〔タグペプチド〕
 本発明のタグペプチドは、下記式(I);
X ₁ -Tyr-X ₂ -Gly-Gln-X ₃    (I)
(式中、X ₁ 、X ₂ 及びX ₃ は、同一又は異なって、任意のアミノ酸残基 を表す。)で表わされるアミノ酸配列を有す� �ものであればよい。
 また、本発明のタグペプチドは、下記式(II) ;
(X ₁ -Tyr-X ₂ -Gly-Gln-X ₃ )n   (II)
(式中、X ₁ 、X ₂ 及びX ₃ は、同一又は異なって、任意のアミノ酸残基 を表す。nは、2~6の整数を表す)で表わされる� ��ミノ酸配列を有するものであってもよい。

 さらに、本発明のタグペプチドは、上記式( I)で表わされるアミノ酸配列(以下「配列(I)」 ともいう)を有し、かつ下記式(IV);
(Tyr-X ₂ -Gly-Gln)   (IV)
(式中、X ₂ は任意のアミノ酸残基を表す。)で表わされ� �アミノ酸配列を2箇所以上有すことが好まし� ��。
 例えば、配列(I)が2回繰り返されたタグペプ チドでは、式(IV)で表わされるアミノ酸配列(� ��下、「配列(IV)」ともいう)は、2個のアミノ� ��残基(X ₃ とX ₁ )を挟んで2箇所に存在する。一方、配列(IV)が 3回繰り返されたタグペプチドには、X ₁ がGlnでX ₃ がTyrである配列(I)が1回含まれる。なお、配� �(IV)を2箇所以上有するタグペプチドは、配列 (I)を少なくとも1回有するタグペプチドにお� �て配列(IV)が少なくとも2箇所に存在すればよ く、その間隔や配置は限定されない。

 配列(I)において、X ₁ は特に限定されないが、例えば、グリシンが 好ましい。X ₂ としては、セリン、バリン、システイン、ア ラニン、トレオニン、グルタミン酸、グリシ ン、アスパラギン酸等の小さい側鎖を有する アミノ酸やプロリンが好ましく、プロリンが より好ましい。X ₃ としては、疎水性アミノ酸が好ましい。例え ば、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラ ニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプ トファン、プロリン、メチオニンが挙げられ 、中でもバリンが好ましい。特に好ましい配 列は、Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val(配列番号1)である。� ��お、本発明におけるタグペプチドを構成す� ��アミノ酸は、L-アミノ酸である。

 本発明のタグペプチドは、配列(I)のみか� ��なるものでもよく、配列(I)と配列(I)以外の� ��ミノ酸残基を含むものでもよい。好ましく� ��、配列(I)を2箇所以上有するものであり、よ り好ましくは、配列(I)を2回以上繰り返した� �ミノ酸配列を有するものである。配列(I)を2� ��所以上有する場合、その回数は限定されな� ��。また、配列(I)を2回以上繰り返したアミノ 酸配列を有する場合も、その繰り返し回数は 限定されない。本発明のタグペプチドは、配 列(I)が繰り返し回数が増加するにつれて、該 タグペプチドに対する抗体との親和性が向上 することが確認されている。本発明のタグペ プチドのアミノ酸残基数の上限は特に限定さ れないが、実用性の点から50残基以下が好ま� ��く、より好ましくは40残基以下、さらに好� �しくは30残基以下である。

 本発明のタグペプチドとしては、下記繰り� ��し単位;
Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val(配列番号1;「P4配列」とも� �う)を3~5回繰りかえしたアミノ酸配列を有す� ��タグペプチド、
又は下記繰り返し単位;
Tyr-Pro-Gly-Gln(配列番号18)を3~5回繰りかえした� �ミノ酸配列を有するタグペプチドが特に好� �しい。

 本発明のタグペプチドは、遺伝子工学的� ��任意のタンパク質と結合させてタグペプチ� ��と任意のタンパク質との融合タンパク質と� ��ることができる。この場合、タグペプチド� ��タンパク質のN末端及びC末端のいずれに結� �していてもよい。このようなタグペプチド� �そのN末端及びC末端に結合したタグペプチド 融合タンパク質は、本発明のタグペプチドと 特異的に結合する抗体を用いて1段階で高純� �に精製することができる。また、該抗体を� �いて検出、定量等することができる。

 本発明のタグペプチドは、任意の物質に� ��学的に結合させることができる。このよう� ��本発明のタグペプチドが化学結合した物質� ��、本発明のタグペプチドと特異的に結合す� ��を用いて簡便かつ高純度に精製することが� ��き、また検出、定量等することができる。� ��発明のタグペプチドを化学的に結合させる� ��手の物質は限定されないが、例えば、タン� ��ク質、核酸、糖類、有機高分子、金属など� ��挙げられる。

〔タグペプチド融合タンパク質〕
 本発明のタグペプチド融合タンパク質は、� ��記で説明した本発明のタグペプチド(以下、 単に「タグペプチド」ともいう)と任意のタ� �パク質との融合タンパク質であり、本発明� �タグペプチドが任意のタンパク質に結合し� �状態で存在するものであればよい。本発明� �タグペプチド融合タンパク質において、タ� �ペプチドはタンパク質のN末端及びC末端のい ずれに結合していてもよい。このようなタグ ペプチドがそのN末端又はC末端に結合したタ� ��ペプチド融合タンパク質は、該タグペプチ� ��と特異的に結合する抗体を用いて1段階で高 純度に精製される。

 本発明のタグペプチド融合タンパク質は、� ��知の遺伝子組換え技術により製造すること� ��できる。以下に、その概略を説明する。
 まず、本発明のタグペプチドをコードする� ��チヌクレオチドを、公知の方法により合成� ��る。ポリヌクレオチドとしては、DNA、RNAが� ��げられるが、DNAが好ましい。ポリヌクレオ� ��ドがDNAの場合には、DNA合成機によりDNAを合� ��することができる。また、DNAは、いくつか� ��部分に分けて合成した後、それらを連結し� ��もよい。タグペプチドのDNA配列は、遺伝子� ��号の縮重により多くの種類がありうるが、D NAから発現されるペプチドが本発明のタグペ� ��チドのアミノ酸配列を有することになる限� ��、特に限定されない。P4配列をコードするDN Aとして、例えば、配列番号9に記載のDNA配列� ��使用することができる。P4配列を3回繰りか� ��したアミノ酸配列からなるタグペプチドを� ��ードするDNAの一例を配列番号11に、P4配列を 5回繰りかえしたアミノ酸配列からなるタグ� �プチドをコードするDNAの一例を配列番号13に 、それぞれ示す。

 合成したタグペプチドをコードするDNAの3 ’末端又は5’末端に、目的とするタンパク� �をコードするDNAを連結する。あるいは、目� �とするタンパク質のDNAをPCR等の手法によっ� �得る際に、DNAの3’末端又は5’末端のプライ マーにタグペプチドをコードするDNAを使用す ると、タグペプチドをコードするDNAが目的タ ンパク質の遺伝子に連結された遺伝子を、PCR 産物として得ることができる。

 本発明のタグペプチド融合タンパク質に� ��いては、タグペプチドと目的とするタンパ� ��質との間に、スペーサーペプチドが挿入さ� ��ていてもよい。スペーサーペプチドは、後� ��する本発明のタグペプチドに対する抗体に� ��合又は会合しないものであり、かつタグペ� ��チドと該抗体との相互作用の障害とならな� ��ものであればどのようなペプチドでもよい� ��例えば、プロテアーゼ切断配列を有するペ� ��チド等が挙げられる。スペーサーペプチド� ��挿入する場合には、タグペプチドをコード� ��るDNAと目的タンパク質をコードするDNAとの� ��にスペーサーペプチドをコードするDNAを連� ��したDNAを作製する。

 上記のようにDNAを合成した後、得られたタ� ��ペプチド及びタンパク質をコードするDNAを� ��んだDNAを発現ベクターに適宜挿入する。ベ� ��ターとしては、公知の発現ベクター(細菌由 来、酵母由来、ウイルス由来など)を好適に� �いることができ、特に限定されない。発現� �クターに含まれるプロモーターは、発現に� �いる宿主に対応して適切なプロモーターで� �ればよい。発現ベクターにはこれ以外に、� �ンハンサー、スプライシングシグナル、ポ� �A付加シグナル、選択マーカー、複製オリジ� ��などを含有しているものを用いることがで� ��る。このように得られた発現ベクターを宿� ��細胞に導入する。宿主細胞としては特に限� ��されず、大腸菌、酵母等の微生物;動物細胞 等を用いることができる。好ましい宿主細胞 は、動物細胞である。発現ベクターを宿主細 胞に導入する方法は、公知の形質転換の中か ら宿主細胞に応じて適宜選択して用いればよ い。得られた組換え微生物又は細胞を適当な 培地で培養し、タグペプチドが結合した融合 タンパク質を発現させる。タグペプチドが結 合した融合タンパク質は、組換え微生物若し くは細胞中、又は培養液中から、後述する抗 体を用いて一段階で精製され得る。
 上記タグペプチド融合タンパク質の製造方� ��において説明した本発明のタグペプチドを� ��ードするポリヌクレオチド及び該ポリヌク� ��オチドを含む組換えベクターも本発明に含� ��れる。なお、本発明の組換えベクターはタ� ��ペプチドと目的のタンパク質との融合タン� ��ク質(タグペプチド融合タンパク質)を発現� �能な組み換えベクターに限定されず、本発� �のタグペプチドをコードするポリヌクレオ� �ドを含むものであればよい。

〔抗体〕
 本発明は、上記本発明のタグペプチドに対� ��る抗体を提供する。本発明の抗体は、本発� ��のタグペプチドを認識し、特異的に相互作� ��する抗体であれば特に限定されない。例え� ��、配列(I)のN末端から2番目のチロシン、4番� ��のグリシン及び5番目のグルタミンを認識し 、上記本発明のタグペプチドと相互作用する 抗体が挙げられる。このような抗体としては 、抗体の抗原結合部において、本発明のタグ ペプチド中の配列(I)のチロシンと抗体中のト リプトファンとが疎水性相互作用により相互 作用し、配列(I)のグリシンのα炭素が抗体中� ��H鎖のTrp50と疎水性相互作用により相互作用� ��、かつ配列(I)のグルタミンの窒素原子と酸� ��原子とが、抗体H鎖中の主鎖のカルボニル酸 素及びアミド窒素原子とそれぞれ水素結合す ることにより、タグペプチドと抗体とが相互 作用する抗体が挙げられる。このようなペプ チド-抗体の相互作用におけるアミノ酸残基� �具体的な立体配置の一例を示したペプチド-� ��体結合部位のX線結晶構造解析図を、図16に� ��す。

 上記抗体の具体例として、ヒトトロンビ� ��受容体PAR4のN末端20残基に相当するペプチド を抗原として、マウス、ウサギ等の哺乳動物 を免疫することにより得られる抗体が挙げら れ、より具体的には、(a)配列番号3で表わさ� �るアミノ酸配列を有する重鎖可変部及び配� �番号5で表わされるアミノ酸配列を有する軽� ��可変部を有する抗体、又は、(b)配列番号7で 表わされるアミノ酸配列を有する1本鎖抗体� �好適に挙げられる。また、(a)の抗体として� �マウス-マウス ハイブリドーマP20.1(受託番� �FERM BP-11061として、独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城� �つくば市東1丁目1番1号 中央第6(郵便番号305- 8566))に国際寄託済み。受託日:2007年12月11日)� �より産生されるモノクローナル抗体が挙げ� �れる。さらに、該モノクローナル抗体をパ� �インで消化することにより得られるFabフラ� �メントも、(a)の抗体に含まれる。(b)の抗体� �、(a)の抗体の可変部領域を利用して得られ� �1本鎖抗体である。(b)の1本鎖抗体は、遺伝子 組換え技術等により2~4量体として使用するの が好ましい。

 上記(a)の抗体は、例えば、後述する実施例� ��記載するように、マウス-マウス ハイブリ� ��ーマP20.1(FERM BP-11061)を用いて製造すること� ��できる。なお、本発明の抗体を産生するマ� ��ス-マウス ハイブリドーマP20.1(FERM BP-11061)� ��、本発明の1つである。
 また、上記(a)及び(b)の抗体は、遺伝子組換� ��技術によって製造することができる。遺伝� ��組換え技術により(a)の抗体を製造する場合� ��は、まず、配列番号4で表わされるアミノ酸 配列をコードするDNA(配列番号3)及び配列番号 6で表わされるアミノ酸配列をコードするDNA(� ��列番号5)を合成する。また、遺伝子組換え� �術により(b)の抗体を製造する場合には、ま� �、配列番号8で表わされるアミノ酸配列をコ� ��ドするDNA(配列番号7)を合成する。これらのD NAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクタ� ��を宿主細胞に導入してタンパク質を発現さ� ��る。次に、発現したタンパク質を分離及び� ��製することによって、上記(a)又は(b)の抗体� ��得ることができる。

〔タンパク質の精製方法〕
 本発明は、上記本発明の抗体を用いたタン� ��ク質の精製方法を提供する。本発明のタン� ��ク質の精製方法は、以下の(i)~(iii)の工程を� ��む方法であればよい。
(i)本発明のタグペプチド融合タンパク質と、 該タグペプチド融合タンパク質以外の物質と を含有する混合物を調製する工程
(ii)前記(i)の工程で得られた混合物に、本発� �の抗体を作用させてタグペプチド融合タン� �ク質と抗体との結合物を形成させる工程
(iii)前記(ii)の工程で得られた結合物に溶離物 質を作用させてタグペプチド融合タンパク質 を抗体から遊離させる工程
 本発明の抗体は、本発明のタグペプチド融� ��タンパク質中のタグペプチドと特異的に相� ��作用することから、該抗体を用いると、本� ��明のタグペプチド融合タンパク質を一段階� ��高純度に精製することができる。

 (i)の工程において混合物を調製する方法� ��、特に限定されない。例えば、目的とする� ��グペプチドが結合したタグペプチド融合タ� ��パク質が細胞中に存在する場合には、培養� ��た組換え微生物又は細胞を公知の方法によ� ��て溶解又は粉砕等して、タグペプチド融合� ��ンパク質と該タグペプチド融合タンパク質� ��外の物質とを含む混合物(細胞溶解液)を得� �。タグペプチド融合タンパク質が封入体等� �不溶性画分として得られる場合には、(ii)の� ��程を行う前に、タンパク質の可溶化工程、� ��溶化したタンパク質の折りたたみ(巻き戻し )工程等を適宜行ってもよい。タグペプチド� �合タンパク質が細胞外、すなわち培地中に� �泌される場合には、培養液の上清を採取し� �これを混合物として(ii)の工程に用いる。細� ��溶解液や培養液上清は遠心分離して固形成� ��を除去し、必要に応じてpHを中性(7~8)に合わ せるが、その他に塩などを添加する必要は特 にない。また、これら混合物中の目的タンパ ク質の濃度は0.2μg/mL以上であることが好まし い。

 (ii)の工程では、本発明の抗体を担体に固 定化した固定化抗体を用いることが好ましい 。抗体を固定する担体としては、本発明の効 果を奏することになる限り特に限定されず、 公知の担体を用いることができる。例えば、 セファロース(GEヘルスケア社)、アフィゲル(B IO-RAD社)等が好適である。抗体を担体に固定� �る方法は、担体の種類等に応じて適宜選択� �ればよく、特に限定されない。例えば、セ� �ァロースを用いる場合には、抗体をカップ� �ングバッファーで透析し、次いでCNBr活性化� ��ファロース(GEヘルスケア)と抗体とを室温で 約1~2時間混合することにより、セファロース 固定化抗体を作製することができる。

 本発明のタンパク質の精製方法において� ��、上記固定化抗体をカラムに充填して使用� ��るカラム法、試料と混合して懸濁状態で結� ��させるバッチ法をともに利用できる。前者� ��場合には、固定化抗体をカラムに充填し、� ��ラムに工程(i)で調製した混合物を流して本� ��明の抗体をタグペプチドに作用させる。こ� ��により、タグペプチドと抗体とが結合し、� ��グペプチド融合タンパク質と抗体との結合� ��が形成される。後者の場合は、試料溶液10mL あたり100μL程度の固定化抗体を加えて穏やか に混和し、タグペプチド融合タンパク質と抗 体との結合物を形成させてからカラムに充填 する。

 次いで、工程(iii)において、(ii)の工程で得� ��れた結合物に溶離物質を作用させてタグペ� ��チド融合タンパク質を抗体から遊離させる� ��すなわち、結合物に溶離物質を作用させる� ��とにより抗体とタグペプチドとを解離させ� ��タグペプチドを介して固定化抗体に結合し� ��タグペプチド融合タンパク質を、抗体から� ��離させる。
 溶離物質としては、本発明のタグペプチド� ��本発明の抗体との結合を解離させる作用を� ��する物質であればよい。このような物質と� ��て、ポリオールなどの親水性の有機溶媒、� ��発明のタグペプチドが挙げられる。本発明� ��タンパク質の精製方法においては、目的と� ��るタンパク質の種類等に応じて溶離物質を� ��宜選択することができるが、親水性の有機� ��媒が好ましい。中でも、プロピレングリコ� ��ルとジメチルスルフォキシドが特に好まし� ��。またエチレングリコールも使用可能であ� ��。

 タグペプチド融合タンパク質と抗体との� ��合物に溶離物質を作用させる方法としては� ��溶離物質を水又は適当な緩衝液と混合して� ��離液とし、該溶離液をカラムに流す方法が� ��ましい。この場合、溶離液中の溶離物質に� ��り抗体から遊離したタグペプチド融合タン� ��ク質は、溶離液とともにカラムから溶出す� ��。水又は緩衝液は、タンパク質の種類に応� ��て選択すればよい。

 溶離液中の溶離物質の含有量は、目的と� ��るタグペプチド融合タンパク質又は溶離物� ��の種類等により適宜変更するのが好ましい� ��例えば、溶離物質として親水性の有機溶媒� ��用いる場合には、水又は緩衝液と親水性の� ��機溶媒との合計体積を100として、親水性の� ��機溶媒を約40%(v/v)以上で混合することが好� �しく、水又は緩衝液と親水性の有機溶媒と� �体積比(水又は緩衝液:親水性の有機溶媒)を� �60:40~40:60とすることが好ましい。

 タグペプチドを溶離物質とする場合には� ��水又は緩衝液中にタグペプチド濃度が約0.1~ 1mg/mLとなるように溶離液を調製することが好 ましい。溶離物質とするタグペプチドとして は、本発明のタグペプチドであれば限定され ないが、配列(I)を含むものが好ましい。本発 明のタグペプチドは、公知のペプチド合成法 によって製造することができる。

 溶離液には、得られるタグペプチド融合タ� ��パク質を安定化させるために塩を添加して� ��よい。塩の種類は、タンパク質の種類等に� ��り選択すればよく、特に限定されない。塩� ��濃度も、タンパク質の種類に応じて適宜調� ��すればよく、特に限定されない。
 タグペプチド融合タンパク質を精製した後� ��固定化抗体は、溶離物質を含む溶離液で洗� ��することにより、繰り返し使用することが� ��能である。

 本発明のタンパク質の精製方法は、(i)~(ii i)の工程の後に、さらに(iv)タグペプチド融合 タンパク質からタグペプチドを切断する工程 を含んでいてもよい。例えば、タグペプチド と目的タンパク質との間にプロテアーゼ切断 配列を有するスペーサーペプチドを挿入した 場合には、精製後の融合タンパク質に該プロ テアーゼ切断配列を認識するプロテアーゼを 適当な条件で作用させることにより、タグペ プチドが結合していない目的タンパク質を得 ることができる。

 本発明のタンパク質の精製方法において� ��、タグペプチドと抗体とが特異的に相互作� ��し、該相互作用は親水性の有機溶媒等の溶� ��物質により容易に解離することから、タグ� ��プチドが結合した融合タンパク質を一段階� ��高純度に精製することができる。また、溶� ��物質に親水性の有機溶媒等を用いることか� ��、目的とする融合タンパク質及び抗体を変� ��させることなく精製することができる。従� ��て、本発明によれば、X線結晶構造解析のた めの高品質な組換えタンパク質を、一段階の 精製操作で十分量得ることができる。結晶化 のためには極めて精製度の高い、化学的に均 一な、しかも生物活性を100%保ったタンパク� �をミリグラムオーダーで調製する必要があ� �が、本発明の技術は、X線結晶構造解析のた� ��のタンパク質の調製に好適である。

 また、本発明のタンパク質の精製方法に� ��いては、固定化抗体を繰り返し精製に用い� ��ことができる。実際に、本発明者は、P20.1� �体をセファロースに固定化した固定化抗体� �、本発明のタグペプチド融合タンパク質(GFPu v-P4×3融合タンパク質)の精製に繰り返し使用� ��てその影響を検討したところ、21回繰り返� �て使用してもその収量はわずかに低下する� �過ぎないことを確認している(実施例の〔10� �参照)。しかも溶離物質として用いる親水性� ��有機溶媒は比較的安価であるため、本発明� ��タンパク質の精製方法を用いれば、タンパ� ��質を安価に、かつ簡便に精製することが可� ��となる。

〔タンパク質を検出又は定量する方法〕
 本発明は、上記本発明の抗体を用いたタン� ��ク質の検出又は定量方法を提供する。本発� ��のタンパク質を検出又は定量する方法は、� ��下の(i)~(iii)の工程を含む方法であればよい� ��
(i)本発明のタグペプチド融合タンパク質を含 有する試料を調製する工程
(ii)前記(i)の工程で得られた試料に、本発明� �抗体を作用させてタグペプチド融合タンパ� �質と抗体との結合物を形成させる工程
(iii)前記(ii)の工程で得られた結合物を検出又 は定量する工程
 本発明の抗体は、本発明のタグペプチド融� ��タンパク質中のタグペプチドと特異的に相� ��作用することから、該抗体を用いると、タ� ��ペプチドが結合した融合タンパク質を検出� ��は定量することができる。
 本発明のタンパク質を検出又は定量する方� ��は、ウェスタンブロッティング、サンドイ� ��チELISA、フローサイトメトリー、免疫沈降� �免疫組織化学等の各種免疫学的手法に適用� �ることができる。

 本発明のタンパク質を検出又は定量する� ��法において、(i)の工程における試料の調製� ��法は特に限定されず、例えば、目的とする� ��グペプチド融合タンパク質を発現した細胞� ��溶解又は粉砕することにより、タグペプチ� ��融合タンパク質を含有する試料を調製する� ��とができる。

 (i)の工程で得られた試料に、(ii)の工程に おいて本発明の抗体を作用させてタグペプチ ド融合タンパク質と抗体との結合物を形成さ せる方法、及び(iii)の工程において結合物を� ��出又は定量する方法について、サンドイッ� ��ELISA又はウェスタンブロッティングを行う� �合を例に挙げて以下に説明する。

(A)サンドイッチELISA
 サンドイッチELISAにおいては、本発明の抗� �を検出抗体は又はキャプチャー抗体として� �いて、タグペプチド融合タンパク質を検出� �は定量することができる。

(A-1)本発明の抗体を検出抗体とする場合
(1)予め本発明の抗体を何らかの手段により修 飾又は標識しておく。修飾又は標識手段は特 に限定されず、例えば、ビオチン化、ペルオ キシダーゼ等の酵素標識、フルオレセインな どの蛍光色素標識、125Iなどの放射性同位元� �による標識などが挙げられる。
(2)本発明の抗体とは別に、融合タンパク質中 のタグペプチド以外のタンパク質部分と特異 的に相互作用する抗体を用意し、この抗体を マイクロタイタープレートに固相化する。
(3)(2)で固相化した抗体上に、(i)の工程で得ら れた試料を流し、タグペプチド融合タンパク 質を抗体にキャプチャー(捕獲)させる。
(4)次いで、キャプチャーされたタグペプチド 融合タンパク質に、本発明の抗体を作用させ てタグペプチド融合タンパク質と本発明の抗 体との結合物を形成させる。本発明の抗体を 酵素標識して用いた場合には、次に(6)の操作 を行う。
(5)本発明の抗体をビオチン化して用いた場合 には、形成された結合物に酵素標識したスト レプトアビジンを作用させ、抗体中のビオチ ンとストレプトアビジンとを結合させる。
(6)酵素の発色又は発光基質(例えば、ペルオ� �シダーゼであればABTS)を加える。酵素により 基質が分解されて発色反応産物が得られるた め、試料の吸光度を測定することによりタグ ペプチド融合タンパク質と抗体との結合物を 検出することができる。また、吸光度は試料 中のタグペプチド融合タンパク質量に定量的 に相関することから、融合タンパク質と抗体 との結合物を定量することができる。更に、 この場合に発色基質とともに基質増感剤を併 用することにより、検出感度を上げることが 可能である。

(A-2)本発明の抗体をキャプチャー抗体とする� ��合
(1)本発明の抗体をマイクロプレート等に固相 化する。
(2)固相化した抗体に、(i)の工程で得られた試 料を加えて抗体にタンパク質をキャプチャー させ、融合タンパク質と抗体との結合物を形 成させる。
(3)形成された結合物に、融合タンパク質中の タグペプチド以外のタンパク質部分と特異的 に相互作用する抗体を作用させ、(2)で形成さ れた結合物とこの抗体とを結合させる。
(4)(3)で作用させた抗体が酵素で標識されてい ない場合には、(3)で加えた抗体と特異的に反 応する抗体(酵素標識抗体:二次抗体)を更に作 用させる。
(5)酵素の基質(通常、発色又は発光基質)を加� ��、酵素反応の生成物を検出する。

(B)ウェスタンブロッティング
 ウェスタンブロッティングにおいては、以� ��の方法により、結合物を検出する。
(1)(i)の工程で得られた試料をSDS電気泳動に供 し、タグペプチド融合タンパク質を分離して 、ニトロセルロース膜又はPDVF膜に転写する� �
(2)膜上の融合タンパク質に、本発明の抗体を 作用させて結合物を形成させる。本発明の抗 体を酵素標識して用いた場合には、次に(4)の 操作を行う。
(3)(2)で作用させた本発明の抗体を酵素で標識 していない場合には、(2)で加えた抗体と特異 的に反応する抗体(酵素標識抗体:二次抗体)を 更に作用させる。
(4)酵素の基質(通常、発色又は発光基質)を加� ��、酵素反応の生成物を検出する。

 本発明のタグペプチド融合タンパク質及� ��本発明の抗体は、蛍光抗体法、免疫沈降法� ��や、検出試薬の開発、細胞イメージング、� ��ンサー開発等にも応用可能である。

〔キット〕
 本発明は、タンパク質の発現、精製、検出� ��は定量のためのキットを提供する。本発明� ��キットは、本発明の組換えベクター又は本� ��明の抗体を含むものであればよい。本発明� ��キットを用いることにより、タンパク質の� ��現、精製、検出又は定量を簡便に行うこと� ��できる。発現用キットには本発明の組換え� ��クターが必須に含まれ、精製、検出又は定� ��用キットには、本発明の抗体が必須に含ま� ��る。本発明の組換えベクター及び本発明の� ��体の両方を含むキットとすることが好まし� ��。

 キットに含まれる組換えベクターは、キ� ��トのユーザーが目的のタンパク質をコード� ��るDNAを組み込むことにより本発明のタグペ� ��チドと目的のタンパク質が結合したタグペ� ��チド融合タンパク質の発現ベクターが作製� ��きる形態で提供されることが好ましい。ユ� ��ザーは、作製した発現ベクターを適当な宿� ��細胞に導入して宿主細胞を培養することに� ��り、所望のタグペプチド融合タンパク質を� ��便に発現させることができる。

 キットに含まれる抗体は、適当な担体に固� ��化された状態(精製用キットの場合)、適当� �標識(酵素標識、放射性標識、蛍光標識等)や 修飾(ビオチン化等)された状態(検出用キット 、定量用キットの場合)が好ましい。本キッ� �を用いてタンパク質を精製、検出又は定量� �る方法は、上記本発明のタンパク質の精製� �法、及び本発明のタンパク質を検出又は定� �する方法に従えばよい。
 なお、キットには、本発明の組換えベクタ� ��又は本発明の抗体以外に、二次抗体、反応� ��緩衝液、基質、使用説明書等の構成を含ん� ��いてもよい。

〔本発明の優位性〕
 本発明のタグシステムは、以下の点で優れ� ��いる。
(I)認識配列が短く、しかも非特異的吸着の原 因となる荷電性のアミノ酸がない。
(II)標的となるタグ配列と、その抗体(P20.1抗� �)との相互作用は、タンパク質の1段階精製が 可能な親和性を有する。
(III)(II)の相互作用は、タンパク質に影響を与 えない条件(例えば、40%エチレングリコール� �)で解離するものであるので、高品質な抗原� ��製とカラムの繰り返し使用とが同時に可能� ��ある。
(IV)抗体とタグペプチドとの複合体の原子分� �能立体構造を取得しているので、さらなる� �変及び改良が可能である。
(V)免疫ブロッティング、蛍光抗体法、免疫沈 降法等にも応用可能であり、タンパク質の精 製だけでなく、検出試薬の開発、細胞イメー ジング、センサー開発等の応用可能性が高い 。
 上記(I)~(V)の中でも、(III)は、これまで市販� ��び量産されてきた抗体を用いるタンパク質� ��製システムには全く見られないものである� ��

〔実施例〕
 次に本発明を実施例によって具体的に説明� ��るが、本発明はこれらに限定されるもので� ��ない。

〔1〕モノクローナル抗体作製
 抗PAR4ペプチド抗体は定法により以下のよう に作製した。
(1-1)ペプチド合成、及びペプチドによる免疫
 ヒトトロンビン受容体PAR4のN末端20残基に相 当する以下の配列のペプチド(配列番号2)をFmo c固相法により合成した。
NH ₂ -GGDDSTPSILPAPRGYPGQVC-COOH

 逆相HPLCにより精製した上記ペプチドを、シ ステイン(Cys)残基を介してキャリアータンパ� ��質であるkeyhole limpet hemocyanin(KLH)に結合さ� �、これを免疫原とした。
 上記ペプチド-KLH複合体を、アジュバントと ともにBalb/cマウスに免疫し、ELISA法にて抗体� ��を測定したところ、25μg×5回の免疫で高い� �体価が得られた。このマウスの脾臓細胞を� �合に供した。

(1-2)細胞融合、ハイブリドーマ樹立
 上記マウス脾臓細胞よりB細胞を採取し、こ れとマウスミエローマ細胞(SP2/0株)とをポリ� �チレングリコール法にて融合したのち、HAT� �択培地にて培養した。
 コロニーを生じたウェルの上清をELISA法に� �スクリーニングし、陽性の強かったものを� �次スクリーニングにまわした。二次スクリ� �ニングでは、抗原として後に述べる融合タ� �パク質(PAR4-Fn)を使用した。その結果、反応� �の高い一つのクローンを得た。同クローン� �限界希釈法によりクローニングし、最終的� �マウス-マウス ハイブリドーマP20.1(受託番� �FERM BP-11061として、独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城� �つくば市東1丁目1番1号 中央第6(郵便番号305- 8566))に国際寄託済み。受託日:2007年12月11日)� �樹立した。

(1-3)抗体の精製、Fabフラグメント、及びセフ� ��ロース固定化抗体の調製
(1)抗体の精製
 1-2で樹立したマウス-マウス ハイブリドー� ��P20.1(FERM BP-11061)を、10%のウシ胎児血清を含� ��RPMI1640培地にて培養した。この培養上清か� �プロテインAセファロースを用いてP20.1抗体� �精製した。精製抗体のアイソタイプはIgG1、� ��鎖はλであった。

(2)Fabフラグメント
 P20.1抗体のFabフラグメントは、PIERCE社のImmun opure Fab preparation kitを用いて調製した。す� �わち、固定化されたパパインによって精製� �たP20.1抗体(IgG)を37℃で、16時間消化し、消化 物をプロテインAセファロースにかけて未結� �物をさらにゲルろ過によって精製した。

(3)セファロース固定化抗体の調製
 精製したP20.1抗体(約30mg)をカップリングバ� �ファー(0.1M NaHCO ₃ 、0.3M NaCl、pH 8.3)で透析した。次いで、この 精製したP20.1抗体と、1mM塩酸で洗ったCNBr-activ ated Sepharose 4B(GEヘルスケア)とを室温で1時間 混合することにより、セファロース固定化抗 体を作製した。未反応の活性基を0.1Mトリス(T ris)によってブロックし、0.1M Gly-HCl、pH2.2で� �特異的に結合した抗体を除去した。未結合� �抗体の定量結果から、セファロースレジン1m Lあたり約2mgのP20.1抗体を固定化することがで きたことが分かった。

〔2〕タグペプチド融合タンパク質の作製
(2-1)タグペプチド/フィブロネクチン融合タン パク質の作製
 ヒトフィブロネクチンの第9-第10Fn3ドメイン 部分の185残基を発現するコンストラクトを用 い、そのN末端又はC末端に種々の長さのP4ペ� �チド配列(PAR4のN末端20残基の一部又は全部)� �付加した6種類のタグペプチド融合タンパク� ��を作製した(図1の上から6種類)。インサート はextension PCRにて調製し、これを発現ベクタ� ��pET11c(Novagen)のNdeI-BamHIサイトに挿入した。ま た、P4ペプチド配列のC末端側6残基のアミノ� �をアラニンに置換した変異体(Ala変異体)のコ ンストラクト(図1の下から6種類)を、Quick Chan ge Mutagenesis kit (Stratagen)を用いて作製した。
 上記各コンストラクトを大腸菌BL21(DE3)株に� ��質転換し、定法に従って発現誘導を行った� ��生成したタグペプチド融合タンパク質を、� ��腸菌可溶化物から陰イオン交換クロマトグ� ��フィーによって精製した。

(2-2)ヒト成長因子/ヒトフィブリノーゲン/タ� �ペプチド融合タンパク質の作製
 ヒト成長因子(hGH)とヒトフィブリノーゲンγ 鎖Cドメインとの融合タンパク質を動物細胞� �発現するベクターはすでに報告されている(X iao et al. Nature 432, 59-67, 2004)。この融合タ� ��パク質のコンストラクトのC末端に、P4ペプ� ��ド由来の6残基ペプチド(GYPGQV:P4配列(配列番� ��1))を1回、3回又は5回繰り返したペプチドを� ��ードするDNAを付加したものをextension PCRで� �製した。図2(a)に、P4配列を付加したヒト成� �因子(hGH)とヒトフィブリノーゲンγ鎖Cドメイ ンとの融合タンパク質を動物細胞で発現する ベクターを示す。図2(b)には、hGHのミニジー� �につなげたビオチン化配列(BAS)とフィブリノ ーゲンγ鎖フラグメント(γC)の後に、P4配列(6� ��基)が1、3又は5回繰り返されているコンスト ラクトを示す。
 P4配列を付加したタグペプチド融合タンパ� �質(hGH-BAS-γC-P4)をコードするDNA配列の一部を� ��列番号15及び図3に示す。なお、配列番号15� �示す塩基配列では、P4配列を付加したタグペ プチド融合タンパク質(hGH-BAS-γC-P4)をコード� �る全DNA5424塩基のうち、1~2100番目の塩基及び3 121~5424番目の塩基は省略している。つまり、� ��列番号15で表わされるDNA配列は、hGH-BAS-γC-P4 をコードするDNA5424塩基のうちの2101~3120番目� �塩基配列である。図3中、下線部は、hGHの配� ��を表す。シャドウ(影)をかけた箇所は、His� �グ配列である。斜字体は、リンカー部分を� �す。太い下線部は、TEVプロテアーゼサイト� �ある。破線部は、BAS配列である。太字は、P4 タグ部分である。箱で囲んだアミノ酸配列は 、P4配列である。その他は、フィブリノーゲ� ��γC部分である。
 P4配列を3回繰りかえしたアミノ酸配列(P4×3) からなるタグペプチドをコードするDNA配列を 配列番号11に、P4配列を5回繰りかえしたアミ� ��酸配列(P4×5)からなるタグペプチドをコード するDNA配列を配列番号13に、それぞれ示す。P 4×3配列をコードするDNAを付加したコンスト� �クトのDNA配列の一部を図4(a)に示す。P4×5配� �をコードするDNAを付加したコンストラクト� �DNA配列の一部を図4(b)に示す。図4(a)に示す塩 基配列では、5460塩基のうち、1~3000番目の塩� �部分及び3181~5460番目の塩基部分は省略され� �いる。図4(b)に示す塩基配列では、5496塩基の うち、1~3000番目の塩基部分及び3181~5496番目の 塩基部分は省略されている。図4(a)及び図4(b)� ��おいて、太字は、P4タグ部分、箱で囲んだ� �ミノ酸配列はP4配列、その他はフィブリノー ゲンγC部分である。
 作製したプラスミドをヒト線維芽細胞株HEK2 93Tにトランスフェクションし、この細胞を10% のウシ胎児血清を含むDMEM培地にて培養した� �得られた培養上清からNi-NTAアガロース(Qiagen) クロマトグラフィーによってヒト成長因子/� �トフィブリノーゲン/タグペプチド融合タン� ��ク質を精製した。このタグペプチド融合タ� ��パク質の検出には、マウス抗hGHモノクロー� ��ル抗体HGH-B(American Type Culture Collection)及び� ��オチン化配列(BAS)に対する抗血清(ウサギ)を 用いた。

〔3〕モノクローナルP20.1抗体の性状解析
(3-1)エピトープの解析
 P20.1抗体によって認識される必要最小のペ� �チド配列を、2-1で作製した各種のP4-Fnタンパ ク質に対するELISA法にて調べた。プロトコー� ��は以下のとおりである。
(1)10μg/mLに希釈したP4-Fn(又はその変異体)溶液 50μLを96wellプレートに加えて静置した(4℃、16 時間)
(2)アスピレーターで吸引し、1%BSA in Tris-buffe red saline (TBS; 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7.5)を 200μL/well加えて室温で1時間静置した。
(3)2-5μg/mLのP20.1抗体を50μL加えて室温で1時間� ��置した。
(4)200μL/wellのTBSで3回洗浄した。
(5)ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG(1/1000希� �)を50μL加えて室温で30分静置した。
(6)200μL/wellのTBSで4回洗浄した。
(7)ペルオキシダーゼ発色基質(ABTS)を100μL/well� ��加え、室温で5~10分静置後、各well中の溶液� �405nmの吸光度を測定した。

 ELISAの結果、P4ペプチドはFnのN末端に融合 させてもC末端に融合させてもP20.1抗体によっ て認識されることが分かった。P4ペプチドをF nのN末端に融合させた5種類のタグペプチド融 合タンパク質のELISAの結果を図5に示す。この 結果から、認識にはP4ペプチドのC末端側の6� �基の部分(GYPGQV:P4配列(配列番号1))だけで十分 であることが分かった。また、この6残基を1� ��ずつAlaに変えた変異体について同様に調べ� ��結果を図6に示す。図6中、コントロールは� �コーティングなし、WTはP4(20)-Fnをコートした ウェルの値を、それぞれ表わす。G、Y、P、G� �Q及びVは、これらの各アミノ酸をそれぞれア ラニンに置換した改変融合タンパク質を表す 。図6から明らかなように、Y2、G4及びQ5は必� �であるが、G1、P3又はV6はAlaに変えても反応� �が残っていることが分かった。

(3-2)P20.1抗体の結合親和性
 P20.1抗体のP4ペプチド配列への結合における 親和性を調べるため、ビアコアによる表面プ ラズモン共鳴解析を行った。2-1で精製したP4( 20)-Fn(図1参照)をビオチン化し、ストレプトア ビジン固定化センサーチップで捕捉した後、 精製P20.1抗体を種々の濃度で流した。結果を� ��7及び表1に示す。P20.1抗体は、P4(20)-Fnに対し て見かけ上の解離平衡定数約3.4nMという親和� ��を示した。市販のFlag抗体であるM2と、タグ� ��してFlag(DYKDDDDV(配列番号19))を使用したFlag(DY KDDDDV(配列番号19))-Fnとの親和性を同様に解析� ��ると、解離平衡定数2.7nMという値が得られ� �。

(3-3)ペプチドによる競合的解離
 P20.1抗体の結合が過剰の遊離ペプチドによ� �て解離できるかどうかを調べるため、P4(20)-F nタンパク質を用いる3-1のELISA実験において最 後の洗浄の際に種々の濃度のP4(C8)ペプチド(PR GYPGQV(配列番号20)の8残基ペプチド、Fmoc法で合 成)を含む緩衝液中で30分反応させた。図8に� �した結果から、0.1mg/mLの濃度のペプチドによ って、ほぼ完全に解離が引き起こされること がわかった。

(3-4)P20.1抗体のウェスタンブロッティングへ� �応用
 2-1で精製したP4(20)-Fn(0.12-0.87pmol/lane)をSDS電� �泳動で分離し、PDVF膜に転写後、1μg/mLのP20.1� ��体と反応させ、続いてペルオキシダーゼ標� ��抗マウスIgGとケミルミネッセンス基質によ� ��て検出した。結果を図9に示す。図9から明� �かなように、P20.1抗体は約0.2pmolのP4ペプチド 融合タンパク質をウェスタンブロッティング で検出できることがわかった。

〔4〕P20.1抗体によって認識されるペプチド配 列のランダムスクリーニング
(4-1)ファージディスプレイライブラリの作製
 P20.1抗体によって認識されるペプチド配列� �さらに大規模に探索するため、ファージデ� �スプレイ法を用いた。図10にファージディス プレイ法の概略を示す。M13ファージのgIIIコ� �トタンパク質のN末端にランダム化した7アミ ノ酸(ただしそのうちTyr2とGln5は固定)のライ� �ラリーを挿入するべく、図11に示すファージ ミドの構築を行い、10 ⁷ の多様性を持つライブラリーを作製した。

(4-2)P20.1抗体反応性クローンの選択
 P20.1抗体を固定化した磁気ビーズパニング� �より、多数の結合クローンを得た。これら� �クローンの可変部の配列をDNAシークエンシ� �グにより解読し、図12に示すような配列パタ ーンを得た。この結果から、N末端から2番目� ��チロシン(Tyr2ともいう)、4番目のグリシン(Gl y4ともいう)及び5番目のグルタミン(Gln5ともい う)の要求性とともにN末端から3番目のプロリ ン(Pro3ともいう)の高い選択性が示されたが、 6番目の部位は疎水性アミノ酸なら許容され� �こと、そして1及び7番目のアミノ酸残基には 特に強い選択性のないことがわかった。すな わちP20.1抗体は、一般に下記ペプチド配列に� ��和性が高いことがわかった。
X1-Tyr2-Pro3-Gly4-Gln5-X6
(上記ペプチド配列中、X1は、任意のアミノ酸 残基を表す。Pro3はS、V、C、A、T、E、G、D等の 小さい側鎖をもつアミノ酸でも可であり、X6� ��疎水性アミノ酸であれば可である。)

〔5〕P20.1抗体のFabフラグメント-ペプチド複� �体のX線結晶解析
(5-1)P20.1抗体の可変部のアミノ酸配列決定
ハイブリドーマからDNAクローニング
 構造決定に必要なP20.1抗体 Fabフラグメント の正確なアミノ酸配列を決定するため、マウ ス-マウス ハイブリドーマP20.1(FERM BP-11061)か ら、Total RNA Isolation System(Promega)を用いて全R NAを抽出し、22.7ng/μLの濃度で100μLを得た。こ れをテンプレートに用い、Mouse Ig-Primer Set(No vagen)を用いてRT-PCRを行った。その産物の中で 、増えたものをpDrive Cloning Vector(QIAGEN PCR Cl oning Kit)とライゲーションし、大腸菌DH5aを形 質転換した。これをLBプレート(アンピシリン 、X-gal及びIPTG添加)に播き、コロニーを得た� �

 得られたDNAクローンについて、可変部に� ��いてはRT-PCRに使用したプライマーを用いてD NA配列を決定した。また、その配列を基に内� ��プライマーを設計し、定常部についても順� ��配列決定を行った。その結果得られたDNA/ア ミノ酸配列を配列表の配列番号3及び5、並び� ��図13及び14に示す。配列番号3及び図13は、P20 .1抗体Fabフラグメントの重鎖可変部のDNA/アミ ノ酸配列であり、配列番号5及び図14は、軽鎖 可変部のDNA/アミノ酸配列である。

(5-2)複合体の結晶化
 1-3で調製したP20.1抗体のFabフラグメント28μL (10mg/mL in 5mM Tris、50mM NaCl、pH7.4)と4μLのP4(C8 )ペプチド溶液(10mg/mL)とを混合して一晩静置� �た。結晶化は Emerald Biostructures社のWizard I� �IIキットを用い、ハンギングドロップ法によ り合計96条件での結晶化を試みた。その結果� ��20%(w/v)PEG3000を含む100mM酢酸緩衝液(pH4.5)の条� ��で柱状の結晶が見られたため、その周辺でP EG3000の濃度を振って最適な条件を模索し、最 終的に23%PEGに決定した。得られたタンパク質 の結晶を図15に示す。図15において、左の円� �は、P20.1抗体のFabフラグメントとP4(C8)ペプチ ドとの複合体の結晶の模式図であり、右が結 晶の拡大写真である。

(5-3)構造決定
 5-2で得た結晶を用い、放射光施設Spring-8の� �ームラインBL-44XUを用いて1.8Åの分解能でX線 結晶構造解析を行った。データの統計値を表 2に示す。

 得られたデータを元に、分子置換法を用� ��て立体構造の決定を行った。分子置換法の� ��ンプレートとしては、P20.1抗体と同じIgG1で� ��鎖がλであるMonoclonal Antibody 2D12.5 Fab Comple xed with Gd-DOTA (PDB ID:1NC4)を用いた。その結� �、単位格子中の2分子のFabの配置を決めるこ� ��ができた。

 位相の改良と構造の精密化のために、5-1� ��決定したP20.1抗体の一次構造を利用した。� �の一次構造のデータと分子置換法の解を用� �て、ARP/wARPで自動モデリングを行い、結果と して、884残基中の736残基のモデルを構築し、 さらにそのうちの650残基の側鎖の構造もアサ インすることができた。改良されたマップに 対して、モデルのフィッティングを行い、構 造の精密化を行った。統計値は表3の通りで� �る。

 電子密度を観察した結果、非対称単位中� ��2分子のFab双方にペプチドが結合しているこ とが分かった。どちらも信頼性の高いモデル が組めたのは、P4(C8)ペプチドのうち、C末側� �GYPGQV(P4配列、配列番号1)に対応する部分であ った。2つの複合体のうち一方の全体構造と� �原認識部位のクローズアップを図16に示す。 明らかになった立体構造から、認識ペプチド 配列の特異性(Tyr2、Gly4、Gln5の要求性)の理由� ��極めて明らかになった。

 本発明の抗体によるペプチド抗原(本発明の タグペプチド)認識の構造化学的基盤が原子� �標により特定されたことは、タンパク質工� �的手法によって以下の2つのことを可能にす� ��機会が与えられたことになる。
(A)認識能力をそのままに保ったままで抗体に 他の性質を賦与する。
(B)現在のものより特異性や親和性を望ましい ものに改変する。
具体的には、タグ認識に関与しないアミノ酸 残基を改変して特異的な標識を可能にしたり 、コアとなる上記の認識部分の外側に存在す る抗体側、ペプチド側のアミノ酸残基を改変 して新たな相補性を導入し、より強く結合す る抗体やより長い特定のペプチドを優先的に 結合する抗体を創出することが可能である。

〔6〕P20.1抗体由来scFvの作製
(6-1)コンストラクトの作製、発現及び精製
 マウス-マウス ハイブリドーマP20.1(FERM BP-1 1061)由来のP20.1抗体だけでなく、簡便に組換� �発現及び精製のできる試薬として利用する� �め、同抗体の一本鎖Fvフラグメント(scFv)を作 製した。5-1で同定したP20.1抗体の可変部のア� ��ノ酸配列を利用して配列番号7及び図17に示� ��ような配列の発現コンストラクトを構築し� ��pET11cベクター及び大腸菌BL21株を用いてscFv� �発現させた。scFvは封入体として得られるた� ��、不溶性分画から塩酸グアニジンによって� ��解させ、Ni-NTAレジンにより精製した後、段� ��透析によって巻き戻しを行った。1L培養液� �ら約2mgのscFvを得た。

 scFvは一価のため結合力が弱い。そこでscF vの下流にストレプトアビジンを融合した組� �えタンパク質を作製し、ストレプトアビジ� �が四量体化する性質を利用して実質的な親� �性の向上を図った。図18に示すコンストラク トを用いてscFvのときと同様にタンパク質の� �現及び精製を行い、4量体のscFv(tetra-scFv)を得 た。

(6-2)scFvの活性
 調製したscFv抗体及びtetra-scFv抗体のペプチ� �結合能を、P4(20)-Fn固定化センサーチップを� �いたビアコア試験により調べた。比較のた� �に、Fabフラグメントについても同様にビア� �ア試験に供した。Fabフラグメント、scFv抗体� ��及びtetra-scFv抗体の結果を、それぞれ図19(a)� ��(b)及び(c)に示す。図19(a)、(b)及び(c)から明� �かなように、scFv抗体はFabフラグメントとほ� ��同様な結合活性を示し、scFvであるにも関わ らず抗原結合能の低下はないことが確認され た。また、tetra-scFv抗体は、ほとんど解離が� �られず、もとのIgG分子(P20.1抗体)をも遙かに� ��駕する強い結合能を獲得した。

〔7〕P4配列(GYPGQV(配列番号1))重複によるP20.1� �体の実効親和性の向上
(7-1)表面プラズモン共鳴によるキネティクス� ��析
 P20.1抗体に対する実効親和性の向上を目指� �、P4配列を1、3又は5回繰り返した重複配列タ グ(それぞれP4×1、P4×3、及びP4×5と呼ぶ)をも� ��タグペプチド融合タンパク質を作製した(2-2 参照)。これらを、P20.1抗体を固定化したセン サーチップ上に流速20μL/分で流し、ビアコア X-100(GEヘルスケア社)でキネティクス解析を行 った。P4配列を1回繰り返したタグをもつ融合 タンパク質の結果を図20(a)に、P4配列を3回繰� ��返したタグをもつ融合タンパク質の結果を� ��20(b)に、P4配列を5回繰り返したタグをもつ� �合タンパク質の結果を図20(c)に、それぞれ示 す。P4配列を1回しか持たないもの(図20(a))はP2 0.1抗体に対して極めて弱い親和性しか持たな かったが、複数回重複させたものは最大結合 能で4倍以上の増大が見られた。P4×3(図20(b))� �対して、P4×5(図20(c))はさらなる結合能の増� �が見られ、この効果がP4配列(6残基)の繰り返 し回数に依存することが明らかとなった。

(7-2)サンドイッチELISA系の構築
7-2-1:P20.1抗体を検出抗体として用いる場合
 抗hGHモノクローナル抗体HGH-Bをマイクロタ� �タープレートに固相化し、ブロッキング後� �P4×1、P4×3、又はP4×5が結合しているhGH-γC-P4� ��合タンパク質(図3及び図4並びに配列番号15� �参照)を一過性発現した細胞の上清を種々の� ��釈率で加えて融合タンパク質を4℃で一晩キ ャプチャーさせた。洗浄後、ビオチン化した P20.1抗体(5μg/mL)を室温で30分反応させ、3回洗� ��後にペルオキシダーゼ標識ストレプトアビ� ��ン(Zymed)を加えてさらに室温で15分静置し、� ��ルオキシダーゼ基質(ABTS)を加えて405nmの吸� �度を測定した。結果を図21に示す。図21に示� ��たように、P4配列(6アミノ酸)1回だけでは1/3� ��釈以上の濃度の上清で弱いシグナルが認め� ��れるに留まったのに対し、P4×3(18アミノ酸)� ��はP4×5(30アミノ酸)の重複配列を融合したタ� ��パク質では1/30希釈以上の上清で濃度依存的 なシグナルが認められた。

7-2-2:P20.1抗体をキャプチャー抗体として用い� ��場合
 P20.1抗体を10μg/mLでマイクロタイタープレー トに固相化し、ブロッキング後7-2-1と同様にh GH-γC-P4融合タンパク質をキャプチャーした。 検出にはBAS配列に対するウサギ抗血清(1:100希 釈)とペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG二次� �体とを用いた。結果を図22に示す。図22に示� ��たように、このケースでもP4配列を繰り返� �たタグ付加によって十分な検出感度が得ら� �た。

(7-3)P20.1抗体固定化ビーズを用いたタグペプ� �ド融合タンパク質のプルダウン効率
 P4×1、P4×3、又はP4×5をもつ3種類のhGH-γC-P4� �合タンパク質をHEK293T細胞で発現させ、その� ��清の該融合タンパク質濃度をサンドイッチE LISA(P20.1抗体への反応性に依存しない、hGH抗� �キャプチャー+抗BAS血清検出システムを使用) にて定量した(プルダウン前)。さらに、この� ��清1mLに対して20μLのP20.1抗体-セファロース(� ��ーズ状)を加えて4℃、1時間反応させた。遠� ��によりビーズを沈降させ、上清中のhGH-γC-P4 融合タンパク質をサンドイッチELISA(P20.1抗体� ��の反応性に依存しない、hGH抗体キャプチャ� ��+抗BAS血清検出システムを使用)にて定量し� �(プルダウン後)。標準物は別にNi-NTAアガロー スにて精製したものを使用し、検量線を書い てP20.1抗体プルダウン前後の融合タンパク質� ��度を見積もった。結果を表4に示す。表4か� �明らかなように、P4配列の3~5回の繰り返しに よって80%程度の結合効率が得られることがわ かった。

〔8〕P20.1抗体固定化ビーズを用いたP4重複配� ��タグ付きタンパク質の精製
(8-1)溶出条件
 P4×3タグ付きhGH融合タンパク質を発現する� �胞の培養上清8mLに、100μLのP20.1抗体-セファ� �ース(0.2mg P20.1抗体相当、ビーズ状)を混和し 、4℃で3時間反応させた。反応後のビーズを3 mLのTris-buffered saline (TBS、20mM Tris-HCl、150mM N aCl、pH 7.5)で洗浄した後、以下に示すような� ��離液を300μL加え、室温で10分混和した。溶� �物を濃縮後、それぞれの等量をSDSゲル電気� �動で分析した。比較のためにNi-NTAビーズと� �結合を同じ条件で行い、イミダゾールで溶� �したものも同時に分析した。

番号 溶離液
(1)0.1mg/mL P4(C8)ペプチド in TBS
(2)1mg/mL P4(C8) ペプチド in TBS
(3)0.1M グリシン-塩酸、pH2.2
(4)50mM トリエタノールアミン(in TBS)、pH11.5
(5)2M ヨウ化カリウム(in TBS)
(6)40%(v/v)プロピレングリコール+1M 塩化ナト� �ウムin TBS
(7)40%(v/v)プロピレングリコール+1M ヨウ化カ� �ウムin TBS
(8)TBS

 結果を図23(a)に示す。なお、上記番号は� �図23(a)のレーン番号である。また、NiはNi-NTA� ��ーズからの溶出物である。図23(a)に示した� �うに、結合したタグ付き融合タンパク質は0. 1mg/mL以上のペプチド濃度で溶出するだけでな く、プロピレングリコールと塩化ナトリウム との組み合わせによっても完全に溶出した。 モノクローナル抗体を用いたアフィニティー クロマトグラフィーでしばしば用いられるい くつかの溶離条件(pH2.2の酸性条件、高濃度の 沃化物イオンのようなカオトロピックイオン )では全く溶出せず、pH11.5の塩基性条件での� �出も部分的であった。従って、タグペプチ� �が結合した融合タンパク質は、穏やかな条� �で溶出することが分かった。また、Ni-NTAビ� �ズからの溶出物(右端のレーンNi)と比べると� ��P20.1抗体ビーズからの溶出物には不純物が� �切なく、1段階で極めて高純度の精製が達成� ��れていることがわかった。

 さらに、以下の溶離液を用いて同様の実験� ��行った。
番号 溶離液
(1)TBS
(2)0.5mg/mL P4(C8) ペプチド in TBS
(3)20%(v/v)プロピレングリコール in TBS
(4)30%(v/v)プロピレングリコール in TBS
(5)40%(v/v)プロピレングリコール in TBS
(6)60%(v/v)プロピレングリコール in TBS
(7)40%(v/v)エチレングリコール in TBS
(8)40%(v/v)DMSO in TBS
 結果を図23(b)に示す。なお、上記番号は、� �23(b)のレーン番号である。図23(b)に示した結� ��から、プロピレングリコールの濃度は40%以� ��が好ましく、また高濃度のNaClは必要ないこ とも明らかとなった。

(8-2)結晶化品質のF-spondin組換えタンパク質の� ��製
 胎児期の脳における軸索ガイダンスをつか� ��どるタンパク質であるF-spondinをP4×3タグ配� �と融合し、P20.1抗体セファロースによる精製 を行った。発現コンストラクトは、マウスナ イトジェン(nidogen)のシグナル配列にP4×3配列( 18残基)をつなぎ、TEVプロテアーゼ切断配列(7� ��基)をはさんでF-spondinのN末端ドメイン146ア� �ノ酸部分を融合した。作製したF-spondin組換� �タンパク質をコードするDNA配列6045塩基中の� ��901~1560番目の塩基配列を配列番号16及び図24� ��示す。配列番号16及び図24においては、1~900� ��び1561~6045番目の塩基配列は省略されている� ��また、配列番号16のDNA配列がコードする組� �えタンパク質のアミノ酸配列を配列番号16及 び17並びに図24に、それぞれ示す。なお、F-spo ndinをコードするDNA塩基配列は、例えば、Miyam oto et al. Arch. Biochem. Biophys. 390(1), 93-100, 2 001等に記載されている。

 上記のコンストラクトを用いてHEK293T細胞 によるタグペプチド/F-spondin融合タンパク質� �一過性発現を行い、1週間後に400mLの培養上� �を得た。これを2mLのP20.1抗体-セファロース� �吸着させ、TBSで洗浄したのち、40%プロピレ� �グリコール及び1M NaClを含む緩衝液で溶出さ せ、SDSゲル電気泳動に供した。結果を図25に� ��す。図25において、レーン1:マーカー、レー ン2:発現培養上清、レーン3及び4:洗浄分画、� ��ーン5~8:溶出分画である。図25から明らかな� ��うに、P20.1抗体-セファロースに吸着させ、4 0%プロピレングリコール及び1M NaClを含む緩� �液で溶出させることにより、タグペプチド/F -spondin融合タンパク質のみが特異的に溶出し� ��。

 精製したF-spondinタンパク質を濃縮後に結� ��化スクリーニングにかけたところ、0.1M Tris  pH8.5、0.2M trimethylamine n-oxide dihydrate、20% PE G2000という条件で良好な単結晶が得られた。� ��26に精製F-spondinの結晶の拡大写真を示す。� �れを用いて高エネルギー研究所のビームラ� �ンAR-NW12AにてX線結晶回折実験を行い、1.85Å� ��解能のデータを取得した。図27に示すよう� �、極めて明瞭な電子密度マップが得られ、� �常1日~数週間かかるモデル構築はわずか1時� �で終了した。未知であったF-spondinのN末端ド� ��インの立体構造が明らかになったとともに� ��P20.1抗体とP4×3タグの組み合わせを用いた高 品質タンパク質精製が非常に優れたものであ ることを証明した。

(8-3)巨大タンパク質リーリンの精製
 リーリンはほ乳類の脳の発生に必須な巨大� ��胞外タンパク質であり、分子量400kDa以上と� ��う巨大さと不安定さの故にこれまで世界的� ��も精製に成功した例はない。このリーリン� ��N末端にP4×3タグを融合した発現コンストラ� ��トを作製した。図28に、リーリンのN末端に( P4配列×3)タグを融合した発現コンストラクト を示す。

 図28のコンストラクトを用いてHEK923T細胞� ��よってタグペプチド/リーリン融合タンパク 質の一過性発現を行い、800mLの培養上清を得� ��。F-spondinのときと同様にP20.1抗体-セファロ� ��スを用いて精製し、最終的に約30μgのタン� �ク質を得た。得られたタンパク質をSDSゲル� �気泳動及びウェスタンブロッティングによ� �分析した結果を図29に示す。図29中、Rは還元 条件を表し、NRは非還元条件を表す。図29か� �明らかなように、SDSゲル電気泳動において� �非還元条件では分子量1000万以上の巨大な多� ��体として存在することが確認され、還元条� ��下では430及び330kDaの主要なバンドと170kDa以� ��のいくつかのフラグメントが観察された。� ��リーリン抗体とP20.1抗体とを用いたウェス� �ンブロッティングの結果、これらは全て全� �リーリン、あるいはその部分分解フラグメ� �トであることが示され、95%以上の純度をも� �組換えリーリンタンパク質を1段階で精製で� ��ることがわかった。

〔9〕YPGQ(配列番号18)の4残基を繰り返したタ� �配列の有効性
(9-1)タグペプチド/フィブロネクチン融合タン パク質の作製
 P20.1抗体による認識の最小単位であるYPGQ(配 列番号18)の4残基を繰り返したタグ配列を付� �したタグペプチド/フィブロネクチン融合タ� ��パク質を作製した。具体的には、図30に示� �ように、コンストラクトをHis-X(n)-Fn(ただしn� ��繰り返しの回数)と命名し、繰り返し回数1~5 回の種類のコンストラクトを作製した。これ らのコンストラクトを大腸菌BL21(DE3)株に形質 転換し、定法に従って発現誘導を行った。生 成したタグペプチド/フィブロネクチン融合� �ンパク質をNi-NTAアガロースを用いて精製し� �。図31に精製したタンパク質の電気泳動像を 示す。

(9-2)表面プラズモン共鳴によるキネティクス� ��析
 9-1により得られたYPGQ(配列番号18)の4残基配� ��を1,2,3,4,5回繰り返した重複配列タグ(X(1)、X( 2)、X(3)、X(4)及びX(5)と呼ぶ)をもつタグペプチ ド/フィブロネクチン融合タンパク質を、P20.1 抗体を固定化したセンサーチップ上に流速20� �L/minで流し、ビアコア2000(GEヘルスケア社)で� ��ネティクス解析を行った。結果を図32に示� �。図32からわかるように、P4配列(6残基)を繰� ��返したときと同様に、4残基配列の繰り返し によっても結合能の増大が認められた。特に 、5回繰り返したX(5)タグにおいてはP4×3より� �高い親和性(解離定数10nM)を示すことが明ら� �となった。

〔10〕P20.1抗体-セファロースの繰り返し使用� ��影響
(10-1)タグペプチド/GFPuv融合タンパク質の作製
 蛍光タンパク質GFPuvのN末端にP4×3タグ配列� �付加したタグペプチド/GFPuv融合タンパク質� �発現コンストラクトを作製した(図33参照)。� ��ンサートはextension PCRにて調製し、発現ベ� �ターpET16b(Novagen)のNcoI-BamHIサイトに挿入した� ��このコンストラクトを大腸菌BL21(DE3)株に形� ��転換し、定法に従って発現誘導を行ったの� ��、大腸菌可溶化物を調製した。

(10-2)P20.1抗体-セファロースを用いたタグペプ チド/GFPuv融合タンパク質の繰り返し精製
 10-1で調製したタグペプチド/GFPuv融合タンパ ク質を含む大腸菌可溶化物0.25mLを、0.5mLのP20. 1抗体-セファロースにアプライし、4℃で20分� ��置した後、2mLのTris-buffered saline (TBS, 20mM T ris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5)で洗浄した。続いて� ��2.5mLの溶出液(40% (v/v) propylene glycol/TBS)で溶 出し、さらに5mLのTBSで洗浄した。この一連の 精製サイクルを、21回行った。それぞれの溶� ��画分に含まれるGFPuvの量を、励起波長390nm/� �光波長510nmの蛍光値を測定することで見積も った。

 結果を図34に示す。図34から明らかなよう に、結合して溶出されるタグペプチド/GFPuv融 合タンパク質の量は溶出/再生のサイクルで� �とんど変化せず、21回のサイクルの後でもそ の収量は最大でも10%程度低下したにすぎなか った。このことは、溶出の後になんらかの変 性条件でレジンを再生させる必要のある多く の市販のシステムに比べ、プロピレングリコ ールによる溶出を用いる本システムが、長期 /多数回使用を可能にする極めて経済的なも� �であることを示している。

 なお、本発明は上述した各実施形態及び� ��施例に限定されるものではなく、請求項に� ��した範囲で種々の変更が可能であり、異な� ��実施形態にそれぞれ開示された技術的手段� ��適宜組み合わせて得られる実施形態につい� ��も本発明の技術的範囲に含まれる。また、� ��明細書中に記載された学術文献及び特許文� ��の全てが、本明細書中において参考として� ��用される。