en tant qu'outil de diagnostic in vivo des tumeurs cancéreuses

La présente invention concerne des dérivés radio-pharmaceutiques constitués de polyamines conjuguées avec l'HYNIC (hydrazinonicotinamide) pouvant complexer le Technétium 99m, leur procédé de préparation et leur utilisation sous forme d'agents d'imagerie permettant de mettre en évidence le système de transport des polyamines dans les cellules cancéreuses pour permettre la sélection des patients porteurs de telles tumeurs en vue d'adapter leur traitement.

Les possibilités devenues incontournables offertes par les applications des traceurs et de la radioactivité en milieu biologique et en médecine ont été l'un des facteurs essentiels du progrès médical au cours du XXe siècle. Les techniques utilisant la radioactivité élargissent les possibilités de diagnostic pour détecter et mieux guérir les maladies : c'est la médecine nucléaire. Au lieu de faire passer les rayonnements à travers l'ensemble du corps comme dans la radiographie, on introduit dans l'organisme une petite quantité de molécules marquées par un radio-isotope émetteur de rayonnement gamma. Ce traceur reconnaîtra certaines cibles d'intérêt qui seront détectées ensuite par une γ-caméra.

Le cancer est encore une des principales causes de mortalité du monde occidental. Les moyens de lutte que sont la prévention, la chirurgie, la radiothérapie, l'immunothérapie et la chimiothérapie ne permettent pas encore, dans de nombreux cas, d'éradiquer la maladie. Les raisons de cet échec reposent en partie sur la difficulté d'identifier la cellule tumorale et de la traiter sélectivement sans trop endommager les tissus sains.

L'imagerie par scintigraphie in vivo est un outil permettant d'identifier les tissus tumoraux par rapport aux tissus sains. Cette approche de marquage par radioactivité est capable de détecter des tumeurs de taille extrêmement petite. Elle est basée sur l'obtention d'une cartographie in vivo issue de la détection externe du rayonnement gamma émis par les radio-isotopes au cours de leur désintégration au sein des tissus en donnant une image en 3D.

Le radio-isotope idéal pour l'imagerie TEMP (Tomogra phie d'Emission MonoPhotonique) est le ^99m Tc, en raison de son faible coût pa r dose et de sa disponibilité au moyen de systèmes générateurs disponibles dans les milieux hospitaliers. Plus de 80 % de toutes les études d'imagerie en médecine nucléaire de diagnostic da ns le monde sont effectuées en utilisant ce radio-isotope ( ^99m Tc). Cet élément radioactif émet un rayonnement γ particulièrement bien ada pté à l'imagerie médicale et à son utilisation extensive pour le diagnostic médica l. Le rayonnement γ émis par l'isotope est détecté in vivo à l'aide d'une gamma-caméra pour former des images scintigraphiques.

Le Technétium 99m est particulièrement intéressant pour les applications médicales : la radiation émise par désintégration de cet isotope a la même longueur d'onde que les rayons X utilisés en radiographie classique, ce qui lui confère une longueur de pénétration adaptée tout en ca usant des dégâts minimes pour un photon ga m ma . De p l us, la demi-vie très courte de cet isotope conjuguée à la demi-vie relativement longue de l'isotope fils Tc-99 lui permet d'être éliminé du corps avant de se désintégrer à nouveau. Sa demi-vie est de 6 heures, ce qui donne suffisamment de temps pour l'acquisition des images et permet une élimination rapide de la radioactivité. Ceci permet de réa liser un diagnostic nucléaire au prix de l'introduction d'une dose relativement faible de radiation dans l'organisme.

De plus, il est facilement disponible dans les hôpitaux grâce à un générateur de technétium. Le générateur contient du molybdène 99 radioactif, attaché (absorbé) sur une colonne d'alumine. Le molybdène se désintègre pour donner du ^99m Tc, qui est récupéré par rinçage de la colonne dans une solution physiologique sous la forme de pertechnétate de sodium (Na ⁺ Tc0 ₄ ^~ ).

Le Technétium 99m peut être utilisé sous une forme moléculaire simple ( ^99m Tc- Pertechnétate) mais est plus fréquemment associé à des molécules leur conférant des propriétés particulières. Par exemple, le Technétium 99m com plexé à de l'acide diéthylènetriaminepentacétique ( ^99m Tc-DTPA) éliminé exclusivement par filtration glomérulaire est un bon marqueur de la fonction rénale. Le Technétium 99m lié au méthyldiphosphonate ( ^99m Tc-MDP) a une affinité particulière pour le tissu osseux. Ce composé radio-pharmaceutique est utilisé pour déceler des zones d'activité ostéoblastique. L'intensité du rayonnement permet alors de déterminer la concentration en composé radio-pharmaceutique dans le liquide bio logiq ue ou l'organe étudié.

Parmi les composés complexés au Technétium 99m, on peut citer également l'H.M.P.A.O. (hexa-méthyl-propylène-amine-oxime) qui sert à étudier les accidents vasculaires cérébraux, l'épilepsie partielle, certains états démentiels et la souffrance cérébrale de l'enfant ; le sesta-M.I.B.I. (méthoxy-iso-butyl-isonitrile) utilisé pour le diagnostic de l'ischémie myocardique (arrêt ou insuffisance de l'apport de sang et d'oxygène au cœur). Le Technétium 99m peut également se complexer avec les globules rouges permettant d'étudier la contraction des ventricules cardiaques, ainsi qu'avec les microparticules d'albumine, qui servent à étudier la vascularisation des poumons, en particulier dans le diagnostic des embolies. On peut citer également le D M SA ( a c i d e d i-mercaptosuccinique) ; le DTPA (acide diéthylène-triamino- pentacétique) ou le M. A. G.3 (mercapto-acétyl-tri-glycine) utilisés pour l'évaluation fonctionnelle séparée de chaque rein dans de nombreuses pathologies rénales, le bilan préchirurgical de l'ablation d'un rein et l'exploration des malformations rénales congénitales ; l'IDA (acide imino-diacétique) qui sert à visualiser les voies biliaires en chirurgie digestive ; les colloïdes marqués pour l'étude des voies et ganglions lymphatiques et le repérage du ganglion sentinelle (premier ganglion touché par l'extension tumorale). Enfin, des aliments marqués au Technétium 99m servent à explorer le transit digestif (œsophage, estomac, voire intestin grêle et côlon).

Le Technétium 99m est aussi souvent utilisé dans les scintigraphies en double marquage, qui permettent, par soustraction d'image, d'étudier un organe n'ayant pas de traceur spécifique. Ainsi, les glandes parathyroïdes sont visualisées en comparant les images obtenues en utilisant du thallium 201, qui se fixe sur la thyroïde et les parathyroïdes, à celles obtenues en utilisant du Technétium 99m, qui ne se fixe que sur la thyroïde. Il existe toutefois toujours un besoin de déterminer la localisation précise et/ou la capacité de réponse d'une cellule à un agent cytotoxique particulier. Dans le cas présent, l'intérêt se porte sur les cellules tumorales ou tumeurs sur-exprimant le système de transport des polyamines (système PTS). Il n'existe en effet à ce jour pas de moyen pour déterminer rapidement et de manière non invasive si une tumeur va répondre ou non à un traitement ciblant le système PTS.

La présente invention se propose donc de résoudre ce problème.

La présente invention a ainsi pour premier objet des polyamines conjuguées à l'hydrazinonicotinamide ou polyamines HYNIC de formule (I) suivante :

dans laquelle :

- RI représente un atome d'hydrogène ou un groupement N-protecteur tel qu'un groupe ferf-butyloxycarbonyle (fBuOCO) ou trifluoroacétyle (CF ₃ CO),

- R2 représente un atome d'hydrogène, un groupement Ci_ ₆ alkyle éventuellement fluoré ou perfluoré, ou un groupement amino-Ci_ ₆ alkyl,

- a, b et c représentent, indépendamment les uns des autres, un nombre entier de 2 à 5, et

- d et e représentent, indépendamment l'un de l'autre, 0, 1 ou 2, à la condition que d et e ne valent pas tous les deux simultanément 0,

ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celles-ci. Par « groupe protecteur » ou « groupe de protection », on entend désigner, au sens de la présente invention, un groupe qui bloque sélectivement un site réactif dans un com posé m ultifonctionnel de tel le sorte q u' une réaction chimique peut être effectuée sélectiveme nt a u nivea u d' u n a utre site réactif non protégé da ns la signification classiquement associée à celui-ci en chimie de synthèse.

Par « groupe N-protecteur », on entend, au sens de la présente invention, tout substituant qui protège le groupe NH ou NH ₂ contre les réactions indésirables tels que les groupes N-protecteur décrits dans Greene, « Protective G rou ps I n Orga nic synthesis », (John Wiley & Sons, New York (1981)) et Harrison et al. « Compendium of Synthetic Organic Methods », Vols. 1 à 8 (J. Wiley & sons, 1971 à 1996). Les groupes N- protecteurs comprennent les carbamates, les amides, les dérivés N-alkylés, les dérivés amino acétale, les dérivés N-benzylés, les dérivés imine, les dérivés énamine et les dérivés N-hétéroatome. En particulier, le groupe N-protecteur comprend le formyle, l'acétyle, le trifluoroacétyle, le benzoyle, le pivaloyle, le phénylsulfonyle, le benzyle (Bn), le t-butyloxycarbonyle (BOC), le benzyloxycarbonyle (Z), le p-méthoxy benzyloxycarbonyle, le p-nitrobenzyl-oxycarbonyle, le trichloroéthoxycarbonyle (TROC), l'allyloxycarbonyle (Alloc), le 9-fluorénylméthyloxyca rbonyle (Fmoc), le trifluoro-acétyle, les carbamates de benzyle (substitués ou non) et similaires. Il pourra s'agir notamment d'un groupe BOC, Z ou trifluoroacétyle (CF ₃ CO).

Par groupement « Ci- ₆ alkyle », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée saturée, linéaire ou ramifiée, comportant 1 à 6, de préférence 1 à 4, atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec-butyle, ferf-butyle, pentyle ou encore hexyle.

Un groupe « Ci- ₆ alkyle fluoré » est un groupe Ci- ₆ alkyle tel que défini ci-dessus pour lequel un ou plusieurs atomes d'hydrogène sont rem placés pa r un atome de fluor.

Un groupe « Ci- ₆ alkyle perfluoré » est un groupe Ci- ₆ alkyle tel que défini ci- dessus pour lequel tous les atomes d'hydrogène sont remplacés par un atome de fluor.

Par groupement « amino-Ci- ₆ alkyl », o n e nte nd, a u se n s de l a p rése nte invention, un groupe NH ₂ -Ci- ₆ alkyle- avec le groupe Ci- ₆ alkyle tel que défini précédemment. Dans la présente invention, on entend désigner par « pharmaceutiquement acceptable » ce qui est utile dans la préparation d'une composition destinée à être administrée à un animal, tel qu'un mammifère, y compris l'homme, qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire, de même que pharmaceutique ou diagnostique humaine.

On entend désigner par « sels pharmaceutiquement acceptables » d'un composé, des sels qui sont pharmaceutiquement acceptables, comme défini ici, et qui possèdent l'activité pharmacologique ou diagnostique souhaitée du composé parent. De tels sels comprennent :

(1) les hydrates et les solvates,

(2) les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptable formés avec des acides inorganiques ou organiques pharmaceutiquement acceptables tels que l'acide chlorhydrique ou l'acide bromhydrique, ou

(3) les sels d'addition de base pharmaceutiquement acceptable formés lorsqu'un proton acide présent dans le composé parent est soit remplacé par un ion métallique, par exemple un ion de métal alcalin, un ion de métal alcalino-terreux ou un ion d'aluminium ; soit coordonné avec une base organique ou inorganique pharmaceutiquement acceptable.

De préférence, il s'agira de sels d'addition d'acide, tel qu'un sel d'addition d'acide chlorhydrique.

Dans la définition de RI, le groupe N-protecteur sera plus particulièrement un groupe -protecteur clivable en milieu acide tel qu'un groupe BOC ou trifluoroacétyle (CF ₃ CO).

RI représentera plus particulièrement un atome d'hydrogène ou un groupement ferf-butyloxycarbonyle (fBuOCO) ou trifluoroacétyle (CF ₃ CO).

R2 représentera notamment un atome d'hydrogène ou un groupement Ci_ ₆ alkyle tel que méthyle. Plus particulièrement, a, b et c représenteront, indépendamment les uns des autres, 3 ou 4.

De préférence, d et e représentent 1 ou 2, et avantageusement 1.

Se lo n u n a utre mode de réa l isation de l'i nve ntion, e re prése nte 2 et d représente 0.

Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, e représentera [GSI]1, de préférence 1, et d représentera 0, 1 ou 2, de préférence 1 ou 2.

Il pourra s'agir plus particulièrement d'un composé de formule (I) pour lequel :

- RI = R2 = H, a = 4, d = 1 et e = 0,

- R1 = R2 = H, b = 3, c = 4, d = 0 et e = 1,

- RI = R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 1 et e = 1,

- RI = R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 2 et e = 1,

- RI = CF ₃ CO, R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 1 et e = 1,

- RI = fBuOCO, R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 1 et e = 1, ou

- R1 = H, R2 = CH ₃ , b = 3, c = 4, d = 0 et e = l,

ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.

Avantageusement il s'agira du composé de formule I pour lequel :

- RI = R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 1 et e = 1,

- RI = R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 2 et e = 1,

- RI = CF ₃ CO, R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 1 et e = 1, ou

- RI = fBuOCO, R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 1 et e = 1,

ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.

De tels com posés ne sont pas uti les en ta nt q ue tels mais permettent de complexer le technétium 99m avec d'autres ligands tels que la tricine. Le complexe ai nsi formé se ra utile com me radio-traceur pou r u ne uti lisation e n i magerie de scintigraphie pour mettre en évidence des tumeurs cancéreuses exprimant le système de transport des polyamines. La présente invention a donc pour deuxième objet un complexe de formule (II) suivante

dans laquelle le technétium (Te) est présent sous forme de son isotope 99m et R2, a, b, c, d et e sont tels que définis précédemment,

ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.

R2 représentera notamment un atome d'hydrogène ou un groupement Ci_ ₆ alkyle tel que méthyle.

Plus particulièrement, a, b et c représenteront, indépendamment les uns des autres, 3 ou 4.

De préférence, d et e représentent 1 ou 2, et avantageusement 1.

En effet, il est préférable que le motif polyamine des composés de la présente invention comporte au moins trois, et avantageusement trois, azotes basiques afin que les composés de formule (II) soient bien pris en charge par le système de transport des polyamines et donc que le marquage soit suffisant pour permettre la mise en évidence des tumeurs exprimant ce système de transport des polyamines.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, e représente 2 et d représente 0.

Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, e représentera 1, de préférence 1, et d représentera 0, 1 ou 2, de préférence 1 ou 2.

Il pourra s'agir plus particulièrement d'un composé de formule (II) pour lequel : - R2 = H, a = 4, d = 1 et e = 0, - R2 = H, b = 3, c = 4, d = 0 et e = 1,

- R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 1 et e = 1,

- R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 2 et e = 1, ou

- R2 = CH ₃ , b = 3, c = 4, d = 0 et e = 1,

ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.

Avantageusement, il s'agira d'un composé de formule II pour lequel :

- R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 1 et e = 1, ou

- R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 2 et e = 1,

ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.

La présente invention a pour troisième objet l'utilisation d'un com posé de formule (II) tel que défini ci-dessus ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci en ta nt q ue sonde de diagnostic pour imagerie médica le, nota m ment pa r scintigraphie, plus particulièrement pour mettre en évidence une tumeur cancéreuse exprimant le système de transport des polyamines in vivo ou in vitro, et notamment in vivo.

La scintigraphie est une méthode d'imagerie médicale utilisant des composés marqués avec des isotopes radioactifs. Ces composés radio-marqués sont administrés à un animal, tel qu'un mammifère, y compris l'homme, et permettent de produire une image médicale par la détection des rayonnements émis par les isotopes radioactifs. Selon le composé marqué utilisé, il sera possible de visualiser différentes parties du corps, selon la cible du composé marqué.

La présente invention a pour quatrième objet un composé de formule (II) tel que défini ci-dessus ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci pour son utilisation dans le diagnostic, plus particulièrement in vivo, d'une tumeur cancéreuse exprimant le système de transport des polyamines, notamment par imagerie médicale, telle que par scintigraphie. En effet, le complexe du Technétium 99m de formule (II) reconnaît les cellules tumorales en profitant de leur capacité d'internaliser les polyamines naturelles dont elles ont besoin pour leur métabolisme.

Un tel complexe de Technétium 99m, injecté au patient, permet de mettre en évidence l'existence d'un foyer tumoral car le complexe est distribué préférentiellement dans la tumeur.

Cette approche permet de sélectionner les patients dont la tumeur exprime bien le transporteur de polyamine ou système PTS. Elle est déterminante pour pouvoir traiter lesdits patients avec un produit anticancéreux qui serait lui-même vectorisé par les polyamines naturelles, ciblant ainsi les cellules tumorales par rapport aux cellules saines. Cette sélection de patients permet d'avoir un taux de réponse plus favorable, et de ne pas traiter les patients non-répondeurs.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (II) tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition diagnostique destinée à la mise en évidence d'une tumeur cancéreuse exprimant le système de transport des polyamines, plus particulièrement in vivo, notamment par imagerie médicale, telle que par scintigraphie.

La présente invention concerne également une méthode de mise en évidence (ou diagnostique) d'une tumeur cancéreuse exprimant le système de transport des polyamines comprenant l'administration à une personne en ayant besoin d'une quantité suffisante d'un composé de formule (II) tel que défini ci-dessus. Cette administration est suivie d'une étape de détection de la radioactivité émise par le Technétium 99m, notamment par imagerie de scintigraphie afin de visualiser la tumeur.

La présente invention a pour cinquième objet une composition comprenant au moins un composé de formule (I) tel que défini précédemment ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. L'excipient pharmaceutiquement acceptable sera plus particulièrement un excipient utilisé dans les compositions administrées par voie parentérale.

Ces compositions comprendront notamment des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles.

Les composés de formule (I) peuvent être présents à des doses comprises entre 0,01 mg et 1000 mg. La dose peut être avantageusement comprise entre 5 mg et 500 mg, et notamment entre 10 mg et 200 mg. Il peut être nécessaire d'utiliser des doses sortant de ces gammes ce dont l'homme du métier peut se rendre compte lui- même.

La présente invention a pour sixième objet une composition diagnostique comprenant au moins un composé de formule (II) selon l'invention ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Par « composition diagnostique », on entend, au sens de la présente invention, une composition destinée à être administrée à un animal tel qu'un mammifère, y compris l'homme, en vue de réaliser un diagnostic, et plus particulièrement un diagnostic in vivo, notamment par imagerie médicale telle que par scintigraphie. Dans le cadre de la présente invention, il s'agira plus particulièrement de permettre la mise en évidence de tumeurs cancéreuses exprimant le système de transport des polyamines.

Le technétium présent dans une telle composition sous forme de complexe de formule (II) sera totalement ou partiellement (c'est-à-dire au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, encore préférentiellement de plus de 90 %, encore plus préférentiellement au moins de 95 % et toujours préférentiellement de près de 100 %) sous forme d'isotope 99m. Les compositions diagnostiques selon l'invention peuvent être formulées pour tous types d'administrations souhaitables, préférentiellement par voie parentérale, notamment par intraveineuse.

L'ingrédient actif peut être administré sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux ou aux êtres humains.

Pour une administration intraveineuse, on utilisera notamment des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles.

Les composés de formule (II) en tant qu'agent de diagnostic peuvent être utilisés à des doses comprises entre 5 mg et 500 mg. Il peut être nécessaire d'utiliser des doses sortant de ces gammes ce dont l'homme du métier peut se rendre compte lui-même.

Une telle composition diagnostique est utile pour le diagnostic d'une tumeur cancéreuse exprimant le système de transport des polyamines, notamment par imagerie médicale, telle que par scintigraphie.

La présente invention a pour septième objet un procédé de préparation d'une composition diagnostique telle que définie ci-dessus comprenant le mélange d'une composition comprenant au moins un composé de formule (I) ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci tel que défini ci-dessus avec un sel de pertechnétate-99m, au moins un agent réducteur et de la tricine.

Le procédé est réalisé de préférence à température ambiante, c'est-à-dire à une température comprise entre 15 et 40°C, notamment entre 20 et 35°C, en particulier à environ 25°C.

Le sel de pertechnétate sera de préférence un sel de métal alcalin tel qu'un sel de sodium. Un tel sel sera plus particulièrement utilisé en solution dans une solution physiologique. Une telle solution est obtenue à l'aide d'un générateur à molybdène 99 comme décrit précédemment. L'age nt réducteur pou rra être u n méla nge de fl uorure d'étai n et d'acide ascorbique permettant de réduire le Technétium du degré d'oxydation +VI I au degré +111 pour permettre sa complexation avec le composé de formule (I) et la tricine.

La tricine sert de ligand du Technétium 99m. Elle répond à la formule suivante :

Par exemple, pour l,5mg de composé de formule (I), il pourra être utilisé 24 mg de tricine, 80 μg de fluorure d'étain et 0,5 mg d'acide ascorbique.

Une telle composition est préparée de manière extemporanée, c'est-à-dire juste avant son utilisation.

La présente invention a donc pour huitième objet un kit comprenant :

(1) une composition comprenant au moins un composé de formule (I) tel que défini précédemment ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable,

(2) de la tricine, et

(3) un agent réducteur.

Ce kit pourra comprendre en outre les instructions nécessaires pour utiliser ce kit, notamment dans le diagnostic de tumeurs cancéreuses.

L'age nt réducteur pou rra être u n méla nge de fl uorure d'étai n et d'acide ascorbique.

Pa r exe m ple, pou r 1,5 mg de composé de formule (I) présent da ns la composition (1), le kit pourra contenir 24 mg de tricine, 80 μg de fluorure d'étain et 0,5 mg d'acide ascorbique. La présente invention a pour neuvième objet un procédé de préparation d'un com posé de form ule (I ) tel que défi ni ci-dessus ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci comprenant les étapes successives suivantes : réaction de l'acide 6-halogéno-nicoti nique avec u ne polya mi ne protég formule (III) suivante :

pour laquelle R2, a, b, c, d et e sont tels que définis précédemment et GPl, GP2 et GP3, identiques ou différents, représentent chacun un groupement N-protecteur, pour donner un composé de formule (IV) suivante :

pour laquelle R2, a, b, c, d, e, GPl, GP2 et GP3 sont tels que définis précédemment et Hal représente un atome d'halogène,

(b) réaction du composé de formule (IV) obtenu à l'étape (a) précédente avec de l'hydrazine pour donner un composé de formule (V) suivante :

pour laquelle R2, a, b, c, d, e, GPl, GP2 et GP3 sont tels que définis précédemment,

éventuellement protection par un groupement N-protecte ur de la fonction hydrazine du composé de formule (V) obtenu à l'étape (b) précédente pour donner un composé de formule (VI) suivante :

pour laquelle R2, a, b, c, d, e, GPl, GP2 et GP3 sont tels que définis précédemment et RI représente un groupement N-protecteur tel que défini ci-dessus,

(d) déprotection des fonctions aminés protégées par les groupements GPl, GP2 et GP3 dans le composé de formule (V) ou (VI) obtenu à l'étape (b) ou (c) précédente pour donner un composé de formule (II) selon l'invention,

(e) éventuellement salification du composé de formule (II) obtenu à l'étape (d) précédente pour obtenir un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et

(f) séparation du composé de formule (II) ou de son sel pha rmace utique me nt acceptable obtenu à l'étape précédente du milieu réactionnel.

Par « halogéno » ou « halogène », on entend, au sens de la présente invention, un atome d'iode, de fluor, de brome ou de chlore. Il s'agit notamment d'un atome de chlore.

Etape (a) :

L'acide 6-halogéno-nicotinique sera de préférence de l'acide 6-chloro- nicotinique, composé disponible dans le commerce.

Dans cette étape, les groupements GPl, GP2 et GP3 peuvent représenter un groupe BOC ou Z. De préférence, ces trois groupements protecteurs sont identiques.

Les polyamines non protégées sont disponibles dans le commerce et peuvent être protégées par des techniques bien connues de l'homme du métier permettant d'avoir accès facilement aux composés de formule (III) . U n exe m p le de dé rivé polyamine, la spermine protégée par trois groupements BOC, est décrit da ns Tetrohedron Lett. 1998, 39, 439. La fonction amide du composé de formule (IV) peut être formée par couplage peptidique entre la fonction acide carboxylique de l'acide 6-halogéno-nicotinique et la fonction aminé libre de la polyamine protégée de formule (III).

Le couplage peptidique pourra être réalisé en présence d'un agent de couplage, tel que le diisopropylcarbodiimide (DIC), le dicyclohexylcarbodiimide (DCC), le chlorhydrate de l-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC), le carbonyldiimidazole (CDI), le 2-(lH-benzotriazole-l-yl)-l,l,3,3-tetraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU), le 2-(IH-benzotriazole-l-yl)-l,l,3,3-tetraméthyluronium tetrafluoroborate (TBTU) ou encore le 0-(7-azobenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3- tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HATU), éventuellement associé à un auxiliaire de couplage tel que le N-hydroxy succinimide (NHS), le N-hydroxy benzotriazole (HOBt), le 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazole (HOOBt), le I- hydroxy-7-azabenzotriazole (HAt) ou le N-hydroxysylfosuccinimide (suifo NHS). En particulier, le couplage pourra être réalisé en présence de TBTU.

Le couplage pourra en outre être réalisé en présence d'une base telle que la triéthylamine. Un solvant inerte tel que l'acétonitrile pourra être utilisé.

Etape (b) :

L'hydrazine utilisée sera plus particulièrement de l'hydrate d'hydrazine, disponible dans le commerce.

La réaction pourra être réalisée à température élevée, notamment au reflux de l'hyrazine, en particulier à environ 100°C.

Etape (c) :

Cette étape de protection peut être effectuée par des techniques bien connues de l'homme du métier.

Lorsque le groupe N-protecteur est un groupe BOC, elle peut être réalisée par réaction avec du ferf-butyl carbonate en présence d'une base telle que de la triéthylamine. Une telle réaction peut être réalisée à température ambiante, notamment dans un solvant tel que le THF. Etape (d) :

L'étape de déprotection peut être réalisée par des techniques bien connues de l'homme du métier.

Lorsque les groupements protecteurs sont des groupements BOC, la déprotection pourra être réalisée en milieu acide, notamment en présence d'acide chlorhydrique ou d'acide trifluoroacétique. Une telle réaction pourra être réalisée à température ambiante, notamment dans un solvant tel que le dioxane ou l'isopropanol.

Lorsque les groupements protecteurs sont des groupements Z, la déprotection pourra être réalisée par hydrogénation sous atmosphère d'hydrogène en présence d'un catalyseur d'hydrogénation tel que Pd/C. Une telle réaction pourra être réalisée en milieu alcoolique, notamment dans le méthanol ou l'éthanol. Une protection par des groupements Z sera préférée lorsque RI représentera un groupement N- protecteur clivable en milieu acide. En effet, cela permettra de déprotéger les groupements GPl, GP2 et GP3 sans déprotéger le groupement RI.

Etape (e) :

Cette étape pourra être réalisée par réaction du composé de formule (II) obtenu à l'étape (d) avec un acide ou une base pharmaceutiquement acceptable. Il s'agira de préférence d'un acide pharmaceutiquement acceptable tel que l'acide chlorhydrique.

Selon la nature des groupements protecteurs GPl, GP2 et GP3 et le sel pharmaceutiquement acceptable désiré (et notamment quand GPl = GP2 = GP3 = BOC et le sel est le chlorhydrate), il peut être envisagé d'effectuer les étapes (d) et (e) de manière « one-pot », c'est-à-dire dans un même réacteur, sans isoler l'intermédiaire de synthèse entre les deux étapes, et notamment en utilisant les mêmes réactifs (notamment le même acide pour déprotéger les groupements GPl, GP2 et GP3 et pour former le sel pharmaceutiquement acceptable). Etape (f) :

Le composé obtenu pourra être séparé du milieu réactionnel par des méthodes bien connues de l'homme du métier, comme par exemple par extraction, évaporation du solvant ou encore par précipitation et filtration.

Le composé pourra être purifié si nécessaire par des techniques bien connues de l'homme du métier, comme pa r recristallisation si le composé est cristallin, par disti l lation, pa r ch ro matogra p hie su r co lo n ne su r ge l de si lice ou e nco re pa r chromatographie liquide haute performance (HPLC). La présente invention a pour neuvième objet un procédé de préparation d'un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus pour lequel RI ≠ H ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci com prena nt les éta pes successives suivantes :

(i) protection par un groupement N-protecteur de la fonction hydrazine de l'acide 6- hydrazinyl-nicotinique pour donner un composé de formule (VII) suivante :

pour laquelle RI représente un groupement N-protecteur tel que défini ci-dessus,

(ii) réaction d'un composé de formule (VII) obtenu à l'étape (i) précédente avec une polyamine protégée de formule (III) telle que définie précédemment pour donner un composé de formule (VI) tel que défini ci-dessus,

(iii) déprotection des fonctions aminés protégées par les groupements GP1, GP2 et GP3 dans le composé de formule (VI) obtenu à l'étape (ii) précédente pour donner un composé de formule (II) selon l'invention pour lequel RI≠ H,

(iv) éventuellement salification du composé de formule (II) obtenu à l'étape (iii) précédente pour obtenir un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et (v) séparation du composé de formule (II) ou de son sel pha rmace utique me nt acceptable obtenu à l'étape précédente du milieu réactionnel.

Etape (i) :

L'acide 6-hydrazinyl-nicotinique répond à la formule suivante :

I l peut être obtenu pa r réaction d'un acide 6-halogéno-nicotinique, tel que l'acide 6-chloro-nicotinique, avec de l'hydrazine, et plus particulièrement de l'hydrate d'hydrazine. Une telle réaction pourra être réalisée à température élevée, notamment au reflux de l'hyrazine, en particulier à environ 100°C.

La réaction de protection de la fonction hydrazine par un groupement N- protecteur se fait par des méthodes bien connues de l'homme du métier, notamment par l'une des méthodes décrites à l'étape (c) précédente.

Lorsq ue le groupement protecteu r est le trifluoroacétyle, la réaction de protection peut être effectuée en présence du chlorure de l'acide trifluoroacétique ou bien par protection par un groupement Boc (voir étape (c)) notamment comme décrit dans J. Med. Chem. 2007, 50, 1418-1422.

Etape (ii) :

Cette étape peut être réalisée dans les mêmes conditions que celles de l'étape (a) décrite précédemment.

Etape (iii) : voir étape (d) précédente.

Etape (iv) : voir étape (e) précédente.

Etape (v) : voir étape (f) précédente.

La présente invention a pour dixième objet un procédé de préparation d'un composé de formule (II) tel que défini ci-dessus ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci com prenant le méla nge d'un composé de form ule (I) tel que défini ci-dessus ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci avec un sel de pertechnétate-99m, au moins un agent réducteur et de la tricine.

Le procédé est réalisé de préférence à température ambiante, c'est-à-dire à une température comprise entre 15 et 40°C, notamment entre 20 et 35°C, en particulier à environ 25°C.

Ce procédé sera réalisé avantageusement dans un milieu aqueux, notamment pharmaceutiquement acceptable.

Le sel de pertechnétate sera de préférence un sel de métal alcalin tel qu'un sel de sodium.

L'agent réducteu r pou rra être u n méla nge de fl uoru re d'étai n et d'acide ascorbique permettant de réduire le Technétium du degré d'oxydation +VI I au degré +111 pour permettre sa complexation avec le composé de formule (I) et la tricine.

La tricine sert de ligand du Technétium 99m. Elle répond à la formule suivante :

Pa r exemple, pour 1,5 mg de composé de formule (I), il pourra être utilisé 24 mg de tricine, 80 μg de fluorure d'étain et 0,5 mg d'acide ascorbique.

La présente invention sera mieux comprise à la lumière des exemples non limitatifs qui suivent.

FIGURES

La Figure 1 représente le pourcentage d'incorporation d'un complexe de formule (II) dans des cellules B16/F10 et A549 incubées avec différentes concentrations de complexe de formule (II) et de spermine.

La Figure 2 représente l'image TEMP d'une souris traitée selon l'exemple 30 1). Les Figure 3a et 3b représentent des images TEMP d'une souris traitée selon l'exemple 31 avec un composé de formule (II) pour lequel R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1 obtenu à partir d'un composé de formule (I) pour lequel RI = H ou CF ₃ CO respectivement.

EXEMPLES

Exemple 1 : Préparation de l'ester ferf-butylique de l'acide {4-[(6-chloro-pyridine-3- carbonyl)-amino]-butyl}-carbamique

Au mélange de 2 g d'acide 6-chloronicotinique et de 2,4 g de N-BOC-1,4- diaminobutane en solution dans 100 mL d'acétonitrile à température ambiante sous agitation et en présence de 2,1 mL de triéthylamine sont ajoutés en une fois 4,1 g de TBTU. Le mélange est laissé en contact à cette température environ 5 heures. Le milieu réactionnel est hydrolysé avec 300 mL de solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,5 M puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x100 mL). Après décantation, séchage sur sulfate de sodium anhydre et filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie Si0 ₂ avec un gradient allant de 100 % de CH ₂ CI ₂ au mélange CH ₂ CI ₂ /Méthanol/NH ₄ OH (80/18/2) pour obtenir 2,1 g de solide couleur crème après évaporation des fractions concernées. (Rdt : 50 %). CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /Méthanol/NH ₄ OH (90/9/1). Rf : 0,63. Exemple 2 : Préparation de l'ester ferf-butylique de l'acide {4-[(6-hydrazino-pyridine- 3-carbonyl)-amino]-butyl}-carbamique.

A 2,1 g de l'ester ferf-butylique de l'acide {4-[(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-amino]- butyl}-carbamique sont ajoutés 30 mL d'hydrate d'hydrazine. Le mélange obtenu est porté au reflux pendant environ 5 heures. Après hydrolyse dans 300 mL d'eau, le milieu est extrait à l'acétate d'éthyle (3x100 mL). Les phases organiques sont lavées avec une solution saturée en NaCI, puis séchées sur sulfate de sodium anhydre. Après filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie Si0 ₂ avec un gradient allant de CH ₂ CI ₂ 100 % à CH ₂ CL ₂ /méthanol 80/20. Une purification complémentaire par HPLC préparative sur colonne Sunfire C18 OBD de Waters 10 μ, 19x250 mm, a été réalisée avec comme phase mobile un gradient allant de HCI 5 mmol à acétonitrile/HCI 5 mmol 50/50 pour obtenir après lyophilisation des fractions concernées 210 mg du composé sous sa forme chlorhydrate obtenu sous forme de poudre blanche. (Rdt : 10 %).

Ci ₅ H ₂₅ N ₅ 0 ₃ : 323,398

Analyse HPLC sur colonne Waters X-Brigde C18, 5 μ, 4,6x250 mm

Élution : Acétonitrile/Tampon KH ₂ P0 ₄ 6,8 g/L pH 4 (2/98), débit 1 mL/minute, λ : 220 nm. Temps rétention : 3,43 min.

Exemple 3 : Préparation de {N-(4-Amino-butyl)-6-hydrazino-nicotinamide, composé de formule (I) (RI = R2 = H, a = 4, d = 1, e = 0).

0,21 g du chlorhydrate de l'ester ferf-butylique de l'acide {4-[(6-hydrazino-pyridine-3- carbonyl)-amino]-butyl}-carbamique sont dissous dans 10 mL de solution 4M d'acide chlorhydrique dans le dioxane. Le milieu réactionnel obtenu est laissé sous agitation 6 heures à température ambiante. Le précipité résultant est filtré sous vide, rincé à l'éther éthylique et séché sous vide. Une purification par HPLC préparative sur colonne Sunfire C18 OBD de Waters 10 μ, 19x250 mm a été réalisée avec comme phase mobile un gradient allant de HCI 5 mmol à acétonitrile/HCI 5 mmol 50/50 pour obtenir après lyophilisation des fractions concernées 55 mg de chlorhydrate du composé sous forme de poudre de couleur crème. (Rdt : 28 %).

Pf : 275°C.

Analyse HPLC sur colonne Waters Atlantis HILIC, 5 μ, 4,6x150 mm

Élution : Acétonitrile/eau/formiate d'ammonium 750/250/0,63 g pH 5, débit 1 mL/minute,

λ : 220 nm. Temps rétention : 14,64 min.

C1 ₀ H17N5O : 223,28 ; Chlorhydrate : Ci ₀ Hi ₇ N ₅ O, 2 HCI : 296,.200 - Masse (ESI+400°C) : 224,2 (M+H)

1H-RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 8.57 (1H, s, H-2 Ar), 8.13 (1H, d, j = 8.8 Hz, H-4 Ar), 6.94 (1H, d, j = 8.8 Hz, H-5 Ar), 3.28 (2H, m, ÇH2N HCO), 2.82 (2H, m, ÇJHzNHz), 2.54 (4H, m, CH2-CH2).

Exemple 4 : Préparation de l'ester benzylique de l'acide [4-(benzyloxycarbonyl-{3-[(6- chloro-pyridine-3-carbonyl)-amino]-propyl}-amino)-butyl]-car bamique

Au mélange de 0,23 g d'acide 6-chloronicotinique et de 0,77 g de l'ester benzylique de l'acide {4-[(3-amino-propyl)-benzyloxycarbonyl-amino]-butyl}-carbami que (J. Med. Chem. 1997, 40, 3842-3850) en solution dans 30 mL d'acétonitrile à température ambiante sous agitation et en présence de 0,3 mL de triéthylamine sont ajoutés en une fois 0,6 g de TBTU. Le mélange est laissé en contact à cette température environ 6 heures. Le milieu réactionnel est hydrolysé avec 200 mL de solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,5 M puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x10 mL). Après décantation, séchage sur sulfate de sodium anhydre et filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie Si0 ₂ avec un gradient allant de 100 % de CH ₂ CI ₂ au mélange CH ₂ CI ₂ /Méthanol (97/3) pour obtenir 0,52 g d'huile incolore après évaporation des fractions concernées. (Rdt : 50 %).

CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /Méthanol (95/5) - Rf: 0.44

Exemple 5 : Préparation de l'ester benzylique de l'acide [4-(benzyloxycarbonyl-{3-[(6- hydrazino-pyridine-3-carbonyl)-amino]-propyl}-amino)-butyl]- carbamique

A 0,52 g de l'ester benzylique de l'acide [4-(benzyloxycarbonyl-{3-[(6-chloro-pyridine-3- carbonyl)-amino]-propyl}-amino)-butyl]-carbamique sont ajoutés 20 mL d'hydrate d'hydrazine. Le mélange obtenu est porté au reflux pendant environ 7 heures. Après hydrolyse dans 300 mL d'eau, le milieu est extrait à l'acétate d'éthyle (3x100 mL). Les phases organiques sont lavées avec une solution saturée en NaCI puis séchées sur sulfate de sodium anhydre. Après filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie Si0 ₂ avec un mélange CH ₂ CL ₂ /méthanol 97/3. Les fractions concernées sont évaporées sous pression réduite pour obtenir 350 mg du composé sous forme d'huile jaune. (Rdt : 68 %).

CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /Méthanol/NH ₄ OH (90/10/1) - Rf: 0.41

CzgHseNeOs: 548,647 Exemple 6 Préparation du N-[3-(4-amino-butylamino)-propyl]-6-hydrazino- nicotinamide, composé de formule 1(1) (RI = R2 = H, d = 0, b = 3, c = 4, e = 1).

0,35 g de l'ester benzylique de l'acide [4-(benzyloxycarbonyl-{3-[(6-hydrazino-pyridine- 3-carbonyl)-amino]-propyl}-amino)-butyl]-carbamique e n so l uti o n da ns 20 m L de méthanol en présence de Pd/10 % est agité violemment sous atmosphère d'hydrogène à température ambiante pendant 5 heures. Le catalyseur est filtré sous vide, rincé au méthanol. Le filtrat est évaporé sous pression réduite pour obtenir un résidu huileux. Le tétra-chlorhydrate est précipité par addition de 4 équivalents d'une solution 4 M d'acide chlorhydrique dans le dioxane à une solution du résidu obtenu dans l'éther éthylique. Le précipité orange est filtré, rincé à l'éther éthylique puis séché sous vide pour donner 145 mg de sel. (Rdt : 53 %)

Pf : 183°C

Ci ₃ H ₂ 4N ₆ 0 : 280,376 ; sel Ci ₃ H ₂₄ N ₆ 0, 4 HCI : 426,220 - Masse 5ESI+ 400°C) : 281,2

(M+H).

Pf : 183°C

¹ H-RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 8.64 (1H, s, H-2 Ar), 8.17 (1H, d, j = 8.8 Hz, H-4 Ar), 6.95 (1H, d, j = 8.8 Hz, H-5 Ar), 3.33 (2H, m, ÇHzNHCO), 2.91 (4H, m, ÇHzNHz), 2.80 (2H, m, CH2-NH2), 1.66-1.90 (6H, m, H2C-CH2).

Exe m p l e 7 Préparation de l'ester ferf-butylique de l'acide (3-ferf- butoxycarbonylamino-propyl)-[4-(ferf-butoxycarbonyl-{3-[(6-c hloro-pyridine-3- carbonyl)-amino]-propyl}-amino)-butyl]-carbamique

Au mélange de 0,31 g d'acide 6-chloronicotinique et de 1 g de Tri-BOC-spermine (d'après FR 2919287) en solution da ns 40 mL d'acétonitrile à température ambiante sous agitation et en présence de 0,3 L de triéthylamine sont ajoutés en une fois 0,4 g de TBTU. Le méla nge est laissé en contact à cette température environ 1/2 heure. Le m i l i e u réa ct i o n n e l est hyd ro lysé ave c 100 mL de solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,5 M, puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x50 mL). Après décantation, séchage sur sulfate de sodium anhydre et filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie Si0 ₂ avec un gradient alla nt de 100 % d'heptane à 100 % d'acétate d'éthyle pour obtenir 0,79 g d'huile incolore après évaporation des fractions concernées. (Rdt : 62 %).

CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /Méthanol/NH ₄ OH (90/9/1). Rf : 0.56

Exemple 8 Préparation de l'ester ferf-butylique de l'acide (3-tert- butoxycarbonylamino-propyl)-[4-(ferf-butoxycarbonyl-{3-[(6-h ydrazino-pyridine-3- carbonyl)-amino]-propyl}-amino)-butyl]-carbamique

A 0,79 g de l'ester ferf-butylique de l'acide (3-ferf-butoxycarbonylamino-propyl)-[4- (fer butoxycarbonyl-{3-[(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-amino]-pro pyl}-amino)-butyl]- carbamique sont ajoutés 30 mL d'hydrate d'hydrazine. Le mélange obtenu est porté au reflux pendant environ 6 heures. Après hydrolyse dans 500 mL d'ea u, le milieu est extrait à l'acétate d'éthyle (3x100 mL). Les phases organiques sont lavées avec une solution saturée en NaCI puis séchées sur sulfate de sodium anhydre. Après filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite pour donner 0,74 g de résidu huileux verdâtre. (Rdt : 94%).

CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /methanol/NH ₄ OH (90/9/1). Rf: 0,46.

CsiHssNyOy : 637,827 - Masse (ESI+ 400°C) : 638,4 (M+H).

Exemple 9 : Préparation du N-{3-[4-(3-amino-propylamino)-butyl amino]-propyl}-6- hydrazino-nicotinamide, composé de formule (I) (RI = R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1)·

0,74 g de l'ester ferf-butylique de l'acide (3-ferf-butoxycarbonylamino-propyl)-[4-(ferf- butoxycarbonyl-{3-[(6-hydrazino-pyridine-3-carbonyl)-amino]- propyl}-amino)-butyl]- carbamique sont dissous dans 20 mL de solution 4 M d'acide chlorhydrique dans le dioxane. Le milieu réactionnel obtenu est laissé sous agitation 7 heures à température ambiante. Le précipité résultant est filtré sous vide, rincé à l'éther éthylique et séché sous vide pour donner 0,45 g de solide de couleur crème. (Rdt : 87 %).

Pf : 282°C.

CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /methanol/NH ₄ OH (40/40/20). Rf: 0,16.

CieHsiNyO : 337.472, sel Ci ₆ H ₃ iN ₇ 0, 4 HCI : 483.332 - Masse: 338.2 (M+H) ESI+ 400°C. Analyse HPLC sur colonne Waters Atlantis HILIC, 5 μ, 4,6x150 mm

Élution : Acétonitrile/eau/formiate d'ammonium 700/300/0,63 g pH 2,5, débit 1 mL/minute,

λ : 220 nm. Temps rétention : 11.35 min. 1H-RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 8.64 (1H, s, H-2 Ar), 8.16(1H, d, j = 8.8 Hz, H-4 Ar), 6.94 (1H, d, j = 8.8 Hz, H-5 Ar), 3.34 (2H, m, CHOISI HCO), 2.93 (8H, m, ÇHzNHz), 1.98 (4H, m, CH2), 1.88 (4H, m, H2C-CH2). Exemple 10 : Préparation de l'ester ferf-butylique de l'acide [3-(ferf-butoxycarbonyl- {4-[ferf-butoxycarbonyl-(3-ferf-butoxycarbonyl amino-propyl)-amino]-butyl}-amino)- propyl]-{3-[(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-amino]-propyl}-ca rbamique

Au mélange de 0,21 g d'acide 6-chloronicotinique et de 0,88 g de (/Vl,/V4,/V9,/V13-tétra- ferf-butoxycarbonyl)-l,16-diamino-4,9,13-triazahexadécane (Tetrahedron 2000, 56 2449-2460) en solution dans 100 mL d'acétonitrile à température a mbiante sous agitation et en présence de 0,22 mL de triéthylamine sont ajoutés en une fois 0,43 g de TBTU. Le mélange est laissé en contact à cette température environ 5 heures. Le milieu réactionnel est hydrolysé avec 100 mL de solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,5M, puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x50 mL). Après décantation, séchage sur sulfate de sodium anhydre et filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie Si0 ₂ avec un gradient alla nt de 100 % de CH ₂ CI ₂ au mélange CH ₂ CI ₂ /Méthanol/NH ₄ OH (80/18/2) pour obtenir 0,66 g d'huile incolore après évaporation des fractions concernées. (Rdt : 62 %).

CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /Méthanol/NH ₄ OH (90/9/1). Rf : 0,53.

Exemple 11 : Préparation de l'ester ferf-butylique de l'acide [3-(ferf-butoxycarbonyl- {4-[ferf-butoxycarbonyl-(3-ferf-butoxycarbonyl amino-propyl)-amino]-butyl}-amino)- propyl]-{3-[(6-hydrazino-pyridine-3-carbonyl)-amino]-propyl} -carbamique

A 0,66 g de l'ester ferf-butylique de l'acide [3-(ferf-butoxycarbonyl-{4-[ferf- butoxycarbonyl-(3-ferf-butoxycarbonyl amino-propyl)-amino]-butyl}-amino)-propyl]- {3-[(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-amino]-propyl}-carbamique sont ajoutés 20 mL d'hydrate d'hydrazine. Le mélange obtenu est porté au reflux pendant environ 5 heures. Après hydrolyse dans 300 mL d'eau, le milieu est extrait à l'acétate d'éthyle (3x100 mL). Les phases organiques sont lavées avec une solution saturée en NaCI puis séchées sur sulfate de sodium anhydre. Après filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite pour donner un résidu huileux q u i e st p u rifi é pa r f l a s h chromatographie Si0 ₂ avec un gradient allant de 100 % de CH ₂ CI ₂ a u méla nge CH ₂ CI ₂ /Méthanol (80/20) pour obtenir 0,31 g d'huile ja une après éva poration des fractions concernées. (Rdt : 47 %).

CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /méthanol/NH ₄ OH (90/9/1). Rf : 0,28.

CsgHyoNsOg : 795,041

Analyse HPLC sur colonne Waters X-Brigde C18, 5 μ, 4,6x250 mm

Élution : Acétonitrile/Tampon KH ₂ P0 ₄ 6,8 g/L pH 4 (50/50), débit 1 mL/minute, λ : 220 nm. Temps rétention : 15.07 min.

Exemple 12 Préparation du N-(3-{3-[4-(3-amino-propylamino)-butylamino]- propylamino}-propyl)-6-hydrazino-nicotinamide, composé de formule (I) (RI = R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = 2, e = 1)

0,31 g de l'ester ferf-butylique de l'acide ([3-(ferf-butoxycarbonyl-{4-[ferf- butoxycarbonyl-(3-fer butoxycarbonyl-amino-propyl)-amino]-butyl}-amino)-propyl]- {3-[(6-hydrazino-pyridine-3-carbonyl)-amino]-propyl}-carbami que sont dissous dans 10 mL de solution 4 M d'acide chlorhydrique da ns le dioxane. Le milieu réactionnel obtenu est laissé sous agitation 6 heures à température ambiante. Le précipité résultant est filtré sous vide, rincé à l'éther éthylique et séché sous vide. Une purification pa r HPLC prépa rative sur colonne Sunfire C18 OBD de Waters 10 μ, 19x250 mm a été réalisée avec comme phase mobile un gradient allant de HCI 5 mmol à acétonitrile/HCI 5 mmol 50/50 pour obtenir après lyophilisation des fractions concernées 37 mg de penta-chlorhydrate du composé sous forme de poudre grise. (Rdt : 16 %).

Pf : 307°C.

Ci ₉ H ₃₈ N ₈ 0 : 394,568, sel Ci ₉ H ₃₈ N ₈ 0, 5 HCI : 576.870 - Masse (ESI + 400°C) : 365,2 (M- NH-NH2).

Analyse HPLC sur colonne Waters Atlantis HI LIC, 5 μ, 4,6x150 mm

Élution : Acétonitrile/eau/formiate d'ammonium 650/350/0,63 g pH 2, débit

1 mL/minute,

λ : 220 nm. Temps rétention : 7,33min.

1H-RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 8.63 (1H, s, H-2 Ar), 8.17 (1H, d, j = 8.8 Hz, H-4 Ar), 6.95 (1H, d, j = 8.8 Hz, H-5 Ar), 3.35 (2H, m, ÇH2NHCO), 2.98 (12H, m, ÇJHzNHz), 1.97 (6H, m, CH2), 1.88 (4H, m, H2C-CH2).

Exemple 13 : Préparation de l'ester benzylique de l'acide (3-benzyloxycarbonyl- amino-propyl)-(4-{benzyloxycarbonyl-[3-({6-[N'-(2, 2, 2-trifluoro-acétyl)-hydrazino]- pyridine-3-carbonyl}-amino)-propyl]-amino}-butyl)-carbamique

Au mélange de 0,49 g d'acide 6-(2-(2, 2, 2-trifluoroacétyl)hydrazinyl)nicotinique et de 1,2 g de tri-Z-spermine (Tetrahedron Letters 1998, 39, 439-442) en solution dans 12 mL de DMF à température ambiante sous agitation et en présence de 0,33 m L de triéthylamine sont ajoutés en une fois 0,63 g de TBTU. Le mélange est laissé en contact à cette température environ 5 heures. Le milieu réactionnel est hydrolysé avec 100 mL de solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,5 M, puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x50 mL). Après décantation, séchage sur sulfate de sodium anhydre et filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie Si0 ₂ avec un gradient allant de 100 % heptane à 100 % acétate d'éthyle pour obtenir 1,23 g de solide ja une. Le chlorhydrate est précipité da ns le dichlorométhane par addition de 1 équivalent d'une solution 4 M d'acide chlorhydrique dans le dioxane pour obtenir 0,93 g de solide jaune pâle. (Rdt : 56 %). CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /Méthanol/NH ₄ OH (90/9/1). Rf : 0,2.

Analyse HPLC sur colonne Waters X-Brigde C18, 5 μ, 4,6x250 mm

Élution : Acétonitrile/Tampon KH ₂ P0 ₄ 6,8 g/L pH 4 (60/40), débit 1 mL/minute.

λ : 220 nm. Temps rétention : 7.69 min.

Exemple 14 : Préparation du N-{3-[4-(3-amino-propylamino)-butylamino]-propyl}-6- [N'-(2, 2, 2-trifluoro-acétyl)-hydrazino]-nicotinamide, composé de formule (I) (RI = CF ₃ CO, R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1)

0,52 g de l'ester benzylique de l'acide (3-benzyloxycarbonylamino-propyl)-(4- {benzyloxycarbonyl-[3-({6-[N'-(2, 2, 2-trifluoro-acétyl)-hydrazino]-pyridine-3-carbonyl}- amino)-propyl]-amino}-butyl)-carbamique en solution dans 30 mL de méthanol en présence de Pd/10 % est agité violemment sous atmosphère d'hydrogène à température ambiante pendant 5 heures. Le catalyseur est filtré sous vide, rincé au méthanol. Le filtrat est évaporé sous pression réduite sans chauffer pour obtenir un résidu huileux. Le tétra-chlorhydrate est précipité par addition de 4 équivalents d'une solution 4 M d'acide chlorhydrique dans le dioxane à une solution du résidu obtenu dans le dichlorométhane. Le précipité beige est filtré, rincé à l'éther éthylique, puis séché sous vide pour donner 162 mg de sel. (Rdt : 40 %).

Pf : 237,5°C

Ci ₈ H ₃ oF ₃ N ₇ 0 ₂ : 433,481, sel Ci ₈ H ₃₀ F ₃ N ₇ O ₂ , 4 HCI : 579,341 - Masse (APCI + 500°C) : 434,2 (M+H)

Analyse HPLC sur colonne Waters Atlantis HILIC, 5 μ, 4,6x150 mm

Élution : Acétonitrile/eau/formiate d'ammonium 700/300/0,63 g pH 2,5, débit 1 mL/minute,

λ : 220 nm. Temps rétention : 5.62 min.

¹ H-RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 8.58 (1H, s, H-2 Ar), 7.98 (1H, d, j = 8.8 Hz, H-4 Ar), 6.74 (1H, d, j = 8.8 Hz, H-5 Ar), 3.34 (2H, m, ÇHzNHCO), 2.95 (8H, m, ÇHzNHz), 1.95 (4H, m, CH2), 1.68 (4H, m, H2C-CH2).

E xe m p l e 15 Préparation de l'ester benzylique de l'acide (3- benzyloxycarbonylamino-propyl)-[4-(benzyloxycarbonyl-{3-[(6- chloro-pyridine-3- carbonyl)-amino]-propyl}-amino)-butyl]-carbamique

Au mélange de 0,98 g d'acide 6-chloronicotinique et de 3,74 g de tri-Z-spermine (Tetrahedron Letters 1998, 39, 439-442) en solution dans 100 mL d'acétonitrile à température ambiante sous agitation et en présence de 1,05 mL de triéthylamine sont ajoutés en une fois 2 g de TBTU. Le mélange est laissé en contact à cette température environ 90 minutes. Le milieu réactionnel est hydrolysé avec 100 mL de solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,5 M puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x50 mL). Après décantation, séchage sur sulfate de sodium anhydre et filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie Si0 ₂ avec un gradient allant de 100 % heptane à 100 % acétate d'éthyle pour obtenir 1,6 g d'huile jaune. (Rdt : 35 %).

CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /Méthanol/NH ₄ OH (90/9/1). Rf : 0,45.

Exemple 16 Préparation de l'ester benzylique de l'acide (3- benzyloxycarbonylamino-propyl)-[4-(benzyloxycarbonyl-{3-[(6- hydrazino-pyridine-3- carbonyl)-amino]-propyl}-amino)-butyl]-carbamique

A 1,6 g de l'ester benzylique de l'acide (3-benzyloxycarbonylamino-propyl)-[4- (benzyloxycarbonyl-{3-[(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-amino] -propyl}-amino)-butyl]- carbamique sont ajoutés 20 mL d'hydrate d'hydrazine. Le mélange obtenu est porté au reflux pendant environ 2 heures. Après hydrolyse dans 300 mL d'ea u, le milieu est extrait à l'acétate d'éthyle (3x100 mL). Les phases organiques sont lavées avec une solution saturée en NaCI puis séchées sur sulfate de sodium anhydre. Après filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite pour donner 1,8 g de résidu huileux. (Rdt : quantitatif).

CCM Si0 ₂ : CH ₂ CI ₂ /méthanol/NH ₄ OH (90/9/1). Rf : 0,40.

C ₄ oH ₄₉ N ₇ 07 : 739,879 - Masse (ESI + 400°C) : 740,5 (M+H)

Exemple 17 Préparation de l'ester ferf-butylique de l'acide N'-{5-[3-

(benzyloxycarbonyl-{4-[benzyloxycarbonyl-(3-benzyloxycarb onylamino-propyl)- amino]-butyl}-amino)-propylcarbamoyl]-pyridin-2-yl}-hydrazin ecarboxylique

A 1,6 g de l'ester benzylique de l'acide (3-benzyloxycarbonylamino-propyl)-[4- (benzyloxycarbonyl-{3-[(6-hydrazino-pyridine-3-carbonyl)-ami no]-propyl}-amino)- butyl]-carbamique en solution dans 30 mL de THF en présence de 2 mL de triéthylamine est ajoutée à température ambiante et goutte à goutte une solution de 2 g de di-ferf-butyl carbonate dans 10 mL de THF. En fin d'addition, le milieu réactionnel est laissé 2 heures sous agitation. Après hydrolyse dans 300 mL d'eau, le milieu est extrait à l'acétate d'éthyle (3x100 mL). Les phases organiques sont lavées avec une solution saturée en NaCI puis séchées sur sulfate de sodium anhydre. Après filtration, le solvant est évaporé sous pression réduite pour donner résidu huileux qui est purifié par flash chromatographie Si0 ₂ avec un gradient allant de 100 % heptane à 100 % acétate d'éthyle pour obtenir 1,15 g d'huile incolore. (Rdt : 63 %).

Analyse HPLC sur colonne Waters X-Brigde C18, 5 μ, 4,6x250 mm

Élution : Acétonitrile/Tampon KH ₂ P0 ₄ 6,8 g/L pH 4 (60/40), débit 1 mL/minute. λ : 220 nm. Temps rétention : 9.33 min.

Exemple 18 : Préparation de l'ester ferf-butylique de l'acide N'-(5-{3-[4-(3-amino- propylamino)-butylamino]-propylcarbamoyl}-pyridin-2-yl)-hydr azinecarboxylique, composé de formule (I) (RI = BOC, R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1).

0,2 g de l'ester benzylique de l'acide (3-benzyloxycarbonylamino-propyl)-[4- (benzyloxycarbonyl-{3-[(6-hydrazino-pyridine-3-carbonyl)-ami no]-propyl}-amino)- butylj-carbamique en solution dans 10 mL de méthanol en présence de Pd/10 % est agité violemment sous atmosphère d'hydrogène à température ambiante pendant 2 heures. Le catalyseur est filtré sous vide, rincé au méthanol. Le filtrat est évaporé sous pression réduite sans chauffer pour obtenir 110 mg de solide. (Rdt : quantitatif). C ₂ iH ₃ 9N ₇ 03 ₂ : 437,590 - Masse (ESI + 400°C) : 438,3 (M+H).

Analyse HPLC sur colonne Waters X-bridge C18, 5μ, 4,6x250mm

Élution : Acétonitrile/tampon ΚΗ ₂ Ρ0 ₄ 6,4 g/1 90/10 pH 4, débit 1 mL/minute

λ : 220 nm. Temps rétention : 7,56 min

1H-RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 8.64 (1H, s, H-2 Ar), 8.16(1H, d, j = 8.8 Hz, H-4 Ar), 6.94 (1H, d, j = 8.8 Hz, H-5 Ar), 3.34 (2H, m, ÇHzNHCO), 2.93 (8H, m, ÇHzNHz), 1.98 (4H, m, CH2), 1.88 (4H, m, H2C-CH2), 1.42 (9H, ferf-butyl).

Exemple 19 : Préparation de l'ester ferf-butylique de l'acide [4-(ferf-butoxycarbonyl- {3-[(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-méthyl-amino]-propyl}-am ino)-butyl]-carbamique

Synthèse réalisée selon le protocole de synthèse de l'ester benzylique de l'acide [4- (benzyloxycarbonyl-{3-[(6-chloro-pyridine-3-carbonyl)-amino] -propyl}-amino)-butyl]- carbamique mais en utilisant l'aminé suivante : ester tert-butylique de l'acide {4-[ferf- butoxycarbonyl-(3-méthylamino-propyl)-amino]-butyl}-carbami que (J. Med. Chem. 1999, 42, 277-290).

Exemple 20 : Préparation de l'ester ferf-butylique de l'acide [4-(ferf-butoxycarbonyl-

{3-[(6-hydrazino-pyridine-3-carbonyl)-méthyl-amino]-prop yl}-amino)-butyl]- carbamique

Réaction avec l'hydrazine suivant les protocoles décrits précédemment. Exemple 21 : Préparation du N-[3-(4-Amino-butylamino)-propyl]-6-hydrazino-N- methyl-nicotinamide, composé de formule (I) (RI = H, R2 = CH ₃ , b = 3, c = 4, d = 0, e = 1).

Déprotection avec une solution 4 M d'acide chlorhydrique dans le dioxane suivant les protocoles décrits précédemment.

Exemple 22 : Dérivé de t e AADT synthétisé

A un mélange de 0,5 g (1 éq., 0,66 mmole) de N-[[[2-[(Triphénylméthyl) thio]éthyl]amino]carbonyl]-méthyl]-/V-(3'-chloropropyl)-S- (triphénylméthyl)-2- aminoéthanethiol (décrit dans J. Med. Chem. 1997, 40, 1835-1844) et de 1,34 g de spermine (10 éq., 6,6 mmoles) en solution dans 100 mL de mélange 1/1 de dichlorométhane et de méthanol sont additionnés 50 mg de bromure de tétrabutylammonium. Ce mélange obtenu est évaporé sous pression réduite pour obtenir un résidu huileux qui est chauffé à 110°C pendant 9 heures. Après refroidissement, 50 mL de soude 1 N sont ajoutés et une extraction au dichlorométhane (4x100 mL) est effectuée. Les phases organiques d'extraction sont rassem blées, séchées sur su lfate de sodi um a nhyd re, fi ltrées et éva porées sous pression réd uite pou r obte n i r u n ré si d u h u i l e u x q u i e st p u ri fi é pa r f l a s h chromatographie sur gel de silice avec un gradient allant de 100% de dichlorométhane à dichlorométhane/méthanol/ammoniaque à 37 % (70/20/10) pour obtenir 0,27 g (rdt : 37 %) sous forme d'une huile orange. Une purification complémentaire par HPLC préparative est réalisée sur colonne C18-Xbridge de Waters 30x250mm, 10 m, débit 40ml/min., I 220 nm, phase mobile gradient 100 % acétonitrile à acétonitrile/solution aqueuse HCI 5mmolaire (50/50).

Les fractions concernées par le produit sont évaporées pour éliminer l'acétonitrile puis lyophilisées pou r obteni r le produit sous forme de solide crème et sous sa forme chlorhydrate. Rdt : 12 %. CCM : CH ₂ CI ₂ /méthanol/ammoniaque 4/4/2 : Rf : 0,5

Exemple 23 : Complexation du composé de l'exemple 22 avec le Technétium 99m

Dans un ballon de 100 ml équipé d'une agitation magnétique, on ajoute au composé de l'exemple 22 (5 mg) de l'anisole (0,2 ml ; 1,8 mmol) puis de l'acide trifluoroacétique 99 % (10 ml ; 134 mmol) qui donne une coloration jaune à la solution. Le milieu réactionnel est ensuite agité 5 min à 5°C. Le mélange est ensuite titré, goutte à goutte, avec du triéthylsilane (Et ₃ Si) (0,07 ml ; 0,43 mmol) jusqu'à disparition de la couleur jaune. La solution est évaporée sous pression réduite à température ambiante. Le composé obtenu (1 mg) est dissout dans du NaCI 0,9 % (1 ml) puis ajouté, dans un flacon sous vide, à un mélange de fluorure d'étain (SnF ₂ ) (80 μg ; 0,51 μιηοΙ) et d'acide ascorbique (0,5 mg ; 2,8 μιηοΙ). On laisse ensuite incuber pendant 3 minutes à température ambiante, avant de rajouter le pertechnétate de sodium (500 μί ; 185 MBq). Celui-ci, réduit extemporanément du degré d'oxydation +VII au degré +111, est a lors com plexé sous forme de pentadentate. Après incubation de 30 minutes, le volume est ajusté à 4 ml avec du NaCI 0,9 %. Exemple 24 : Etudes in vivo avec le complexe de l'exemple 23

Fixation tumorale : Des cellules de cancer du sein MX1 (5.10 ⁶ cellules) ont été injectées en sous-cutané au niveau du flanc de souris femelles Swiss nude. 22 jours post-greffe, la sonde radiomarquée (15 MBq5) a été injectée à ces souris. Des scintigraphies du corps entier ont ensuite été réalisées 30 min, 1 h et 5 h post-injection. Pour cela, les souris, anesthésiées par voie gazeuse avec de l'isoflurane, ont été imagées en décubitus ventral sur une gamma-caméra (γ Imager, BIOSPACE Mesures) avec le logiciel γ Acquisition (BIOSPACE Mesures) avec les paramètres suivants :

- Fenêtre spectrale : 124-160 KeV

- Temps d'acquisition : 5 min

- Matrice 256x256

Pour l'ensemble des images, une région d'intérêt a été tracée autour de la tumeur et une autre de même taille a été définie sur le muscle d'une patte arrière afin de déterminer le rapport tumeur/muscle.

Les résultats indiquent qu'il n'y a pas de fixation tumorale, le traceur se concentre ra pidement da ns le foie. Ainsi, ce traceur n'est pas reconnu par le système de transport des polyamines.

Exemple 25 : Chélation directe du Technétium 99m sur les aminés de la spermine après réduction du Tc0 ₄ ^"

La spermine (10 mg) est dissoute dans de l'eau ppi (1 ml). 100 μί de la solution obtenue sont ajoutés, dans un flacon sous vide, à du fluorure d'étain (80 μg ; 0,51 μιηοΙ). On rajoute ensuite le pertechnétate de sodium (370 MBq). Celui-ci, réduit extemporanément du degré d'oxydation +VII au degré +111, est alors complexé sous forme de monodentate. Puis on ajoute de l'acide ascorbique (0,5 mg ; 2,8 μιηοΙ). Après incubation de 15 minutes à température ambiante, le pH est ajusté aux environs de 6,3-6,7. Exemple 26 : Etudes in vivo avec le composé de l'exemple 25

Fixation tumorale : Des cellules de mélanome murin B16/F10 (2,5.10 ⁵ cellules) ont été injectées en sous-cutané au niveau de la patte arrière droite de souris maies C57BL/6. 10 jours post-greffe, la sonde radiomarquée a été injectée aux souris. L'imagerie a été réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple 24 ci-dessus.

Les résultats indiquent qu'il n'y a pas de fixation tumorale, une partie du traceur est rapidement éliminé par voie urinaire et il y a une forte fixation hépatique. Ainsi, le complexe de l'exemple 25 n'est pas reconnu par le système de transport des polyamines.

Exemple 27 : Complexation des composés de formule (I) avec le Technétium 99m

Un exemple de marquage est donné avec le N-(3-{3-[4-(3-amino-propylamino)- butylamino]-propylamino}-propyl)-6-hydrazino-nicotinamide, composé de formule (I) (RI = R2 = H, = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1), permettant de donner le complexe suivant :

Le composé de formule (I) (1,5 mg) et de la tricine (24 mg ; 89 μιηοΙ) sont dissous dans du NaCI 0,9% (1,5 ml) puis 1 ml de la solution obtenue est placée dans un flacon sous vide. Du fluorure d'étain (80 μg ; 0,51 μιηοΙ) et de l'acide ascorbique (0,5 mg ; 2,8 μιηοΙ) sont ajoutés comme agents réducteurs. On laisse ensuite incuber pendant 3 minutes à température ambiante, avant d'ajouter le pertechnétate de sodium (500 μί ; 370 MBq). Celui-ci, réduit extemporanément du degré d'oxydation +VII au degré +111, est alors complexé sous forme de monodentate. Après incubation de 30 minutes, du PBS lOx est ajouté (0,5ml) puis le volume est ajusté à 5ml avec du NaCI 0,9 %. Exemple 28 : Contrôle du marquage

Une radio HPLC en phase inverse a été réalisée sur une colonne XBridge C8 4,6*250mm 5 μ (Waters, USA) avec une phase mobile (débit de 1 m l/mi n à température ambiante) composée d'eau (55 %), d'acétonitrile (45 %) et de TFA (0,1 %). Aucune étape de purification n'a été réalisée avant injection.

Des radios HPLC en phase inverse réalisées entre 30 min et 5 h post-marquage des composés ont montré que le marquage est stable.

Les résultats obtenus à 30 min post-marquage sont présentés dans le tableau ci- dessous.

Complexe de formule (II) obtenu à partir d'un composé de formule (I) pour lequel RI

Complexe de formule (II) obtenu à partir d'un composé de formule (I) pour lequel RI

Exemple 29 : Etude in vitro - Incorporation dans différents types cellulaires du complexe de formule (II) obtenu à partir d'un composé de formule (I) pour lequel RI = R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = l

Des cellules A549 et B16 ont été mises en culture dans des plaques à 24 puits (2.10 ⁵ cellules/puits). Après 24h, les cellules ont été incubées pendant 30 minutes avec le complexe de formule (II) à différentes concentrations ou avec 0,2 μΜ de complexe de formule (II) en présence ou non d'une concentration croissante de spermine utilisée pour évaluer la compétition avec la sonde. Après l'incubation, les plaques ont été placées sur la glace et les cellules ont été rincées avec du NaCI 0,9 % froid additionné de 1 mM de spermidine. Les cellules ont reçu un traitement à la trypsine. Elles ont été mises en suspension dans du PBS. L'activité de chaque puits a été mesurée à l'ai d'un compteur gamma.

La spermine bloque en partie l'incorporation du complexe de formule (II) da ns I cellules B16 et A549 (résultats présentés sur la Figure 1), ce qui indique que la son emprunte les transporteurs de polyamines pour entrer dans les cellules.

Exemple 30 : Etudes in vivo avec le complexe de formule (II) obtenu à partir d'un composé de formule (I) pour lequel RI = R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1

1) Fixation tumorale : Des cellules de mélanome murin B16/F10 (2,5.10 ⁵ cellules) ont été injectées en sous cutané au niveau de la patte arrière droite de souris mâles C57BL/6. 10 jours post-greffe, le complexe de formule (II) (14,8MBq) a été injecté à 18 souris, 400 μg de spermine ayant été préalablement injectés à 8 de ces souris. Des scintigraphies du corps entier ont ensuite été réalisées 30 min et 2 h post-injection. Pour cela, les souris, a nesthésiées pa r voie gazeuse avec de l'isoflu ra ne, ont été imagées en décubitus ventral sur une gamma caméra (γ Imager, BIOSPACE Mesures) avec le logiciel IRIS (Ariès Nucléaire, France) avec les paramètres suivants :

- Fenêtre spectrale : 121 - 164 KeV

- Temps d'acquisition : 3 min

- Matrice : 256*256

Pour l'ensemble des images, une région d'intérêt a été tracée autour de la tumeur et une autre de même taille a été définie sur le muscle de la patte controlatéral afin de déterminer le rapport tumeur sur muscle. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau qui suit.

Temps post-injection 30 min 2 h

du complexe de Sans Avec Sans Avec

formule (II) spermine spermine spermine spermine

Rapport

tumeur/muscle 3,97 ± 1,01* 2,31 ± 0,50 5,26 ± 1,40* 2,93 ± 1,12

(moyenne ± écart-type)

Inhibition (%) 45,0 47,7

^Différence significative (P<0.001) entre les lots avec ou sans compétiteur Des souris ont également été imagées en TEMP (nanoSPECT/CT, Bioscan, USA), une image étant présentée sur la Figure 2.

La compétition mise en évidence dans cette étude entre la spermine et le complexe de formule (II) indique que la sonde utilise le système de transport des polyamines. Cette sonde est donc un biomarqueur de l'incorporation de spermine par les cellules.

2) Stabilité plasmatique : 14,8MBq de complexe de formule (II) ont été injectés par voie intraveineuse à des souris mâles C57BL/6 saines. 30 minutes, 1 h, 2 h, 3 h et 5 h postinjection, des prélèvements de sang sur héparine ont été réalisés au sinus rétro- orbitaire. Ces échantillons ont ensuite été centrifugés 5 minutes afin de récupérer au moins 100 μί de sérum. 50 μί ont permis la réalisation d'une radio HPLC d'exclusion- diffusion sur une colonne TSK SW2000 + pré-colonne 7,8*300mm 5 μ (Tosoh bioscience) avec une phase mobile (débit de 1 ml/min à température ambiante) composée de NaCI 0,9 % (100 %). De l'albumine de macaque marqué avec du ^99m Tc a été utilisée pour le contrôle du temps de rétention de l'albumine.

Les 50 μί de sérum restants ont permis de réaliser une radio HPLC en phase inverse, après dénaturation des protéines avec de l'acétonitrile, sur une colonne XBridge C8 4,6*250 mm 5 μ (Waters, USA) avec une phase mobile (débit de 1 m l/mi n à température ambiante) composée d'eau (55 %), d'acétonitrile (45 %) et de TFA (0,1 %). Une grande partie du complexe de formule (II) injecté est éliminé rapidement (38 % à 30 minutes). Une partie du Technétium s'est transchelaté sur l'albumine plasmatique dès 30 minutes après l'injection par voie intraveineuse. La radio HPLC en phase inverse indique une bonne stabilité du complexe.

3) Biodistribution chez la souris saine : Cette étude a été réalisée sur 32 souris C57BL/6 (16 mâles et 16 femelles) âgées de 6-7 semaines. 2,96 MBq de complexe de formule (II) ont été injectés par voie intraveineuse sous un volume de 60 μί. Puis les animaux ont été sacrifiés 30 min, 2 h, 5 h et 24 h post-injection (4 souris/temps) et divers organes ont été prélevés, pesés et leur activité à été déterminée avec un compteur gamma. La quantité de complexe de formule (II) présente dans chaque organe a été calculée en pourcentage de la dose injectée par gramme de tissus (% ID)/g. Le complexe de formule (II) se distribue de manière quasi homogène dans l'ensemble des organes et sa fixation ne persiste que dans le foie et les reins. La fixation rénale est due au système mégaline/cubiline qui est impliqué dans un processus de récupération et d'épa rgne de molécules utiles à l'organisme. Plus les molécules sont petites et aminées, plus elles sont récupérées dans l'urine primaire au niveau du tubule proximal où elles sont réabsorbées. Les taux de fixation observés au niveau du foie et des reins suggèrent que chez la souris il n'y a pas de risque de toxicité rénale ni d'effets secondaires dus à la dosimétrie.

Exemple 31 : Etude in vivo avec d'autres complexes de formule (II)

L'étude a été réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple 30, 1) ci-dessus avec d'autres complexes de formule (II).

Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :

( ¹⁾ Complexe de formule (II) obtenu à partir d'un composé de formule (I) pour lequel RI = H.

⁽²⁾ Complexe de formule (II) obtenu à partir d'un composé de formule (I) pour lequel RI = CF ₃ CO.

Des souris ont également été imagées en TEMP (nanoSPECT/CT, Bioscan, USA), deux images étant présentées sur les Figures 3a et 3 b obte nues avec u n com posé de formule (II) pour lequel R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1, ce composé de formule (II) ayant été obtenu à partir d'un composé de formule (I) pour lequel RI = H ou CF ₃ CO respectivement. On peut ainsi constater que l'ensemble des sondes se fixe sur la tumeur. Cependant, dans le cas des composés des exemples 3 et 6 (com prenant moins de trois atomes basiques dans le motif polyamine), le rapport tumeur sur muscle est moindre qu'avec les autres composés ce qui permet un moins bon diagnostic de la tumeur.

Abréviations utilisées dans la partie expérimentale :

APCI Ionisation chimique à pression atmosphérique

BOC ferf-Butyloxycarbonyle

CCM Chromatographie sur Couche Mince

DMF Diméthylformamide

DMSO Diméthylsulfoxyde

ESI Ionisation par électrospray

HPLC Chromatographie liquide haute performance

PBS Tampon phosphate salin

Pf Point de fusion

ppi Pour préparation injectable

Rdt Rendement

Rf Rapport frontal

RMN Résonance magnétique nucléaire

TEMP Tomographie d'émission monophotonique

TFA Acide trifluoroacétique

THF Tétrahydrofurane

Z Benzyloxycarbonyle