ZHANG XINKE (CN)
CHENG YANNA (CN)
TAN HAINING (CN)
LI YAN (CN)
CN1420783A | 2003-05-28 | |||
CN1266064A | 2000-09-13 |
LIANG, LIMIN ET AL.: "Constitutive Expression of Human Endostatin in Pichia Pastoris and Bioactivity Assay", PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY, vol. 12, no. 5, 2005, pages 294 - 297
济南圣达知识产权代理有限公司 (CN)
权利要求书 、 一种 Tat PTD-Endostatin重组蛋白, 其特征在于: 是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导 蛋白 Tat的蛋白转导域和人内皮抑素构成的融合蛋白, 其中, 人类免疫缺陷病毒的反式激 活转导蛋白 Tat的蛋白转导域的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1所示,人内皮抑素的氨基酸序 列如 SEQ ID N0.2所示。 、 一种表达 Tat-ES融合蛋白的 DNA序列,其特征在于:其具有 SEQ ID N0.3和 SEQ ID N0.4 所示的序列或编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。 、 一种采用酵母表达 Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法, 其特征在于: 步骤如下: ( 1 ) 常规方法制备含有编码 Tat PTD 的目的基因和编码 Endostatin 的目的基因的 Tat PTD-ES融合基因; (2)用限制性内切酶 Eco ? Not /分别酶切质粒 pGAPZoA和 Tat PTD-ES融合基因, 并分别回收酶切产物, 然后用 T4 DNA连接酶连接; (3 )上述连接产物转化大肠杆菌 JM109感受态细胞, 筛选阳性克隆并用 PCR及 DNA测 序分析鉴定重组质粒 pGAPZoA/Tat PTD-Endostatin,最终获得重组表达质粒 pGAPZoA/Tat PTD-Endostatin; (4)制备感受态的酵母菌 GS115, 重组表达质粒 pGAPZoA/Tat PTD-Endostati 单酶切线 性化后经电转化法导入感受态的 GS115菌中,在含 Zeocin的 LB平板上培养 2-3天筛选转 化子, 挑选阳性转化子单菌落进行菌落 PCR验证, 获得阳性转化子; ( 5 )上述阳性转化子发酵,分离纯化得到发酵产物,鉴定发酵产物,即为 Tat PTD-Endostatin 重组蛋白。 、 根据权利要求 3所述的方法, 其特征在于: 所述步骤(4) 中的酵母菌株为毕赤酵母或酿 酒酵母。 、 一种采用大肠杆菌表达 Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法, 其特征在于: 步骤如下: ( 1 ) 常规方法制备含有编码 Tat PTD的目的基因和编码 Endostatin的目的基因的 Tat-ES 融合基因, 并扩增; (2)用限制性内切酶 M e l、 BamH l分别酶切质粒 pET28a和 Tat PTD-ES融合基因, 并 分别回收酶切产物, 然后用 T4 DNA连接酶连接; (3 )连接产物转化大肠杆菌 JM109感受态细胞, 筛选阳性克隆并用 PCR及 DNA测序分 析鉴定重组质粒 pET28a/Tat PTD-Endostatin , 最终获得重组表达质粒 pET28a/Tat PTD-Endostatin; (4 )制备感受态的大肠杆菌 Rossetta感受态细胞, 将表达质粒热激法转化入 Rossetta感 受态细胞中, 在含卡那霉素的 LB平板上培养 16h, 筛选转化子, 挑选阳性转化子单菌落 进行菌落 PCR验证, 获得阳性转化子; (5)上述阳性转化子发酵,分离纯化得到发酵产物,鉴定发酵产物,即为 Tat PTD-Endostatin 重组蛋白。 、 根据权利要求 5所述的方法, 其特征在于: 所述步骤(5)具体如下: ①挑选阳性转化子, 过夜培养后, 按 1 : 100接入 LB培养基中, 震荡培养至 OD6()() 为 0.8-1.0, 加入 IPTG, 37°C, 200r/min, 诱导 6h, 收菌; ②将菌体破壁, 采用 SDS-PAGE对目的蛋白进行鉴定; ③包涵体复性: 菌体超声后离心得包涵体,采用稀释复性或透析复性或超滤复性法对包涵 体进行复性; ④分离纯化 Tat PTD-Endostatin融合蛋白: 将复性成功的蛋白质经亲和层析或离子交换层 析进行纯化, 除盐后得目的蛋白。 、 根据权利要求 6所述的方法, 其特征在于: 所述③中复性的具体方法如下: 菌体破壁后, 10000g离心 30min,弃去上清得到包涵体;采用含去污剂的尿素或盐酸胍溶液洗涤多次去 除粘附的杂蛋白; 采用变性液对包涵体进行溶解, 在室温搅拌 2h后, 10000g离心 30min, 上清为包涵体溶液; 然后, 将包涵体溶解的、 变性的无生物活性的蛋白质复性, 使其能够 折叠形成可溶的、 有生物活性的构象。 、 根据权利要求 6所述的方法, 其特征在于: 所述④中, 采用 G25-SephadeX、超滤或透析 的方法除盐。 、 权利要求 1所述的 Tat PTD-Endostatin融合蛋白在治疗癌症或新生血管生成引起的疾病中 的应用。 0、 根据权利要求 9所述的应用, 其特征在于: 所述新生血管生成引起的疾病为非小细胞肺 癌、 糖尿病引起的视网膜病变、 老年性黄斑盘状变性引起的脉络膜血管增生。 |
本发明提供了一种 Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用, 属于蛋白转导领 域。
背景技术
内皮抑素 (Endostatin, ES)是 1997年 O'Reilly等首次发现的一种内源性血管内皮细胞 增殖的强效抑制剂。研究发现, ES可特说异性抑制新生血管内皮细胞的生成, 并对多种起源的 新生血管内皮细胞生成有抑制作用, 且不影响静止的血管内皮细胞, 无耐药性, 毒副作用小。 我国已将血管内皮抑素衍生物研制成具有自主 知识产权的国家一类新药 Endostar (恩度,
书
YH16), 用以治疗非小细胞肺癌。此外研宄者们在 ES防治眼部新生血管性疾病方面也取得一 些可喜的成就。 但是 ES仍旧存在一些缺点, 由于其体内半衰期短, 入胞能力差, 临床上的 使用剂量较大, 增加了患者的经济负担。 如果能够通过一定的手段提高其稳定性、 延长其体 内半衰期、 并增加其入胞能力达到提高其体内活性从而减 少给药剂量或延长给药周期, 将会 大大提高 ES的治疗效果, 促进其在临床上的应用。
能够穿透细胞膜的 Tat蛋白可能帮助解决使药物透过眼球屏障进入 作用部位问题。 Tat蛋. 白来源于人类免疫缺陷病毒 HIV-1的反式激活因子, 1988年 Maurice和 Paul发现 Tat蛋白能 够跨膜递送入细胞, 1997年 Vives等证明 Tat蛋白中有一段富含碱性氨基酸、 带有正电荷的 多肽片段(Tat蛋白中 47-57位氨基酸序列片段) 与其转导功能密切相关, 并称之为 Tat蛋白 转导域 (PTD), 其序列是 YGRKKRRQRRR。 到目前为止研宄表明, Tat PTD能够运载蛋白 多肽、 外源基因、 脂质体、 无机分子等多种物质有效进入细胞内。 与其他运输载体相比, Tat PTD具有其优越性: (1 ) 转导效率不受连接物大小的限制, 且对其运输的 "货物分子"的活性 不产生影响; (2)在一定范围内不会造成细胞损伤, 不具有明显的免疫原性、 抗原性和致炎 性; (3) 能穿透血脑屏障, 有望解决大分子药物进入生物屏障结构发挥疗 效的问题。 此外, Tat PTD与大分子蛋白质相连以后,从结构上来看, 也可以理解为对大分子蛋白质进行了一定 的化学修饰, 延长了肽链, 有望增加蛋白质的稳定性, 延长生物半衰期, 也有利于提高其在 ' 治疗肿瘤等疾病的疗效。
本发明利用穿膜肽 Tat PTD的穿膜作用和内皮抑素的抑制新生血管的生 成作用, 将二者 通过基因工程的手段融合在一起, 以期获得能够穿透细胞膜甚至是血脑屏障或眼 球屏障的内 皮抑素, 达到通过简单的局部滴眼给药预防眼部血管增 生的目标。 这一研究对探索大分子蛋 白质眼部给药的新途径和视网膜脉络膜病变的 防治具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术, 本发明提供了一种 Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应 用。
本发明是通过以下技术方案实现的- 一种 Tat PTD-Endostatin重组蛋白, 是由人类免疫缺陷病毒 (HIV-1 ) 的反式激活转导蛋 白 Tat的蛋白转导域和人内皮抑素构成的融合蛋白 , 其中, 人类免疫缺陷病毒的反式激活转 导蛋白 Tat 的蛋白转导域 (Tat PTD ) 的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1 所示, 人内皮抑素 (Endostatin) 的氨基酸序列如 SEQ ID N0.2所示。
本发明还提供了能够表达 Tat PTD-ES融合蛋白的 DNA序列, 其具有 SEQ ID N0.3(Tat PTD)和 SEQ ID N0.4(Endostatin)所示的序列或编码相同蛋白质的 其具有遗传密码简并性的 序列。
所述 Tat PTD-Endostatin重组蛋白可以通过酵母或大肠杆菌 系表达, 方法如下: 采用酵母表达 Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法, 步骤如下:
( 1 ) 常规方法制备含有编码 Tat PTD 的目的基因和编码 Endostatin 的目的基因的 Tat PTD-ES融合基因, 并扩增;
( 2) 用限制性内切酶 Eco ? Not /分别酶切质粒 pGAPZoA和 Tat PTD-ES融合基因, 并分别回收酶切产物, 然后用 T4 DNA连接酶连接;
( 3 )上述连接产物转化大肠杆菌 JM109感受态细胞, 筛选阳性克隆并用 PCR及 DNA 测序分析鉴定重组质粒 pGAPZoA/Tat PTD-Endostatin, 最终获得重组表达质粒 pGAPZaA/Tat PTD-Endostatin;
(4)制备感受态的酵母菌 GS115 ,重组表达质粒 pGAPZoA/Tat PTD-Endostatin单酶切线 性化后经电转化法导入感受态的 GS115菌中,同时以不含 Tat PTD-Endostatin的 pGAPZoA电 转作对照, 在含 Zeociii的 LB平板上培养 2-3天筛选转化子, 挑选阳性转化子单菌落进行菌 落 PCR验证, 获得阳性转化子;
( 5 ) 上述阳性转化子发酵, 分离纯化得到发酵产物, 鉴定发酵产物, 即为 Tat PTD-Endostatin重组蛋白。
所述步骤(4) 中的酵母菌株为毕赤酵母或酿酒酵母。
采用大肠杆菌表达 Tat PTD-Endostatin重组蛋白的方法, 步骤如下:
( 1 ) 常规方法制备含有编码 Tat PTD 的目的基因和编码 Endostatin 的目的基因的 Tat PTD-ES融合基因, 并扩增;
(2) 用限制性内切酶 Nde I、 flwH /分别酶切质粒 pET28a和 Tat PTD-ES融合基因, 并分别回收酶切产物, 然后用 T4 DNA连接酶连接;
(3 )连接产物转化大肠杆菌 JM109感受态细胞, 筛选阳性克隆并用 PCR及 DNA测序 分析鉴定重组质粒 pET28a/Tat PTD-Endostatin , 最终获得重组表达质粒 pET28a/Tat PTD-Endostatin;
(4)制备感受态的大肠杆菌 Rossetta感受态细胞,将表达质粒热激法转化入 Rossetta感 受态细胞中, 在含卡那霉素 (5(^g/ml) 的 LB平板上培养 16h, 筛选转化子, 挑选阳性转化 子单菌落进行菌落 PCR验证, 获得阳性转化子;
( 5 ) 上述阳性转化子发酵, 分离纯化得到发酵产物, 鉴定发酵产物, 即为 Tat PTD-Endostatin重组蛋白。
所述步骤 (5) 具体如下:
① 挑选阳性转化子, 过夜培养后, 按 1 : 100 (体积比)接入 LB培养基中, 震荡培 养至 OD 600 为 0.8-1.0 (约 6h) , 加入 IPTG (加入后的浓度为 0.25mmol/L) , 37 °C , 200r/min, 诱导 6h, 收菌;
②将菌体超声破壁(或采用高压分散、酶裂解 法破碎细胞),采用 SDS-PAGE对目的蛋白 进行鉴定;
③包涵体复性: 菌体超声后离心得包涵体, 采用稀释复性或透析复性或超滤复性法对包 涵体进行复性;
④分离纯化 Tat PTD-Endostatin融合蛋白:将复性成功的蛋白质经 和层析或离子交换层 析进行纯化, 除盐后得纯度较高的目的蛋白。
所述③中复性的具体方法如下: 菌体破壁 (采用高压分散、 酶裂解法或超声波法破碎细 胞)后, 10000g离心 30min, 弃去上清得到包涵体; 采用含去污剂的尿素或盐酸胍溶液洗涤 多次去除粘附的杂蛋白 (去污剂溶液的浓度使其能够溶解干扰的细胞 蛋白质和膜成分而不溶 解包涵体); 然后采用变性液对包涵体进行溶解(包涵体在 变性条件下溶解), 在室温搅拌 2h 后, 10000g离心 30min, 上清为包涵体溶液; 然后, 将包涵体溶解的、 变性的无生物活性的 蛋白质复性, 使其能够折叠形成可溶的、 有生物活性的构象。
所述去污剂溶液为浓度不大于 2mol L的尿素或不大于 1.5M的盐酸胍, 去污剂溶液中含 有 Tritonx-100, 浓度为 0.5% (v/v)»
所述变性液为 5-7M浓度的盐酸胍或 6-8M浓度的尿素。 所述变性液对包涵体的溶解在还原条件下进行 。
所述还原条件是指使用还原试剂, 所使用的还原试剂为二硫苏糖醇 (DTT)或 β-巯基乙 醇。
所述复性是通过降低变性试剂的浓度 (通过缓慢地连续或逐步稀释溶解液来降低变 性试 剂的浓度)至无变性作用或弱变性作用的水平 来复性。
所述复性时, 复性缓冲液中含有至少一种还原和氧化形式的 硫醇成分, 硫醇成分为 GSH/GSSG。
所述④中, 复性成功后采用亲和层析或阳离子交换层析纯 化目的蛋白质。
亲和层析采用 Ni离子亲和层析, 缓冲液 pH5-ll。
阳离子交换层析采用 CM-Sepharose, SP-Sepharose, 缓冲液 pH7-9。
所述除盐为: 采用 G25-Sephadex, 超滤, 或透析的方法除盐。
本发明的 Tat PTD-Endostatin融合蛋白, 能够用于治疗新生血管生成引起的各种疾病, 包 括眼部血管增生性疾病及各种肿瘤, 如糖尿病引起的视网膜病变, 非小细胞肺癌等。
本发明采用酵母和大肠杆菌表达体系表达了 Tat PTD-ES融合蛋白, 采用 SDS-PAGE和 Western Blot进行产物鉴定, 并采用 Ni离子亲和层析分离纯化后得到了纯度比较高 Tat PTD-ES融合蛋白, 并通过 CCK-8法验证了其抑制人脐静脉内皮细胞(EAHY926 )增殖的活 性。
本发明的 Tat PTD-Endostatin融合蛋白,保留了内皮抑素抑制新 血管的生成作用, 具有 较强的穿过细胞膜的特性, 具有穿透体内生理屏障如血脑或眼球屏障的潜 力用, 具有转导效 率高、 易透过血脑屏障、 眼球屏障的优点, 克服了内皮抑素的穿膜效果差的局限性, 可发挥 更好的抑制新生血管细胞生成的作用, 可透过血脑屏障治疗脑部肿瘤, 或通过简单的局部滴 眼给药达到预防视网膜血管增生的目标。
附图说明
图 1为 Tat PTD-ES融合基因和 Endostatin基因的 PCR图谱, 其中泳道 1为 Endostatin的 PCR产物, 泳道 2、 3均为 Tat PTD-Endostain基因的 PCR产物, M为 DNA Marker I (600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp、 100bp)。
图 2 为 重 组质 粒 的 酶切 后 图 谱 , 其 中 泳道 Ml 为 DNA Marker M 1 (600bp,500bp,400bp,300bp,200bp, 1 OObp) , 泳道 1、 3均为 pGAPZaA/Tat PTD-Endostatin重 组质粒酶切后产物,泳道 23为 pGAPZoA/Endostatin重组质粒酶切后产物,泳道 M2为 lkb DNA Ladder(10000bp8000bp、 7000bp、 6000bp、 5000bp 4000bp、 3000bp、 2000bp、 lOOObp) 。 图 3为验证重组质粒时的 PCR图谱, 其中泳道 1以重组质粒 pGAPZoA/ Endostatin为模 板的 PCR产物,泳道 2、 3均为以重组质粒 pGAPZoA/Tat PTD-Endostatin为模板的 PCR产物, 泳道 M为 DNA Marker I (600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp、 lOObp) 。
图 4为重组质粒 pGAPZoA/Tat PTD-Endostatin的测序结果。
图 5为发酵液上清的 SDS-PAGE电泳图谱, 其中泳道 1为蛋白质 Marker(94.0KDa、 66.2 KDa、 45.0 KDa、 33.0 KDa、 26.0 KDa、 20.0 KDa、 14.4 KDa)、 2为毕赤酵母菌含空质粒发酵 液的上清液, 3、 4为表达 Tat PTD-ES的阳性毕赤酵母菌发酵的上清液, 5为表达 Endostatin 的阳性毕赤酵母菌发酵的上清液。
图 6为重组质粒 pET28a/Tat PTD-ES的测序结果。
图 Ί为大肠杆菌超声破壁后的 SDS-PAGE结果, 其中泳道 1为 Es包涵体; 2、 3. Tat PTD-ES包涵体; 4.空质粒; 5.空菌株; 6.Marker; 7.空质粒上清; 8.Tat PTD-ES上清; 9.Es 上清。
图 8为大肠杆菌包涵体经复性分离纯化后所得样 的 SDS-PAGE电泳图谱,其中泳道 1, 泳道 2为蛋白质 Marker, 泳道 3为经分离纯化后的样品。
图 9为纯化后的重组蛋白对 EAHY926细胞增殖的抑制作用。
图 10为纯化后的重组蛋白对鸡胚尿囊膜血管生成 制作用的影响, A为生理盐水组; B 为阴性对照; C为 Tat PTD-ES组; D为 ES组。
图 11为纯化后的重组蛋白入胞能力的考察, 其中, A为 ES, B为 Tat PTD-ES。
具体实施方式
下面以具体实施例方式对本发明作进一步描述 , 实施例中的实验方法, 如无特别说明, 均为常规方法。
实施例 1 采用 表达体系表达 Tat PTD-ES融合蛋白
a. Tat PTD-ES融合基因的扩增: 将编码 Tat-PTDl l个氨基酸的 33个密码及选定的酶切位点
(EcoR I )设计到上游引物的 5'端, 用 PCR技术从含有 Endostatin的 pGAPZ a A质粒(本 发明人的实验室拥有, 常规方法构建得到的) 中扩增 Tat PTD-ES融合基因, 扩增得到的 融合基因片段为 600左右, 其 PCR结果见图 1。
b. 构建含有 Tat PTD-ES融合基因的表达质粒:
©pGAPZ Q A酵母表达质粒的扩增、 提取: DH5a常规活化后制备感受态, 取 pGAPZ a A 质粒 DNA热激法转化 DH5a, 转化后将菌液涂布于含 Zeocin (25 g/ml) 的低盐 LB平板中, 次日挑取单菌落, 扩增, 并用试剂盒抽提质粒。 ② Tat PTD-ES 基因的亚克隆: EcoR l、 Not I双酶切含 Tat PTD-ES 基因融合基因及 pGAPZ a A空质粒,琼脂糖凝胶电泳后回收 Tat PTD-ES融合基因与 3kb的 pGAPZ a A质粒,加 入 T4连接酶 buffer,室温连接过夜。次日取连接产物转化 DH5a,并涂布于含 Zeocin (25 g/ml ) 的低盐 LB平板中。 同时转化不含 Tat PTD-ES基因的 pGAPZaA作为空白对照。
③ Tat PTD-ES亚克隆的筛选及鉴定: 从 Zeocin低盐 LB平板中挑选单克隆, 接种于含 Zeocin的低盐 LB培养基中, 37Ό避光培养, 抽提质粒 DNA, 分别以酶切、 PCR法筛选含有 Tat PTD-ES的重组表达载体工程菌。 酶切结果见图 2, PCR结果见图 3, 筛选的阳性克隆质 粒由大连宝生物公司测序, 测序结果见图 4, 结果表明序列正确。
c Tat PTD-ES蛋白的表达:
①电转化实验: 制备感受态的毕赤酵母菌 GS115, 重组酵母表达质粒 pGAPZ a A单酶切 线性化后经电转化法导入感受态的 GS115菌中, 同时以不含 Tat PTD-ES的 pGAPZ a A电转作 对照。将电转后的 GS115菌株涂布于含 Zeocin ( ΙΟΟμ^πιΙ)的 YPDS平板中, 在 30'C培养箱 中培养 2-3天至长出白色单菌落,从含 Zeocin的 LB平板上挑取单菌落至 2mlYPD培养基中, 30°C摇床中振荡培养至对数生长期, -80°C冻存。
② PCR及 SDS-PAGE筛选阳性表达菌: 电转后的单克隆冻存菌 ΙΟμΙ经过过夜活化后, 以 1: 100接种于 lOOmlYPD培养液中, 30Ό振荡培养, 培养至第 4天时, 取发酵液, 分别进行 PCR及 SDS-PAGE验证, SDS-PAGE结果见图 5, 由结果可得筛选的阳性菌落能表达 Tat PTD-ES融合蛋白, 其分子量在 20KD左右。
d. Tat PTD-ES融合蛋白的分离纯化
取第四天的重组毕赤酵母菌发酵液高速离心( 8000r/min, 20min), 取上清液采用镍离子 亲和层析和 Sephade X G25从毕赤酵母表达上清液中分离纯化 Tat PTD-ES融合蛋白,纯化后的 样品经 SDS-PAGE验证, 表明采用镍离子亲和层析和 SephadexG25可以将 Tat PTD-ES融合 蛋白从发酵液中分离出来。
实施例 2 采用大肠杆菌表达 Tat PTD-ES融合蛋白
a. 双酶切融合基因及空质粒: 采用 Nde I、 BamH I对 Tat PTD-ES融合基因(常规方法构建 得到) 及选用的大肠表达的 pET28a进行双酶切, 并分别进行片段回收。
b. 融合基因与质粒的连接: 在连接体系中将回收的目的基因与质粒混匀, 4'C孵育过夜, 连 接产物用于下一步转化。
c 重组质粒的转化: E.coli JM109感受态细胞 200μ1加入上述连接反应液, 混匀, 冰浴
30min, 42°C热激 90s, 冰浴 2min, 加入 0.8ml LB培养基, 37°C孵育 lh, 将孵育液涂 布于 LK平板上, 37°C培养 12~16h。
d. 阳性重组子的鉴定: 随机挑选数个具有 Kan抗性的转化子菌落, 经 LB液体培养基培 养、 小量扩增后, 抽提重组质粒为模板, 进行 PCR验证, 并进行测序, 测序结果见图 6, 结果表明序列正确。
e. 重组质粒转入工程菌株中:将测序正确的重组 质粒,釆用热激法转入 i? 0 ^ e tta菌株中,涂 布 LB平板 (Kan 50 g ml), 平板于 37'C培养 16-24 h;
f. 待平板上长出菌落后进行阳性转化子的筛选鉴 定。
g. 挑选阳性转化子, 过夜培养后, 按 1:100接入 LB培养基中, 震荡培养至 OD 6 。。 约为 0·8-1·0(约 6h), 加入 IPTG (加入后的浓度为 0.25mmol/L) , 37°C , 200r/min, 诱导 6h, 收菌。
h. 将菌体超声破壁后, 采用 SDS-PAGE和 Western Blot对目的蛋白进行鉴定。
实施例 3 大肠杆菌表达的包涵体蛋白复性的工艺流程
a. 包涵体溶解: 菌体破壁超声后, 10000g离心 30min, 弃去上清得到包涵体; 采用含去污剂 的尿素或盐酸胍溶液洗涤多次以去除粘附的杂 蛋白; 然后采用变性液对包涵体进行溶解, 在室温搅拌 2h后, 10000g离心 30min,上清为包涵体溶液。去污剂溶液为浓度 2mol L的 尿素, 去污剂溶液中还含有 Triton x-100, 浓度为 0.5%(v/v)。 变性液含有 20-100mmol/L Tris/HCK 8mol/L尿素、 5mmol/L EDTA及 10nunol/LDTT。 SDS-PAGE结果如图 7所示。 b. 蛋白复性: 复性缓冲液经过滤后, 将包涵体裂解液在搅拌得同时缓慢滴入复性缓 冲液中, 复性体系的蛋白终浓度为 0.01-0.2mg/ml,然后将混合物置于 4'C下复性 10-50h。复性缓冲 液为: pH7.0-9.0, 20-100mmol/Ltris/HCK 2mol/L尿素、 5mmol/LEDTA、 lramol/LGSSG> 0.2mmol/L GSH。
c 分离纯化 Tat PTD-ES融合蛋白: 将复性成功的蛋白质经 Ni离子交换层析进行纯化, 除 盐后得纯度较高的目的蛋白, 如图 8所示。
实施例 4 Tat PTD-ES融合蛋白的生物活性研宄
考察 Tat PTD-ES抑制内皮细胞的活性: 以 Es为阴性对照, 采用 CCK-8法考察纯化后的 Tat PTD-ES抑制血管内皮细胞的活性, 具体实施步骤如下:
将人脐静脉内皮细胞(EAHY926)的冻存液在 37 °C水浴锅内快速融化, lOOO r/min离心 15 min, 弃上清, 沉淀细胞用培养液重悬并轻轻吹打混匀, 形成细胞悬液, 于细胞计数板上 进行细胞计数, 然后接种于培养瓶中, 置于 C0 2 恒温培养箱 (5% C0 2 , 37 °C ) 培养 24 h, 换液,以后每 2~3天换液一次。待细胞长至融合状态时,细胞 用 PBS清洗两遍,然后加入 0.25% 胰蛋白酶 l~2 mL, 在倒置显微镜下观察, 待细胞间隙增大, 细胞回缩变圆时, 立即将胰蛋白 酶吸出或倒掉,加入含 15%小牛血清的培养液终止消化,用弯头吸管反 复吹打瓶壁上的细胞, 使大部分细胞脱落形成细胞悬液, 于倒置显微镜下计数, 然后以 10 5 /mL密度接种于新的培 养瓶中, 恒温培养箱继续培养。
采用 CCK-8法测定纯化后 ES抑制血管内皮细胞的活性。 收集对数期细胞, 调整细胞悬 液浓度为 Ι.ΟχΙΟ 4 /孔, 分于 96孔板, 每孔 200 μί, 置于 37 °C、 5%C0 2 的 C0 2 恒温培养箱中 培养使细胞贴壁; 加入药物 (纯化后的 Tat PTD-ES设 6个浓度梯度: 5 g/mL、 20 g/mL、 75 g/mL、 100 μ§ /πΛ、 200 ^mh, 用培养基稀释,每个浓度设 5个平行孔), 继续培养 48 h; 小心吸取上清, PBS洗涤, 再次离心, 弃上清,加入 200μί新鲜培养基; 每孔加入 CCK-8溶 液 10μί, 37 °C继续培养 2 h后终止培养, 用酶联免疫检测仪于波长 490 nm处测定各孔吸光 度 (A 49G ) 值, 并计算其抑制率: 抑制率 =[1- (实验组 A49Q /对照组 A49Q ) ]><100%。 重复实验 五次, 取平均值。
不同浓度纯化后的 Tat PTD-ES对 HUVEC内皮细胞增殖的抑制作用见图 9, 结果显示纯 化后的 Tat PTD-ES融合蛋白对 HUVEC有明显的抑制作用, 随着浓度的增大抑制作用增强, 具有浓度依赖性,当浓度增大到 200 g/mL时, 内皮细胞大部分被抑制,抑制率达到 86.45%。
实施例 5 Tat PTD-ES鸡胚绒毛尿囊膜血管 (CAM)生成的作用
a. 孵育 CAM的方法, 方法如下: 选择来源于受精率大于 90%的种鸡厂、 生长良好的白 皮种蛋(表面清洁光滑、 蛋壳均匀、 蛋形规范、 气孔气室均匀), 用温水清洗 3次后, 在 1 ο 的苯扎溴酚溶液中浸泡 lmin消毒后置于隔热式电热恒温培养箱中培养 温度 (37 ± 1 ) V, 培养箱内放入水盘以保持 40%~60%相对空气湿度, 并保持一定的通风换气条件。鸡蛋气室向 上, 长轴与蛋托约呈 70°-80°角。 每天转蛋 3次, 转蛋角度以水平位置前俯后仰各 45°为宜。 鸡胚孵育 3天后, 用照蛋灯照蛋, 挑选出发育良好的鸡胚。 将其移至超净台内, 用 75%酒精 消毒后晾干。 用牙科钻或砂轮在蛋壳表面划刻出凹痕, 用尖针在种蛋气室表面扎一小孔, 在 凹痕处滴少量生理盐水, 用吸耳球对准气室表面的小孔轻轻吸气, 此时可看到凹陷处的生理 盐水下陷, 即该处 CAM下陷, 形成假气室(区别于蛋自身的气室)。 用灭菌透明胶带封闭假 气室, 制备假气室后稳定 48 h。
b. 给药方法: 将鸡胚按重量随机分组, 生理盐水组, 阴性对照组: bFGF 20 nL (50AU) /只 Es组: Es (5(^g/mL)100 μL+ bFGF 20 (50 AU) /只; Tat PTD-ES(50 g mL) + bFGF 20 |iL ( 50 AU) /只。 将稳定 48 h的种蛋假气室上的透明胶带揭开, 按上述剂量将供试液直接加到 鸡胚绒毛尿囊膜上, 注意小心加药, 尽量使药物集中于一点上。加药后用无菌透明 胶带封口, 标记后放入温度(37 ± 1 ) Ό的培养箱中, 保持 40%-60%的相对空气湿度, 继续培养 48 h后 观察结果。
Tat PTD-ES鸡胚绒毛尿囊膜血管 (CAM) 生成的作用结果见图 10, 与阴性对照组相比, Tat PTD-ES组的血管数目明显小于阴性对照组,表明 Tat PTD-ES能明显抑制 CAM血管的生 成, 且与 Es没有显著性差异。
实施例 6 荧光显微镜考察重组蛋白进入细胞的能力
将 EAHY926内皮细胞接种于 12孔板中 (lxl0 4 ceUs/well), 加入无血清 DMEM培养基(内 含 FITC-Es、 FITC-Tat PTD-ES,各用药组按照蛋白浓度 100 protein/mL) lmL。 置于 37°C 二氧化碳培养箱中孵育, 孵育 2 h后用冰冻的 PBS漂洗 3次, 荧光显微镜观察 Tat PTD-ES及 ES的入胞情况。
Tat PTD-ES的入胞结果见图 11, 由结果可得, Tat PTD-ES进入细胞的能力较好, 具有能 够穿透生理屏障的潜力。
上述活性实验研究证明本发明表达的 Tat PTD-ES融合蛋白保留了 Endostatin的抑制血管 内皮细胞增殖的作用, 有望用于治疗由新生血管生成引起的各种疾病 , 包括眼部血管增生性 疾病及各种肿瘤, 如糖尿病引起的视网膜病变, 非小细胞肺癌等, 甚至有望比 Endostatin更 好的发挥疗效。
Next Patent: SINGLE-USE BAG-INFUSING DRINK PARTICLE