) polymorphes. 11 existe quatre types de molécules HLA II par individu (2 HLA-DR, 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP), dénommées en fonction de l'allèle codant la chaîne béta qui est la plus polymorphe. La molécule HLA-DR est très polymorphe. En effet, alors que sa chaîne alpha ne compte que 3 allèles, la chaîne béta (β) codée par le gène DRBl , qui est la plus exprimée, compte à ce jour 458 allèles. Pour les molécules HLA-DQ et HLA-DP, les deux chaînes (α et β) qui les constituent sont polymorphes mais elles présentent moins d'allèles. On a dénombré 8 allèles DQAl (chaîne α de HLA-DQ), 56 allèles DQBl (chaîne β de HLA-DQ), 20 allèles DPAl (chaîne α de HLA-DP) et 1 10 allèles DPBl (chaîne β de HLA-DP). Cependant, la combinaison entre les deux chaînes α et β codées par ces allèles donne naissance à de nombreuses molécules HLA-DQ et HLA-DP. Du fait de ce polymorphisme, ces isoformes possèdent des propriétés de liaison différentes entre elles, ce qui implique qu'elles peuvent lier des peptides différents d'un même antigène. Ainsi, chaque individu reconnaît dans un antigène un ensemble de peptides dont la nature dépend des molécules HLA II qui le caractérisent. Comme il existe un grand nombre d'allèles HLA 11, il existe donc dans une séquence donnée un répertoire important d'épitopes T de séquences très différentes, chacun spécifique d'un allèle différent. Ainsi, un peptide capable de stimuler une réponse T CD4+ spécifique d'EBV chez quelques individus peut être inactif chez la majorité des autres individus, parce que ces derniers ne reconnaissent pas les antigènes d'EBV par les mêmes épitopes.

La plupart des épitopes T CD4+ des antigènes EBNAl, LMPl et LMP2 connus, possèdent une restriction définie pour une seule molécule HLA DR, DQ ou DP (Tableau I).

Tableau I : Epitopes T CD4+ des antigènes EBNAl, LMPl et LMP2

* élément de restriction potentiel déterminé en fonction de l'haplotype HLA II des individus répondeurs.

** utilisation pour induire une tolérance immunitaire dans le but de traiter des maladies autoimmunes.

En conséquence, de tels peptides ne seront généralement pas reconnus par l'ensemble des molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne. En effet, pour les molécules HLA-DR, par exemple, une dizaine d'allèles sont nécessaires pour couvrir plus de 60 % de la fréquence génique retrouvée dans la population caucasienne et donc concerner plus de 85 % de cette population.

Les inventeurs ont identifié des epitopes T CD4+ dérivés des antigènes de latence EBNAl, LMPl et LMP2 d'EBV, lesquels epitopes sont aptes à

être reconnus par les molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne et donc capables d'induire une réponse T CD4+ spécifique d'EBV chez la majorité des individus de cette population recevant une vaccination ou une thérapie cellulaire à l'aide de peptides incluant ces épitopes. La présente invention a en conséquence pour objet, un peptide immunogène du virus Epstein-Barr (EBV) comprenant au moins un épitope T CD4+ de l'un des antigènes de latence EBNAl, LMPl ou LMP2, apte à être présenté par au moins 7 molécules HLA II différentes choisies parmi les molécules HLA-DRl , HLA- DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DRI l, HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5 et HLA-DP4, lequel peptide est sélectionné dans le groupe constitué par : a) les peptides de respectivement 26, 26 et 24 acides aminés dont la séquence s'étend des positions 475 à 500, 514 à 539, et 529 à 552 d'EBNAl , b) le peptide de 16 acides aminés dont la séquence s'étend des positions 68 à 83 de LMPl , c) les peptides de respectivement 21 et 17 acides aminés dont la séquence s'étend des positions 224 à 244 et 372 à 388 de LMP2, et d) les variants de même longueur et définis par les mêmes positions que les peptides définis en a), b) et c), lesquels variants sont obtenus par substitution d'au moins un acide aminé desdits peptides définis en a), b) et c) par un autre acide aminé, et présentent une activité de liaison inférieure à 1000 nM, vis-à-vis d'au moins 7 molécules HLA II différentes choisies parmi HLA-DRl, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DRI l, HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA- DRB5 et HLA-DP4. Les peptides selon l'invention dont les séquences sont celles précisées ci-dessus présentent des propriétés distinctes des peptides de l'art antérieur et notamment les propriétés suivantes :

- activité de liaison aux molécules HLA II : les peptides selon l'invention possèdent une forte affinité pour la majorité des molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne et sont donc aptes à être présentés par des molécules HLA II chez la majorité des individus de la population caucasienne. Ces peptides possèdent une activité de liaison < 1000 nM pour au moins 7 des

molécules HLA II choisies parmi HLA-DRl, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DRI l , HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5 et HLA-DP4 qui correspondent aux molécules HLA II dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne. L'activité de liaison peut-être mesurée par un test de liaison HLA H/peptide, en compétition, avec une révélation immuno-enzymatique, selon le principe décrit dans le Brevet US 6,649,169 pour les molécules HLA-DR et dans la Demande Internationale PCT WO 03/040299 pour les molécules HLA-DP4, ainsi que dans les articles aux noms de Texier et al., J. Immunol., 2000, 164, 3177 et Eur. J. Immunol., 2001 , 31 , 1837 et Castelli et al., J. Immunol, 2002, 169, 6928-6934.

- immunogénicité : les peptides selon l'invention sont reconnus par des lymphocytes T CD4+ chez la majorité des individus de la population caucasienne et contiennent des épitopes T naturellement présentés au cours de l'infection par EBV. En conséquence, ces peptides sont donc capables d'induire des cellules T CD4+ spécifiques d'EBV à partir des précurseurs présents chez la majorité des individus naïfs ou bien de stimuler de telles cellules chez la majorité des individus séropositifs pour EBV. L 'immunogénicité des peptides peut être déterminée, notamment à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs), par tout essai approprié connu de l'Homme du métier comme par exemple : un test de prolifération cellulaire, un test ELISPOT (dosage des cellules productrices de cytokines) ou un test de dosage de cytokines (IFN-γ, IL-2, IL-4 et IL-IO).

- activité cytotoxique : des clones de lymphocytes T CD4+ de type ThI sont isolés à partir des lymphocytes T générés par stimulation in vitro de PBMC, à l'aide des peptides selon l'invention. Les clones ainsi obtenus sont mis en présence de cibles EBV positives de même spécificité HLA : lymphocytes issus du même individu et transformés par EBV (LCL) ou des lignées tumorales (Hodgkin, lymphomes T/NK) EBV positives en cas d'identité HLA. La présence de lymphocytes T CD4+ cytotoxiques spécifiques des antigènes de latence de type I ou II d'EBV, capables de lyser les cellules cibles EBV positives de même spécificité, est analysée par un test de cytotoxicité classique, notamment par mesure du relargage du ⁵¹ Cr.

L'invention englobe les peptides dont la séquence correspond à celle d'un fragment de la protéine EBNAl, LMPl ou LMP2 de n'importe quel isolât

d'EBV, incluant les variants naturels isolés à partir d'individus infectés par EBV. Les séquences du génome et des protéines correspondantes des différents isolats d'EBV sont disponibles dans les banques de données, notamment dans celle du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Les positions des peptides sont indiquées relativement aux séquences présentant les numéros d'accès suivants dans la base de données NCBl : NP_039875 (EBNAl), CAA26023 (LMPl) et AAA45887 (LMP2). Par exemple le peptide de 26 acides aminés qui s'étend des positions 475 à 500 d'EBNAl, s'étend du résidu d'asparagine (N) en position 475 au résidu d'acide glutamique (E) en position 500 de la séquence NCBI NP_039875 ; il est notamment représenté par la séquence NPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDE (SEQ ID NO : 4).

A partir de ces indications, l'Homme du métier est en mesure de déterminer facilement les positions correspondantes dans les protéines d'autres isolats d'EBV, qui peuvent varier de quelques acides aminés du fait de courtes insertions et/ou délétions dans la séquence en acides aminés desdites protéines.

L'invention englobe également les variants obtenus à partir des séquences précédentes par substitution d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du peptide, dès lors que ledit variant conserve une forte affinité (activité de liaison < 1000 nM) pour au moins 7 des molécules HLA II prépondérants dans la population caucasienne telles que définies ci-dessus et qu'il est immunogène. Les résidus d'acides aminés impliqués dans la liaison aux molécules HLA-DR et HLA-DP (résidus d'ancrage) et l'effet des modifications de ces résidus sur la liaison auxdites molécules (affinité, spécificité) sont connus de l'Homme du métier ; le Brevet US 6,649,166 décrit le mode de liaison des peptides aux molécules HLA DR, incluant la détermination des résidus d'ancrage Pl , P4, P6, P7 et P9 et l'effet de mutations de ces résidus sur l'affinité et la spécificité de liaison aux molécules HLA DR. La Demande Internationale PCT WO 03/040299 enseigne que la liaison à HLA- DP4 implique les résidus en P6, Pl et/ou P9 qui doivent être presque exclusivement aromatiques ou hydrophobes alors que le résidu en P4 peut être n'importe quel résidu d'acide aminé.

L'invention englobe également les peptides modifiés dérivés des précédents par introduction de toute modification au niveau de résidu(s) d'acide

aminé, de la liaison peptidique ou des extrémités des peptides, dès lors que ledit peptide modifié conserve une forte affinité (activité de liaison < 1000 nM) pour au moins 7 des molécules HLA II prépondérants dans la population caucasienne telles que définies ci-dessus, et qu'il est immunogène. Ces modifications qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l'Homme du métier, incluent de façon non-limitative : la substitution d'un acide aminé par un acide aminé non- protéinogénique (acide aminé D ou analogue d'acide aminé) ; l'addition de groupements chimiques (lipide, oligo ou polysaccharide) au niveau d'une fonction réactive, notamment de la chaîne latérale R ; la modification de la liaison peptidique (— CO-NH-), notamment par une liaison du type rétro ou rétro-inverso ( -NH-CO-) ou une liaison différente de la liaison peptidique ; la cyclisation ; la fusion d'un peptide (épitbpe d'intérêt pour la vaccination ; étiquette utile pour la purification du peptide, notamment sous forme clivable par une protéase) ; la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d'une protéine, notamment une chaîne α ou β d'une molécule HLA II ou le domaine extracellulaire de ladite chaîne ; le couplage à une molécule appropriée, notamment un marqueur, par exemple un fluorochrome. Ces modifications sont destinées en particulier à augmenter la stabilité, la solubilité, l'immunogénicité ou à faciliter la purification ou la détection, soit du peptide selon l'invention, soit de cellules CD4+ spécifiques dudit peptide. Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide, ladite molécule HLA II comprend une chaîne β codée respectivement par les allèles DRBl *0101 (molécule HLA-DRl), DRBl *0301 (molécule HLA-DR3) DRBl *0401 (molécule HLA-DR4) DRBl *0701 (molécule HLA-DR7), DRBl *1 101 (molécule HLA-DRI l ), DRBl *1301 (molécule HLA-DR13), DRB1 *15O1 (molécule HLA- DRl 5), DRB3*0101 (molécule HLA-DRB3), DRB5*0101 (molécule HLA-DRB5), DP*0401 ou DP*0402 (molécule HLA-DP4).

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO :4, 5, 6, 1 1 , 20 et 21. La présente invention a également pour objet un fragment polyépitopique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux épitopes identiques

ou différents d'EBV, incluant au moins un épitope T CD4+ dont la séquence est celle d'un peptide tel que défini ci-dessus.

Au sens de la présente invention on entend par fragment polyépitopique, une séquence artificielle ou synthétique, obtenue à partir de fragments d'un ou plusieurs antigènes d'EBV, laquelle séquence ne correspond à aucune séquence naturellement présente dans un antigène d'EBV.

De préférence, ledit fragment polyépitopique présente une longueur de 20 à 1000 acides aminés, de préférence de 20 à 100 acides aminés.

Ledit fragment polyépitopique comprend avantageusement une étiquette fusionnée à l'une de ses extrémités, pour la purification ou la détection dudit fragment. L'étiquette, notamment une séquence polyhistidine ou un épitope B d'un autre virus, est de préférence séparée de la séquence polyépitopique par un site de clivage d'une protéase de façon à isoler la séquence polyépitopique, à partir de la fusion. Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment polyépitopique, il comprend un épitope T CD4+ dont la séquence est celle d'un peptide tel que défini ci-dessus et au moins un autre épitope sélectionné dans le groupe constitué par :

- un épitope T CD8+ d'une protéine d'EBV présenté par une molécules HLA 1 et reconnu par des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'EBV ; les séquences des épitopes T CD8+ d'EBV sont connus de l'Homme du métier et incluent notamment les peptides 51-60, 125-133, 156-164 et 159-167 de LMPl et les peptides 131-139, 200-208, 236-244, 340-350, 419-427, 426-434, 442-451 , 447-455 et 453-461 de LMP2. - un épitope B d'un antigène d'EBV reconnu spécifiquement par des anticorps dirigés contre EBV, et

- un épitope T CD4+ universel naturel ou synthétique tel que le peptide de la toxine tétanique TT 830-846 (O'SULLIVAN et al., J. Immunol., 1991, 147, 2663-2669), le peptide de Phémagglutinine du virus de la grippe HA 307-319 (O'SULLIVAN et al, précité), le peptide PADRE (KXVAA WTLKAA; Alexander et al., Immunity, 1994, 1, 751-761), le peptide 45-69 de la protéine Nef du VIH-I et des peptides issus des antigènes de Plasmodium falciparum tels que le peptide CS.T3

(SIN1GAGLIA et al., Nature, 1988, 336, 778-780) et les peptides CSP, SSP2, LSA-I et EXP-I (DOOLAN et ah, J. Immunoh, 2000, 165, 1123-1137).

La combinaison de l'épitope T CD4+ avec l'un au moins des épitopes tels que définis ci-dessus permet avantageusement de déclencher ou de moduler une réponse immunitaire anti-EBV.

La présente invention a également pour objet un lipopeptide, caractérisé en ce qu'il comprend un peptide ou un fragment polyépitopique tels que définis ci-dessus. Ledit lipopeptide est notamment obtenu par addition d'un lipide sur une fonction α-aminée ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé dudit peptide ou fragment polyépitopique ; il peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras en C _4-2O , éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d'un stéroïde. La partie lipidique préférée est notamment représentée par un groupe N ^α -acétyl-lysine N ^ε (palmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam).

La présente invention a également pour objet une protéine de fusion, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une protéine ou un fragment de protéine hétérologue, fusionnés avec un peptide ou un fragment polyépitopique tels que définis ci-dessus. Le peptide ou le fragment polyépitopique peuvent être fusionnés avec l'extrémité NH ₂ ou COOH de ladite protéine ou insérés dans la séquence de ladite protéine.

Au sens de la présente invention, on entend par protéine hétérologue, relativement aux peptides dérivés respectivement d'EBNAl , LMPl et LMP2, des protéines autres que EBNAl, LMPl et LMP2. Avantageusement ladite protéine de fusion est constituée par un peptide d'EBV tel que défini ci-dessus, fusionné avec l'une des chaînes d'une molécule HLA II choisie parmi les molécules HLA-DRl, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DRI l, HLA-DR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA- DRB5 et HLA-DP4, de préférence la chaîne béta, ou bien avec un fragment de celle-ci correspondant à une molécule HLA II soluble, notamment un fragment correspondant au domaine extracellulaire précédé du peptide signal homologue ou d'un peptide signal hétérologue. Ledit peptide d'EBV est avantageusement inséré entre le peptide

signal et l'extrémité NH ₂ du domaine extracellulaire de la chaîne β, comme décrit pour la molécule HLA-DR ( Kolzin et al., PNAS, 2000, 91, 291-296).

Alternativement, ledit peptide d'EBV ou ledit fragment polyépitopique sont fusionnés avec une protéine facilitant leur purification ou leur détection, connue de l'Homme du métier comme notamment la glutathione-S- transférase (GST) et les protéines fluorescentes (GFP et dérivées). Dans ce cas, la séquence du peptide ou du fragment polyépitopique d'intérêt est de préférence séparée du reste de la protéine par un site de clivage d'une protéase, pour faciliter la purification dudit peptide ou dudit fragment polyépitopique. La présente invention a également pour objet un polynucléotide, caractérisé en ce qu'il code pour un peptide, un fragment polyépitopique ou une protéine de fusion tels que définis ci-dessus.

Conformément à l'invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l'ADNc codant ledit peptide ou fragment polyépitopique ou ladite protéine de fusion. Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l'usage des codons soit optimal chez l'hôte dans lequel elle est exprimée.

L'objet de l'invention englobe également les polynucléotides recombinants comprenant au moins un polynucléotide conforme à l'invention lié à au moins une séquence hétéro! ogue. Au sens de la présente invention, on entend par séquence hétéro- logue relativement à une séquence d'acide nucléique codant un peptide d'EBV, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence d'acide nucléique codant ledit peptide d'EBV. L'objet de la présente invention englobe en particulier : a) des cassettes d'expression comprenant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), et b) des vecteurs recombinants comprenant un polynucléotide conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs sont des vecteurs d'expression comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.

La présente invention a en outre pour objet des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes modifiées par au moins un polynucléotide ou un vecteur tel que défini ci-dessus.

De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus, les AAV et les baculovirus, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l'introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l'électroporation ou la microinjection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l'électroporation associée à des liposomes. Les polynucléotides, les vecteurs recombinants et les cellules transformées tels que définis ci-dessus, sont utiles notamment pour la production des peptides, fragments polyépitopiques et protéines de fusion selon l'invention.

Les polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.

Les peptides et leurs dérivés (variants, peptides modifiés,

lipopeptides, fragments polyépitopiques, protéines de fusion) tels que définis ci- dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, notamment par synthèse en phase solide ou liquide ou par expression d'un ADN recombinant dans un système cellulaire approprié (eucaryote ou procaryote). De manière plus précise,

- les peptides et leurs dérivés (variants, fragments polyépitopiques) peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-) et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse, - les lipopeptides peuvent être notamment préparés selon le procédé décrit dans les Demandes Internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630.

- les peptides et dérivés tels que les variants, les fragments polyépitopiques et les protéines de fusion peuvent également être produits à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l'homme du métier ; l'ADNc est clone dans un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d'affinité.

La présente invention a également pour objet une composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide d'EBV, un fragment polyépitopique, un lipopeptide ou un vecteur tels que définis ci-dessus, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et/ou une substance porteuse, et/ou un adjuvant.

La composition immunogène selon l'invention se présente sous une forme galénique adaptée à une administration par voie parentérale (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse), entérale (orale, sublinguale), ou locale (rectale, vaginale).

Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés.

Les adjuvants sont avantageusement choisis dans le groupe constitué par : des émulsions huileuses, des substances minérales, des extraits bactériens, la saponine, l'hydroxyde d'alumine, le monophosphoryl -lipide A et le squalène.

Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les

ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nanoparticules.

De préférence, ladite composition immunogène comprend au moins deux des six peptides d'EBV incluant un épitope T CD4+ tels que définis ci-dessus, de préférence trois à cinq peptides, de manière préférée les six peptides, sous forme d'un mélange de peptides ou de lipopeptides, d'un fragment polyépitopique ou d'un vecteur d'expression codant lesdits peptides ou ledit fragment.

De manière préférée, ladite composition comprend également, au moins un autre peptide incluant un épitope sélectionné dans le groupe constitué par : un épitope T CD4+ universel ou un épitope T CD8+ d'EBV, tels que définis ci-dessus.

La présente invention a également pour objet un peptide, un fragment polyépitopique, un lipopeptide ou un vecteur tels que défini ci-dessus comme vaccin pour la prévention et/ou le traitement d'une infection par EBV ou d'une pathologie tumorale associée.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un peptide, d'un fragment polyépitopique, d'un lipopeptide ou d'un vecteur tels que défini ci-dessus, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention et/ou au traitement d'une infection par EBV ou d'une pathologie tumorale associée.

Les peptides selon la présente invention et les produits dérivés (fragment polyépitopique, lipopeptide, vecteur recombinant) peuvent être utilisés en immunothérapie dans le traitement des tumeurs associées à EBV et notamment celles présentant une latence de type I ou II. Lesdits peptides ou produits dérivés sont utilisés, soit comme vaccin, soit en thérapie cellulaire, ou bien encore par une combinaison des deux approches.

La thérapie cellulaire comprend, la préparation de lymphocytes T

CD4+ spécifiques dεBV par un protocole classique de stimulation in vitro comprenant l'isolement de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) d'un patient à traiter ou d'un donneur volontaire de phénotype HLA identique ou partiellement identique, et la mise en culture des PBMC en présence de peptide(s), de

façon à induire la prolifération de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'EBV. Dans une seconde étape les lymphocytes T CD4+ spécifiques d'EBV sont réinjectés au patient.

La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic et de suivi de l'évolution d'une infection par EBV ou d'une pathologie tumorale associée, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide tel que défini ci-dessus, éventuellement marqué ou complexé, notamment complexé à des molécules HLA II marquées, sous la forme de complexes multimériques comme des tétramères.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un peptide tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un réactif de diagnostic et de suivi de l'évolution d'une infection par EBV ou d'une pathologie tumorale associée.

Au sens de la présente invention, on entend par diagnostic ou suivi de l'évolution d'une infection par EBV ou d'une pathologie tumorale associée, l'évaluation de la réponse immunitaire T CD4+ spécifique d'EBV au cours d'une infection par EBV, d'une pathologie associée à EBV, ou bien d'un protocole d'immunothérapie ou de vaccination anti-EBV. La détection est effectuée à partir d'un échantillon biologique contenant des cellules T CD4+, notamment un échantillon de cellules mononucléées isolées à partir d'un prélèvement de sang périphérique (PBMCs).

La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic et de suivi de l'évolution d'une infection par EBV ou d'une pathologie tumorale associée, caractérisée en ce qu'elle comprend :

- la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un réactif de diagnostic tel que défini ci-dessus, et

- la détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un des antigènes de latence EBNAl _? LMPl ou LMP2 d'EBV, par tout moyen approprié.

La présente invention a également pour objet un kit de détection et de suivi de l'évolution d'une infection par EBV ou d'une pathologie tumorale associée, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif tel que défini ci-dessus, associé à un moyen de détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un des antigènes de latence EBNAl , LMPl et LMP2 d'EBV.

La détection des lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène de latence, est effectuée par tous moyens, connus en eux-mêmes. Par exemple, on peut

utiliser des moyens directs comme les tests de prolifération lymphocytaire ou la cytométrie de flux en présence de complexes multimériques tels que définis ci-dessus, ou bien des moyens indirects comme le dosages de cytokines telles que l'lL-2, l'IL-4, l'IL-5, IL-IO et l'IFN-γ, notamment par des techniques immunoenzymatiques (ELISA, RIA, ELISPOT) ou par cytométrie de flux (dosage des cytokines intracellulaires). De manière plus précise :

Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clones) est cultivée pendant 3 à 5 jours en présence desdits peptides et au besoin de cellules présentatrices appropriées, telles que des cellules dendritiques, des PBMC autologues ou hété- rologues, des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après infection par le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La présence de cellules T CD4+ spécifiques d'un antigène de latence d'EBV dans la suspension initiale est détectée à l'aide des peptides d'EBV, selon l'une des méthodes suivantes :

* test de prolifération :

La prolifération des cellules T CD4+ spécifiques d'un antigène de latence d'EBV est mesurée par incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules. * test ELISPOT :

Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T sécrétant de cytokines (IL-2, IL-4, IL-5, IL-I O et l'IFN-γ), spécifiques d'un peptide tel que défini ci-dessus. Le principe de ce test est décrit dans Czerkinsky et al., J. Immunol. Methods, 1983, 65, 109-121 et Schmittel et al., J. Immunol. Methods, 1997, 210, 167- 174, et sa mise en œuvre est illustrée dans la Demande Internationale WO 99/51630 ou Gahéry-Ségard et al., J. Virol., 2000, 74, 1694-1703.

* détection des cytokines :

La présence de cellules T spécifiques d'un antigène de latence dεBV, sécrétant des cytokines telles que l'IL-2, l'IL-4, l'IL-5, IL-IO et l'IFN-γ est détectée, soit par dosage des cytokines présentes dans le surnageant de culture, par un test immunoenzymatique, notamment à l'aide d'un kit commercial, soit par détection des cytokines intracellulaires en cytométrie de flux. Le principe de détection des

cytokines intracellulaires est décrit dans Goulder et al. , J. Exp. Med., 2000, 192, 1819-1832 et Maecker et al, J. Immunol. Methods, 2001, 255, 27-40 et sa mise en œuvre est illustrée dans Draenert et al., J. Immunol. Methods, 2003, 275, 19-29. * complexes multimériqυes - un échantillon biologique, de préférence des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ₃ est mis en contact avec des complexes multimériques marqués, notamment par un fluorochrome, formés par la liaison entre des molécules HLA II solubles et des peptides d'EBV tels que définis ci-dessus, et

- les cellules marquées par lesdits complexes multimériques sont analysées, notamment par cytométrie de flux.

De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de l'échantillon biologique avec lesdits complexes, on l'enrichit en cellules T CD4+, en le mettant en contact avec des anticorps anti-CD4 ou par tri indirect, pour éviter une activation non-spécifique. Les complexes multimériques HLA Il/peptide peuvent être préparés à partir de molécules natives extraites de cellules exprimant HLA II ou de molécules recombinantes produites dans des cellules hôte appropriées comme précisé, par exemple dans NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67) ou dans KURODA et al. (J. Virol., 2000, 74, 18, 8751-8756). Ces molécules HLA II peuvent notamment être tronquées (délétion du domaine transmembranaire) et leur séquence peut être modifiée afin de les rendre solubles ou bien de faciliter Pappariement des chaînes alpha et béta (Novak et al., précité).

Le chargement de molécules HLA II avec le peptide peut se faire par mise en contact d'une préparation de molécules HLA II comme ci-dessus, avec le peptide. Par exemple, des molécules HLA II solubles et biotinylées sont incubées, pendant 72 heures à 37 ⁰ C, avec un excès d'un facteur 10 de peptides d'EBV tels que définis ci-dessus, dans un tampon phosphate-citrate 10 mM, NaCl 0,15 M à un pH compris entre 4,5 et 7.

Alternativement, la séquence du peptide peut être introduite dans l'une des chaînes de la molécule HLA II sous forme d'une protéine de fusion qui permet la préparation de complexes multimériques HLA II/peptîdes à partir de cellules hôtes appropriées exprimant ladite protéine de fusion. Lesdits complexes

peuvent ensuite être marqués, notamment par la biotine.

Les complexes multimériques de type tétramère sont notamment obtenus en ajoutant aux molécules HLA II chargées, de la streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre (mole à mole) par rapport aux molécules HLA II, l'ensemble étant ensuite incubé pendant une durée suffisante, par exemple une nuit à température ambiante.

Les complexes multimériques peuvent également être formés, soit par incubation de monomères HLA II/peptides avec des billes magnétiques couplées à la streptavidine comme décrit pour les molécules HLA I (Bodinier et al., Nature, 2000, 6, 707-710), soit par insertion de monomères HLA II/peptides dans des vésicules lipidiques comme décrit pour les molécules du CMH de classe II murines (Prakken, Nature Medicine, 2000,6, 1406-1410).

Pour utiliser ces complexes multimériques HLA II/peptide notamment de type tétramère, on met en contact une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec des peptides d'EBV tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clones) avec des complexes multimériques HLA II/peptide à une concentration appropriée (par exemple de l'ordre de 10 à 20 μg/ml), pendant une durée suffisante pour permettre la liaison entre les complexes et les cellules T CD4+ spécifiques d'EBV (par exemple, de l'ordre de 1 à 3 heures). Après lavage, la suspension est analysée par cytométrie de flux : on visualise le marquage des cellules par les complexes multimériques qui sont fluorescents.

La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les complexes multimériques HLA II/peptide des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire.

La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé de tri de cellules T CD4+ spécifiques d'un antigène de latence d'EBV, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :

- la mise en contact d'un échantillon cellulaire avec des complexes multimériques HLA II/peptide marqués, notamment par un fluorochrome, lesdits complexes étant formés par la liaison de molécules HLA II solubles avec au moins un peptide d'EBV tel que défini ci-dessus, et

- le tri des cellules liées auxdits complexes HLA II/peptide, notamment en cytométrie de flux.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'objet de la présente invention, avec référence au dessins annexés dans lesquels :

- la figure 1 illustre l'immunogénicité du mélange des six peptides issus des antigènes de latence de type I et II d'EBV se liant avec une affinité < 1000 nM aux 12 molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne, dans le modèle murin transgénique HLA-DRl. Un groupe de cinq souris HLA- transgéniques Aβ°/DR1 (souris Cockt) a été immnunisé par une première injection sous-cutanée du mélange peptidique (120 μg au total) émulsifié dans du Montanide® Isa 720, suivie de 2 rappels à demi-dose, à 2 semaines d'intervalle. Le groupe témoin (Souris Te), n'a reçu que du Montanide® Isa 720, selon le même protocole. La réponse proliférative des lymphocytes extraits des ganglions, 7 jours après la dernière injection, a été mesurée par incorporation de ( ³ H)thymidine, dans différentes conditions. A : en l'absence d'antigène (témoin) ou en présence d'une gamme concanavaline A (ConA) (cultures de 48 heures). B : en l'absence d'antigène (témoin) ou en présence d'une gamme de concentrations du mélange peptidique (60, 30, 15 ou 7,5 μg au total), (cultures de 5 jours). Les résultats sont exprimés en nombre de coups par minute (cpm).

- la figure 2 illustre l'immunogénicité du mélange des six peptides issus des antigènes de latence de type I et II d'EBV se liant avec une affinité < 1000 nM aux 12 molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne, dans le modèle murin transgénique HLA-DRl . Un groupe de cinq souris HLA- transgéniques Aβ°/DR1 (souris Cockt) a été immnunisé par une première injection sous-cutanée du mélange peptidique (120 μg au total) émulsifié dans du Montanide® Isa 720, suivie de 2 rappels à demie-dose, à 2 semaines d'intervalle. Le groupe témoin (Souris Te), n'a reçu que du Montanide® Isa 720, selon le même protocole. La réponse proliférative des lymphocytes extraits des rates, 7 jours après la dernière injection, a été mesurée par incorporation de ( ³ H)thymidine, dans différentes conditions. A : en l'absence d'antigène (témoin) ou en présence d'une gamme concanavaline A (ConA) ou de LPS

(cultures de 48 heures). B : en l'absence d'antigène (témoin) ou en présence d'une gamme de concentrations du mélange peptidique (60, 30, 15 ou 7,5 μg au total), (cultures de 5 jours). Les résultats sont exprimés en nombre de coups par minute (cpm). - la figure 3 illustre la réponse proliférative des lymphocytes T issus de donneurs sains d'haplotype HLA II variés, séropositifs pour EBV, après stimulation in vitro par le mélange peptidique. Les cellules mononucléées sanguines issues de sujets sains séropositifs pour l'EBV (plaques 96 puits, 5x10 ⁵ cellules par puits) ont été cultivées 4 à 6 jours en présence du mélange contenant les peptides G17F, N26E, V21V, K26L, P24G et I16L (SEQ ID NO: 21, 4, 20, 5, 6 et 11) à la concentration de lOμg/mL pour chacun d'entre eux. La réponse proliférative des lymphocytes T a été mesurée par incorporation de ( ³ H)thymidine. L'index de stimulation correspondant au rapport du nombre de coups par minute des lymphocytes T en présence du mélange peptidique sur le nombre moyen de coups par minute des lymphocytes T en l'absence de peptide. (bruit de fond), est présenté pour chaque puits pour les différents donneurs. Un puits est considéré comme positif lorsque le nombre de coups par minute est supérieur a 1000 et l'index de stimulation supérieur à 3. Exemple 1 : Identification d'épitopes T CD4+ reconnus par les molécules HLA II les plus abondantes dans la population caucasienne. 1) Matériels et méthodes

1.1) Synthèse peptidiqυe

Le logiciel TEPlTOPE (Sturniolo et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 555-561) a été utilisé pour sélectionner des motifs de liaison potentiels aux molécules HLA de classe II, dans la séquence des antigènes de latence de type II d'EBV (EBNAl , LMPl et LMP2). Les peptides correspondants ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide (Néosystem), purifiés par chromatographie liquide de haute performance (HPLC ; colonne Cl 8, SYNMETRY), puis contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS).

1.2) Tests de liaison HLAiIZG£Ptide Les tests de liaisons aux molécules HLA II sont des tests de liaison en compétition avec une révélation immuno-enzymatique dont le principe est décrit dans le Brevet US 6,649,169 pour les molécules HLA-DR et dans la Demande

Internationale PCT WO 03/040299 pour les molécules HLA-DP4, ainsi que dans les articles aux noms de Texier et al., J. Immunol., 2000, 164, 3177 et Eur. J. Immunol., 2001 , 31, 1837 et Castelli et al., J. Immunol, 2002, 169, 6928-6934.

Des exemples de ces tests sont présentés dans les Demandes Internationales PCT WO 02/090382, WO 03/040299 et WO 2004/014936. a) Choix des allèles HLA II

12 molécules HLA II (10 molécules HLA-DR et 2 molécules HLA- DP) les plus abondantes dans la population française et dont les fréquences alléliques sont caractéristiques de la population caucasienne, ont été sélectionnées : * molécules HLA-DR dont la chaîne β est codée par le gène DRl

II s'agit des molécules HLA-DRl , -DR3, -DR4, -DR7, -DRI l, - DR 13 et -DRl 5 dont la chaîne β est codée par les allèles du locus DRBl dont la fréquence dépasse les 5 % dans la population française : DRBl*0101 (9,3 %), DRBl *0301 (10,9 %), DRBl *0401 (5,6 %), DRBl *0701(14 %), DRBl*1101 (9,2 %), DRBl *1301 (6 %) et DRBl *1501 (8 %) qui représentent à eux seuls 64 % de la population. Ces mêmes allèles sont les allèles HLA-DR les plus abondants dans les autres populations caucasiennes. Leur fréquence varie entre 53 % (en Espagne) et 82 % (au Danemark). Pour les Etats-Unis et le Canada, ils représentent respectivement 58 et 55 % des allèles DR de la population. * molécules HLA-DR dont la chaîne β n'est pas codée par le gène

DRl

II s'agit des molécules HLA-DRB3, -DRB4 et -DRB5 dont la chaîne β est codée par les allèles les plus fréquents dans la population française : HLA- DRB3*0101 (9,2 %), HLA-DRB4*0101 (28,4 %), et HLA-DRB5*0101 (7,9 %). Ces molécules couvrent à elles seules 45 % de la fréquence allélique.

* molécules HLA-DP

II s'agit des molécules HLA-DP4 qui regroupent les molécules codées par les allèles DPBl *0401 et DPBl *0402. Ces molécules DP4 sont les molécules HLA II les plus abondantes en Europe et aux états-Unis. Leur fréquence allélique est en effet de 40 et 1 1 % respectivement ce qui signifie qu'elles sont l'une ou l'autre trouvées chez environ 76% des individus. Les peptides présents dans une séquence protéique et qui lient l'ensemble de ces molécules incluent donc les épitopes

T CD4 ⁺ de la majorité de la population. b) Purification des molécules HLA II

Les molécules HLA II sont purifiées par immunoaffinité à partir de différentes lignées homozygotes de lymphocytes B humains transformées par le virus Epsteiri Barr (EBV), à savoir : H0M2 (DRBl *0101, DPB1 *O4O1), SCHU (DRB1 *15O1, DRB5*0101, DPBl *0402), STEILIN (DRBl *0301, DRB3*0101), PITOUT (DRBl *0701, DBR4*0101 , DPBl*0401), SWEIG (DRBl*! 101), BOLETH (DRBl *0401, DRB4*0103), HHKB (DRBl * 1301, DRB3*0101, DPB1 *O4O1). Les molécules HLA-DR sont purifiées par chromatographie d'affinité à l'aide de l'anticorps monoclonal monomorphique L243 (Smith et al., P.N.A.S., 1982, 79, 608- 612) couplé au gel de protéine A-sépharose CL 4B (PHARMACIA), comme décrit dans Gorga et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 16087-16094. Les molécules HLA-DP4 sont purifiées selon le même protocole, à l'aide de l'anticorps monomorphique B7/21 (WATSON et al., Nature, 1983, 304, 358-361). Brièvement, les cellules (5x10 cells/ml) sont lysées sur de la glace, dans du tampon 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH=8,3, contenant 1% Nonidet P40, 10 mg/1 aprotinine, 5 mM EDTA et 10 μM PMSF. Après une centrifugation à 100 000 g pendant 1 h, le surnageant est chargé sur les colonnes de sépharose 4B, de protéine A-sépharose 4B, puis sur la colonne d'affinité spécifique. Les molécules HLA II sont éluées avec un tampon 1,1 mM n- dodécyl β-D-maltoside (DM), 500 mM NaCl et 500 mM Na ₂ CO ₃ , pH=l l,5. Les fractions sont immédiatement neutralisées à ^>Y\=1 avec un tampon 2 M Tris HCl, pH=6,8 puis dialysées de façon extensive, contre un tampon 1 mM DM, 150 mM NaCl, 10 mM, pH=7. c) Synthèse _. desj>eptide_1τaceurs Les peptides traceurs utilisés dans les tests de liaison sont les suivants : HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT, SEQ ID NO : 23), A3 152-166 (EAEQLRAYLDGTGVE, SEQ ID NO : 24), MT 2-16 (AKTlA YDEEARRGLE, SEQ ID NO : 25), YKL (AAYAAAKAAALAA, SEQ ID NO : 26), Bl 21-36 (TERVRLVTRHIYNREE, SEQ ID NO : 27), LOL 191-210 (ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT, SEQ ID NO : 28), E2/E168 (AGDLLA1ETDKATI, SEQ ID NO : 29) et Oxy 271-287 (EKKYFAATQFEPLAARL, SEQ ID NO : 30). Les peptides sont synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase

solide, biotinylés au niveau du résidu NH ₂ terminal à l'aide d'acide biotiny]-6- aminocaproïque (FLUKA CHIMIE), selon le protocole décrit dans Texier et al., J. Immunol., 2000, 164, 3177-3184), puis clivés de la résine par de l'acide trifluoroacétique (95 %) et purifiés par chromatographie liquide de haute performance en phase inverse, sur une colonne C]s (Vydac™). d) Tests de liaison HLA H/peptides

Les molécules HLA II sont diluées dans du tampon phosphate 10 mM, NaCl 150 raM, dodécyl maltoside (DM) 1 mM, citrate 10 mM, thimérosal 0,003%, en présence d'un peptide biotinylé approprié (peptide traceur), à un pH donné, et de dilution sériées de peptide compétiteur (peptide à tester). A savoir : le peptide HA 306-318 est utilisé à 1 nM et 30 nM, à ρH=6, respectivement pour les allèles DRBl *0101 et DRBl *0401 et à 20 nM, à pH=5, pour l'allèle DRBl *] 101. YKL est utilisé à 20 nM, à pH=5, pour l'allèle DRBl *0701. L'incubation est réalisée à pH=4,5 pour les allèles DRBl *1501 , DRBl *1301 et DRBl*0301 , en présence de respectivement, A3 152-166 (10 nM), Bl 21-36 (200 nM) et MT 2-16 (200 nM). Le peptide oxybiotinylé est utilisé à pH=5 (10 nM) pour les allèles DPBl *0401 et DPBl *0402. Le mélange réactionnel (100 μl par puits) est incubé dans des plaques à 96 puits en polypropylène (NUNC), à 37°C pendant 24 h, à l'exception des allèles DRBl *1301 et DRBl*0301 qui sont incubés pendant 72 h. A la fin de l'incubation, les échantillons sont neutralisés avec 50 μL de tampon Tris HCl 450 mM, pH 7,5, thimérosal 0,003 %, BSA 0,3 %, DM 1 mM. Les échantillons sont ensuite transférés sur des plaques ELISA Maxisorp™ (96 puits, NUNC) prélablement recouvertes d'anticorps L243 ou B7/21 L243 (10 μg/ml) et saturées avec du tampon Tris HCl 100 mM, ρH=7.5, BSA 0,3 %, thimérosal 0,003%. L'incubation des échantillons sur ces plaques est réalisée pendant deux heures à température ambiante. Des lavages avec du tampon Tris HCl 0,1 M, pH 7,5, Tween-20 0,05% sont ensuite effectuées entre chaque étape. Le peptide biotinylé lié aux molécules HLA II est détecté par l'addition de 100 μL/puits du conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (45 minutes, AMERSHAM) dilué au 1/2000 dans le tampon Tris 10 mM, pH 7, NaCl 0,15 M, Tween 20 0,05%, BSA 0,2%, thimérosal 0,003%, puis de 200 μL/puits du substrat A- méthyl-umbelliféryl-phosphate (MUP, SIGMA) à la concentration de 100 μM, en tampon NaHCO ₃ 0,05M, pH 9,8, MgCl ₂ ImM. L'émission de fluorescence par le

produit de la réaction enzymatique est mesurée à 450 nm après excitation à 365 nm, à l'aide d'un fluorimètre pour plaques à 96 puits (DYNEX). La liaison maximale est déterminée en incubant le peptide traceur biotinylé avec la molécule HLA II en l'absence de peptide compétiteur. La spécificité de liaison est contrôlée par l'addition d'un excès de peptide non biotinylé. Le bruit de fond obtenu ne diffère pas significativement de celui obtenu en incubant le peptide biotinylé. sans les molécules HLA II. Les résultats sont exprimés sous la forme de la concentration de peptide compétiteur qui inhibe 50% de la liaison maximale du peptide traceur biotinylé (IC ₅ o). Les moyennes et les écarts-types sont calculés à partir d'au moins trois expériences indépendantes. La validité de chaque expérience est déterminée à l'aide des peptides traceurs ; leurs valeurs d'ICso varient d'un facteur inférieur à trois. Un peptide dont la valeur d'IC ₅₀ est inférieure à 1000 mM est considéré comme possédant une bonne affinité pour la molécule HLA II correspondante. 2) Résultats L'analyse des séquences des antigènes EBNAl, LMPl et LMP2 a permis d'identifier 24 séquences peptidiques de 15 à 31 acides aminés, susceptibles de contenir des motifs pour plusieurs molécules HLA-DR. Parmi ces 24 peptides, 22 ont pu être synthétisés en chimie f-moc avec une pureté de l'ordre de 90% en HPLC. Neuf peptides sont dérivés de EBNAl, 7 de LMPl et 6 de LMP2. Les séquences des peptides dérivés des séquence présentant les numéros d'accès NP_039875, CAA26023 et AAA45886, respectivement pour EBNAl, LMPl et LMP2), sont présentées dans la liste de séquences jointe en annexe et le Tableau II.

Tableau II : Séquences des peptides

L'activité de liaison des peptides vis-à-vis des 12 molécules HLA II prépondérantes dans la poplulation caucasienne (HLA-DR 1 ,-DR3,-DR4,-DR7,-DRl 1 , -DR13,-DR15,-DRB3,-DRB4 ₎ -DRB5, DP401 et -DP402 ; Tableau III) montre que 6 peptides se lient avec une bonne affinité à au moins 7 molécules HLA II différentes : G17F (LMP2), N26E (EBNAl), V21V (LMP2), K26L(EBNA1), P24G (EBNAI) ₇ 116L (LMPl).

Tableau III : Activité de liaison des peptides vis-à-vis des molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne.

κ>

-4

un peptide possédant une valeui d ICo infeπeuie a 1000 nM est consideie comme possédant une bonne affinité poui la molécule HLA II correspondante

Compte tenu de la fréquence allélique de chacun des 12 allèles HLA II testés, un mélange comportant ces 6 peptides serait capable d'être reconnu par plus de 90% de la population caucasienne.

Exemple 2 : Immunogénicité des peptides in vivo chez des souris transgéniques pour une molécule HLA II

La capacité des peptides ayant une bonne affinité pour les molécules HLA II, tels que définis à l'exemple 1 à induire une réponse immunitaire, a été évaluée par un test de prolifération in vitro, chez des souris transgénique pour les molécules HLA-DRl (souris transgéniques Aβ7DRl ; Pancré et al., Clinical and Expérimental Immunology, 2002 ; 129: 429-437). 1) Matériels et méthodes

Un premier groupe de souris transgéniques âgées de 6 semaines, a été immunisé par une première injection sous-cutanée du mélange peptidique déterminé à l'exemple 1 (20 μg de chaque peptide, soit 120 μg au total) émulsifié dans du Montanide® Isa 720 (SEPPIC), suivie de deux rappels à 2 semaines d'intervalle, avec une demi-dose du mélange peptidique (10 μg de chaque peptide, 60 μg au total) émulsifié dans du Montanide® Isa 720. Le groupe témoin a reçu uniquement des injections de Montanide® Isa 720, selon le même protocole. Sept jours après la dernière injection, les animaux ont été sacrifiés et la rate ainsi que des ganglions lymphatiques ont été prélevés. Les cellules de rate ou de ganglion lymphatique (5.10 ⁵ /puits d'une plaque de microtitration de 96 puits (Falcon®), en triplicat), ont été mises en culture, soit en l'absence d'antigène (témoin négatif), soit en présence d'une gamme de LPS (Sigma®, 10 mg et 1 mg) ou de concanavaline A (Sigma®, 10 mg et 1 mg, (témoins positifs, cultures de 48h), soit en présence d'une gamme de concentrations (60 μg, 30 μg, 15 μg, 7,5 μg au total) du mélange peptidique (cultures de 5 jours). Après la culture, de la thymidine tritiée (( ³ H)thymidine) (1 mCi/puits, 49,0 Ci/mmol, AMERSHAM) a été ajoutée et les cellules ont été récupérées 6 heures plus tard par aspiration sur filtre en fibre de verre (WALLAC). La thymidine incorporée a été mesurée à l'aide d'un compteur de scintillation β (1450 Trilux, WALLAC). Les résultats sont exprimés en index de prolifération (nombre de coups par minute (CPM) en présence d'antigène/nombre de CPM en l'absence d'antigène).

2) Résultats

Les résultats présentés aux figures 1 et 2 montrent que les peptides sélectionnés par le test de liaison aux molécules HLA II sont capables d'induire une forte réponse CD4+ spécifique d'EBV chez les individus immunisés. Après restimulation in vitro avec le mélange peptidique, il existe une réponse proliférative des lymphocytes de la rate et des ganglions extraits des animaux vaccinés. En revanche, cette prolifération n'est pas observée chez les animaux contrôles non immunisés (figures 1 et 2). Ces résultats indiquent donc que les peptides sélectionnés peuvent être utilisés dans des compositions immunogènes pour la prévention et le traitement des pathologies associées aux infections par EBV.

Exemple 3 : Immunogénicité des peptides in vitro chez des sujets sains séropositifs pour EBV 1) Matériels et méthodes a) Donneurs et typage HLA

Du sang a été prélevé chez 12 donneurs volontaires sains séropositifs pour l'EBV d'haplotype HLA II varié.

Tableau IV : Haplotypes HLA-DRBl des donneurs volontaires sains séropositifs pour l' EBV

b) Réponse proliférative des lymphocytes T au mélange peptidique oυ aux peptides testés individuellement

Les cellules mononucléées du sang (PBMCs) des donneurs ont été séparées par la méthode classique du gradient de Ficoll. Les PBMCs (5.10 ⁵ cellules/puits d'une plaque à 96 puits) ont ensuite été cultivées 4 à 6 jours dans un milieu sans sérum (AIM V, GIBCO™), en présence ou en l'absence du mélange peptidique (60 μg/rnL au total, soit lOμg/mL de chaque peptide). La réponse proliférative a été mesurée par incorporation de ( ³ H)thymidine (1 mCi/puits, 49,0 Ci/mmol, AMERSHAM). Les résultats sont exprimés en index de stimulation (coups par minute des lymphocytes T stimulés/moyenne des coups par minute des lymphocytes T non stimulés). Les puits correspondant aux lymphocytes T stimulés ont été analysés de manière individuelle et considérés connme positifs lorsque le nombre de coups par minute était supérieur à 1000 et l'index de stimulation supérieur à 3 (nombre de coups par minute en présence du mélange de peptide 3 fois supérieur à celui observé en l'absence de peptides (bruit de fond)). Les peptides ont également été testés de manière individuelle chez 6 donneurs (donneurs 1 , 3, 5, 6, 9 et 10). Pour ce faire, une gamme de concentrations (2,5, 5, 10 et 20 μg) a été testée en triplicat pour chaque peptide. La réponse a été considérée comme positive lorsque la moyenne des index de stimulation des triplicats était supérieure à 2 avec un puits possédant un index de stimulation supérieur a 3. c) Détection de cytokines

Les PBMCs des donneurs (1.10 ⁶ cellules/puits, plaques 24 puits) ont été cultivés dans du mileu AIM V (GIBCO™) ou RPMI 1640 (GIBCO™), supplémenté avec 10% de sérum humain de groupe AB, en présence ou en l'absence du mélange peptidique (60 μg/mL), pendant 2 ou 5 jours. L'IL-2, l' IL-4, l'IL-10 et l'IFN-γ présents dans les surnageants de culture ont été dosés en ELISA sandwich, selon un protocole standard, à l'aide d'anticorps dirigés contre chacune de ces cyrtoines (BD PharMingen). L'absorbance à 492 nm a ete mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre (Multiskan RC, LABSYSTEMS). Les résultats présentés correspondent à la moyenne obtenus sur deux puits.

2) Résultats a) réponse T CD4+ spécifique dεBV induite par le mélange peptidique

Afin de déterminer si le mélange peptidique était reconnu par les lymphocytes T CD4+ humains, des cellules mononucléées sanguines issues de donneurs volontaires sains séropositifs pour EBV, d'haplotype HLA varié (Tableau

III) ont été stimulées in vitro par le mélange peptidique. Dans un premier temps, la réponse proliférative des lymphocytes T qui permet d'établir l 'existence d'une réponse lymphocytaire T de type mémoire, a été évaluée par mesure de l'incorporation de ( ³ H)thymidine après 4 à 6 jours de culture en présence du mélange peptidique. La réponse proliférative a pu être évaluée chez 11 donneurs (figure 3).

Tous les donneurs montrent une réponse proliférative, avec des niveaux de prolifération variables d'un donneur à l 'autre. Ces résultats indiquent la présence de lymphocytes T mémoires capables de reconnaître le mélange peptidique, chez l'ensemble des donneurs testés. Les résultats indiquent également que le mélange contient des peptides naturellement présentés au cours de l'infection par EBV.

La réponse à chacun des peptides testé séparément, a été évaluée (Tableau V). Les résultats confirment l'intérêt de chacun des 6 peptides dans le mélange sélectionné. Tableau V : Analyse de la réponse T CD4+ spécifique d'EBV induite par chacun des peptides testé séparément.

La sécrétion de cytokines dans le milieu de culture après stimulation

des PBMCs avec le mélange peptidique, a également été testée en ELISA (Tableau

VI).

Tableau VI : Analyse de la sécrétion de cytokines après stimulation avec le mélange peptidique.

* PBMC cultivés en milieu AIM

** PBMC cultivés en milieu RPMI+sérum humain de groupe AB

Une sécrétion significative d'IFN-γ a pu être mise en évidence chez 7 des 12 donneurs. Une sécrétion d'IL-10 a également été retrouvée chez 4 des 12 donneurs. Aucune production significative d'IL-4 ou d'Il-2 n'a été retrouvée par ELlSA. Par comparaison, les contrôles en l'absence de mélange peptidique étaient négatifs, à l 'exception d'un cas (*: IFN -γ retrouvé à 126 pg/mL).